Bir in vivo yaprak aşılama yöntemi kullanarak kavağın kök pamukçuk patojenlerine karşı direncini değerlendirmek için adım adım bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem özellikle Çin'deki kavak damızlık döllerde Cytospora chrysosperma ve Botryosphaeria dothidea pamukçuk hastalığı direncinin büyük ölçekli değerlendirmesi için uygundur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İn Vivo Yaprak Aşılaması: Kök Pamukçuk Hastalığının Kavak Yetiştiriciliğinde Hibrit Klonların Hastalık Direncini Değerlendirmek İçin Alternatif Bir Yöntem
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr.) ve Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr.) Ces. Çin'deki kavak plantasyonlarında bulunan ve bazen tüm kavak fidelerini yok edebilen veya olgun kavak ormanlarına ciddi şekilde zarar verebilen iki büyük orman hastalığıdır. Hibrit ıslah, ağaç hastalıklarını kontrol etmenin ve yönetmenin en doğrudan ve etkili yöntemidir. Bununla birlikte, in vitro kök inokülasyonuna dayalı olarak hastalık direncinin değerlendirilmesi veya hastalığa dirençli klonların seçilmesi verimsiz, zaman alıcı ve pahalıdır ve kavak sapı pamukçuk hastalığının melez üremesinin gelişimini sınırlar. Bu çalışmada, in vivo yaprak aşılaması yoluyla kök pamukçuk patojenlerine karşı hastalık direncini değerlendirmek için alternatif bir yöntem önerdik. Bu yöntemde kullanılan test malzemeleri, 1 yaşındaki kavak fidanları üzerinde olabileceği gibi, serada veya tarlada bulunan çok yıllık kavakların tek yıllık dalları üzerinde de olabilir. Bu alternatif yöntemin kritik adımı, aşılayıcı yaprakların seçimidir: 5-7. yeni olgunlaşmış yapraklar en uygun olanı olabilir. Yaprak aşılama yönteminin ikinci kritik adımı, iğne delikleri yoluyla bitki yapraklarında yaralar açmak ve hastalık şiddetini ölçmek için yeterli lezyonları sağlamaktır. Kavak ıslahının erken aşamasında üretilen yeterli sayıda yaprak için, bu in vivo yaprak aşılaması, hastalığa dirençli kavak klonlarının pamukçuk patojenlerini köklendirmek için hızlı, doğru ve büyük ölçekli taramasına katkıda bulunur. Ayrıca, bu yaprak aşılama yöntemi, kök pamukçuk hastalığı patojeni C. chrysosperma, B. dothidea veya diğer kavak sapı pamukçuk patojenlerinin patotiplerinin taranması için de etkili bir yöntem olarak hizmet edecektir.
Giriş
Esas olarak iki nekrotrofik patojenin neden olduğu kavak sapı pamukçuk hastalıkları, Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr. ve Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr.) Ces. Çin'in Kuzeydoğu, Kuzey ve Kuzeybatı (Üç Kuzey) bölgelerindeki kavak tarlalarının gelişimini ve hayatta kalmasını ciddi şekilde tehdit ediyor. Hibrit ıslah, ağaç hastalıklarını kontrol etmek ve yönetmek için en doğrudan ve verimli yöntemdir; Bununla birlikte, yüksek verimli, hızlı büyüyen veya diğer kavak melezi klonları için ıslahtaki ilerleme ile karşılaştırıldığında, kavak pamukçuk hastalığı için direnç ıslahı üzerine araştırmalar azdır. Hastalığa dirençli melez ıslahı ile ilgili sadece sınırlı sayıda çalışma bildirilmiştir 1,2,3 ve kavak ağaçlandırmasında pamukçuğa dirençli hibrit klon yetiştirilmemiştir.
Düzenli melez ıslahının en önemli adımı, melez döllerin fenotip edinimine dayalı klon seçimidir. Ancak patolojik fenotiplerin (patotiplerin) edinimi zaman alıcı, zahmetli, yorucu, pahalı ve uzmana bağlı bir süreçtir. Odunsu bitkiler için, uzun yaşam döngüleri, yavaş büyümeleri ve iri gövdelerinin neden olduğu zaman, emek ve ekonomi tüketen doğası nedeniyle daha zordur. Örneğin, kavakta, melez döllerin pamukçuk direnci taraması, konvansiyonel in vitro gövde aşılama yöntemleri ile hibridizasyondan 5-7 yıl sonra gerçekleştirilmiştir 1,2,3. Dahası, bu düşük verimli ve yüksek tüketen hastalığa dirençli tarama yöntemiyle sınırlı olan araştırmacılar, pamukçuğa dirençli klonları, tüm melez soylardan değil, küçük bir alt gruptan (örneğin, seçilen yüksek verimli veya hızlı büyüyen kavak klonları) yeniden seçtiler. Bu nedenle, düzenli kök aşılama yöntemlerini kullanarak, otantik dirençli klonları tanımlamaktan emin değildir ve üreyen döllerin hastalığa dirençli çeşitliliğini ortaya çıkaramaz, bu nedenle hastalık direnci ile ilgili genlerin veya gen modüllerinin araştırılmasını sınırlar. Kavak hızlı büyüyen/yüksek verimli ıslahın hızlı gelişimi ile karşılaştırıldığında, bu ıslah programları, ıslahın ilk iki yılında fenotipik seleksiyon ve hatta genomik seleksiyon yoluyla melezler elde edebilir4, kavak pamukçuğuna dirençli ıslah yavaş gelişmiştir. Melez döllerin hastalığa dirençli taraması (veya tespiti) veya patojen aşılama yöntemi, kavak pamukçuk hastalığına dirençli ıslahta çok önemli hız sınırlayıcı adım haline gelmiştir.
Bu protokolde, kavak sapı aft patojenleri için yeni bir aşılama yöntemi olan in vivo yaprak aşılama yöntemi tanıtılmıştır. Bu yöntemi kullanarak, onlarca kavak türünün (çeşitler veya klonlar) pamukçuk hastalığına direncini 5-7 gün içinde hızlı ve verimli bir şekilde test edebiliriz. Doğrulama testi, in vivo yaprak aşılamasının, kök pamukçuk hastalığının direnç tespitinde geleneksel in vitro gövde aşılaması ile tutarlı olduğunu göstermiştir, bu da yaprak aşılama yönteminin, kök pamukçuk hastalığının ıslahında direnç döllerinin tüm genotip seçimi gibi kavak pamukçuk hastalıklarının büyük ölçekli direnç taraması için uygun olduğunu düşündürmektedir. Bu yöntem, kavak pamukçuk hastalıklarının melez ıslahında dirençli yavru seçiminin patolojik problemini çözmektedir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Aft patojeni için mantar kültürü
- Mantar suşları için patates dekstroz agar (PDA; patates ekstraksiyonu 6.0 g, dekstroz 20.0 g, agar 20.0 g) kültür ortamını hazırlayın; Yukarıdaki malzemeleri 1000 mL'ye kadar suda çözün, ortamı 100 ° C'de 10 dakika boyunca tamamen çözün.
- PDA ortamını 25 mL'lik tüplere dökün (her biri 15.0 mL içerir); Tüm tüpleri 121.1 °C'de 30 dakika sterilize edin. Ortamı kültür plakalarına (9.0 cm çapında) dökün ve plakaları oda sıcaklığında (RT) soğutun.
- PDA ortamında 28 ° C'de 7 gün boyunca kültürlenen mantar patojeninin miselyumunu ~ 0,5 cm kare küpler halinde kesin; Mantar küplerini PDA plakalarının merkezine aşılayın (miselyum tarafları ortama bakar).
- Mantar patojenlerini 7-10 gün boyunca termostatik bir inkübatörde (28 ° C, karanlıkta) kültürleyin.
- Mantar miselyumlu PDA ortamını kare küpler halinde kesin (kenar uzunluğu 1.0-1.2 cm).
2. Kavak malzemelerinin hazırlanması
- 1 yaşındaki kavak klonları için (3 aydan > yetiştirilen), ana dalların yeni olgunlaşmış, tamamen uzamış yapraklarını (her zaman fida/dalların tepesinden 5-7. yapraklar) aşılanan materyal olarak seçin, zararlılardan, hastalıklardan ve mekanik hasarlardan arınmış olduklarından emin olun.
- Çok yıllık kavak melezi klonlarının 1 yaşındaki dalları için (2 ay > yetiştirilir), aşılanmış materyaller olarak seçilen dalların en üstteki 5-7. yapraklarını seçin. Yaprakların sağlıklı olduğundan ve test edilen tüm kavak klonları arasında aynı ışık durumuna (gölge veya ışık) sahip olduğundan emin olun.
3. Aşılama yapraklarının ön muamelesi
- Kavak yapraklarına temiz su püskürtün ve kuruduktan sonra, seçilen yaprakları aşılama manipülasyonlarından 1 saat veya 1 gün önce% 75 alkolle silin.
4. İn vivo yaprak aşılaması
- Küçük yapraklar için (yaprak genişliği < 8.0 cm), iki kare mantar miselyum küpü ve PDA (veya su agar, WA) küplerini (yan uzunlukta 1.0-1.2 cm) kavak klonlarının üst 5-7 yaprağının üst yüzeyine aşılayın; Miselyum yapraklara bakar. Aşılama bölgelerinin yarım yaprakların merkezinde, merkezi damarlardan ~ 1-2 cm uzakta olduğundan emin olun ve ikincil damarları gizlemekten kaçının. Her klon 6 yaprakta 12 bölge aşılar (miselyum için 10 bölge ve PDA aşılaması için 2 bölge).
- Büyük yapraklar için (yaprak genişliği 8.0 cm≥), üstteki 5-7 kavak yaprağına dört kare mantar miselyum küpü ve PDA (veya WA) küpü aşılayın. Her klon 3 yaprakta 12 bölgeyi aşılar (miselyum için 10 bölge ve PDA aşılaması için 2 bölge).
- Aşılanmış yaprakları şeffaf yapışkan bantla (6.0 cm genişliğinde) sarın ve yapraklara yapışmalarını sağlamak için hafifçe bastırın, böylece deney sırasında miselyum (veya PDA) küplerinin hareket etmesini ve su kaybını önleyin.
- Yaprakları ve miselyum (veya PDA) küplerini, iğneler küplere kavak yapraklarının üst yüzeyinden alt yüzeyine nüfuz edene kadar beş bölgede delin. Bir bölge merkezde, diğer dördü ise küplerin dört köşesine 1-2 mm yakındır.
NOT: Mantar aşılama manipülasyonu için 3 kişilik bir ekip işbirliği önerilir. Kavak melezi bir popülasyonun (>100 genotip) aşılama manipülasyonu, ekip çalışması ile 4 saat içinde gerçekleştirilebilir. Delici manipülasyonlar, farklı delme sürelerinin hastalık şiddeti üzerindeki etkisini hafifletmek için test edilen tüm yapraklar aşılandıktan ve sarıldıktan sonra gerçekleştirildi. - Miselyum aşılayıcılarının yer kaymasını ve su kaybını inceleyin ve aşılamanın 3. gününe kadar yaprakların alt yüzeyinden delinen yara bölgelerinin etrafındaki nekrotik lezyonların başlangıcını gözlemleyin.
- Aşılamadan sonraki 3 gün içinde miselyum küplerinin yer kaymasını ve su kaybını gözlemleyin. Taşınan ve kurutulan miselyum küplerini etkisiz aşılamalar olarak tanımlayın ve işaretleyin ve diğer küpleri etkili aşılar olarak tanımlarken bunları patotiplerin nihai tanımlamasından atın.
NOT: Bu protokol, beşten fazla etkili aşılama küpü ile test edilen kavak klonlarını geçersiz aşılanmış klonlar olarak tanımlar; Bu nedenle, her kavak klonu, 30 bağımsız nekrotik noktaya dönüşecek en az 30 etkili aşılama bölgesi sağlamıştır.
- Aşılamadan sonraki 3 gün içinde miselyum küplerinin yer kaymasını ve su kaybını gözlemleyin. Taşınan ve kurutulan miselyum küplerini etkisiz aşılamalar olarak tanımlayın ve işaretleyin ve diğer küpleri etkili aşılar olarak tanımlarken bunları patotiplerin nihai tanımlamasından atın.
- Deneyin sonunda (aşılamadan ~ 5-7 gün sonra) aşılanmış tüm yaprakları toplayın, plastik numune torbalarında laboratuvara geri getirin ve 4 ° C'de saklayın.
5. Yaprak patotip tayini ve kavak direncinin laboratuvarda kök pamukçuk hastalıklarına karşı değerlendirilmesi
- Şeffaf yapışkan bantları ve miselyum (veya PDA) aşılayıcılarını yapraklardan dikkatlice çıkarın.
- Nekrotik lekelerin şekli ve rengi de dahil olmak üzere her bir kavak klonunun yaprak patotiplerini gözlemleyin ve tanımlayın ve delinme bölgelerinin etrafındaki yaprakların yüzeyinde oluşan mantar hif benzeri yapıyı, piknidia ve conidia'yı içerebilir.
- Yaprakları bir kamerayla (ek bir cetvel ile) fotoğraflayın veya 300 dpi'nin üzerinde çözünürlüğe sahip görüntüler elde etmek için bir tarayıcı kullanarak yaprakları (ek bir cetvel ile) tarayın ve ardından görüntüleri JPEG, TIFF veya PNG formatında kaydedin.
6. Hastalık oluşumunun tanımlanması ve istatistiksel analizi
- Hastalıklı yaprakların görüntülerini ImageJ 1.54g (http://imagj.org) yazılımında açın.
- Ölçeği yaprak görüntülerindeki cetvele göre ayarlayın.
- Değnek (izleme) aracıyla lezyonları tanımlayın ve ölçün.
- Tüm nekrotik noktaların alanları ölçüldükten sonra alan değerlerini bir elektronik tablo olarak kaydedin ve dışa aktarın.
- Hastalık belirleme kriterlerini belirleyin:
- Miselyum küplerinin kapladığı delik bölgelerinin etrafındaki lezyon alanı, PDA küplerinin kapladığından önemli ölçüde daha büyükse, bu bölgeleri hastalık bölgeleri olarak tanımlayın.
- Miselyum küplerinin kaplı delme bölgelerinin morfolojik özellikleri, lezyonun renkleri, hif benzeri yapı, piknidia ve konidia üreten lezyonun renkleri de dahil olmak üzere PDA kaplı bölgelerle karşılaştırıldığında önemli ölçüde değiştiyse, bölgeyi aynı zamanda bir hastalık bölgesi olarak tanımlayın.
- Her kavak melez klonunun etkili PDA lezyon noktalarının ortalama alanlarını hesaplayın. Ortalama alanlara göre, bir kavak klonunun tüm miselyum aşılanmış noktalarını iki kategoriye ayırın: başlangıçlı ve başlangıçsız. Ardından, test edilen kavak klonunun hastalık insidans oranını hesaplayın (Formül 1: Hastalık insidans hızı (%) = Hastalıklı prick sitelerinin sayısı / Toplam verimli prick sitelerinin sayısı × 100).
- Yapraklardaki hastalıklı lekelerin ortalama alanını hesaplayın (n = 50). Test edilen tüm kavak klonlarında hastalıklı yaprak lekelerinin ortalama alanlarının değerlerine göre, 5 seviyeli bir hastalık derecelendirme standardı belirleyin.
- Yukarıdaki hastalık derecelendirme standardına göre her bir kavak klonunun (Formül 2) hastalık indeksini hesaplayın (Formül 2: Hastalık indeksi = ∑(Seviyeye göre diken yeri sayısı × Tüm seviyelerde şiddet değerleri)/(En yüksek şiddet düzeyinin değeri × Toplam verimli dikme bölgesi sayısı) × 100).
- Herhangi bir uygun veri analiz yazılımı kullanarak Shapiro-Wilk testini kullanarak kavak klonlarının sayısının farklı direnç seviyelerindeki normal dağılımını doğrulayın.
- Hastalık indeksine göre, test edilen tüm kavak klonlarını beş (veya yedi) grup olarak tanımlayın: çok yüksek direnç (VHR), yüksek direnç (HR), direnç ( R ), direnç yok ve duyarlılık yok (NRNS), duyarlılık (S), yüksek duyarlılık (HS) ve çok yüksek duyarlılık (VHS) grup5.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokolde, kök pamukçuk patojeni C. chrysosperma ile enfekte olmuş 48 kavak melezi klonda şematik iş akışı gerçekleştirilmiştir (Şekil 1). Kavak melezi klonları, Pekin'deki Çin Ormancılık Akademisi'ndeki (CAF) fidanlıkta yetiştirilen P. deltoides'in melezleme soyunun bir parçasıdır.
Kök pamukçuk patojeni C. chrysosperma izolatı CZC, kavak pamukçuk hastalığının 6,7,8,9
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, kavak kanserine dirençli patojenler için hızlı ve etkili bir aşılama yöntemi sağlar ve kavak kanserine dirençli patojenlerin hibrit ıslahı ve kök pamukçuk patojenlerinin patojenite taraması gibi büyük ölçekli hastalık direnci taraması gerektiren araştırma alanları için uygundur.
Yöntemin ilk kilit noktası, olgunlaşmış gövde/dallar yerine yeni olgunlaşmış yaprak aşılaması ile hastalık direncinin değerlendirilmesidir. Sonuç olarak, kök pamukçuk has...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu araştırma, Merkezi Kamu Yararına Bilimsel Kurum, Devlet Anahtar Ağaç Genetiği ve Islahı Laboratuvarı Temel Araştırma Fonu (hibe numarası CAFYBB2020ZY001-2) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (hibe numarası 32171776) tarafından Jiaping Zhao'ya ortaklaşa finanse edildi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Alüminyum folyo | Biosharp BS-QT-027B | ||
| C. chrysosperma izolatı | Çin Ormancılık Kültürü Toplama Merkezi | CFCC86775 | Laboratuvarımız tarafından ayırma ve koruma |
| Cytospora chrysosperma | Bitki Fizyolojisi Laboratuvarı, Ormancılık Yeni Teknoloji Enstitüsü, Çin Ormancılık | AkademisiNCBI erişim numarası: rRNA-ITS için MK994101 ve EF1 ve alfa için MN025273; gen CGMCC numarası: 40575 | Laboratuvarımız tarafından ayırma ve koruma |
| Epson Perfection V370 Fotoğraf | Epson | V370 | Tarayıcı; Yaprakları görüntüye tarayın |
| PDA (Patates Dekstroz Agar) | Solarbio | P8931 | Mantar büyümesi için besin sağlar |
| PE plastik film | Yapraklardaki mantarları sabitlemek için | ||
| Populus alba var. Pyramidalis | Bitki Fizyolojisi Laboratuvarı, Ormancılık Enstitüsü Yeni Teknoloji, Çin Ormancılık Akademisi | Laboratuvarımız SPSS | |
| Veri analizi yazılımı | |||
| Termostatik inkübatör | Shanghai Kuntian Laboratory Instrument Co., Ltd | KTD-6000 | Mantar büyümesi için bir ortam sağlayın |
| Tough TG-6 kamera | OLYMPUS | Hastalıklı yaprakların fotoğraflarını çekmek için |
Kaynaklar
- Du, K., et al. Genetic analysis and seedling selection of the poplar progenies of Aigeiros section. Journal of Huazhong Agricultural University. 28 (5), 624-630 (2009).
- Shi, Y. Identification of canker resistance to selection poplar clones [Master's thesis]. , Northwest Agriculture and Forestry University. (2014).
- Zhang, L., Zhang, H., Ou, D., Fan, J. Investigation on the resistance to canker of some new leuce hybrids inoculated with Botryosphaeria dothidea. Journal of Northwest Forestry University. 32 (6), 210-213 (2017).
- Du, C., et al. Genomic selection of seedling growth traits in a poplar hybrid population. For Res. 36 (6), 11-19 (2023).
- Li, Z., et al. A rapid and efficient in vivo inoculation method for introducing tree stem canker pathogens onto leaves: Suitable for large-scale assessment of resistance in poplar breeding progeny. BioRxiv. , (2024).
- Li, P., et al. Fungal canker pathogens trigger carbon starvation by inhibiting carbon metabolism in poplar stems. Sci Rep. 9 (1), 10111(2019).
- Xing, J., et al. Fungal pathogens of canker disease trigger canopy dieback in poplar saplings by inducing functional failure of the phloem and cambium and carbon starvation in the xylem. Physiol Mol Plant Pathol. 112, 101523(2020).
- Xing, J., et al. Comparisons of photosynthetic response and characteristics in leaves of Populus alba var. pyramidalis Infected by the stem canker pathogen Valsa sodida and Botryosphaeria dothidea at early stage. Scientia Silvae Sinicae. 57 (09), 121-129 (2021).
- Li, J., et al. Effects of Valsa sordida infection on photosynthetic characteristics and carbon-water metabolism in Populus alba var. pyramidalis. For Res. 34 (05), 58-68 (2021).
- Balendres, M. A., De Torres, R., Dela Cueva, F. Culture storage age and fungal re-isolation from host-tissue influence Colletotrichum spp. virulence to pepper fruits. J Phytopathol. 167 (9), 510-515 (2019).
- Ward, K. T., Ostry, M. E. Variation in Septoria musiva and implications for disease resistance screening of poplars. Plant Dis. 89 (10), 1077-1082 (2005).
- Asalf, B., et al. Ontogenic resistance of leaves and fruit, and how leaf folding influences the distribution of powdery mildew on strawberry plants colonized by Podosphaera aphanis. Phytopathology. 104 (9), 954-963 (2014).
- Dunnell, K. L., Le Boldus, J. M. The correlation between Septoria leaf spot and stem canker resistance in hybrid poplar. Plant Dis. 101 (3), 464-469 (2017).
- Wei, J., Huang, L., Gao, Z., Ke, X., Kang, Z. Laboratory evaluation methods of apple Valsa canker disease caused by Valsa ceratosperma sensu Kobayashi. Acta Phytopathol Sinica. 40 (1), 14-20 (2010).
- Shen, W., et al. Comparative study on the effectiveness of three inoculation methods for Valsa sordida in Populus alba var. pyramidalis. Biology. 13 (4), 251(2024).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Daha fazla makale keşfet
