Besleyicisiz Koşullar Altında Kültürlenen İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Delesyonuna

Muhammad Abid Sheikh; Farah Helena Afandi; Grazia Iannello; Barbara Corneo; Bright Starling Emerald; Suraiya Anjum Ansari

doi:10.3791/67296

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Besleyicisiz Koşullar Altında Kültürlenen İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Delesyonuna

1.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67296

⸱

1 Kasım 2024

Muhammad Abid Sheikh¹ , Farah Helena Afandi¹ , Grazia Iannello² , Barbara Corneo² , Bright Starling Emerald³^,⁴^,⁵ , Suraiya Anjum Ansari¹^,⁴^,⁵

¹Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine and Health Sciences, United Arab Emirates University, ²Columbia Stem Cell Initiative, Stem Cell Core, Columbia University Irving Medical Center, ³Department of Anatomy, College of Medicine and Health Sciences, United Arab Emirates University, ⁴Zayed Center for Health Sciences, United Arab Emirates University, ⁵ASPIRE Precision Medicine Research Institute Abu Dhabi (PMRI-AD), United Arab Emirates University

Bu makalede

Özet

Sunulan yöntem, yüksek verimli bir lentiviral aracılı gen dağıtım sistemi kullanarak L2HGDH genini hedefleyen sgRNA'ları kararlı bir şekilde ifade eden insan embriyonik kök hücre (hESC) hattı H9'da CRISPR aracılı bir gen nakavtının oluşturulmasını açıklar.

Özet

Genom düzenleme için CRISPR-Cas9 sistemi, kök hücreler de dahil olmak üzere memeli hücrelerinde gen fonksiyonu çalışmalarında devrim yarattı. Bununla birlikte, bu tekniğin, özellikle pluripotent kök hücrelerde pratik uygulaması, zaman ve emek yoğun olması ve düşük düzenleme verimliliğine sahip olması gibi bazı zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Burada, yüksek verimli ve stabil bir lentiviral aracılı gen dağıtım sistemi kullanarak, L2HGDH geni için sgRNA'ları kararlı bir şekilde ifade eden bir insan embriyonik kök hücre (hESC) hattında CRISPR aracılı bir gen nakavtının oluşturulmasını açıklıyoruz. L2HGDH geninin ekzon 1'ini hedefleyen sgRNA'lar kimyasal olarak sentezlendi ve hESC enfeksiyonu için daha yüksek lentiviral titreler ve puromisin kullanılarak stabil seçim elde etmek için sgRNA'ların yapısal ekspresyonunu Cas9 ile yüksek verimli bir tek vektör sisteminde birleştiren lentiCRISPR v2-puro vektörüne klonlandı. Puromisin ile seçilen hücreler daha da genişletildi ve sınırlı seyreltme yöntemi kullanılarak tek hücreli klonlar elde edildi. Tek klonlar genişletildi ve Western blot analizi kullanılarak L2HGDH ekspresyonunda %100'lük bir azalma ile doğrulandığı gibi, L2HGDH geni için birkaç homozigot nakavt klonu elde edildi. Ayrıca, MSBSP-PCR kullanılarak, CRISPR mutasyon bölgesi, seçilen homozigot klonlarda Cas9'un PAM tanıma dizisinin yukarı akışında haritalandı. Kesin ekleme/silme işlemlerini analiz etmek için Sanger dizilemesi yapıldı ve klonların fonksiyonel karakterizasyonu yapıldı. Bu yöntem, daha önce bildirilen viral olmayan gen verme yöntemlerine kıyasla önemli ölçüde daha yüksek bir homozigot delesyon yüzdesi üretti. Bu rapor L2HGDH genine odaklansa da, bu sağlam ve uygun maliyetli yaklaşım, gen fonksiyon çalışmaları için pluripotent kök hücrelerdeki diğer genler için homozigot nakavtlar oluşturmak için kullanılabilir.

Giriş

İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC'ler) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler), vücuttaki tüm hücre tiplerine farklılaşma potansiyeline sahip kök hücrelerdir. Bu hücreler, insan gelişimini incelemenin yanı sıra çeşitli hastalıkların altında yatan mekanizmaları anlamak için değerli araçlar olarak hizmet eder ve böylece rejeneratif tıp, hastalık modellemesi ve ilaç keşfi için muazzam bir umut vaat eder. Bu tür çalışmalar, belirli genlerin organizmaların gelişimine, işleyişine ve düzenlenmesine nasıl katkıda bulunduğunun araştırılmasını içerir ^1,2.