Yöntem makalesi

Midye (Mytilus galloprovincialis) Hemosit Motilitesine Dayalı Toksikolojik ve Ekotoksikolojik Bir Test

1.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67285

⸱

13 Aralık 2024

 ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences and Technologies (DiSTeBA), University of Salento, 2NBFC, National Biodiversity Future Center

Bu makalede

Özet

Makale, Mytilus galloprovincialis hemositlerinin motilitesine dayalı olarak kirleticilerin toksisitesinin ve ekotoksisitesinin hızlı ve hassas bir şekilde değerlendirilmesi için yeni bir in vitro yöntem önermektedir. Yöntem, daha etik ve hassas toksikolojik ve ekotoksikolojik maruziyet testlerinin geliştirilmesine katkıda bulunmayı amaçlamaktadır.

Özet

Hemositler, çift kabuklu yumuşakçalarda dolaşımdaki bağışıklığı yetkin hücrelerdir ve hücre aracılı doğuştan gelen bağışıklığın birçok önemli işlevinde anahtar rol oynarlar. Bağışıklık tepkisinin erken aşamalarında, hemositler aktif olarak enfeksiyon bölgesine göç eder. Bu doğal hareketlilik, bu hücrelerin temel bir özelliğidir. Hücre yapışması, hücre sinyalizasyonu, hücre iskeleti dinamikleri ve hücre hacmindeki değişiklikler gibi çoklu süreçleri entegre eden önemli bir hücresel işlevi temsil eder. Bu nedenle, ilaçlara veya kirleticilere maruz kaldıktan sonra hücre motilitesindeki değişiklikler, yararlı bir toksikolojik son nokta olarak hizmet edebilir. Hücre motilitesinin hücresel fizyolojideki temel rolüne rağmen, toksikolojik açıdan zayıf bir şekilde araştırılmıştır. Bu çalışma, Mytilus galloprovincialis'in hemosit motilitesinin değerlendirilmesine dayalı olarak, kirleticilerin toksisitesinin ve ekotoksisitesinin hızlı ve hassas bir şekilde değerlendirilmesi için yeni bir in vitro yöntem önermektedir. 96 oyuklu bir polistiren mikroplakanın dibine yapışan hemositler üzerinde bir hücre motilite testi geliştirdik. Artan ilaç konsantrasyonlarına maruz kaldıktan sonra, hücre yörüngeleri ve hızları, hızlandırılmış mikroskopi altında hücre takibi ile ölçüldü ve bu da hemosit motilitesi üzerindeki etkileri ölçmemize izin verdi. Hayvanlardan nispeten non-invaziv bir şekilde hemosit toplama kolaylığı nedeniyle, önerilen yöntem, kirleticilerin ve ilaçların etkilerini ve etki mekanizmalarını taramak için alternatif bir test sunmaktadır. 3R (Değiştirme, Azaltma ve İyileştirme) kriterleriyle uyumludur, etik kaygıları ele alır ve omurgalı in vivo hayvan testlerinin azaltılmasına katkıda bulunur.

Giriş

İn vitro ve in vivo biyotahliller gibi etkiye dayalı yöntemler, çevresel kimyasal kirleticilerin canlı organizmalardaki etkilerinin tespiti ve bunların çevresel izleme ve risk değerlendirmesinde araç olarak kullanılması için yenilikçi araçları temsil etmektedir 1,2,3,4. Bazı sınırlamalarının üstesinden gelerek klasik analitik kimyasal yaklaşımı tamamlarlar. Örneğin, etkiye dayalı yöntemler, kirleticilerin biyoyararlanımını, organizma sağlığı üzerindeki etkilerini ve karışımların birleşik toksikolojik etkilerini değerlendirebilir. Bu birleşik etkiler, yalnızca kimyasal analize dayalı olarak tahmin edilemeyebilir5.

Son yıllarda, ortaya çıkan endişe verici kirleticilerin (ortaya çıkan kirleticiler) ekotoksikolojisi, etkiye dayalı yöntemlerin maruziyeti tespit etmek ve biyota üzerindeki etkiyi değerlendirmek için yararlı araçlar olabileceği bir alanı temsil etmektedir 1,5,6,7. Çeşitli etkiye dayalı yöntemler, çevresel izleme ve değerlendirmede test organizmaları olarak çift kabuklu yumuşakçaları kullanır 8,9. Geniş dağılımları, filtreyle beslenen yapıları, sapsız yaşam tarzları, çok çeşitli çevresel kirleticilerin biyoakümülasyon yeteneği ve kirleticilere karşı saptanabilir yanıtlar geliştirebilmeleri, farklı yaşam evreleri ile çalışabilme ve laboratuvar koşullarında idame ettirebilmeleri gibi bazı özellikler bu organizmaları ekotoksikolojik çalışmalar için uygun kılmaktadır7. Kirliliğe maruz kalmaya karşı oldukça hassastırlar ve türe, yaşam evresine ve çevresel koşullara bağlı olarak toksik kirleticilere karşı çeşitli tepkiler gösterirler 8,9,10. Bu nedenle, çeşitli çevresel yönergeler, standart test türleri olarak çift kabuklu türleri kullanır10,11.

Çift kabuklu yumuşakçalar arasında, yaygın Mytilus galloprovincialis, metallotiyonin indüksiyonu, antioksidan enzim değişikliği, lizozomal membran destabilizasyonu, lipid peroksidasyonu, lipofusin birikimi, artmış mikronükleus frekansı, karbonik anhidraz indüksiyonu 12,13,14, 15. İmmün yetmezliği olan hemolenfatik hücreler olan hemositler, çift kabuklu yumuşakçalarda çevresel kirleticilerin toksikolojik etkilerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır 4,13,16,17. Bu hücreler, organizmanın bağışıklık tepkisi için çok önemlidir ve hücre aracılı doğuştan gelen bağışıklığın birkaç önemli işlevini yerine getirir. Bunlar, mikropların fagositoz yoluyla ortadan kaldırılmasını ve lizozomal enzimlerin, anti-mikrobiyal peptitlerin salınması ve solunum patlaması sırasında oksijen metabolitlerinin üretimi gibi çeşitli sitotoksik reaksiyonları içerir 18,19,20. Hemositler, organizmanın bağışıklık tepkisinin erken evresinde enfeksiyon bölgesine göç edebilen içsel olarak hareketli hücrelerdir 21,22,23. Genel olarak motilite, vücudu korumak için bu hücrelerin immünosürveyansını sağladığı için tüm bağışıklık hücrelerini karakterize eden temel bir özelliktir24. Çeşitli yumuşakça türleri üzerinde yapılan araştırmalar, hemosit motilitesinin bağışıklık tepkilerinin, yara iyileşmesinin ve patojenlerle etkileşimlerinin kritik bir bileşeni olduğunu göstermektedir. Bu motilite, yumuşakçalarda hemosit fonksiyonlarının karmaşıklığını ve uzmanlaşmasını vurgulayan spesifik moleküler yollar tarafından düzenlenir 21,25,26,27.

Hemositlerin fizyolojisinde motilitenin temel önemine rağmen, hemosit motilitesinin çevresel kimyasal kirleticilere duyarlılığını araştıran çok az çalışma vardır 23,28,29,30. Son zamanlarda, grubumuz Mytilus galloprovincialis hemositlerinin doku kültürü ile tedavi edilmiş polistiren 96 oyuklu mikroplakada spontan hareketini karakterize etti ve hemosit motilitesinin parasetamol23'e in vitro maruziyete duyarlılığını inceledi. M. galloprovincialis hemositleri, daha önce başka bir midye türü olan Mytilus edulis 21,22,23,28'de bulunan ve insan bağışıklık hücrelerinde31 zaten tarif edildiği gibi, lamellipodia ve hızlı şekil değişikliklerine dayalı rastgele benzeri bir hücre hareketi gösterdi. Hemosit motilitesinin son zamanlarda kimyasal stres faktörlerine duyarlı olduğu gösterilmiştir23,28. Bu önceki bulgulara dayanarak, bu çalışma, hücre motilitesinin velosimetrik analizi (ortalama hızın ölçülmesi, göç edilen mesafe, Öklid mesafesi ve doğrudanlık) yoluyla M. galloprovincialis hemositlerinin ve değişikliklerinin motilitesinin değerlendirilmesine dayalı olarak kirleticilerin toksisitesinin ve ekotoksisitesinin hızlı ve hassas bir şekilde değerlendirilmesi için yeni bir in vitro yöntem önermektedir. Yöntem, kısa süreli tahlillerde (1-4 saat süren) veya 24-48 saat süren uzun süreli maruz kalma tahlillerinde çeşitli maddelerin toksisitesini in vitro tarama imkanı sunar.

Protokol

Tüm deneyler, Avrupa Komitesi Konseyi Direktifi'ni (2010/63 EEC) uygulayan İtalyan Hayvan Refahı mevzuatı (D.L.26/2014) kapsamında gerçekleştirilmiştir. Mytilus galloprovincialis , yaygın olarak Akdeniz midyesi olarak bilinen, filtreyle beslenen bir çift kabukludur. Akdeniz'e ve güney Avrupa'nın Atlantik kıyılarına özgüdür. Batı Kuzey Amerika, Asya ve Güney Afrika'da tanıtıldı ve yaygın. Dünyanın çeşitli yerlerinde önemli bir ticari balıkçılık türüdür. Reaktiflerin ve kullanılan ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Yapay deniz suyu (ASTM) veya filtrelenmiş doğal deniz suyunun hazırlanması

  1. ASTM D1141-98 (2021)32'ye göre yapay deniz suyu ASW'nin hazırlanması için, aşağıdaki tuzları damıtılmış suda (1 L için g) çözün: 27.65 NaCl, 0.133 NaHCO3, 3.33 MgCl2· 6H2O, 2.66 Na2SO4, 0.733 CaCl2 · 2H2O, 0.466 KCl, 0.067 KBr, 0.02 H3BO3, 0.013 SrCl2·6H2O, 0.0019 NaF. ASW çözeltisinin pH'ı 7.80'dir.
  2. Filtrelenmiş doğal deniz suyunun (FSW) hazırlanması için, antropojenik faaliyetlerden etkilenmeyen bir alandan toplanan doğal deniz suyunu 37 PSU'yu 0,2 μm filtrelerle filtreleyin.

2. Hayvan iklimlendirmesi

  1. Yetişkin midye örneklerini (Mytilus galloprovincialis Lam.) deneysel kullanımdan önce termostatik bir odada 15 ° C'de havalandırılmış ASW veya FSW (1 L / hayvan) içeren statik tanklarda (açlık halinde) 24 saat iklimlendirin.

3. Hemosit motilite değerlendirmesi için reaktif hazırlığı

  1. Yukarıdaki gibi filtrelenmiş deniz suyu (FSW) veya standart fizyolojik tuzlu su (SPS) hazırlayın. HEPES (4- (2-hidroksietil) -1-piperazin-etansülfonik asit) 4.77 g, NaCl 25.48 g, MgSO4 13.06 g, KCl 0.75 g, CaCl2 1.47 g yaklaşık 800 mL damıtılmış su içinde çözün, daha sonra daha fazla damıtılmış su ilavesiyle 1 L'ye kadar yapılır. 1 M NaOH ile pH'ı 7,36'ya ayarlayın.
  2. Dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 20 mg / mL'lik bir Nötr Kırmızı stok çözeltisi hazırlayın.
  3. Nötr Kırmızı boyama çözeltisi hazırlayın: 995 μL FSW veya SPS'ye 5 μL Nötr Kırmızı stok çözeltisi ekleyin.
  4. 2 mM L-glutamin, 40 IU/mL penisilin G ve 100 μg/mL streptomisin ile takviye edilmiş FSW veya SPS'yi aşağıdaki gibi hazırlayın: 10 mL FSW/SPS'ye 100 μL 2 mM L-glutamin ve 100 μL Penisilin / Streptomisin karışımı ekleyin.
  5. FSW veya SPS'de %0,4 Tripan mavisi hazırlayın.
    NOT: Nötr Kırmızı stok çözeltisi Martínez-Gómez ve ark.33'e göre hazırlanmıştır. Nötr Kırmızı stok çözeltisi, 4 °C'de saklandığında yaklaşık 2-3 hafta dayanır. Nötr Kırmızı boyama solüsyonu ve% 0.4 Tripan mavisi testten hemen önce hazırlanmalıdır.

4. Hemolenf örneklemesi

  1. Bir şırıngayı 0,5 mL filtrelenmiş deniz suyu FSW veya standart fizyolojik tuzlu su SPS (15 ° C'de) ile önceden doldurun.
  2. Ventral yüzey boyunca valfleri bir neşter ile hafifçe ve dikkatlice ayırın. Neşteri yerinde tutun veya bir pipet ucu kullanın. Hipodermik bir şırınga iğnesinin valfler arasındaki boşluğa girmesine izin verin.
  3. UNEP / RAMOGE34'e göre önceden doldurulmuş şırınga ile arka adduktor kasından yavaşça 0,5 mL hemolenf toplayın.
  4. İğneyi şırıngadan çıkarın ve şırınganın içeriğini bir mikrotüpe aktarın.
  5. Hemolenfleri 3-4 midyeden toplayın ve hemolenf örneklerini bireyler arasında aynı oranı kullanarak 15 ° C'de bir tüpte bir araya getirin.
    NOT: Şırınganın önceden doldurulması, örnekleme sırasında hemolenfin hemen 1:1 oranında seyreltilmesi için kullanılır. Martínez-Gómez ve ark.33'e göre, hemolenfin FSW veya SPS ile 50:50 oranında seyreltilmesi, hemosit agregasyonunu önlemek için yaygın olarak kullanılır.

5. Hemosit kaplama ve kültürü

  1. Hücreleri bir hemositometre ile sayın.
  2. Hemolenfi FSW veya SPS ile 1 × 106 hücre / mL konsantrasyonda seyreltin.
  3. Tripan mavisi boyama ile süspansiyondaki hemositlerin canlılığını değerlendirin: 100 μL hemosit süspansiyonuna FSW veya SPS içinde çözülmüş 100 μL% 0.4 Tripan mavisi ekleyin. 15 °C'de 5 dakika inkübe edin.
  4. Daha sonra, bir hemositometreye bir damla süspansiyon ekleyin ve mikroskopi gözlemi altında lekelenmemiş (canlı) ve lekeli (cansız) hücreleri sayın.
  5. Hemosit canlılığını, sayılan toplam hücre sayısı35 üzerinden hesaplanan canlı hücrelerin yüzdesi olarak değerlendirin.
  6. Hücre canlılığı değerlendirmesi için aşağıdaki formülü kullanın35:
    Canlı hücreler (%) = [canlı hücre sayısı/toplam hücre sayısı (canlı + canlı olmayan)] x 100
  7. Protokolde daha fazla ilerlemek için hemosit canlılığının %95'ten yüksek olduğundan emin olun.
  8. 96 oyuklu düz tabanlı polistiren TC ile muamele edilmiş mikroplakanın her bir oyuğuna 50 μL seyreltilmiş hemolenf ekleyin. Plakayı kapağıyla örtün.
  9. Tek tabaka oluşturmak için hemositlerin 15 ° C'de 30 dakika boyunca kuyucukların dibine yapışmasına izin verin.
  10. Bir mikropipet ile hafifçe aspire ederek fazla hemolenfi çıkarın.

6. Kısa süreli tahlil

  1. Kısa süreli tahliller için (1-4 saat içinde), kuyucukların dibine yapışan hücreleri, 15 ° C'de farklı konsantrasyonlarda FSW veya SPS'de çözülen 100 μL ilgili madde ile hemen inkübe edin. Her deneysel koşulun üç tekrarlanan belirlemesi için en az üç kuyu kullanın.
  2. İnkübasyondan sonra, adım 8'i izleyerek hücre motilitesini değerlendirin.

7. Uzun süreli maruz kalma testi

  1. Uzun süreli maruziyetler için, yani 24-48 saatlik maruziyet deneyleri, kültürlenmiş yapışık hücreleri, 2 mM L-glutamin 40 IU / mL penisilin G ve 100 μg / mL streptomisin ile desteklenmiş kültür ortamında (FSW veya ASW) çözünen test maddesinin artan konsantrasyonları ile inkübe edin. Her deneysel koşulun üç tekrarlanan belirlemesi için en az üç kuyu kullanın.
  2. İnkübasyondan sonra, adım 8'i izleyerek hücre motilitesini değerlendirin.

8. Hızlandırılmış mikroskopi ile hücre motilite değerlendirmesi

  1. Yapışık canlı hemositleri içeren çok kuyulu plakayı çok modlu bir okuyucuya yerleştirin.
  2. Zaman atlamalı mikroskopi ile plaka üzerinde gerçek zamanlı görüntüleme ile yapışık canlı hücrelerin hareketliliğini değerlendirin: 20x büyütme ve renkli parlak alan görselleştirme altında çok modlu okuyucuyu kullanarak 10 dakika boyunca her 1 dakikada bir 1 görüntü hızında her bir oyukta aynı ilgi bölgesinin (ROI) (kullanılan ROI boyutu: 720μm x 720μm) görüntülerini yakalayın.
  3. Hemositlerin daha iyi görselleştirilmesi için, hücreleri hızlandırılmış mikroskopiden hemen önce hayati boya Nötr Kırmızı ile aşağıdaki gibi boyayın:
    1. Kuluçka ortamını her kuyucuktan çıkarın.
    2. Yapışan hücreleri içeren plakanın kuyucuklarına, ilgilenilen maddeyi içeren standart fizyolojik tuzlu su içinde çözülmüş 100 μL Nötr Kırmızı boyama çözeltisi ekleyin.
    3. Hücreleri 15 ° C'de 15 dakika inkübe edin. Fazla boyayı yıkayın.
    4. FSW veya SPS'de çözülen ilgilenilen maddeden 100 μL ekleyin. Hareketlilik değerlendirmesi için hücreleri görselleştirin.
      NOT: Çok modlu bir okuyucunun kullanılması, çok sayıda kuyudan görüntülerin aynı anda alınmasına izin vererek, kuyuda bulunan tüm deneysel koşulların ve kopyaların aynı anda motilite tespitine izin verir. Nötr kırmızı boya, sitoplazmada küçük turuncu lekeler olarak görünen lizozomların içinde tutulurken, çekirdek, asidofilus hayati boyası onu lekelemediği için yarı saydam bir delik olarak görünür. Görüntü alımı, 20 °C'lik bir oda sıcaklığında 10 dakika boyunca yapıldı.

9. Hücre izleme ve velosimetrik parametrelerin hesaplanması

  1. Her kuyucuk için Görüntü J ile hızlandırılmış mikroskopi altında elde edilen aynı ilgi bölgesinin çerçevelerini analiz edin.
  2. Görüntüleri, adında boşluk kalmayacak şekilde bir klasöre kaydedin. Görüntüler JPEG veya PNG formatında olabilir.
  3. ImageJ'yi açın. Görüntü dizisini içe aktarmak > > dosyaya tıklayın.
  4. ImageJ'in Manuel İzleme eklentisini kullanarak tek hücrelerde hücre takibi gerçekleştirin. Tek tek hücrelerin konumları, zaman içindeki konumsal değişikliklerin izlenmesine olanak tanıyan ardışık görüntülerde işaretlenir.
  5. Analizden kaydedilen alandan kaçan hücreleri hariç tutarak kuyu başına en az 40 hücreyi analiz edin.
  6. Veri Kümelerini ImageJ eklentisi olan "Manuel İzleme"den ücretsiz olarak kullanılabilen Chemotaxis ve Migration Tool yazılımına aktarın.
  7. Ortalama hız, Öklid mesafesi, göç edilen mesafe ve doğrusallık gibi velosimetrik parametreleri, yazılımın36ücretsiz olarak sunulan Kullanım kılavuzunda veya aşağıda verilen adımlarda bildirilen ayrıntılı talimatlara göre Kemotaksis ve Migrasyon Aracı yazılımını kullanarak ölçün:
    1. Veri kümelerini ImageJ eklentisi "Manuel İzleme"den Chemotaxis ve Migration Tool yazılımına aktarın.
    2. İstediğiniz dilim sayısını seçin (örneğin, izleme için kullanılan görüntü sayısı).
    3. x/y piksel boyutunu ve zaman aralığını ayarlayarak yazılımı kalibre edin. x/y kalibrasyonu, bir pikselin kenar uzunluğunu μm cinsinden gösterirken, zaman aralığı her dilim arasındaki süreyi temsil eder.
    4. Değerleri ve parametreleri ayarladıktan sonra Ayarları Uygula'ya tıklayın.
    5. Yörüngeleri çizin ve görüntü olarak dışa aktarın. Ölçülen değerleri görmek için Ölçülen değerler düğmesine tıklayın. Kaydet onu.
    6. İstatistikler düğmesine tıklayın ve parça serisinin hızını ve doğrudanlığını kaydedin.
  8. Kontrol hücreleri için hesaplanan velosimetrik parametreleri, test maddesine farklı konsantrasyonlarda maruz kalan hemositlerinkilerle karşılaştırın.
    NOT: Göç edilen mesafe (μm cinsinden ölçülür), gözlem süresi boyunca (10 dakika) göç yolunun uzunluğunu ifade eder. Öklid mesafesi (μm cinsinden de ölçülür), hücrenin başlangıç noktası ile bitiş noktası arasındaki düz çizgi mesafesini temsil eder. Ortalama hız (μm min-1 olarak ifade edilir), taşınan mesafenin her hücre için hücre izleme süresine oranı olarak hesaplanır. Doğrudanlık, Öklid mesafesinin her yörünge için biriken mesafeye oranı olarak tanımlanır.

Sonuçlar

Çalışma, Mytilus galloprovincialis hemositlerinin motilitesini kullanarak, kirleticilerin toksisitesini ve ekotoksisitesini hızlı ve hassas bir şekilde değerlendirmek için yeni bir in vitro yöntem sunmaktadır. Şekil 1A-C, kuyu dibine 30 dakika bağlandıktan sonra hemositlerin temsili hızlandırılmış görüntülemesini göstermektedir. Şekildeki hücreler, motilite değerlendirmesinden hemen önce Nötr Kırmızı ile boyandı. Hücre hareketleri, çok modlu bir okuyucu ile 20x büyütme altında, 10 dakika boyunca dakikada bir görüntü hızında optik mikroskopi kullanılarak izlendi. Şekil 1A-C, 0 dakika, 5 dakika ve 10 dakikada aynı ilgi bölgesinden (ROI) yakalanan 11 kareden üçünü gösterir. Aynı hücreler, hareketlerini vurgulamak için her üç şekilde de numaralandırılmıştır ve numaralandırma, yörüngelerini açıkça göstermek için şekiller arasında tutarlı kalır.

Hücreler, lamellipodia aktivitesine ve hızlı şekil değişikliklerine bağlı olarak tek hücreli hareketler gösterir. Hücreler, izleme sırasında görselleştirmelerini iyileştirmek için hayati boya Nötr kırmızı ile etiketlendi. Nötr kırmızı, hücre zarına kolayca nüfuz edebilen amfifilik ve zayıf katyonik bir boyadır. Hücrelerin içine girdikten sonra, boya protonasyon nedeniyle lizozomlarda sıkışıp kalır. Midye hemositleri, özellikle granülositler, iyi gelişmiş bir lizozomal sistem gösterir; bu nedenle, sitoplazma birkaç kırmızı etiketli lizozom açısından zengin ve çekirdek (boya tarafından işaretlenmemiş) yarı saydam bir delik olarak görünecek şekilde Nötr Kırmızı boyama ile iyi bir şekilde görselleştirilirler.

Protokolün uygulanmasıyla, Udayan ve ark.23'e göre iki ana hemosit morfotipi gözlemlenebilir: (1) bipolar fasulye şeklinde ve bazen amip anahatlı yayılmış hücreler ve daha küçük yuvarlak yıldız şekilli hücreler (hücreler n = 3 ve 10). Her iki hücre tipinde de hareket, psödopodia ve filopodia'nın devam eden uzaması ve geri çekilmesi ile sürekli şekil değişiklikleri ile karakterize edildi.

Protokol uygulaması, Şekil 2'de bildirildiği gibi yörünge grafikleri oluşturarak ve ortalama hız ve doğrudanlık gibi ana velosimetrik parametreleri hesaplayarak hemosit motilitesinin başarılı bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır. Bunlar, yayılmış hücreler için sırasıyla 6.46 ± 0.2 μm/dk ve 0.56 ± 0.02'ye (ortalama ± SEM) ve küçük hücreler için sırasıyla 5.18 ± 0.34 μm/dk ve 0.37 ± 0.03'e karşılık geldi, kuyu dibine 30 dakika bağlandıktan sonra bazal fizyolojik koşullar altında. Bu nedenle protokol, velosimetrik parametrelere dayalı olarak farklı hemosit popülasyonlarının sınıflandırılmasına izin verir.

Protokolün uygulanmasıyla, ilaçlara veya kirleticilere maruz kaldıktan sonra hemosit motilitesinin velosimetrik parametresindeki değişiklikler tespit edilebilir. Şekil 3A-D, midye hemositlerinin, tüm dünyadaki nehirlerde en yüksek konsantrasyona ve en yüksek tespit frekanslarına sahip çevreye (PiE) salınan farmasötiklerden biri olan parasetamole in vitro maruziyetinin temsili sonuçlarını göstermektedir31.

Udayan ve ark.23'e göre, kontrol hücrelerinde, her iki hücre morfotipinde de zamanla hızda önemli bir artış gözlendi, bu da 24 saatlik kültür sırasında hemositlerin aktivasyonunu düşündürüyor, bu da muhtemelen kültür ortamında geri çekilme ve kaplama ile deneysel olarak indüklenen enflamatuar yanıtı çağrıştırıyor. Hücreler ilaca maruz kaldığında, hemositlerin motilite aktivasyonu, 24 saat sonra yayılmış hücrelerde (Şekil 3A) önemli ölçüde azalmıştır, ancak daha düşük bir ortalama bazal hız ile karakterize edilen küçük yuvarlak hücrelerde (Şekil 3C) önemli ölçüde azalmıştır (zaman 0'da değerlendirildiği gibi). Ek olarak, protokol, 24 saat sonra küçük hücrelerin doğrudanlığındaki önemli artış ve yayılmış hücrelerde 1 saat maruz kaldıktan sonra doğrudanlıktaki azalma ile gösterildiği gibi, ilaca maruz kalmayı takiben hücre yörüngesi değişikliklerinin tespit edilmesine izin verdi (Şekil 3C, D).

figure-results-1
Şekil 1: Kuyu dibine 30 dakika bağlandıktan sonra nötr kırmızı lekeli hemositlerin temsili hızlandırılmış görüntülemesi. Hücreler, motilite değerlendirmesinden hemen önce hayati boya olan Nötr Kırmızı ile boyandı. Hücre hareketleri, 20x büyütme altında 10 dakika boyunca dakikada bir görüntü hızında optik mikroskopi kullanılarak izlendi. Kısaltmak için, A, B ve C panelleri, aynı ilgi alanından (ROI) 0 dakika, 5 dakika ve 10 dakikada yakalanan 11 kareden üçünü görüntüler. Aynı hücreler, hareketlerini göstermek için her üç şekilde de numaralandırılmıştır ve oklar zaman aralıklarını gösterir. Ölçek çubukları 100 μm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: M. galloprovincialis hemositlerinin temsili yörünge grafiği. Gösterilen yörüngeler tek bir kuyudan geliyor. 25 hücrenin yörüngeleri gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Parasetamol maruziyetinin (24 saat) yayılmış hücrelerin (A,B) ve küçük yuvarlak yıldız şeklindeki hücrelerin (C,D) hızı ve doğrudanlığı üzerindeki etkisi. Veriler ortalama ± SEM olarak ifade edilir. Verilerin istatistiksel anlamlılığı tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve Tukey'in son testi ile değerlendirildi. *p < 0,05'e karşı. kontrol (p < 0.05). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu çalışmada açıklanan protokol, M. galloprovincialis hemositlerinin ve değişikliklerinin motilitesinin değerlendirilmesine dayalı olarak ilaçların ve kirleticilerin toksisitesinin hızlı ve hassas bir şekilde değerlendirilmesi için uygun yeni bir in vitro yöntemi temsil etmektedir. Motilite, bu hücrelerin 21,22,23,37,38 bağışıklık fonksiyonunun kendine özgü bir yönüdür, bu nedenle hücre hareketliliğindeki herhangi bir değişiklik, bu hücrelerin bağışıklık fonksiyonundaki değişikliklere işaret edebilir. Motilite, hücre yapışması, hücre sinyalizasyonu, hücre iskeleti aktivitesi, hücre içi sinyalleme ve hücre hacmi regülasyonu gibi çeşitli hücresel süreçleri entegre eden ve karmaşık biyokimyasal ve biyomekanik sinyallerin entegrasyonunu ve koordinasyonunu gerektiren temel bir hücresel işlevdir 39,40,41. Bu süreçlerin her biri veya her bir sürecin bileşenleri, ilaçların ve kirleticilerin toksik etkisinin potansiyel hedefleri olabilir. Bu nedenle, hücre hızındaki ve/veya yörüngesindeki motilitedeki değişiklikler, çoklu hücresel hedefler üzerindeki etkileri entegre eden hassas uç noktaları temsil eder.

Protokol, kısa süreli tahlillerde (1-4 saat süren) veya 24-48 saat süren uzun süreli maruz kalma tahlillerinde test maddelerinin etkilerinin in vitro değerlendirmesi için uygundur ve kirleticilerin ve ilaçların potansiyel toksik etkiler açısından hızlı bir şekilde taranmasını sağlar. Yöntem, 96 oyuklu bir plaka kullanarak, birden fazla maddenin veya tek bir maddenin değişen konsantrasyonlarının aynı anda test edilmesini kolaylaştırır, böylece zamandan ve reaktiflerden tasarruf sağlar. Ek olarak, protokol, faz kontrast mikroskobu veya floresan mikroskobu gibi diğer ekipmanlarla birlikte kullanılmak üzere de uyarlanabilir. Bu durumda, hücreler herhangi bir leke olmadan veya floresan hayati boyalar kullanılarak görüntülenebilir.

Yöntem, toksikolojik tarama için yeni ve hassas alternatifler sunarken, daha geniş uygulamalar için yöntemin bazı sınırlamalarının dikkate alınması gerekmektedir. İlk olarak, protokol uygulamasının kritik bir yönü sıcaklıktır. Midye hemositlerinin sıcaklık değişimlerine duyarlı olduğu bilinmektedir. Sıcaklığın hemositler üzerindeki etkileri karmaşıktır, yüksek ve düşük sıcaklıklar bağışıklık fonksiyonlarını olumsuz yönde etkiler 42,43,44. Yöntem kurulumu sırasında gözlemlendiği gibi, sıcaklığın hücre motilitesi üzerindeki etkisi ile ilgili kritik aşama, organizmaların iklimlendirme sıcaklığını takip etmesi gereken substrat üzerinde hücre toplama, yapışma ve yetiştirmenin ön aşamasıdır. Bu ilk aşamada, iklimlendirme sıcaklığının üzerindeki birkaç derecelik sıcaklık artışları, yayılmış hücre şeklini ve hareketliliğini elde etmek için kritik olabilir. Bu nedenle hemosit kültürü için 15 °C'lik bir sıcaklık önerilmektedir. Motilite değerlendirmesi için hızlandırılmış görüntü alımı, 20 °C'lik bir oda sıcaklığında 10 dakika boyunca yapıldı. Yöntem kurulumu sırasındaki ön gözleme dayanarak, kültürlenmiş hücrelerin bu zaman aralığı için 20 ° C'de maruz kalması, hemosit motilitesini önemli ölçüde değiştirmez. Yöntemin bir başka sınırlaması, kullanıcıya bağlı değişkenliğe neden olabilen ve ayrıntılara önemli ölçüde zaman ve dikkat gerektiren hemositlerin manuel olarak izlenmesini içerir. Bununla birlikte, hayati boya nötr kırmızının kullanılması, hücrelerin görselleştirilmesini ve buna bağlı olarak iyi gelişmiş lizozomal sistemin görselleştirilmesi yoluyla hücre takibini iyileştirir. Çekirdek boya tarafından lekelenmez ve hücre manuel takibi sırasında kolayca tanınabilen ve kolayca işaret edilebilen boş bir delik olarak görünür. Yöntemin bir diğer sınırlaması da in vitro doğası ile ilgilidir. İn vitro durum, motiliteyi değerlendirmek için kontrollü bir ortam sağlarken, özellikle tüm organizma bağışıklık tepkileri içinde, in vivo olarak meydana gelen karmaşık etkileşimleri ve yanıtları tam olarak kopyalayamayabilir.

Son yıllarda, sonuçları iyileştirmeyi ve hayvan testlerine olan bağımlılığı azaltmayı amaçlayan yeni yaklaşımlar ve metodolojiler yaşam bilimlerinde yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır45. Protokol, çevresel matrislerde tek tek veya karışımlar halinde bulunan kimyasal kirleticilerin toksikolojik etkilerini hızlı bir şekilde taramak için kirleticilerin ve ilaçların etkilerinin ve etki mekanizmalarının in vitro taraması için alternatif bir hassas test sunar. İlaçlar ve kirleticiler tarafından çeşitli hücresel hedefler üzerinde uygulanan toksikolojik etkilere entegre bir yanıt sağlayabilen yeni bir son nokta olan bağışıklık sistemi hücrelerinin hareketliliğine odaklanır. Bu anlamda, literatürde mevcut olan in vitro testlerin yelpazesini, çevresel biyoizlemede uygulama için entegre bir çoklu tahlil yaklaşımı perspektifinden de genişletmektedir. Protokolün bazı özellikleri, onu 3R'nin (Değiştirme, Azaltma ve İyileştirme) kriterleriyle uyumlu hale getirerek, omurgalıların in vivo hayvan testlerinin azaltılmasına ve daha etik ve verimli toksikolojik ve ekotoksikolojik maruziyet toksisite testinin geliştirilmesine katkıda bulunur. Bu özellikler arasında midyelerden düşük invaziv bir şekilde kolay hemolenf toplanması, test için gereken az miktarda hemolenf ve çoklu toksik madde konsantrasyonlarının aynı anda maruz kalmasına izin veren ve zamandan ve reaktiflerden önemli ölçüde tasarruf sağlayan replikasyonlara izin veren çok kuyulu bir plakanın kullanılması yer alır.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu araştırma, İtalya Üniversite ve Araştırma Bakanlığı, CUP: F85D18000130001 tarafından DiSTeBA'ya verilen "Dipartimento di Eccellenza" projesi ve Avrupa Birliği NextGenerationEU, PNRR, proje n. CN00000033 tarafından finanse edilen NBFC (Ulusal Biyoçeşitlilik Gelecek Merkezi) tarafından finanse edilmiştir. Salento Üniversitesi Biyoloji ve Çevre Bilimleri ve Teknolojileri Bölümü'ndeki BIOforIU altyapısına da teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.2 ve mikro; m filtre (çap 25 mm)ABLUO laboratuvar gereçleri
2.5 ml hipodermik şırınga iğnesi 22GIşınları2522CM32laboratuvar gereçleri
96 kuyulu düz tabanlı polistiren TC ile işlenmiş mikroplakaCorning3916laboratuvar gereçleri
CaCl2< / sub>.2H2< / sub>OMerk (Sigma - Aldrich) C3881-1KG
Kimyasal Kemotaksis ve Migrasyon Aracı yazılımı (Ibidi GmbH)Yazılım
Cytation 5 Agilent BioTeckCytation 5Ekipmanı: Hücre görüntüleme çok modlu okuyucu
Dimetil sülfoksit (DMSO) Merk (Sigma - Aldrich) 472301Solvent
Falcon 15 mL Tüp Konik AltCorning352196laboratuvar gereçleri
H3< / sub>BO 3< / sub>Merk (Sigma - Aldrich) B0394
Kimyasal Hemositometre Hızlı okuma 102BiosigmaBVS100laboratuvar gereçleri
HEPES (4- (2-hidroksietil) -1-piperazin-etansülfonik asit)Merk (Sigma - Aldrich)  H3375-500G
Kimyasal ImageJ yazılımıNIHyazılımı
KBrMerk (Sigma - Aldrich) P9881Kimyasal
KClMerk 104936Kimyasal
L-glutaminMerk (Sigma - Aldrich) G7513Hücre kültürü ortamı için esansiyel amino asit
MgCl2· 6H2OMerk (Sigma - Aldrich) M2670Kimyasal
MgSO4Merk (Sigma - Aldrich) M7506
Kimyasal Mikroskop Nikon Eclipse E600NikonEkipman: Hücre görüntüleme 
Na2SO4Riedel-de Haen31481Kimyasal
NaClMerk (Sigma - Aldrich) 31434-1KG-R Kimyasal
NaFFluka71519 500gKimyasal
NaHCO3Merk (Sigma - Aldrich) S5761-1KG
Kimyasal Nötr KırmızıMerk (Sigma - Aldrich) N4638-1GHayati hücre boyası
Penisilin / StreptomisinMerk (Sigma - Aldrich) P0781-100MLHücre kültürü için antibiyotikler
SrCl2· 6H2OMerk (Sigma - Aldrich) 255521
Kimyasal Tripan mavi Merk (Sigma - Aldrich) T8154Hücre boyası

Kaynaklar

  1. Di Paolo, C., et al. Bioassay battery interlaboratory investigation of emerging contaminants in spiked water extracts - Towards the implementation of bioanalytical monitoring tools in water quality assessment and monitoring. Water Res. 104, 473-484 (2016).
  2. Brack, W., et al. Effect-based methods are key. The European Collaborative Project SOLUTIONS recommends integrating effect-based methods for diagnosis and monitoring of water quality. Environ Sci Eur. 31 (1), 10(2019).
  3. Lionetto, M. G., Caricato, R., Erroi, E., Giordano, M. E., Schettino, T. Potential application of carbonic anhydrase activity in bioassay and biomarker studies. Chem Ecol. 22 (sup1), S119-S125 (2006).
  4. Lionetto, M. G., Caricato, R., Giordano, M. E. Pollution biomarkers in the framework of marine biodiversity conservation: State of art and perspectives. Water. 13 (13), 1847(2021).
  5. Connon, R. E., Geist, J., Werner, I. Effect-based tools for monitoring and predicting the ecotoxicological effects of chemicals in the aquatic environment. Sensors. 12 (9), 12741-12771 (2012).
  6. Fabbri, E., Valbonesi, P., Moon, T. W. Pharmaceuticals in the marine environment: Occurrence, fate, and biological effects. Contaminants of Emerging Concern in the Marine Environment. León, V. M., Bellas, J. Chapter 2, Elsevier. Amsterdam. 11-71 (2023).
  7. Lionetto, F., et al. Autofluorescence of model polyethylene terephthalate nanoplastics for cell interaction studies. Nanomaterials. 12 (9), 1560(2022).
  8. Damiens, G., Gnassia-Barelli, M., Loquès, F., Roméo, M., Salbert, V. Integrated biomarker response index as a useful tool for environmental assessment evaluated using transplanted mussels. Chemosphere. 66 (3), 574-583 (2007).
  9. Ogidi, O. I., Onwuagba, C. G., Richard-Nwachukwu, N. Biomonitoring tools, techniques and approaches for environmental assessments. Biomonitoring of Pollutants in the Global South. Izah, S. C., Ogwu, M. C., Hamidifar, H. , Springer. Singapore. (2024).
  10. Rosner, A., et al. A broad-taxa approach as an important concept in ecotoxicological studies and pollution monitoring. Biol Rev. 99 (1), 131-176 (2024).
  11. Gagné, F., Burgeot, T. Bivalves in ecotoxicology. Encyclopedia of Aquatic Ecotoxicology. , 247-258 (2013).
  12. Caricato, R., et al. Carbonic anhydrase integrated into a multimarker approach for the detection of the stress status induced by pollution exposure in Mytilus galloprovincialis: A field case study. Sci Total Environ. 690, 140-150 (2019).
  13. Calisi, A., et al. Morphological and functional alterations in hemocytes of Mytilus galloprovincialis exposed in high-impact anthropogenic sites. Mar Environ Res. 188, 105988(2023).
  14. Viarengo, A., Burlando, B., Evangelisti, V., Mozzone, S., Dondero, F. Sensitivity and specificity of metallothionein as a biomarker for aquatic environment biomonitoring. Biomarkers in Marine Organisms. Garrigues, F., Barth, H., Walker, C. H., Narbonne, J. F. , Elsevier Science. Amsterdam. 29-43 (2001).
  15. Bocchetti, R., et al. Contaminant accumulation and biomarker responses in caged mussels, Mytilus galloprovincialis, to evaluate bioavailability and toxicological effects of remobilized chemicals during dredging and disposal operations in harbor areas. Aquat Toxicol. 89 (3), 257-266 (2008).
  16. Calisi, A., Lionetto, M. G., Caricato, R., Giordano, M. E., Schettino, T. Morphometric alterations in Mytilus galloprovincialis granulocytes: A new biomarker. Environ Toxicol Chem. 26 (6), 1435-1441 (2007).
  17. Burgos-Aceves, M. A., Faggio, C. An approach to the study of the immunity functions of bivalve haemocytes: Physiology and molecular aspects. Fish Shellfish Immunol. 67 (6), 513-517 (2017).
  18. Canesi, L., et al. Tyrosine kinase-mediated cell signaling in the activation of Mytilus hemocytes: Possible role of STAT-like proteins. Biol Cell. 95 (9), 603-613 (2003).
  19. Novas, A., Barcia, R., Ramos-Martínez, J. I. Nitric oxide production by hemocytes from Mytilus galloprovincialis shows seasonal variations. Fish Shellfish Immunol. 23 (4), 886-891 (2007).
  20. Pruzzo, C., Gallo, G., Canesi, L. Persistence of vibrios in marine bivalves: The role of interactions with hemolymph components. Environ Microbiol. 7 (5), 761-772 (2005).
  21. Le Foll, F., et al. Characterization of Mytilus edulis hemocyte subpopulations by single-cell time-lapse motility imaging. Fish Shellfish Immunol. 28 (2), 372-386 (2010).
  22. Rioult, D., Lebel, J. -M., Le Foll, F. Cell tracking and velocimetric parameters analysis as an approach to assess activity of mussel (Mytilus edulis) hemocytes in vitro. Cytotechnology. 65 (5), 749-758 (2013).
  23. Udayan, G., Giordano, M. E., Pagliara, P., Lionetto, M. G. Motility of Mytilus galloprovincialis hemocytes: Sensitivity to paracetamol in vitro exposure. Aquat Toxicol. 265, 106779(2023).
  24. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
  25. Ivanina, A., Falfushynska, H., Beniash, E., Piontkivska, H., Sokolova, I. Biomineralization-related specialization of hemocytes and mantle tissues of the Pacific oyster Crassostrea gigas. J Exp Biol. 220 (18), 3209-3221 (2017).
  26. Furukawa, F., et al. Hemocyte migration and expression of four Sox genes during wound healing in Pacific abalone, Haliotis discus hannai. Fish Shellfish Immunol. 117, 24-35 (2021).
  27. Lau, Y., Gambino, L., Santos, B., Espinosa, E., Allam, B. Regulation of oyster (Crassostrea virginica) hemocyte motility by the intracellular parasite Perkinsus marinus: A possible mechanism for host infection. Fish Shellfish Immunol. 78, 18-25 (2018).
  28. Gendre, H., et al. Modulation of hemocyte motility by chemical and biological stresses in Mytilus edulis and Dreissena polymorpha. Fish Shellfish Immunol. 139, 108919(2023).
  29. Kaloyianni, M., et al. Oxidative effects of inorganic and organic contaminants on haemolymph of mussels. Comp Biochem Physiol C: Toxicol Pharmacol. 149 (4), 631-639 (2009).
  30. Sendra, M., et al. Nanoplastics: From tissue accumulation to cell translocation into Mytilus galloprovincialis hemocytes. Resilience of immune cells exposed to nanoplastics and nanoplastics plus Vibrio splendidus combination. J Hazard Mater. 388, 121788(2020).
  31. Pizzagalli, D. U., Pulfer, A., Thelen, M., Krause, R., Gonzalez, S. F. In vivo motility patterns displayed by immune cells under inflammatory conditions. Front Immunol. 12, 804159(2021).
  32. ASTM D1141-98. Standard Practice for Preparation of Substitute Ocean Water. , (2021).
  33. Martínez-Gómez, C., Bignell, J., Lowe, D. Lysosomal membrane stability in mussels. ICES Techniques in Marine Environmental Sciences. 56, 1-41 (2015).
  34. UNEP/RAMOGE. Manual on the biomarkers recommended for the MED POL Biomonitoring Programme. UNEP. , Athens. (1999).
  35. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  36. Asano, Y., Horn, E. Instructions Chemotaxis and Migration Tool 2.0 Version 1.1. , (2013).
  37. Wilkinson, J. L., et al. Pharmaceutical pollution of the world's rivers. Proc Natl Acad Sci USA. 119 (8), e2113947119(2022).
  38. Parisi, M. G., Pirrera, J., La Corte, C. Effects of organic mercury on Mytilus galloprovincialis hemocyte function and morphology. J Comp Physiol B. 191 (1), 143-158 (2021).
  39. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  40. Bailly, M., Condeelis, J. Cell motility: Insights from the backstage. Nat Cell Biol. 4 (5), E292-E294 (2002).
  41. Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol Rev. 94 (1), 235-263 (2014).
  42. Mosca, F., et al. Effects of high temperature and exposure to air on mussel (Mytilus galloprovincialis, Lmk 1819) hemocyte phagocytosis: Modulation of spreading and oxidative response. Tissue Cell. 45 (3), 198-203 (2013).
  43. Beaudry, A., et al. Effect of temperature on immunocompetence of the blue mussel (Mytilus edulis). J Xenobiot. 6 (1), 5889(2016).
  44. Wu, F., et al. Combined effects of seawater acidification and high temperature on hemocyte parameters in the thick shell mussel Mytilus coruscus. Fish Shellfish Immunol. 56, 554-562 (2016).
  45. Schmeisser, S., et al. New approach methodologies in human regulatory toxicology - Not if, but how and when. Environ Int. 178, 108082(2023).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Hemosit MotilitesiMidye HemositleriToksisite DeneyiEkotoksikoloji DeneyiH cre TakibiZaman Atlamal Mikroskopievresel Biyomonit rlemeH cre GBa kl k Yan t
Midye (Mytilus galloprovincialis) Hemosit Motilitesine Dayalı Toksikolojik ve Ekotoksikolojik Bir Test
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.