Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Triton X-114 Tabanlı Fraksiyonasyon Yaklaşımı Kullanılarak Leptospira'da Hücre Altı Proteinlerin Zenginleştirilmesi

1.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67298

⸱

8 Ağustos 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, ICMR - Regional Medical Research Centre, 2Department of Chemistry & Molecular Biology, University of Gothenburg

Bu makalede

Özet

Prokaryotlar organel bir sistemden yoksun olsalar da, lokalize proteinlere sahip hücre altı bölgeler vardır. Hücre altı bölgelerdeki enzim ve proteinlerin kantitatif ve kalitatif analizleri, ilaç ve aşı hedeflerinin geliştirilmesi için önemlidir. Burada, Triton X-114 ve analizini kullanarak Leptospiral proteinlerin hücre altı fraksiyonasyonunu gösteriyoruz.

Özet

Prokaryotlar kesin hücre altı organellerden yoksundur, ancak çoğu biyokimyasal ve fizyolojik fonksiyonun düzenlendiği sitoplazma, iç zar, periplazma ve dış zar gibi farklı bölgeler sergilerler. Bu nedenle, proteinlerin fonksiyonel özelliklerinin anlaşılması, hücre altı lokalizasyonlarının aydınlatılmasını gerektirir. Bununla birlikte, gram negatif bakterilerden hücre altı proteinlerin ekstrakte edilmesi, karmaşık fosfolipid çift tabakaları nedeniyle zorluklar doğurur. Triton X-114, dış zar proteini (OMP) ekstraksiyonunda umut vaat etmesine rağmen, özlü bir protokol belirsizliğini korumaktadır. Bu protokol, spiroket Leptospira'yı model olarak kullanarak hücre altı proteinleri çıkarmak için adım adım bir iş akışını gösterir. Hücre altı fraksiyonlama ve faz ayrımını içeren bu teknik, sitoplazmik, dış ve iç zar proteinleri için farklı fraksiyonlar verir. Deterjan Triton X-114, optimum bulutlanma noktası sıcaklığı (~ 22 ° C) ve düşük kritik misel konsantrasyonu (CMC) nedeniyle faz ayırma için çok uygundur ve minimum denatürasyon ile doğal proteinlerin verimli bir şekilde ekstraksiyonunu ve saflaştırılmasını sağlar. Özellikle, analiz, sitoplazmadan farklı iç ve dış zarlardan proteinleri ayırt etmedeki etkinliği ortaya koymaktadır.

Giriş

Hücre altı proteomik (SCP) analizler, bakteri hücrelerinin belirli hücre altı bölmelerindeki proteomu analiz ederek bakteriyel patogenezin aydınlatılmasında çok önemli bir rol oynar. Bu hücre altı proteomik yaklaşım, bakteri proteinlerini farklı bölmeler içinde karakterize eder, yüksek oranda proteinleri dışlayarak karmaşıklığı azaltır ve bunların organizasyonu ve orantılı bolluğu hakkında bilgi sağlar 1,2. Örneğin, hücre altı fraksiyonlama ve LC-MS/MS tekniklerini kullanarak, Shewanella oneidensis üzerine yapılan bir çalışma, proteomunun önemli bir bölümünü ortaya çıkardı ve hücre ve protein bolluğunun bölme mimarisi ile ilgili önemli ayrıntılar sağladı. Bu çalışma, gram-negatif bakteriler3 içindeki hücre altı organizasyona ilişkin sonraki araştırmalar için temel bir çerçeve görevi görmektedir. Bakteriyel patogenez alanında, in vivo enfeksiyon sırasında bakteri proteomunun tanımlanması, patojeniteyi tetikleyen mekanizmaları anlamak için zorunludur4. Çeşitli enfeksiyon aşamalarında epitel hücreleri içinde hücre içi Salmonella proteomunun araştırılması, bakteriyel patojenler tarafından hücre içi ortamlarında kullanılan adaptif stratejilerin ortaya çıkarılmasında etkili olmuştur 4,5. SCP stratejileri, çeşitli hücresel bölmeler içindeki protein bolluğunu ve translokasyonunu değerlendirerek hücresel dinamikler hakkında kapsamlı bilgiler sağlar. Bu yöntem, çeşitli bakteri bölmelerinden proteinlerin kapsamlı bir şekilde tanımlanmasını kolaylaştırarak, bakteri proteomlarının kapsamlı analizini geliştirir 6,7.

Proteinlerin hücre altı dağılımı sadece fonksiyonel aktivitelerini belirlemekle kalmaz, aynı zamanda fonksiyonel çeşitliliklerini de arttırır8. Örneğin, enzimler, hücre altı lokalizasyonlarına bağlı olarak çeşitli düzenleyici mekanizmalar ve aktivite seviyeleri sergilerler. Örneğin transglutaminazlar (TGazlar), polen tüplerindeki farklı hücre altı bölmeler boyunca farklı roller veya düzenleyici mekanizmalar gösterir: sitoplazmik TGazlar, hücre iskeleti ile etkileşime girerek Ca(2+)'ya bağımlı bir şekilde sitozolik proteinlere (örneğin, aktin ve tübülin) birincil aminleri dahil eder; membran Gazlar, Golgi ve plazma membranları ile ilişkilidir, bu da ekzositotik iletimde bir rol olduğunu düşündürür; ve hücre duvarı ile ilişkili TGazlar, hücre duvarı belirteçleri ile birlikte lokalize olarak apikal büyümeyi düzenler. Bu işlevsel ayrımlara bölmeye özgü rolleraracılık eder 9. Ayrıca, bakteri zarfındaki oksitlenmiş proteinlerin onarımı, reaktif oksijen türlerine maruz kalan belirli hücresel bölmelerdeki enzim sistemlerinin kritik rolünün altını çizer10. Hücre altı lokalizasyonu lipid modifikasyonları ile modüle edilen ve çeşitli hücresel zarlarla etkileşimini etkileyen endotelyal nitrik oksit sentazı (eNOS) düşünün11. Enzim bölümlendirmesi, enzimler ve substratlar arasındaki etkileşimlere elverişli farklı ortamları korur, böylece bölmeye özgü metabolik süreçleri kolaylaştırır12.

Bakteriler ve diğer prokaryotların berrak hücre altı organelleri yoktur; Sitoplazma, iç zar, periplazma ve dış zar dahil olmak üzere farklı bölgeler vardır. Organizmadaki biyokimyasal ve fizyolojik fonksiyonların çoğu çeşitli alt mahzen bölmelerinde düzenlenmiştir13. Bu nedenle, proteinlerin hücre altı lokalizasyonu, fonksiyonel özelliklerini tahmin etmek için önemlidir. Bununla birlikte, gram negatif bakterilerden hücre altı proteinlerin ekstrakte edilmesi, karmaşık çift zarlı fosfolipid çift tabakaları nedeniyle zorluklar doğurur. Sodyum dodesil sülfat (SDS) gibi deterjanlar ve üre gibi katkı maddeleri kullanan geleneksel ekstraksiyon yöntemleri, genellikle membran protein bütünlüğünü tehlikeye atarak aşağı akış analizlerini etkiler14,15. Ayrıca, lipit bileşimi, zar proteinlerinin konformasyonel değişikliklerinin şekillendirilmesinde önemli bir rol oynar. Çözündürmenin başarısı, deterjan-lipit-protein oranı gibi faktörlere bağlıdır, çünkü işlem, lipit çift tabakasına deterjan eklenmesini ve ardından protein çözünmesiniiçerir 16. Deterjan seçimi, bulutlanma noktası sıcaklığı ve inkübasyon süresi17 gibi faktörler göz önüne alındığında, membran proteinlerini etkili bir şekilde çözündürmek için kritik öneme sahiptir. Lipid ortamı, zar proteinlerinin18,19 konformasyonel değişikliklerini etkileyebilir.

Deterjanlar, membran proteinlerinin biyolojik membranlardan ekstrakte edilmesi ve sonraki protein saflaştırılması için bir ön koşul olan sulu çözeltilerde çözünürlüklerini sağlamak için gereklidir. Bununla birlikte, zar proteinlerinin saflaştırılması genellikle zordur, çünkü bunlar doğal lipid zar ortamlarından çıkarılır ve zarın fiziksel ve kimyasal özelliklerini yalnızca kısmen kopyalayan bir deterjan tamponuna yerleştirilir20. Ekstraksiyondan sonra, zar proteinleri tipik olarak çözünür proteinler olarak diyaliz, protein çökeltme ve bazı kromatografi yöntemleri kullanılarak sonraki işlemlerde saflaştırılır20,21. Faz ayırma, kromatografi tabanlı saflaştırma protokollerine güçlü bir alternatif veya tamamlayıcı sunar ve doğrudan çözündürülmüş proteinlere uygulanabilir. Temel olarak, faz ayrımı, integral membran proteinlerinin, deterjanla seyreltilmiş sulu fazda deterjanla zenginleştirilmiş faza ve sitozolik proteinlere bölünmesine izin verir20,22. Daha önceki çalışmalarda zar proteinlerinin çözündürülmesinde çeşitli deterjanların kullanıldığı tarif edilmiştir20. Bunlar arasında Triton ailesi (Triton X-100 ve Triton X-114), Tween ailesi (Tween-20 ve -80), anyonik deterjanlar, katyonik deterjanlar, polioksietilen glikol monoeter deterjanlar vb. bulunur, ancak proteinlerin yapısı ve işlevi açısından artıları ve eksileri vardır20. Bu deterjanların fizikokimyasal özellikleri, zar proteinlerinin faz bölünmesini ve çözünmesini büyük ölçüde etkiler20. Deterjanlar, polar bir kafa grubuna ve hidrofobik bir hidrokarbon zincirine sahip amfipatik moleküllerdir. Düşük konsantrasyonlarda suda monomer olarak bulunurlar. Kritik misel konsantrasyonunun (CMC) üzerinde, boyutları deterjan tipine bağlı olan miseller oluştururlar ve toplama numarası misel başına molekül sayısını gösterir (misel moleküler ağırlığı olarak da adlandırılır). Bir diğer önemli faktör, bulanıklaşan ve sonunda iki ayrı faz oluşturan sulu bir misel deterjan çözeltisinin sıcaklığının değiştirilmesiyle ulaşılabilen "bulutlanma noktası"dır. Bu işlem, faz ayırma veya bulutlanma noktası ekstraksiyonu olarak bilinir. Yüksek bir CMC, daha zayıf bağlanmaya sahip yüksek deterjan konsantrasyonlarına karşılık gelen daha fazla membran proteini verebilir ve bu, tanımlanmış bir deterjan konsantrasyonuna sahip bir tampona karşı diyalize edilebilir20. Bununla birlikte, çoğu deterjanda yüksek bir CMC'ye ulaşmak, ekstrakte edilen protein yapısını ve işlevini etkileyebilen ve sonraki süreçleri etkileyebilen yüksek bir bulutlanma noktası sıcaklığı gerektirir. Bu aşamadaki yüksek deterjan konsantrasyonu bile protein için zararlı olabilir ve yüksek viskozite nedeniyle hassas hacimlerde pipetleme için sıvı kullanımında sorunlara neden olabilir. Örneğin, triton X-100, deterjan miselinde 64-65 ° C'lik bulutlanma noktası sıcaklığının üzerinde yüksek bir membran proteini verimine sahiptir. Çalışma sıcaklığını korumak için,% 9 -% 23 (NH4)2ÖYLE4 veya% 16 -% 25 NaCl ilavesi oda sıcaklığına (RT) düşürülebilir, bu da yüksek konsantrasyonda deterjan ile sonuçlanır ve bu da muhtemelen protein stabilitesini etkiler. Benzer şekilde, ara tabanlı ekstraksiyon yüksek bir bulutlanma noktası sıcaklığı kullanır (ara 20 için 76 °C ve ara 80 için 93 °C). Anyonik deterjan SDS, protein uygulamalarında sıklıkla kullanılır, ancak genellikle proteinleri denatüre eder20. Membran proteinlerini verimli bir şekilde ekstrakte etmeyi amaçlayan araştırmacılar, Triton X-114'ü, membran proteini çalışmaları için ideal olan yaklaşık 22 °C'lik optimum bulutlanma noktası sıcaklığı nedeniyle klasik bir deterjan olarak tanımladılar. İlk olarak 1981 yılında Bordier tarafından tanıtılan Triton X-114, o zamandan beri hayvan ve bitki dokularının yanı sıra mikroorganizmalar da dahil olmak üzere çeşitli kaynaklarda membran proteini ekstraksiyonu ve saflaştırılması için yaygın olarak kullanılmaktadır20,22. Triton X-114'ün düşük CMC'si diyaliz ile uzaklaştırılmasını önler; Bununla birlikte, hafif yapısı, deterjanla zenginleştirilmiş fazda zar proteinlerinin denatürasyonunu en aza indirir. Ek olarak, Triton X-114, Triton X-100'e kıyasla daha küçük miseller (n = 7-8) oluşturur20. James G. Pryde'ın çalışma protokolü, kültürlenmiş memeli hücrelerinden membran proteini ekstraksiyonu için Triton X-114'ü kullandı. 20 ° C'nin üzerinde bir bulutlanma noktası sıcaklığı kullanılarak (3 dakika boyunca 30 ° C'de inkübasyon), entegre membran proteinleri deterjanla zenginleştirilmiş faza bölünürken, periferik ve sitozolik proteinler deterjanla tükenmiş sulu fazdan geri kazanıldı22. Ayrıca, David A. Haake ve ark. dış zar proteinlerini (OMP'ler) çıkarmak için Triton X-114'ü kullandılar. Leptospira interrogans, CaCl ile ve CaCl olmadan2 katkı maddesi olarak23,24. Daha sonraki çalışmalar, Triton X-114'ün OMP'leri gliserol veya CaCl gibi katkı maddeleri olmadan hücre altı bölmelerden etkili bir şekilde çıkardığını doğruladı225,26. Bununla birlikte, tuzların dahil edilmesi deterjan konsantrasyonunu artırabilir, bu da yüksek verimli kütle spektrometresi kullanan büyük ölçekli proteom çalışmalarını etkileyebilir20. Hücre altı proteom analizi konusundaki çalışmamızda, tandem kütle spektrometresi ile birlikte Triton X-114'ü kullandık ve sitoplazmik, iç zar ve dış zar proteinleri dahil olmak üzere tüm hücre altı bölmelerde önemli bir zenginleştirme elde ettik25,26. Bu protokolün birincil amacı, tipik bir gram-negatif bakteri hücresinin hücre altı bölmelerini verimli bir şekilde zenginleştirirken, sonraki süreçlerdeki sorunları en aza indirmektir. Ek olarak, protokol uygun maliyetli ve zaman açısından verimli olacak şekilde tasarlanmıştır. Burada, hücre altı protein izolasyonu için laboratuvarda geliştirilen optimize edilmiş protokolü detaylandırıyor ve ekstraksiyon işlemi sırasında karşılaşılan her bir darboğazı tartışıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Bu protokol, hücre altı protein ekstraksiyon deneyi için Leptospira sorgulayıcılarını kullanır. Bu protokol diğer gram negatif bakterilerle kullanım için uyarlanabilirken, spesifik araştırma hedeflerine bağlı olarak optimizasyon gerekli olabilir. Malzeme Tablosu ve Tablo 1 , sırasıyla tamponların ve reaktif çözeltilerinin bileşimleri ile birlikte kimyasalların ve ekipmanın listesini sağlarken, Tablo 2 laboratuvar tesislerini özetlemektedir.

1. Leptospira suşu ve kültür koşulları

  1. L. interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae serovar Kopenhageni suşu Fiocruz L1-130'u elde edin.
    NOT: Bu suş, leptospirosis teşhisi, referansı, araştırması ve eğitimi konusunda uzmanlaşmış bir DSÖ işbirliği merkezi olan Hindistan Tıbbi Araştırma Konseyi - Hindistan'ın Port Blair kentindeki Bölgesel Tıbbi Araştırma Merkezi'nden elde edilmiştir.
  2. % 1 sığır serum albümini (BSA) ile desteklenmiş 50 mL Ellinghausen McCullough Johnson Harris (EMJH) ortamında Leptospira'yı (~ 1 × 106 hücre / mL içeren aşı) büyütün.
  3. Kültür orta log büyüme fazına (3.5 × 108 hücre / mL) ulaşana kadar 30 ° C'de inkübe edin. Ortamın kontamine olmadığından emin olmak için kültürlenmiş ortamın alikotlarını besleyici agar plakaları üzerinde test edin.
    NOT: Hücreleri saymak için karanlık alan mikroskobu ve bir Petroff-Hausser sayma odası kullanın. Ayrıntılar için daha önce yayınlanmış bir makaleyebakın 27.

2. Hücre toplama

  1. 7 günlük bir inkübasyon süresinden sonra, L. interrogans kültürünün üç biyolojik kopyasını eşit hacimlerde (her biri 25 mL) santrifüj tüplerine aktarın.
    NOT: Leptospira kültürü, transfer sırasında bir BSL-2 laboratuvar tesisinde bir Laminer hava akış başlığı içinde işlendi.
  2. Tüm tüpleri 2500 × g'da 4 °C'de 45 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice dezenfektan içeren bir behere boşaltın ve atın. Bir sonraki adım için hücre peletini kullanın.
  3. Hücre peletlerini 5 mM MgCl2 ile desteklenmiş fosfat tamponlu tuzlu su ile (her seferinde 1 mL) üç kez yıkayın, her yıkamadan sonra 4 ° C'de 10 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüjleyin.
    NOT: Bu adım, EMJH ortamında bulunan istenmeyen BSA'yı hücre peletinin yüzeyinden uzaklaştıracaktır.

3. Hücre altı protein ekstraksiyonu

  1. Triton X-114 ekstraksiyonu
    1. Hasattan sonra elde edilen Leptospira hücre peletini, hasat edilen pelet başına 10 mL oranında 10 mM Tris-Cl (pH 8),% 1 Triton X-114 ve 150 mM NaCl içeren bir ekstraksiyon tamponu ile muamele edin (Tablo 1) (İsteğe bağlı -deneysel amaca göre bir proteaz inhibitörü kokteyli eklenebilir).
      NOT: Prosedür, membran proteinlerini çıkarmak için ekstraksiyon tamponu ekleyerek bakterileri bir deterjan çözeltisine maruz bırakmayı içerir.
    2. Çözelti görsel olarak bulanık hale gelene kadar 25 °C'nin altında bir mikropipet kullanarak ekstraksiyon tamponunu pelet ile nazikçe karıştırın.
    3. Karışımı gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
    4. Elde edilen ekstraktı tekrar bir mikropipet ile karıştırın ve 15.000 × g'da 4 °C'de 30 dakika santrifüjleyin.
    5. Süpernatanı başka bir şişeye boşaltın ve sonraki ekstraksiyon işlemleri için hücre peletini saklayın.
      NOT: Bu süpernatant, sitoplazma ve dış zardan bol miktarda hidrofilik ve hidrofobik proteinlerin bir karışımını içerir ve faz ayrımı için kullanılır.
    6. Hücre peletine 10 mM Tris-Cl (pH 8), 8 M üre, bir proteaz inhibitör kokteyli ve% 1 sodyum dodesil sülfat (SDS) içeren 50 μL tampon ekleyin.
    7. Ekstraksiyon tamponunu ekledikten sonra karışımı 5 dakika boyunca sürekli olarak girdaplayın, ardından 4 ° C'de 5 dakika daha inkübe edin.
    8. Karışımı 15.000 × g'da 4 ° C'de 30 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin ve elde edilen süpernatanı pelet fraksiyonu (P) olarak belirleyin.
      NOT: Pelet fraksiyonunun Leptospira25,26'da yüksek miktarda iç zar proteini içerdiği bulunmuştur.
  2. Faz bölümü
    1. Ekstraksiyondan elde edilen süpernatantın Triton X-114 konsantrasyonunu% 2'ye ayarlayın. Örneğin, süpernatan hacmi 900 μL ise, istenen konsantrasyonu elde etmek için 9 μL Triton X-114 deterjan ekleyin.
    2. Karışımı 37 °C'de 1 saat inkübe edin, ardından 2000 × g'da 30 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Bu düşük hızlı santrifüjleme, fazların ayrılmasını hızlandırabilir.
    3. Karışımın iki farklı faza ayrılmasına izin verin: sulu ve deterjan. Görünür ayırma elde etmek için düşük hızda uygun santrifüjlemeyi sağlayın. Gerekirse, izolasyondan önce 1 dakika oturmasına izin verin. Ayrılma gerçekleşmezse, 3.2.2 adımını gerektiği kadar tekrarlayın.
      NOT: Faz ayrımı görsel olarak, bir spektrofotometre kullanılarak bulanıklık ölçümleri veya statik ışık saçılımı yoluyla gözlemlenebilir. Bulutlanma noktası testinin doğruluğunu artırmak için, çözeltiye 500 nM konsantrasyonda hidrofobik bir boya (5-Hekzadekanoil-aminoeozin) ekleyin ve ultraviyole görünür spektroskopi (UV-VIS) ile analiz edin.
    4. Arayüzü steril bir şırınga ile delerek ve ayrı bir şişeye aktararak üst sulu fazı izole edin. Alt deterjan fazını bir mikropipet kullanarak izole edin ve ayrı bir şişede saklayın.
      NOT: Ayırma işlemi sırasında her iki fazı da içeren şişeyi dikkatli bir şekilde kullanın. Şişeyi bir şırınga ile delmeden önce, iğne kırılmasını veya üst sulu fazın çıkarılmasında zorluk çekmeyi önlemek için kapağını açın. Bir şırınga kullanmak, ayırma işleminden sonra her fazın daha doğru hacim ölçümünü sağlar ve fazlar arasındaki protein çapraz kontaminasyonunu en aza indirir.
    5. Fazları sulu (A) ve deterjan (D) olarak etiketleyin ve ileride kullanmak üzere -20 °C'de saklayın.

4. Protein tahmini

  1. Bikinkoninik tahlil28 veya diğer uygun yöntemleri kullanarak her bir Triton X-114 fraksiyonunun (sulu, deterjan ve pelet) protein konsantrasyonlarını değerlendirin.

5. Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) jel elektroforezi

NOT: Her fraksiyondan (sulu, deterjan, pelet) proteinler, onları azaltmak için beta-merkaptoetanol ile muamele edilmeli, daha sonra %10 SDS-PAGE (üç biyolojik kopya) kullanılarak ayrılmalıdır. %10 SDS-PAGE tarifi Tablo 1'de bulunabilir. Protein örneği hedeflemesi için, herhangi bir enzim aktivitesi analizinin, yerel PAGE'de çözülebilecek yerel bir formda yapılması gerekir.

  1. Protein numunesini, numunenin hacminin dört katı kullanarak buz gibi soğuk asetonda yeniden süspanse edin. Karışımı -20 °C'de en az 2 saat inkübe edin, ardından 14.000 × g'da 10 dakika santrifüjleyin. Ek olarak, pelet fraksiyonunu %80 buz gibi soğuk asetonda yeniden süspanse edin, ardından 5 °C'de 4 dakika inkübe edin. Aşırı üre tuzu kristallerini çıkarmak için 14.000 × g'da 10 dakika santrifüjleyin.
  2. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı dikkatlice çıkarın ve protein peletini, kalan tüm aseton şişelerden buharlaşana kadar kuru bir banyoya koyun.
  3. Protein örneklerini beta-merkaptoetanol içeren 20 μL'lik örnek tamponunda inkübe edin, ardından bir su banyosunda veya kuru banyoda 10 dakika boyunca 95 ° C'de ısıtın.
    NOT: Burada protein örnekleri, sitoplazmik proteinleri içeren sulu (A) fraksiyonunu, dış zar proteinlerini içeren deterjan (D) fraksiyonunu ve iç zar proteinlerini içeren pelet (P) fraksiyonunu temsil eder.
  4. A, D ve P içeren numuneleri, önceden boyanmış bir protein markörü (M) ve toplam protein (T) ile birlikte% 10 SDS-PAGE jelinin her bir oyuğuna yükleyin.
    NOT: Toplam protein, 20 μL numune tamponu kullanılarak üç fraksiyonun da tek bir şişede bir araya getirilmesiyle hazırlanabilir.
  5. Elektroforez cihazında 1x elektrot tamponu kullanın (Tablo 1). Jel çalışma parametrelerini istifleme jeli için 6 mA ve çözme jeli için 12 mA olarak ayarlayın. Elektroforezi RT'de çalıştırın.
  6. Jeli Coomassie Brilliant Blue G veya laboratuvarda bulunan diğer protein boyaları ile boyayın.

6. İmmünoblotlama

  1. Jel ayrıldıktan sonra, lekelenmemiş jeli transfer tamponunda (25 mM Tris bazı, 190 mM glisin,% 20 metanol) 5 dakika inkübe edin.
  2. Uygun büyüklükteki kurutma kağıtlarını immünoblot transfer tamponunda 5 dakika inkübe edin, ardından bunları sandviçin alt tabakası olarak birleştirin.
  3. Lekelenmemiş jellerden proteinleri aktarmak için poliviniliden florür (PVDF) membranları veya nitroselüloz membranları kullanın. PVDF membranını 30 saniye boyunca mutlak metanole batırarak başlayın, ardından immünoblot transfer tamponunda 5 dakikalık bir bekletme yapın. Daha sonra, kurutma sandviçine entegre edin.
  4. Şimdi, transfer tamponundan çıkarılan lekesiz jeli yerleştirin ve transfer kurutma sandviçinde kullanın.
  5. Son olarak, sandviçi üzerine başka bir kurutma kağıdına koyarak örtün, sıkışan hava kabarcıklarını bir leke silindiri ile serbest bırakın ve aktarımı yarı kuru bir transfer yöntemi kullanarak çalıştırın.
    NOT: Laboratuvar olanaklarına bağlı olarak kuru ve ıslak transfer dahil olmak üzere diğer yaklaşımlar kullanılabilir.
  6. Membranı 2 saat boyunca bir bloke edici tampona (TBS-0.1% Tween 20 [TBS-T] içinde% 8 yağsız süt) daldırın, ardından Leptospira lipoprotein LipL41'i hedefleyen monospesifik antiserumlar * ile 4 ° C'de gece boyunca inkübasyon yapın LipL41 (1: 5000) veya kamçılı filament 35 kDa çekirdek proteini (FlaB) (1: 4000) (* özel antikor). Membranı TBS-T ile üç kez durulayın ve her durulamanın 5 dakika devam etmesine izin verin.
    NOT: İlgilendiğiniz herhangi bir antikoru kullanın. Antikorların seyreltme faktörü değişebilir.
  7. Membranı, RT'de 2 saat boyunca yaban turpu peroksidaz (HRP) IgG (1: 20000 seyreltme) ile konjuge edilmiş bir fare anti-tavşan ikincil antikoru ile inkübe edin.
  8. Protein bantlarını görselleştirmek için zarı elektrokemilüminesans (ECL) reaktifine maruz bırakın.
  9. Membranı karanlık bir odada maviye duyarlı X-ışını filmi altına yerleştirin.
    NOT: Geliştirilen diğer yöntemler de kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu deneyde, hücre altı bölmeleri çıkarmak için spiroket Leptospira'yı model organizma olarak kullandık. İyonik olmayan bir deterjan olan Triton X-114'ün etkinliğinden yararlanarak bulutlanma noktası ve kritik misel konsantrasyonuna (CMC) bağlı stratejik bir metodoloji kullandık (Şekil 1). Daha fazla ilerlemeden önce, tek bir biyolojik kopya için her bir fraksiyondaki konsantrasyonu değerlendirmek için protein tahmini yapıldı. Sulu (A): Deterjan (D): Pelet (P) fraksiyonlarında 3:1:1....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Hücre altı fraksiyonlama teknikleri, sonraki analizler için ayrı hücresel bileşenlerin izolasyonunda çok önemli bir rol oynar. İyonik olmayan bir deterjan olan Triton X-114, numuneleri farklı fazlara ayırma kabiliyeti nedeniyle bu tekniklerde yaygın olarak kullanılır ve çeşitli hücresel bileşenlerin ayrılmasına izin verir32. Triton X-114, idrar hücre dışı veziküller, Golgi zarları, bakteri zarları ve Borrelia burgdorferi ve Leptospira interrogans...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, çatışan herhangi bir mali çıkarları olmadığını beyan etmişlerdir.

Teşekkürler

Yazarlar, Hibe No aracılığıyla sağlanan mali destek için Hindistan'ın Yeni Delhi kentindeki Hindistan Tıbbi Araştırma Konseyi'ne içten teşekkürlerini sunarlar. Leptos/22/2013-ECD-I-2012-2400 ve Bilim ve Teknoloji Bölümü, Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu, Yeni Delhi, Hindistan, Hibe No. aracılığıyla sağladıkları finansman desteği için. SR/SO/HS/0108/2012'den M.G.M.'ye Ek olarak, yazarlar, Hibe No aracılığıyla Kıdemli Araştırma Bursu verdikleri için Hindistan, Yeni Delhi, Hindistan'daki Hindistan Tıbbi Araştırma Konseyi'ne takdirlerini sunarlar. ICMR-SRF 2020-0756/PROTEOMICS- BMS, Burs/131/2022-ECD-II-2021-8230 sırasıyla HP'ye ve AS'ye ve Bilim ve Teknoloji Bölümü, Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu, Yeni Delhi, Hindistan, Hibe No. PDF/2017/000343 - S.A.D.C.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Asetik asit  Sigma  695092
Aseton    Sigma  32201
Akrilamid    Sigma  A-3553
Amonyum persülfat    Sigma  A-3678
Denge  ŞİMADUZ  Z741079
Bis Akrilamid    Sigma  M7279 Serisi
Sığır serum albümin fraksiyonu V (BSA)  Sigma  A-8022
Bromofenol Mavisi    Sigma  B-8026 Serisi
Santrifüj Tüpü (50 mL)Tarson'lar500020
Kapaklı Konik Matara (150 mL)Tarson'lar431030
Soğutma santrifüjü  Eppendorf Belediyesi  5355316200
Coomassie parlak mavi    Sigma1.12553
Karanlık alan mikroskobu  ZEİSS  GmbH37081
Hassas Görev MendilleriKimtech Bilim34155
Kuru banyo  Eppendorf Belediyesi  535531620
Ellinghausen– McCullough– Johnson– Harris (EMJH) orta, Difco  Difco  279410
Jel tepsileri: Jel tepsileri en az 2cm daha geniş boyutlarda olmalı ve düz ve düz bir yüzeye sahip olmalıdır.   Hoefer  Uygulanamaz
Cam Gaga (150 mL)Tarson'lar421030
Glisin G8790    Sigma  G-8898 Serisi
Immobilon Kurutma Filtre KağıdıKırlangıçIBFP0813C
Immunoblot yarı kuru kurulum  ATTA  AE-6675 Serisi
İnkübatör - Jel tepsilerini 37&°C'de 18 saat inkübe etmek için.  GÖZ  SLI-700 Serisi
Laminer hava akışı  Uygulanamaz  Uygulanamaz
Luminol  Sigma  09253
Magnezyum klorür M8266  Sigma  M8266 Serisi
Manyetik karıştırıcı  TARSONLAR  6040
Metanol    Sigma  17995-7
Mikropipet Uçları (10 µ L– 10 mL)AxygenT-10, T-200-C, T-1000-C, T-10ML-C
Mikropipetler  Eppendorf Belediyesi  EP2231300010
Mikrotüpler (1,5 mL Güvenli Kilit)Eppendorf BelediyesiEP022363212
Mini döndürme  Soy  GEN-MINI-6K
Çok modlu okuyucuBMG LABORATUVAR TEKNOLOJİSİ  S/N 413-3877
Yağsız kurutulmuş süt, sığırSigma-AldrichM7409 Serisi
P-Kumarik asit    Sigma  C9008
Fosfat tamponlu salin    SigmaP4417 
Buzdolabı  LG  GC-B217BLJ2
Rocker - Jeli boyamak için düşük hızda sallanan veya döner çalkalayıcı.  TARSONLAR  4080
SDS-SAYFA KURULUMU- Elektroforez Aparatı  Hoefer, Inc.  SE300-10A-1.0 Serisi  Hoefer modeli ' miniVE' 10 cm x 8 cm boyutunda jel dökebilen 1 mm kalınlığında. 
Sodyum klorür      Sigma  5886
Sodyum dodesil sülfat (SDS)    Sigma  L-4396
TEMED    Sigma  T-9281
Triton X-114    Sigma648468
Trizma Baza (TRIS) T6066    Sigma  T6066 Serisi
Girdap  TARSONLAR  3020

Kaynaklar

  1. Curreem, S. O. T., Watt, R. M., Lau, S. K. P., Woo, P. C. Y. Two-dimensional gel electrophoresis in bacterial proteomics. Protein Cell. 3 (5), 346-363 (2012).
  2. King, B. R., Latham, L., Guda, C. Estimation of subcellular proteomes in bacterial species. Open Appl Informatics J. 3 (1), 1-11 (2009).
  3. Brown, R. N., Romine, M. F., Schepmoes, A. A., Smith, R. D., Lipton, M. S. Mapping the subcellular proteome of Shewanella oneidensis MR-1 using Sarkosyl-based fractionation and LC−MS/MS protein identification. J Proteome Res. 9 (9), 4454-4463 (2010).
  4. Cash, P. Investigating pathogen biology at the level of the proteome. Proteomics. 11 (15), 3190-3202 (2011).
  5. Liu, Y., et al. Temporal regulation of a Salmonella Typhimurium virulence factor by the transcriptional regulator YdcR. Mol Cell Proteomics. 16 (9), 1683-1693 (2017).
  6. Rey, S., Gardy, J. L., Brinkman, F. S. Assessing the precision of high-throughput computational and laboratory approaches for the genome-wide identification of protein subcellular localization in bacteria. BMC Genomics. 6 (1), 162(2005).
  7. Lietzén, N., et al. Quantitative subcellular proteome and secretome profiling of influenza A virus-infected human primary macrophages. PLoS Pathog. 7 (5), e1001340(2011).
  8. Arioka, Y., Watanabe, A., Saito, K., Yamada, Y. Activation-induced cytidine deaminase alters the subcellular localization of Tet family proteins. PLoS One. 7 (9), e45031(2012).
  9. Del Duca, S., Faleri, C., Iorio, R. A., Cresti, M., Serafini-Fracassini, D., Cai, G. Distribution of transglutaminase in pear pollen tubes in relation to cytoskeleton and membrane dynamics. Plant Physiol. 161 (4), 1706-1721 (2013).
  10. Gennaris, A., et al. Repairing oxidized proteins in the bacterial envelope using respiratory chain electrons. Nature. 528 (7582), 409-412 (2015).
  11. Schilling, K., et al. Translocation of endothelial nitric-oxide synthase involves a ternary complex with caveolin-1 and NOSTRIN. Mol Biol Cell. 17 (9), 3870-3880 (2006).
  12. Mintz-Oron, S., Aharoni, A., Ruppin, E., Shlomi, T. Network-based prediction of metabolic enzymes' subcellular localization. Bioinformatics. 25 (12), i247-i252 (2009).
  13. Phukan, H., Sarma, A., Rex, D. A. B., Rai, A. B., Prasad, T. S. K., Madanan, M. G. Unique posttranslational modification sites of acetylation, citrullination, glutarylation, and phosphorylation are found to be specific to the proteins partitioned in the Triton X-114 fractions of Leptospira. ACS Omega. 7 (22), 18569-18576 (2022).
  14. Tinrat, S. Preliminary phytochemical analysis, antibacterial and anti-biofilm activities of Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe extracts. Malaysian J Microbiol. 18 (4), 344-353 (2022).
  15. Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), a000414-a000414 (2010).
  16. Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Curr Protoc Protein Sci. 53 (1), ps0408s53(2008).
  17. Santos, H. deL., Ciancaglini, P. A practical approach to the choice of a suitable detergent and optimal conditions for solubilizing a membrane protein. Biochem Educ. 28 (3), 178-182 (2000).
  18. Picard, M., Duval-Terrié, C., Dé, E., Champeil, P. Stabilization of membranes upon interaction of amphipathic polymers with membrane proteins. Protein Sci. 13 (11), 3056-3058 (2004).
  19. Rice, A. J., Alvarez, F. J., Davidson, A. L., Pinkett, H. W. Effects of lipid environment on the conformational changes of an ABC importer. Channels. 8 (4), 327-333 (2014).
  20. Arnold, T., Linke, D. Phase separation in the isolation and purification of membrane proteins. BioTechniques. 43 (4), 427-440 (2007).
  21. Fricke, B. Phase separation of nonionic detergents by salt addition and its application to membrane proteins. Anal Biochem. 212 (1), 154-159 (1993).
  22. Pryde, J. G. Partitioning of proteins in Triton X-114. In: Methods in Molecular Biology. , Humana Press. Totowa. (2000).
  23. Haake, D. A., Walker, E. M., Blanco, D. R., Bolin, C. A., Miller, J. N., Lovett, M. A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 59 (3), 1131-1140 (1991).
  24. Haake, D. A., et al. The leptospiral major outer membrane protein LipL32 is a lipoprotein expressed during mammalian infection. Infect Immun. 68 (4), 2276-2285 (2000).
  25. Thoduvayil, S., et al. Triton X-114 fractionated subcellular proteome of Leptospira interrogans shows selective enrichment of pathogenic and outer membrane proteins in the detergent fraction. Proteomics. 20 (19-20), (2020).
  26. Phukan, H., et al. Physiological temperature and osmotic changes drive dynamic proteome alterations in the leptospiral outer membrane and enhance protein export systems. J Proteome Res. 22 (11), 3447-3463 (2023).
  27. Murray, G. L., King, A. M., Srikram, A., Sermswan, R. W., Adler, B. Use of luminescent Leptospira interrogans for enumeration in biological assays. J Clin Microbiol. 48 (6), 2037-2042 (2010).
  28. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  29. Shang, E. S., Summers, T. A., Haake, D. A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding LipL41, a surface-exposed lipoprotein of pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 64 (6), 2322-2330 (1996).
  30. Evangelista, K. V., Hahn, B., Wunder, E. A. Jr, Ko, A. I., Haake, D. A., Coburn, J. Identification of cell-binding adhesins of Leptospira interrogans. PLoS Negl Trop Dis. 8 (10), e0003215(2014).
  31. Picardeau, M. Virulence of the zoonotic agent of leptospirosis: still terra incognita. Nat Rev Microbiol. 15 (5), 297-307 (2017).
  32. Hu, S., et al. Purification and identification of membrane proteins from urinary extracellular vesicles using Triton X-114 phase partitioning. J Proteome Res. 17 (1), 86-96 (2018).
  33. Radolf, J. D., Chamberlain, N. R., Clausell, A., Norgard, M. V. Identification and localization of integral membrane proteins of virulent Treponema pallidum subsp. pallidum by phase partitioning with the nonionic detergent Triton X-114. Infect Immun. 56 (2), 490-498 (1988).
  34. Nally, J. E., Whitelegge, J. P., Bassilian, S., Blanco, D. R., Lovett, M. A. Characterization of the outer membrane proteome of Leptospira interrogans expressed during acute lethal infection. Infect Immun. 75 (2), 766-773 (2007).
  35. Crother, T. R., Nally, J. E. Analysis of bacterial membrane proteins produced during mammalian infection using hydrophobic antigen tissue Triton extraction (HATTREX). Curr Protoc Microbiol. 9 (1), mc1201s9(2008).
  36. Casey, T. M., Meade, J. L., Hewitt, E. W. Organelle proteomics. Mol Cell Proteomics. 6 (5), 767-780 (2007).
  37. Bell, A. W., et al. Proteomics characterization of abundant Golgi membrane proteins. J Biol Chem. 276 (7), 5152-5165 (2001).
  38. Boonciew, P., et al. Improved antibody detection for canine leptospirosis: ELISAs modified using local leptospiral serovar isolates from asymptomatic dogs. Animals. 14 (6), (2024).
  39. Nogueira, S. V., et al. Leptospira interrogans enolase is secreted extracellularly and interacts with plasminogen. PLoS One. 8 (10), e0078150(2013).
  40. Riazi, M., Zainul, F. Z., Bahaman, A. R., Amran, F., Khalilpour, A. Role of 72 kDa protein of Leptospira interrogans. as a diagnostic marker in acute leptospirosis. Indian J Med Res. 139 (2), 308-313 (2014).
  41. Domingos, R. F., et al. Features of two proteins of Leptospira interrogans with potential role in host-pathogen interactions. BMC Microbiol. 12, 50(2012).
  42. Dhandapani, G., et al. Proteomic approach and expression analysis revealed the differential expression of predicted leptospiral proteases capable of ECM degradation. Biochim Biophys Acta Proteins Proteomics. 1866 (5-6), 712-721 (2018).
  43. Matsunaga, J., Werneid, K., Zuerner, R. L., Frank, A., Haake, D. A. LipL46 is a novel surface-exposed lipoprotein expressed during leptospiral dissemination in the mammalian host. Microbiology. 152 (12), 3777-3786 (2006).
  44. Pinne, M., Haake, D. A. A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans. PLoS One. 4 (6), e6071(2009).
  45. Madathiparambil, M. G., Cattavarayane, S., Perumana, S. R., Manickam, G. D., Sehgal, S. C. Presence of 46 kDa gelatinase on the outer membrane of Leptospira. Curr Microbiol. 62 (5), 1478-1482 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

H cresel FraksiyonlamaTriton X 114 EkstraksiyonuLeptospira ProteinleriD Membran ProteinleriMembran ProteinleriFaz Ayr mProtein LokalizasyonuSDS PAGEmmunoblotlamaK tle Spektrometrisi
Triton X-114 Tabanlı Fraksiyonasyon Yaklaşımı Kullanılarak Leptospira'da Hücre Altı Proteinlerin Zenginleştirilmesi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.