Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Tekrarlayan İmplantasyon Başarısızlığı Olan Kadınlarda Çoklanmış Floresan İmmünohistokimyasal Boyama Kullanılarak Dört Uterin NK Hücre Alt Tipinin Ölçümü

2.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67284

⸱

25 Ekim 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynaecology, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 2Department of Pathology, School of Clinical Medicine, The University of Hong Kong, Queen Mary Hospital, 3Reproduction and Development Laboratory, Li Ka Shing Institute of Health Sciences, The Chinese University of Hong Kong, 4School of Biomedical Sciences, Prince of Wales Hospital, The Chinese University of Hong Kong, 5Chinese University of Hong Kong - Sichuan University Joint Laboratory in Reproductive Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 6Laboratory for Reproductive Immunology, Hospital of Obstetrics and Gynecology, Fudan University, 7NHC Key Lab of Reproduction Regulation, Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies, Fudan University, 8Shanghai Key Laboratory of Female Reproductive Endocrine Related Diseases, Hospital of Obstetrics and Gynecology, Fudan University

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, ileri çoğullanmış floresan immünohistokimyasal boyama teknikleri kullanılarak implantasyon penceresi sırasında uterus doğal öldürücü hücre alt kümelerini ölçmek için öncü bir yöntem sunmaktadır.

Özet

İmmünohistokimya (IHC), biyolojik araştırma ve klinik tanıda çok önemli bir rol oynar ve doku antijenlerini tanımlamak ve görselleştirmek için en yaygın kullanılan yöntem olarak hizmet eder. Bununla birlikte, geleneksel IHC boyama yöntemlerinin, bağışıklık hücrelerinin çeşitli alt tiplerini ayırt etmede sınırlamaları vardır. Bu zorluk, bilim adamlarını bağışıklık hücresi alt tiplerinin kesin olarak tanımlanması ve farklılaştırılması için yeni teknolojiler ve metodolojiler keşfetmeye itmiştir. Son yıllarda, multipleks IHC, birden fazla antijenin aynı anda tespit edilmesini ve aynı doku örneği içinde görselleştirilmesini sağlayan bir çözüm olarak ortaya çıkmıştır. Uterus doğal öldürücü (uNK) hücreler, desidualizasyon, uterus spiral arterlerinin yeniden şekillenmesi ve embriyo implantasyonu dahil olmak üzere erken gebelik süreçlerinde çok önemli bir rol oynar. uNK hücrelerinin farklı alt tipleri, başarılı embriyo gelişimi ve hamilelik için çeşitli biyolojik olayları koordine etmelerine izin veren farklı işlevler sergiler. Bu nedenle, uNK hücre alt tipleri üzerine derinlemesine araştırmalar, hamilelik sırasında immün regülasyon mekanizmalarını aydınlatmak için gereklidir. Bu tür çalışmalar, kısırlık ve tekrarlayan üreme yetmezliği gibi ilgili durumları ele almak için değerli bilgiler ve yeni yaklaşımlar sağlar. Bu makale, implantasyon penceresi (WOI) sırasında endometriyal örneklerde dört alt tip uNK hücresinin yoğunluğunu incelemek için ayrıntılı bir multipleks IHC boyama protokolünü tanıtmaktadır. Protokol, numune hazırlama, alt tip belirteçlerin optimizasyonu, mikroskobik görüntüleme ve veri analizlerini içerir. Bu multipleks IHC boyama protokolü, farklı uNK hücre alt tiplerinin aynı anda tespit edilmesini sağlayan yüksek özgüllük ve hassasiyet sunar, böylece araştırmacılara hamilelik sırasında bağışıklık düzenlemesinin karmaşıklıklarını ve mekanizmalarını keşfetmek için güçlü bir araç sağlar.

Giriş

İn vitro fertilizasyon-embriyo transferinden (IVF-ET) sonra belgelenen ilk canlı doğum 1978'de bildirilmiştir. Son 40 yılda, infertil çiftler arasında IVF-ET yardımı için yüksek bir talep olmuştur1. 2021'de 238.126 hasta Amerika Birleşik Devletleri'nde toplam 413.776 IVF döngüsü başlattı. Bu, döngülerde 2 yıl öncesine göre %25'lik bir artışa ve 2012'ye göre %135'lik bir artışa işaret ediyor2. Bu artış esas olarak infertilite prevalansının artmasına ve hamilelik planlamasının gecikmesine bağlanmaktadır. Embriyo kültürü tekniklerindeki ve süperovulasyon protokollerindeki gelişmeler, ET döngüsü başına canlı doğum oranının artmasına, 40 yaşın altındaki kadınlarda %30-50'ye ve 40 yaşından büyük kadınlarda %30'un altına ulaşmasına yol açmıştır2. Bununla birlikte, bu gelişmelere rağmen, transfer edilen embriyoların yarısından fazlası hala implante edilememektedir. Tipik olarak yüksek kaliteli embriyoların transferinde üç veya daha fazla ardışık denemeden sonra başarısızlık olarak tanımlanan tekrarlanan implantasyon başarısızlığı (RIF), IVF-ET3 geçiren kadınların %15'ini etkiler. RIF'li çiftler son derece savunmasızdır ve onları gereksiz risklere maruz bırakabilecek pahalı ve gereksiz prosedürlere maruz kalmaya daha yatkındır4. Bu nedenle, RIF'in nedenlerini anlamak ve embriyo implantasyonunu iyileştirmek, özellikle RIF'li kadınlar için IVF-ET'nin başarısını artırmak için çok önemlidir. Endometriyumun hazırlanması başarılı embriyo implantasyonu için kritik öneme sahiptir. Bu süreç, orta salgı fazında endometriyumdaki toplam lenfositlerin% 30'unu oluşturmaktan erken gebelik sırasında desidua'da% 70 -% 80'e geçiş yapan uterus doğal öldürücü (uNK) hücrelerin önemli bir birikimi ile karakterize edilir5. Özellikle, uNK hücreleri, enfekte hücrelerin lizis veya apoptoz yoluyla ölümüne neden olmak için doğuştan gelen bağışıklık sistemi için kritik olan sitotoksik lenfositler olan periferik NK hücrelerinden farklıdır. uNK hücrelerinin kesin işlevleri henüz tam olarak anlaşılmamış olsa da, birkaç kanıt dizisi, anjiyogenezin yeniden şekillenmesi, trofoblast invazyonu ve fetal gelişimde rol oynadıklarını göstermektedir6. uNK hücrelerinin stromal hücreler üzerindeki yüzdesi ile RIF arasındaki ilişki, son 20 yılda geniş bir ilgi görmüştür. 604 kadını içeren 8 çalışmayı içeren yakın tarihli bir meta-analiz, orta luteal faz sırasında CD56 + uNK hücrelerinin yoğunluğunun, RIF'li kadınlarda fertil kontrollere kıyasla önemli ölçüde arttığını göstermiştir7. Bununla birlikte, orta luteal faz sırasında uNK hücrelerinin özelliklerinin, yaprak döken NK (dNK) hücrelerininkinden önemli ölçüde farklı olduğuna dikkat etmek önemlidir. uNK hücreleri, hamilelik sonrası dNK hücrelerinin çeşitli alt kümelerine daha fazla farklılaşabilse de, uNK hücrelerinin tek başına ölçülmesi, dNK hücrelerini doğru bir şekilde temsil etmez8. uNK hücreleri dinamik farklılaşmaya uğrar ve adet döngüsü ve desidualizasyon süreçlerinde farklı roller oynar, bu da onları tek başına CD56 ile tanımlanabilenden daha karmaşık hale getirir. Endometriyal hazırlık sırasında uNK hücre davranışının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlamak için çoklu belirteçler gereklidir. Son çalışmamız, adet döngüleri boyunca uNK hücrelerinin çeşitliliğini tanımlamak için tek hücreli RNA dizilimi kullandı. Akış sitometrisi kullanılarak doğrulanan sonuçlar, her biri adet döngüsü9 sırasında dinamik değişiklikler sergileyen dört farklı uNK hücresi alt tipinin varlığını göstermiştir. Gen zenginleştirme analizi ve gen ontolojisi fonksiyonel zenginleştirme, bu uNK alt kümelerinin menstrüasyonun çeşitli aşamalarında farklı işlevleri yerine getirdiğini göstermektedir. Bununla birlikte, akış sitometrisi klinik laboratuvarlarda evrensel olarak erişilebilir değildir ve enzim sindirimi için taze endometriyal dokunun hemen işlenmesi, hatalar üzerine deneysel adımların tekrarlanmasını imkansız hale getirir.

Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, daha pratik bir tanı yaklaşımı sağlayan bir multipleks boyama testi kullanarak NK hücrelerinin bu dört alt popülasyonunun ölçümünü araştırmaktı. Çoklu boyamada, her hedefe karşı farklı spesifik antikorlar, belirli bir dalga boyu ışık tarafından uyarıldığında farklı dalga boylarında ışık yayan farklı florofor etiketlerine bağlanır. Geleneksel IHC boyama yöntemiyle karşılaştırıldığında, bu yöntem, bir numunedeki birden fazla hedefin nispi bolluğunu ve dağılımını kantitatif olarak karşılaştırabilir ve farklı hedeflerin etkileşimi ve birlikte lokalizasyonu hakkında bilgi sağlayarak uNK hücrelerinin farklı alt tiplerini tanımlamamızı sağlar. Bu yaklaşım sadece uNK hücreleri ve RIF arasındaki ilişki hakkındaki anlayışımızı derinleştirmekle kalmayacak, aynı zamanda endometriyal ilişkili hastalıklarda diğer bağışıklık hücresi alt popülasyonlarını araştırmak için içgörüler sağlayacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Çalışma, Hong Kong Ortak Çin Üniversitesi-Yeni Bölgeler Doğu Kümesi Klinik Araştırma Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (CREC ref no.: 2022.581). RIF'li kadınlar, Hong Kong Çin Üniversitesi, Galler Prensi Hastanesi, Yardımcı Üreme Teknolojisi Merkezi'nden işe alındı. RIF, 40 yaşın altındaki bir kadında en az 3 taze veya dondurulmuş siklusta en az 4 iyi kaliteli embriyonun transferinden sonra klinik bir gebelik elde edilememesi olarak tanımlandı10. Endometriyal biyopsiler alınmadan önce katılımcılardan bilgilendirilmiş onam alındı.

1. Endometriyal örneklerin alınması ve işlenmesi

  1. Endometriyal örnek toplama zamanlaması
    1. Çalışma katılımcıları arasında tutarlılığı sağlamak için sıkı bir protokol izleyerek endometriyal örnekler toplayın. Doğal döngüleri olan hastalar için, adet döngüsünün 9. gününden itibaren idrar tahlili yapın ve LH dalgalanmasından (LH + 7) sonraki 7. günde endometriyal biyopsi yapın11 . Hormon replasman tedavisi (HRT) döngüsü geçiren hastalar için, adet döngüsünün 2. gününden itibaren günde 6 mg estradiol valerat oral yoldan uygulayın.
    2. Adet döngüsünün 13. gününde ultrasonografi ile endometriyal kalınlığı değerlendirin. Endometriyal kalınlık 8 mm'ye ulaştığında veya aştığında, progesteronu transvajinal yoldan uygulayın ve progesteron uygulamasından 5 gün sonra endometriyal biyopsi yapın12.
  2. Endometriyal numune toplama ve fiksasyon: uterus boşluğuna bir pipet örnekleyici yerleştirin ve onu fundal bölgeye ilerletin; İç pistonu aşağı çekerek, aynı anda uterus boşluğu içindeki dönme ve dikey hareketlerle endometriyal yüzeyi kazıyarak emme uygulayın. Rahim ağzı ve uterus sekresyonlarını ortadan kaldırmak için toplanan örnekleri normal tuzlu su ile durulayın. Numuneleri ölçün ve boyutunu değerlendirin. 3 mm x 15-25 mm'lik numuneler için, bunları hemen 10 mL %10 nötr tamponlu formaline batırın ve 24-48 saat oda sıcaklığında sabitleyin.
  3. Dehidrasyon: Fiksasyonun tamamlanmasının ardından, numuneleri suyu etanol ile değiştirmek için tasarlanmış bir dehidrasyon dizisine tabi tutun. Bunu yapmak için, tam dehidrasyonu sağlamak için dokuları %70, %80, %90 ve %100 etanol banyolarına daldırın. Son etanol banyosunun ardından, kalan alkolü gidermek ve parafin sızması için hazırlamak için numuneleri ksilen içinde temizleyin.
  4. Gömme: Dokuyu kalıbın dibine düz bir şekilde yerleştirdikten sonra, parafini eritin ve endometriyal dokunun parafin matrisinde tamamen kapsüllendiğinden emin olmak için dikkatlice numunelere ekleyin. Kalıpları parafin mumu ile doldurduktan sonra, parafin mumunun katılaşmasını sağlamak için bir dondurucu masasında soğutun. Parafin blokları sertleştikten sonra, daha fazla işlem gerekene kadar oda sıcaklığında saklayın.
    NOT: Kullanılan kalıplar, endometriyal dokunun katlanmadan altta düz bir şekilde uzanmasına izin vermek için elde edilen endometriyal numunelerin boyutuna uyacak şekilde özel olarak seçilmiştir, böylece sonraki kesitler için ve gereksiz fazlalık oluşturmadan optimum oryantasyon sağlanmıştır.
  5. Kesit alma: Kesitlere ayırmaya hazırlanmak için parafin bloklarını 4 °C'de 2 saat soğutun. Numuneleri bir mikrotom kullanarak 4 μm'lik bölümler halinde dilimleyin, ardından dilimleri 42 °C'ye ısıtılmış damıtılmış su yüzeyinde düzleştirin ve yapışkan cam slaytlara monte edin. Dilimleri gece boyunca bir slayt kurutucuya koyun ve kullanmadan önce oda sıcaklığında saklayın.

2. Multipleks immünohistokimya koşullarının optimizasyonu

  1. IHC doğrulaması: IHC boyama parametrelerinin doğrulanması için, antijen alımı, antikor konsantrasyonu ve inkübasyon süreleri için koşullara ince ayar yapmak için sistematik bir yaklaşım benimseyin.
    1. Üreticinin tavsiye ettiği seyreltme aralıkları dahilinde, her antikor için 2-3 konsantrasyonu test edin. pH 6 ve pH 9'daki tamponları karşılaştırarak antijen alımını optimize edin ve inkübasyon protokollerini hem oda sıcaklığında 1,5 saat hem de gece boyunca 4 °C'de değerlendirin.
    2. Lekelenme yoğunluğuna, özgüllüğüne ve arka plan gürültüsüne odaklanarak her durumu titizlikle değerlendirin. Minimum spesifik olmayan ciltleme ile en net, en spesifik boyamayı veren en uygun kombinasyonu seçin. Bu titiz doğrulama, IHC protokolünde en yüksek doğruluğu ve tekrarlanabilirliği sağladı.
  2. Tiramid Sinyal Amplifikasyonu (TSA) monopleks boyama: Bireysel antikorlar için en uygun boyama parametrelerini belirledikten sonra, antikorların farklı TSA boyaları ile eşleşmesini optimize edin. Daha yüksek ifadeye sahip işaretleyiciyi daha düşük floresan yoğunluk seviyesine sahip bir boyayla eşleştirin veya tam tersini yapın. Bu aşama sırasında, gözlemlenen floresan sinyal gücüne göre antikor konsantrasyonunda ve inkübasyon süresinde ayarlamalar yapın. Önemli bir arka plan veya spesifik olmayan lekelenme gözlenirse, eşleştirilmiş boyayı13 değiştirin.
  3. TSA multipleks boyama: Multipleks immünohistokimya (m-IHC) protokolü için, boyamanın sıralı sırası, belirlenmiş prensiplere göre dikkatlice tanımlanmıştır. Çoğullama işleminin tek etiketli boyamanın hassasiyetini ve özgüllüğünü yansıttığından emin olmak için, boyama dizisinin başında daha düşük ekspresyon seviyelerine sahip öncelikli antikorlar. Antijen alımı için baz onarımı gerektiren antikorları boyama dizisinin sonuna yerleştirin, çünkü baz onarımı, bazı durumlarda spesifik olmayan boyama artefaktlarını çoğaltabilen asit bazlı yöntemlere kıyasla sağlamdır.
  4. Adım 2.1 ve 2.2'deki bulguları kullanarak, antijen alma gereksinimlerine ve ekspresyon yoğunluklarına bağlı olarak kullanılacak antikorlara ve hangi aşamada karar verin. Örneğin, antijen alımı için bir baz onarımı gerektiren CXCR4 antikoru, boyamanın son aşamalarına yerleştirilmiştir. Tersine, daha düşük bir ekspresyon yoğunluğu ile karakterize edilen CD49a antikoruna, boyama dizisinde ilk pozisyon verilmiştir. Başarılı algılama şansını en üst düzeye çıkarın ve çoğullama prosedürünün sonraki aşamalarında ortaya çıkabilecek maskeleme etkilerini en aza indirin.
  5. Kalan antikorlar için, hem duyarlılığı hem de özgüllüğü dengeleyen en etkili diziyi belirlemek için optimizasyon aşamasında farklı kombinasyonları test edin. Bu karşılaştırmalı analizlerin sonuçları, Tablo 1'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, multipleks panelin nihai bileşimine rehberlik edecek ve seçilen panelin arka planı en aza indirirken optimum performans sağlamasını sağlayacaktır.

3. m-IHC süreci

  1. Mum alma, hidrasyon ve fiksasyon: Doku bölümlerini 60 ° C'de 2 saat pişirin, ardından ksilen I (10 dakika), ksilen II (10 dakika), %100 etanol (5 dakika), %95 etanol (5 dakika), %80 etanol (5 dakika), %75 etanol (5 dakika), ddH2O (3x için 2 dakika), %10 nötr tamponlu formalin (en az 20 dakika), ve ddH2O (3x için 2 dakika).
  2. Antijen alımı: Her antikor için Tablo 1'de listelendiği gibi ilgili AR6 veya AR9 tamponunun 200 mL'sini ısıya dayanıklı bir antijen alma kasetine ekleyin. Bölümleri uygun antijen alma tamponuna yerleştirin ve kaynayana kadar yaklaşık 2 dakika boyunca yüksek güçte bir mikrodalgada ısıtın. Daha sonra kaseti gevşek bir şekilde kapatın, 15 dakika düşük güçte ısıtın ve oda sıcaklığına soğutun. Bölümleri ddH,2, O ve PBST ile durulayın.
  3. Hidrofobik bariyer çizimi: Fazla çözeltiyi emici kağıtla çıkardıktan sonra, hidrofobik bir bariyer kalemi kullanarak dokunun etrafına tam bir daire çizin.
  4. Endojen enzim aktivitesinin inaktivasyonu: Bölümleri% 3 hidrojen peroksit ile tedavi edin ve oda sıcaklığında 8 dakika inkübe edin. PBST 3x ile her biri 2 dakika yıkayın.
  5. Spesifik olmayan bölgelerin bloke edilmesi: Emici kağıtla kuruduktan sonra, bir bloke edici solüsyon (1x Antikor Seyreltici/Blok) uygulayın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
  6. Primer antikor ile inkübasyon: Bloke edici çözeltinin çıkarılmasından sonra, 1x Antikor Seyrelticide 1:1000 seyreltmede her slayta 150 μL birinci primer antikor olan CD49a uygulayın. Bölüm 2'de daha önce optimize edildiği gibi inkübe edin. İnkübasyondan sonra, slaytları PBST 3x ile her biri 2 dakika yıkayın. Kalan antikorlar için, spesifik seyreltme oranları için Tablo 1'e bakınız.
  7. İkincil antikor ile inkübasyon: İkincil antikoru uygulamadan önce, reaktifin seyreltilmesini önlemek için fazla nemi gidermek için emici kağıt kullanın. Her slayta 4-5 damla (yaklaşık 150 μL) 1x Anti-Ms + Rb HRP ikincil antikor ekleyin, ardından oda sıcaklığında 10 dakikalık bir inkübasyon yapın. İnkübasyon sonrası her biri 2 dakika boyunca PBST ile üç yıkama yapın.
    NOT: 1x Anti-Ms + Rb HRP ikincil antikorunun tavşan ve fare birincil antikorları için spesifik olduğunu lütfen unutmayın.
  8. TSA boyası ile sinyal amplifikasyonu: Fazla nemi lekeledikten sonra, TSA boyasını amplifikasyon seyrelticisinde 1:100 oranında seyreltin. Her slayta bu seyreltilmiş TSA boya çözeltisinden 150 μL ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. PBST 3x ile her biri 2 dakika yıkayın.
  9. İlgili antikor ve boyayı kullanarak TSA prosedürü için 3.2 ve 3.5-3.8 adımlarını tekrarlayın.
  10. Boyama çekirdekleri: Son antikoru boyadıktan sonra, ısıya dayanıklı bir kaset içinde 200 mL AR6 tamponunda bölümleri mikrodalgada ısıtarak, 2 dakika kaynatarak, ardından 15 dakika düşük güçte ısıtarak bağlanmamış floroforları ortadan kaldırın. Numuneleri oda sıcaklığına soğutun ve ddH,2O ve PBST ile durulayın. PBST (1:10) içinde damla damla seyreltilmiş 150 μL DAPI çalışma solüsyonu ekleyin, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin ve 2 kez ddH2O ile durulayın.
  11. Montaj: Bölümler karanlık bir alanda yaklaşık 30 dakika boyunca tamamen havayla kurutulduktan sonra, tek bir damla (yaklaşık 30 μL) su verme önleyici floresan montaj aparatı uygulayın ve lameller yerleştirin.
    NOT: TSA boyasının ilk uygulamasından sonra tüm işlemleri ışıktan koruyun. Hızlı gözlem ve görüntü yakalama, floresan söndürmeyi önlemek için boyama sonrası tamamlama konusunda çok önemliydi.

4. Görüntü elde etme ve analiz etme

  1. Pozlama süresi: Floroforlara karşılık gelen uyarma ve emisyon dalga boylarını devralan bir görüntüleyici kullanarak görüntü yakalayın. Pozlama sürelerini ayarlarken, doğruluğu sağlamak için çok çeşitli işaretleyici ifadelere sahip slaytları kontrol edin. Her işaretçi/filtre kombinasyonu için, slaytın farklı alanlarına manuel olarak odaklanın. Pozlama süresini ayarlamak için Otomatik Pozlama özelliğini kullanın.
  2. TSA boyalarına göre filtreleri seçin ve kanal başına en uygun pozlama sürelerini belirlemek için birden fazla slaytı inceleyin. Görüntüleme boyunca karşılaştırılabilirliği korumak için bu ayarları sonraki tüm alımlara tutarlı bir şekilde uygulayın.
  3. Yakalama alanlarının seçimi: Doku kesitleri arasında tarafsız örnekleme ve analiz edilen her alana luminal epitelin tutarlı bir şekilde dahil edilmesini sağlamak için, kritik kriter luminal epitel sınırının varlığı olmak üzere, görüntü elde etmek için ilk alanı rastgele seçin.
  4. Bu ilk alanın yakalanmasının ardından, çerçeve içindeki luminal epitel sınırını korurken bir alanı başlangıç noktasının soluna veya sağına hareket ettirerek (yakalanan her görüntü arasında bir alanı atlayarak) sonraki alanları sistematik olarak seçin. 14 boyunca tutarlı bir analiz derinliği sağlamak için her biri luminal epitelin en az bir kısmını içeren en az beş farklı alanı yakalamak için bu işlemi tekrarlayın. Bu yaklaşım, kapsamlı ve temsili veri toplamayı sağlamak için yakalanan tüm alanlarda en az yaklaşık 10.000 stromal hücre içermeyi amaçladı.
  5. Görüntü analizi
    1. Görüntü hazırlama: Multispektral görüntüleri içe aktarmak ve analiz etmek için önce dosyaları > Otomatik Floresan (AF) slaytını yüklemek için yazılım arayüzünde Dosya ve Açık Görüntü'ye gidin. Görüntüleri yükledikten sonra, Flor Seç düğmesine tıklayarak ve uygun spektral kitaplığı seçerek floroforları karıştırmaya devam edin. Tüm floroforlar seçildikten sonra, seçimi onaylamak için Tamam'a tıklayın. AF spektrumunu izole etmek için, AF görüntüsünden temsili bir doku alanını örneklemek için AF damlalık aracını kullanın ve doku olmayan pikselleri hariç tutmaya dikkat edin. Örneklemeyi sonra, arayüzün sol alt köşesindeki Görüntüyü Hazırla veya Tümünü Hazırla'ya tıklayın 15.
    2. Doku segmentasyonu: Epitel hücreleri içeren epitel alanları, stromal hücreler içeren stromal alanlar ve hücresel içeriği olmayan boş alanlar dahil olmak üzere, görüntüdeki doku tipi başına 3-5 bölgeden oluşan bir taban çizgisini manuel olarak tanımlayarak segmentasyon sürecini başlatın. İlk segmentasyon sonuçları tatmin edici değilse, eğitim veri kümesini iyileştirmek için ek bölgelere manuel olarak açıklama ekleyin, böylece sonraki analizlerin doğruluğunu ve güvenilirliğini artırın. Bölgelerin ve parametrelerin bu dinamik ayarı, yazılımın mevcut ve diğer içe aktarılan görüntülerdeki benzer yapıları daha yüksek doğrulukla otomatik olarak tanımlayabilmesini sağlar.
      NOT: İlk ek açıklama, yazılımın her bir doku bileşeninin özelliklerini öğrenmesi için bir eğitim veri kümesi görevi görür. Yazılımın segmentasyon yetenekleri daha sonra dokunun karmaşıklığına ve değişkenliğine bağlı olarak yinelemeli olarak rafine edilir.
    3. Hücre Segmentasyonu: Hücre segmentasyonunu başlatmak için Segment Hücreleri'ne tıklayın. Hücre Segmentasyonu Ayarı'nda, Çekirdek ve Zar'ı seçin. Hücre çekirdeklerini tanımlamak için DAPI'yi seçin ve arka plan gürültüsü olmadan tüm hücre çekirdeklerini algılamak için yoğunluk ayarını yapın. Membranı bulmak için CD16, CD49a ve CD56 sinyallerini seçin ve bu sinyali nükleer bölünmeye yardımcı olmak için kullanın. Yakından yerleştirilmiş çekirdekleri ayırt etmek için nükleer bileşen bölme özelliğini kullanın.
      NOT: DAPI, hücrelerin içini vurgular. Nükleer bileşen bölme özelliği, hücre çekirdeklerini birbirine yakın olduklarında veya birleşmiş göründüklerinde ayırt etmeye yardımcı olur. Bu adım, güvenilir hücre sayımları elde etmek ve analizin bütünlüğünü korumak için önemlidir.
    4. Hücre fenotiplemesi: NK hücrelerinin farklı alt tiplerini ayırt etmek için CD56, CD49a, CXCR4 ve CD16 dahil olmak üzere dört farklı hücre yüzeyi markörü benimseyin. Fenotipleme Şemasında, bu dört belirteçleyiciyi devam edecek fenotipler olarak etiketleyin. Görünümü İlişkilendir bölümünde, tanımlama için fenotiplerin her birine belirli renkler atayın. Ekle düğmesini kullanarak, hücreleri işaretçileri pozitif veya negatif olarak ifade edecek şekilde kategorilere ayırın; örneğin, CD56 fenotipinde, hücreler CD56+ veya CD56- olarak etiketlenebilir. Eğitim işlemi sırasında her fenotip için en az beş hücreyi manuel olarak etiketleyin. İlk eğitim etkili sonuçlar vermezse ek manuel etiketleme yapın.
    5. Hücre fenotipleme konfigürasyonu ayarlandıktan sonra, görüntüdeki her hücre, dört yüzey işaretleyicisinin pozitif mi yoksa negatif mi ifade edildiğini gösterecektir. Daha fazla analiz için elde edilen verileri bir elektronik tabloya aktarın.
    6. Veri işleme: Tüm görüntülerden elde edilen verileri işlenmek üzere bir elektronik tabloya aktarın. Görüntüdeki toplam hücre sayısına göre tüm uNK hücre alt türlerinin yüzdelerini hesaplayın. Son hücre sayımı, birden fazla görüntüdeki ortalama sayımı temsil eder ve numune içindeki çeşitli uNK hücre alt tiplerinin popülasyonuna kapsamlı bir genel bakış sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Doğal döngüden geçen kadınlar için endometriyal örnek toplama zamanlamasında tutarlılığı korumak için, LH dalgalanmasından 7 gün sonra yapılan endometriyal biyopsiler ile luteinize edici hormon (LH) dalgalanmasını kesin olarak tespit etmek için bir idrar testi yapıldı. HRT döngüleri geçiren kadınlar için, örnekler progesteron takviyesi başladıktan tam olarak 5 gün sonra planlandı. Endometriyumdaki NK hücrelerinin farklı alt tiplerini ölçmek için m-IHC boyaması kullanıldı. Deneysel prosedürün şematik bir taslağı

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Embriyo implantasyonu, embriyo ve endometriyum arasında karmaşık bir etkileşimi içerir. Endometriyal homeostazın immünolojik durumu, endometriyal alıcılığın belirlenmesinde çok önemli bir rol oynar. WOI sırasında, endometriyumdaki baskın lökosit popülasyonu NK hücreleridir. uNK hücrelerinin yaklaşık% 90'ı yüksek CD56 ekspresyonu sergiler, ancak CD16'dan yoksundur. Bununla birlikte, uNK hücrelerinin küçük bir alt kümesi, düşük CD56 ekspresyonu ancak pozitif CD16 ekspresyonu

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma Sağlık ve Tıbbi Araştırma Fonu (10210956) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
CD49aNovus BiologicalsNBP2-76478Birincil antikorlar
CD56LeicaNCL-L-CD56-504Birincil antikorlar
CD16abcamab183354Birincil antikorlar
CXCR4R& DMAB172Birincil antikorlar
Amplifikasyon seyrelticiAkoya BiosciencesFP1498 serisiFlorofor seyreltme tamponu
Antikor seyrelticileriAkoya BiosciencesARD1001EAAntikoru seyreltin
Sitrat tamponlu çözelti, pH 6.0 /9.0(10x)Akoya BiosciencesA6001/A9001Antijen alma çözeltisi
inForm gelişmiş görüntü analiz yazılımıAkoya BiosciencesinForm Doku Bulucu Yazılımı 2.2.6Veri analiz yazılımı
Mantra İş İstasyonlarıAkoya BiosciencesCLS140089Spektral görüntüleme
mikrodalgaAkoya BiosciencesinvertörMikrodalga sıyırma
TSA 520Akoya BiosciencesFP1487001KUygun tiramid bazlı floresan reaktifler
TSA 620Akoya Biyolojik bilimlerFP1495001KUygun tiramid bazlı floresan reaktifler
TSA 650Akoya BiosciencesFP1496001KUygun tiramid bazlı floresan reaktifler
TSA 570Akoya BiosciencesFP1488001KUygun tiramid bazlı floresan reaktifler
Poli-L-lizin kaplı slaytlarFisher Technologies120-550-15Rutin histolojik kullanım için slaytlar
PolyHRP Geniş SpektrumluPerkin ElmerARH1001EAİkincil antikorlar
Invitrogen & trade;   Fluoromount-G ve ticaret; Montaj OrtamıThemoFisher Science495802Kurulum
Spektral DAPIAkoya BiosciencesFP1490ANükleik asit boyama

Kaynaklar

  1. De Geyter, C. Assisted reproductive technology: Impact on society and need for surveillance. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 33 (1), 3-8 (2019).
  2. State-Specific Assisted Reproductive Technology Surveillance. CDC. , https://www.cdc.gov/art/state-specific-surveillance/2021/index.html (2024).
  3. Busnelli, A., et al. How common is real repeated implantation failure? An indirect estimate of the prevalence. Reprod Biomed Onl. 40 (1), 91-97 (2020).
  4. Ben Rafael, Z. Repeated implantation failure (RIF): an iatrogenic meaningless definition that generates unnecessary and costly use of add-on procedures. Human Reprod. 35 (7), 1479-1483 (2020).
  5. Hanna, J., et al. Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface. Nat Med. 12 (9), 1065-1074 (2006).
  6. Vento-Tormo, R., et al. Single-cell reconstruction of the early maternal-fetal interface in humans. Nature. 563 (7731), 347-353 (2018).
  7. Von Woon, E., et al. Number and function of uterine natural killer cells in recurrent miscarriage and implantation failure: a systematic review and meta-analysis. Human Reprod Update. 28 (4), 548-582 (2022).
  8. Manaster, I., et al. Endometrial NK cells are special immature cells that await pregnancy. J Immunol. 181 (3), 1869-1876 (2008).
  9. Lai, Z. Z., et al. Single-cell transcriptome profiling of the human endometrium of patients with recurrent implantation failure. Theranostics. 12 (15), 6527-6547 (2022).
  10. Coughlan, C., et al. Recurrent implantation failure: definition and management. Reprod BioMed Onl. 28 (1), 14-38 (2014).
  11. Chen, X., et al. Measurement of uterine natural killer cell percentage in the periimplantation endometrium from fertile women and women with recurrent reproductive failure: establishment of a reference range. Am J Obst Gyneco. 217 (6), 680.e1-680.e6 (2017).
  12. Yang, W. J., et al. A comparison of uterine natural killer cell density in the peri-implantation period between natural cycles and hormone replacement therapy cycles. Am J Reprod Immunol. 82 (3), e13156(2019).
  13. Syed, J., et al. Multiplex immunohistochemistry: The importance of staining order when producing a validated protocol. Immunother. 5 (2), 1-9 (2019).
  14. Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. J Reprod Immunol. 116, 50-59 (2016).
  15. Mansfield, J. R., Gossage, K. W., Hoyt, C. C., Levenson, R. M. Autofluorescence removal, multiplexing, and automated analysis methods for in vivo fluorescence imaging. J Biomed Optics. 10 (4), 41207(2005).
  16. Hoyt, C. C. Multiplex immunofluorescence and multispectral imaging: Forming the basis of a clinical test platform for immuno-oncology. Front Mol Biosci. 8, 674747(2021).
  17. Von Woon, E., et al. Number and function of uterine natural killer cells in recurrent miscarriage and implantation failure: a systematic review and meta-analysis. Human Reprod Update. 28 (4), 548-582 (2022).
  18. Lee, J. Y., Lee, M., Lee, S. K. Role of endometrial immune cells in implantation. Clin Exp Reprod Med. 38 (3), 119-125 (2011).
  19. Gothe, J. P., de Mattos, A. C., Silveira, C. F., Malavazi, K. C. Exploring natural killer cell testing in embryo implantation and reproductive failure: An overview of techniques and controversies. Reprod Sci. 31 (3), 603-632 (2024).
  20. Russell, P., et al. The distribution of immune cells and macrophages in the endometrium of women with recurrent reproductive failure: I: Techniques. J Reprod Immunol. 91 (1), 90-102 (2011).
  21. Wang, W., Sung, N., Gilman-Sachs, A., Kwak-Kim, J. T. Helper (Th) cell profiles in pregnancy and recurrent pregnancy losses: Th1/Th2/Th9/Th17/Th22/Tfh cells. Front Immunol. 11, 2025(2020).
  22. Nagamatsu, T., Schust, D. J. The contribution of macrophages to normal and pathological pregnancies. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 460-471 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Uterin NK HücreleriMultiplex İmmünohistokimyaİmmün Hücre Alt TipleriFlorasan BoyamaEndometrial DokuHücre FenotiplemesiCD49a MarkörüCXCR4 MarkörüDoku Segmentasyonu
Tekrarlayan İmplantasyon Başarısızlığı Olan Kadınlarda Çoklanmış Floresan İmmünohistokimyasal Boyama Kullanılarak Dört Uterin NK Hücre Alt Tipinin Ölçümü
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.