Proteinazlar bakteriyel patogenez için hayati öneme sahiptir, invazyon ve immün kaçışı sağlar. Bakterilerin sitoplazmik ve membran proteinlerinin aktif formlarında tek aşamalı ekstraksiyonu üzücüdür. Bu video makalesi, jelatinazları tespit etmek ve karakterize etmek için zimografi analizi için Leptospira'nın tüm hücresel proteinlerinin ekstraksiyonunu göstermektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bakteriyel Jelatinazların Tek Adımda Ekstraksiyonu ve Zymografik Analizi
Bu makalede
Özet
Özet
Patojenik bakterilerin proteinazları, konakçının hücre dışı matriks (ECM) bileşenlerini ve hücresel bariyerlerini aktif olarak parçalayarak, konak bağışıklık tepkisini değiştirerek ve konak savunma sistemini bozarak invazyon ve patogeneze katkıda bulunur. Bu, proteinazları en öldürücü moleküllerden biri yapar ve bunların tanımlanması ve karakterizasyonu, hastalığın önlenmesi ve kontrol edilmesi için gereklidir. Birçok bakteri ayrıca dış zara bağlı proteinazlara sahiptir. Dış zar proteinlerinin aktif formlarında izolasyonu ve karakterizasyonu, dış zar içindeki lokalizasyonları nedeniyle önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Bu çalışmada, Leptospira'dan hem sitoplazmik hem de dış zarla ilişkili jelatinazları ekstrakte etmek için tek aşamalı bir yöntem gösteriyoruz ve bunların enzimatik aktivitelerini zimografi kullanarak gösteriyoruz. Bu yöntemde, hücre zarını bozmak ve bağlı proteinleri serbest bırakmak için sodyum deoksikolat ve salınan zar proteinini doğal formunda çözündürmek için 6-aminokaproik asit kullanıyoruz. Ayrıca, leptospiral jelatinazların zimografik bir analizini gösteriyoruz. Bu yaklaşım, çeşitli bakteriyel patojenlerden metaloproteazları, kollajenazları ve jelatinazları izole etmek, saflaştırmak ve karakterize etmek için çok yönlü bir çerçeve sağlar.
Giriş
Çoğu bakteriyel patojen, patogenez sırasında invazyon ve hedef organlara yayılma sırasında konakçının hücre dışı matriksi (ECM) ile karşılaşmalıdır. Kollajen, hayvan dokularının ECM'sindeki ana bileşeni oluşturur1. Jelatinler, kolajen ve onun hidrolize formu olan jelatin üzerinde etkili olan bir proteaz grubudur. ECM bozunması esas olarak kollajenazlar ve jelatinazlar 2,3 içeren bir grup proteaz tarafından gerçekleştirilir. Bakteriyel patojenler, invazyon ve patogenezdeki kolaylıkları için konakçı ECM'yi yeniden şekillendirmek veya parçalamak için kollajenazları ve jelatinazları kullanır 4,5. Bakteriyel ECM parçalayıcı enzimler, aşı ve ilaç hedeflemesi için potansiyel adaylardır5.
Bakteriyel proteazlarsalgı ve zara bağlı formlarda bulunur 6,7,8,9. Hücresel enzim ekstraksiyonu için birçok yöntem, zara bağlı bakteriyel jelatinazları ve kollajenazları izole etmek için etkisizdir, çünkü bu prosedürler zara bağlı proteinlerin doğal formunu verimli bir şekilde koruyamayabilir. Benzer şekilde, yalnızca zara bağlı proteazları ve jelatinazları ekstrakte eden zara özgü yöntemler vardır. Membran proteinleri de dahil olmak üzere toplam proteinler için geleneksel ekstraksiyon yöntemleri, genellikle enzimatik aktiviteyi etkileyebilecek deterjanlar ve kaotropik iyonlar içerir. Enzim aktivitesini ve çözünürlüğünü koruyan bir ekstraksiyon prosedürü, elektroforetik ayırma için gereklidir ve proteaz aktivitesini tespit etmek için zimografi geliştirmeyi sağlar.
Hücre zarını bozarak hücreleri parçalayabilen iyonik bir deterjan olan sodyum deoksikolat, hücre içeriğinin ve zar proteininin salınmasını sağlar. 6-aminokaproik asit, salınan zar proteinini doğal formunda çözündürebilir. 6-aminokaproik asit ile çözündürme, elektroforezi etkilememesi gibi bir avantaja sahiptir. Burada, sodyum deoksikolat ve 6-aminokaproik asit kullanılarak hücresel ve zara bağlı bakteriyel proteinazların ekstraksiyonunu ve bunları doğal çözünür formları10,11,12'de stabilize etmeyi gösteriyoruz. Bu yöntem, elektroforezi engellemeden doğrudan kullanılabilen hücre ve zardaki proteinleri etkili bir şekilde çözer13,14. Uygulamaya bağlı olarak aktivasyon tamponunda kullanılan proteaz inhibitörleri ve metal iyonları değiştirilerek çeşitli enzimatik karakterizasyonlar gerçekleştirilebilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Bakteriyel jelatinazların ekstraksiyonu
NOT: Reaktiflerin ve malzemelerin hazırlanması için Tablo 1'e bakın.
- Organizmayı 30 ° C'de 10 mg / mL sığır serum albümini içeren Ellinghausen McCullough Johnson Harris (EMJH) ortamında büyütün. Ekstraksiyon proteinazları için 3.5 × 108 hücre / mL içeren büyümenin orta log fazında13,14 mL Leptospira kültürü alın. Büyümenin orta log aşamasını gözlemlemek için karanlık alan mikroskobu altında bir Petroff-Hausser sayma odası ile doğrudan mikroskobik sayımı kullanın.
- Hücreleri 10 dakika boyunca 6.000 × g'da santrifüjleme ile hasat edin ve süpernatanı 121 ° C'de 60 dakika otoklavlayarak dekontaminasyon için bir kapta atın.
- Peletleri 1 mL yıkama tamponu içinde süspanse ederek 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 6.000 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Bu yıkamayı tekrarlayın.
- 10 mL kültürden bir Leptospira peleti için 100 μL ekstraksiyon tamponu ekleyerek ve 5 dakika boyunca girdap yaparak proteini peletten çıkarın. 4 °C'de 1 saat inkübe ederek ekstraksiyona devam edin. Ekstrakte edilen proteini 10 dakika boyunca 4 ° C'de 15.000 × g'da santrifüjleme ile toplayın ve peleti 60 dakika boyunca 121 ° C'de otoklavlayarak dekontaminasyon için bir kapta atın.
- Eşit hacimde 2x numune tamponu ekleyerek protein ekstraktını doğrudan zymografi için kullanın.
- Protein konsantrasyonunu belirlemek için Bradford tahmin testini kullanın.
- Protein konsantrasyonu düşükse, proteini çökeltme için 4x hacimde aseton ile karıştırarak aseton ile çökeltin ve gece boyunca -20 °C'de inkübe edin. Ertesi gün, numuneyi 10 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüjleyin, elde edilen peleti havayla kurutun ve PBS'de yeniden süspanse edin veya istenen tamponda çözün ve -20 ° C'de 1 aya kadar saklayın. Uzun süreli depolama veya nakliye için liyofilizasyon kullanın.
NOT: Ekstrakttaki aktif proteazlar ve proteaz inhibitörlerinin olmaması nedeniyle, proteinler numunede bozunabilir.
2. Jelatinazların zimografisi
- Jelatin kopolimerize SDS PAGE jelinin hazırlanması
- Jelin çözülmesi
- Jeli dökmek için bileşenleri gerekli miktarlarda ekleyerek çözücü jel karışımını yapın. 50 mL'lik bir beherde 3,86 mL suya 2,5 mL Tris-HCl (pH 8,8), %10 jelatin stok çözeltisinden 0,1 mL, 3,34 mL akrilamid-bis akrilamid çözeltisi (ABA), 0,1 mL %10 SDS, 0,006 mL TEMED ve 0,1 mL %10 amonyum persülfat ekleyin ve köpürme ve kabarcıklar olmadan iyice karıştırın. Bahsedilen sistem (Normal Cam Plakalar; 18 x 8 cm) 10 mL çözünen jel karışımı gerektirir.
NOT: Jelatin donmuş bir alikottan geliyorsa, çözeltiyi herhangi bir topak olmadan temizlemek için eriyene kadar çözdürün. Dökümden hemen önce amonyum persülfat ekleyin, çünkü polimerizasyon amonyum persülfat eklendikten hemen sonra başlayacaktır. - Çözünen jel karışımını, kuyucukların tabanı için işaretin ~ 3-5 mm altına kadar döküm odasına dökün. Hava kabarcıklarından kaçının.
- Jelin üstünde 1 mm'lik eşit bir tabaka elde etmek için yavaşça biraz su dökün ve kabarcıkları çıkarın. Jelin 1 saat ayarlanmasına izin verin.
NOT: Jel oluşumu, su tabakası ile jel tabakası arasında bir faz ayrımı aranarak doğrulanabilir; Jel kaseti eğilse bile jel dökülemez.
- Jeli dökmek için bileşenleri gerekli miktarlarda ekleyerek çözücü jel karışımını yapın. 50 mL'lik bir beherde 3,86 mL suya 2,5 mL Tris-HCl (pH 8,8), %10 jelatin stok çözeltisinden 0,1 mL, 3,34 mL akrilamid-bis akrilamid çözeltisi (ABA), 0,1 mL %10 SDS, 0,006 mL TEMED ve 0,1 mL %10 amonyum persülfat ekleyin ve köpürme ve kabarcıklar olmadan iyice karıştırın. Bahsedilen sistem (Normal Cam Plakalar; 18 x 8 cm) 10 mL çözünen jel karışımı gerektirir.
- İstifleme jeli
- Aşağıdaki bileşenleri karıştırarak istifleme jelini hazırlayın. 10 mL'lik bir beherde 1.84 mL suya 2.5 mL Tris-Cl (pH 6.6), 0.35 mL ABA, 0.03 mL% 10 SDS ve 0.006 mL TEMED ekleyin. 1 mm kalınlığındaki 8 x 10 cm'lik sistem, 3 mL çözücü jel karışımı gerektirir.
- Jel kasetinden, jel kurulumunu bir tarafa eğerek ve toplanan suyu dar bir filtre kağıdı şeridi kullanarak köşeden kurulayarak jelin üst kısmında oluşan suyu boşaltın.
- Adım 2.1.2.1'de belirtilen karışıma 0,03 mL %10 APS ekleyin ve kabarcık oluşturmadan karıştırın.
- İstifleme jelini çözücü jelin üzerine dökün ve tarağı tarak dişlerinin altında hava kabarcıkları oluşturmadan hemen yerine yerleştirin ve çözen jel ile tarak dişlerinin altı arasında 3-5 mm kalınlığında istifleme jeli bırakın. Jelatinin tam polimerizasyonu ve çapraz bağlanması için en az 3 saat bekleyin.
- Alt ara parçayı çıkarın ve jeli elektroforez aparatına sabitleyin.
- Jeli, 1x elektrot tamponu içeren tanka yavaşça yerleştirin ve jelin dibinde sıkışmış hava olmadığından emin olun.
- Jelin çözülmesi
- Numunenin hazırlanması
- Ekstrakta eşit hacimde numune tamponu ekleyin ve SDS'nin proteine bağlanmasına izin vermek için 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Pozitif kontrol olarak eşit hacimde numune tamponu ile 2 μL insan serumu içeren bir numune kullanın.
- Numunenin yüklenmesi
- Numuneyi dar uçlu bir pipet veya bir Hamilton şırınga (0,5-1 mL) ile dikkatlice kuyucuklara yükleyin. Yüklenen numuneleri bozmadan kuyucukların kalan kısımlarını, jelin üst kısmını ve elektroforez ünitesinin üst tankını doldurmak için kademeli olarak elektrot tamponu ekleyin.
NOT: Hamilton şırıngası, çapraz kontaminasyonu önlemek için numuneler arasında iyice yıkanmalıdır.
- Numuneyi dar uçlu bir pipet veya bir Hamilton şırınga (0,5-1 mL) ile dikkatlice kuyucuklara yükleyin. Yüklenen numuneleri bozmadan kuyucukların kalan kısımlarını, jelin üst kısmını ve elektroforez ünitesinin üst tankını doldurmak için kademeli olarak elektrot tamponu ekleyin.
- Elektroforez çalışması
- Elektroforezi jel başına 6 mA'da başlatın ve boya cephesi çözme jeline girene kadar çalıştırın. Ardından, akımı jel başına 12 mA'ya yükseltin ve boya cephesi jelin tabanının 1 cm üzerine ulaşana kadar devam edin.
NOT: Çalışma süresi, kullanılan ABA konsantrasyonuna ve hedef proteinin boyutuna bağlı olarak değişebilir.
- Elektroforezi jel başına 6 mA'da başlatın ve boya cephesi çözme jeline girene kadar çalıştırın. Ardından, akımı jel başına 12 mA'ya yükseltin ve boya cephesi jelin tabanının 1 cm üzerine ulaşana kadar devam edin.
- Standardın bantlarının oryantasyonunun işaretlenmesi
- Elektroforezi tamamladıktan sonra, bir plaka ayırma aleti veya plastik spatula kullanarak cam plakaları dikkatlice sökün ve jelin sağ alt köşesini keserek numune yükleme yönünü işaretleyin ve yakındaki delikler açarak veya jeli tarayarak önceden boyanmış işaretleyici bantları işaretleyin.
- Çözünmüş enzimlerin renatürasyonu
- Jeli Triton X-100 içeren renatüre edici solüsyona bir jel tepsisine batırın ve çalkalamadan oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
NOT: Triton X-100, proteinleri yeniden düzenler, çünkü çözülmüş proteinler içeren zimogram jeli, SDS varlığında denatüre olabilir ve aktivitesini kaybedebilir.
- Jeli Triton X-100 içeren renatüre edici solüsyona bir jel tepsisine batırın ve çalkalamadan oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- Proteaz aktivitesi için inkübasyon
- Renatüre edici solüsyonu, jeli tamamen batıran bir aktivasyon tamponu ile değiştirin ve bir inkübatörde 18 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
NOT: Proteinaz aktivitesini gerektiği gibi karakterize etmek için ilgilenilen proteinazların inhibitörleri veya aktivatörleri ekleyerek aktivasyon tamponunu değiştirin.
- Renatüre edici solüsyonu, jeli tamamen batıran bir aktivasyon tamponu ile değiştirin ve bir inkübatörde 18 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Zymogramın boyanması
- İnkübasyondan sonra, aktivasyon tamponunu çıkarın ve kalan Triton X-100'ü çıkarmak ve çalkalama sırasında köpürmeyi önlemek için jeli 1 dakika boyunca kısa bir süre suyla durulayın.
- Boyama solüsyonunu tepsiye ekleyin ve jelin tamamen suya batırıldığından emin olun. Hasarı önlemek için jeli düşük hızda hafifçe çalkalayın. Jel tamamen maviye dönene kadar boyamaya devam edin.
- Jel yüzeyindeki fazla lekeyi 1 dakika su ile durulayarak çıkarın. Leke giderici solüsyonu tepsiye ekleyin ve hafifçe çalkalayın. Mavi arka plana karşı istenen bant kontrastı elde edilene kadar leke giderme solüsyonunu birkaç kez taze solüsyonla değiştirin.
NOT: Leke giderme işlemini gerçekleştirirken, proteolitik bantların gözlemlenmesine ve kaydedilmesine izin verecek şekilde tamamen lekelenmediğinden emin olmak için jeli sürekli olarak izleyin. - Jeli bir jel dokümantasyon sisteminde veya belge tarayıcıda tarayın ve protein bantlarının moleküler kütlesini protein standartlarıyla karşılaştırarak belirleyin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Sonuç, leptospiral proteinin zimogramını ve insan serumundan elde edilen jelatinazları gösterir. Şekil 1'de gösterilen sonuçlar, proteazları mavi bir arka plana karşı beyaz şeffaf bantlar olarak temsil eder. Bantlar, kopolimerize jelatinin bozulduğu ve dolayısıyla lekelenmediği alanları temsil ederken, tüm jelin diğer alanları jelatinin varlığından dolayı maviye boyanır. Ayrıca, jelatinin aynı zamanda bir protein olmasına rağmen, akrilamid ile kopolimerizasyon nedeniyle elektroforezde ayrışt...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Akrilamid jelin hazırlanması sırasında jelatin, akrilamid polimer matrisi ile birlikte polimerize olur. Sonuç olarak, kopolimerize jelatin, jel içinde hareketsiz kalır ve bir protein olmasına rağmen elektroforez sırasında göç etmez. Elektroforezden sonra, deoksikolat ve 6-aminokaproik asit tamponu kullanılarak ekstrakte edilen doğal proteinler, kütlelerine ve yüklerine göre ayrılır. SDS'yi çıkardıktan sonra, bu proteinler Triton X-100 varlığında yeniden doğaya dönüşür ve aktivitelerini y...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, MGM'ye hibe No.SR/S0/HS/0108/2012 yoluyla verdikleri destek için Yeni Delhi Bilim ve Teknoloji Departmanı, SERB Bölümü'ne şükranlarını sunarlar
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 6-Aminokaproik asit | Merck | A2504 Serisi | |
| Asetik asit | Sigma | 695092 | |
| Aseton | Sigma | 32201 | |
| Akrilamid | Sigma | A-3553 | |
| Amonyum persülfat | Sigma | A-3678 | |
| Bis Akrilamid | Sigma | M7279 Serisi | |
| Sığır serum albümin fraksiyonu V (BSA) | Sigma | A-8022 | |
| Bromofenol Mavisi | Sigma | B-8026 Serisi | |
| CaCl2 | Merck | C4901 (İngilizce) | |
| Coomassie parlak mavi | Sigma | 1.12553 | |
| Deoksikolat | Sigma-Aldrich | D6750 Serisi | |
| Ellinghausen– McCullough– Johnson– Harris (EMJH) orta, Difco | Difco | 279410 | |
| Jelatin | Merck | G9382 Serisi | |
| Gliserol | Merck | G5516 Serisi | |
| Glisin G8790 | Sigma | G-8898 Serisi | |
| Leptospira interrogans serovar Kopenhageni suşu Fiocruz L1-130 (ATCC BAA-1198) , ICMR-RMRC Portblair'in biyolojik deposunda tutulur | ICMR-RMRC Port Blair'in biyolojik deposunda tutulur | Optimum büyüme sıcaklığı 30 ° C | |
| Magnezyum klorür M8266 | Sigma | M8266 Serisi | |
| Metanol | Sigma | 17995-7 | |
| Fosfat tamponlu salin | Sigma | P4417 | |
| Plaka ayırma aracı | Harika Eş | ||
| Rotor | Termobilimsel | FIBERLite F15 8x50 cy | |
| Sodyum dodesil sülfat (SDS) | Sigma | L-4396 | |
| TEMED | Sigma | T-9281 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma Base (TRIS) | Sigma | T6066 Serisi |
Kaynaklar
- Yue, B. Biology of the extracellular matrix. J Glaucoma. 23 (8 Suppl 1), S20-S23 (2014).
- Cabral-Pacheco, G. A., et al. The roles of matrix metalloproteinases and their inhibitors in human diseases. Int J Mol Sci. 21 (24), 1-53 (2020).
- Ambili, M., Jayasree, K., Sudhakaran, P. R. 60K gelatinase involved in mammary gland involution is regulated by β-oestradiol. Biochim Biophys Acta. 1403 (3), 219-231 (1998).
- Zhang, Y. -Z., Ran, L. -Y., Li, C. -Y., Chen, X. -L. Diversity, structures, and collagen-degrading mechanisms of bacterial collagenolytic proteases. Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6098-6107 (2015).
- Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Crit Rev Microbiol. 42 (1), 106-126 (2016).
- Madathiparambil, M. G., Cattavarayane, S., Perumana, S. R., Manickam, G. D., Sehgal, S. C. Presence of 46 kDa gelatinase on the outer membrane of Leptospira. Curr Microbiol. 62 (5), 1478-1482 (2011).
- Kramer, R. A., Zandwijken, D., Egmond, M. R., Dekker, N. In vitro folding, purification and characterization of Escherichia coli outer membrane protease OmpT. Eur J Biochem. 267 (3), 885-893 (2000).
- Kum, S. L., Ho, J. C. S., Parikh, A. N., Liedberg, B. Amphiphilic membrane environments regulate enzymatic behaviors of Salmonella outer membrane protease. ACS Bio Med Chem Au. 2 (1), 73-83 (2022).
- Sarma, A., et al. Extracellular proteome analysis shows the abundance of histidine kinase sensor protein, DNA helicase, putative lipoprotein containing peptidase M75 domain and peptidase C39 domain protein in Leptospira interrogans grown in EMJH medium. Pathogens. 10 (7), 852(2021).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Levy, D., Gulik, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. Phospholipid vesicle solubilization and reconstitution by detergents. Symmetrical analysis of the two processes using octaethylene glycol mono-n-dodecyl ether. Biochemistry. 29 (40), 9480-9488 (1990).
- Lichtenberg, D., Ahyayauch, H., Alonso, A., Goñi, F. M. Detergent solubilization of lipid bilayers: a balance of driving forces. Trends Biochem Sci. 38 (2), 85-93 (2013).
- Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).
- Zeug, A., et al. Current microscopic methods for the neural ECM analysis. Prog Brain Res. 214, 287-312 (2014).
- Madathiparambil, M. G., et al. A zymography analysis of proteinase activity present in Leptospira. Curr Microbiol. 62 (3), 917-922 (2011).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
