Burada, kavakta kök biyolojisi ve ışık tepkisi ile ilgili fizyolojik süreçlerin incelenmesi için uygun olan floem veya epidermis-kuşak mantar patojeni aşılama yolu yoluyla maceracı köklerin (AR'ler) üretimini indüklemek için bir protokol sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kök pamukçuk patojenlerinin neden olduğu kavak maceracı kökleri: Kök biyolojisi ve ışık tepkisi ile ilgili süreçleri incelemek için deneysel bir sistem
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Valsa sordida ve Botryosphaeria dothidea , birçok bitki konakçısına, özellikle de Populus cinsindeki türlere zarar veren iki önemli nekrotrofik mantar patojenidir. Bu iki mantar patojeni esas olarak kavak dallarında, gövdelerinde ve dallarında meydana gelir ve pamukçuk lezyonları, kanopi geri dönüşü ve solma gibi klasik semptomlara neden olur. Patojen aşılaması, bitki hastalıklarının mekanizmasını incelemek için en etkili yoldur. Saplardaki aşılama yerlerinin etrafındaki aftların yanı sıra, kavak türlerinde kök pamukçuk patojen inokülasyonlarından sonra yeni bir gelişimsel fenomen olan parlak kırmızı renkli bol maceracı kökler (AR'ler) gözlenmiştir. Bu çalışmada, kavak ağaçlarında mantar patojenlerini kullanarak AR'leri indükleme yöntemini tanımladık. Bu yöntemin en önemli adımı, (floem veya epidermis) kuşak manipülasyonu sonrası patojen aşılamasıdır. İkinci önemli adım, nemlendirici malzemenin uygulanmasıdır. Parafilm ile nemlendirme manipülasyonu ile karşılaştırıldığında, aşılanmış bölgeleri ev tipi polietilen (PE) plastik sargı ile sarmak, kuşaklama aşılamasından sonraki 20 gün içinde renkli, çok sayıda ve sağlam AR'ler üretebilir. Son olarak, gölgelendirme işleminden sonra (sapları alüminyum folyo ile sarmak) kavak gövdelerindeki aşılanmış halkalardan beyaz AR'ler filizlendi. Bu yöntem, kök gelişimi, morfogenez ve hastalık stresi altındaki yanıtın biyolojisini anlamak için çok önemli olan kök gelişimi ve morfogenezi incelemek için yeni bir deneysel sistem sunar. Ayrıca, gölgeleme tedavisi ile birleştirildiğinde, bu çalışma, örneğin flavonoidlerin, antosiyaninlerin veya diğer ilgili metabolitlerin biyosentezi ve bu işlemlerde yer alan genler veya transkripsiyon faktörleri gibi ışık tepkisi ile ilgili süreçleri araştırmak için uygun bir deneysel sistem sağlayabilir.
Giriş
Nekrotrofik mantar patojenleri Valsa sordida ve Botryosphaeria dothidea'nın neden olduğu kavak sapı pamukçuk hastalıkları, kuzey Çin'de kavak türlerinin ekolojik ve ekonomik plantasyonlarının gelişimine ciddi şekilde zarar veren iki önemli ağaç hastalığıdır. Kavak aft hastalıkları her zaman gövde ve dalların kabuğunda görülürken, aft lezyonları tipik belirtileridir. Hastalıkların başlamasından sonra, genişleyen aft lezyonları konakçıların floem, kambiyum ve ksilemine aşamalı olarak zarar verdi. Ayrıca, asimile edilmiş ürünlerin ve suyun vasküler sistem yoluyla taşınmasını etkilediler. Bununla birlikte, pamukçuk patojenlerinin floem ve ksilem taşınmasını nasıl engellediği belirsizliğini korumaktadır.
Aft patojenleri ile enfekte olmuş kavaklarda karbonhidrat ve suyun taşıma mekanizmalarını ortaya çıkarmak için, klasik bahçe kuşağı manipülasyonu ve patojen aşılama yöntemini (misel bloğu yaralama aşılaması) birleştiren floem veya epidermis kuşak aşılama yöntemlerini 1,2 önerdik. Bu yöntemler, istila sürecini ve pamukçuk patojenlerinin neden olduğu su ve karbonhidratların tıkanmasını simüle edebilir.
Araştırmamız, mantar patojenlerinin başlangıçta hidrolik arızaya değil, karbon açlığına neden olarak kavak gölgelikölümüne neden olduğunu göstermiştir 1,3,4,5. Şaşırtıcı bir şekilde, kök pamukçuk patojenlerinin aşılanması ile ilişkili olan kavak saplarında özel bir rizogenez gözlemledik: bol miktarda kırmızı maceracı kökler (AR'ler), üst gövdelerin alt ucundan (floem veya epidermis kuşak halkalarının üst kenarının tersine) büyür. Dahası, deneylerimiz AR üretiminin kavak-pamukçuk patojen etkileşiminde evrensel olduğunu göstermiştir. Farklı yaşlarda (1, 2 ve hatta 6 yaşında) çeşitli kavak türlerinden veya klonlarından üretilebilirler ve farklı pamukçuk patojenleri (V. sordida ve B. dothidea) veya bunların izolatları tarafından indüklenebilirler. Ek olarak, kavak AR'lerinin renk mekanizmalarını inceledik ve sonuçlar, flavonoidlerin ve antosiyaninlerin biyosentezinin yanı sıra ışıkla ilgili genlerin (veya gen modüllerinin) aydınlatma koşulları altında gen ekspresyonunun düzenlenmesi ile ilişkili olduğunu gösterdi6. Bu nedenle, patojenler tarafından indüklenen bu kavak AR'leri, bitki-patojen etkileşimi, kök biyolojisi ve ışıkla ilgili genlerin işlevi ve ekspresyonu için kararlı ve ideal bir deneysel sistem olarak kullanılabilir.
Bu çalışmada, kuşak aşılama yolu ile bir kavak AR deney sistemi kurmak için protokolü tanıtacağız ve sunacağız; ayrıca, AR'lerin oluşumunu etkileyen önemli faktörlere dikkat çekiyor ve kavak kök biyolojisi ve diğer ışık tepkisi ile ilgili fizyolojik süreçlerin çalışmasında kuşak aşılamasının potansiyel uygulamasını açıklıyoruz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Kuşak aşılaması yoluyla kavak AR'lerinin indüksiyonu
- Mantar pamukçuk patojeni kültürü
- Patates dekstroz agar (PDA) ortamını hazırlamak için 6 g patates özütü, 20 g dekstroz ve 20 g agarı 1000 mL suda çözün. Ortamı 121.1 ° C'de 30 dakika sterilize edin ve ortamı, her biri yaklaşık 20 mL PDA ortamı içeren Petri kaplarına (9 cm çapında) dökün.
- Aktive edilmiş mantar miselyum küpünü (~ 0.5 cm) PDA Petri kabının ortasına aşılayın.
- Aşılanmış PDA plakalarını karanlıkta 28 ° C'de 7-10 gün inkübe edin.
- İnkübe edilmiş PDA ortamını mantar miselyumu ile kayışlar halinde kesin (1.2 cm genişliğinde; yaklaşık 3-6 cm uzunluğunda).
- Kavak malzemelerinin hazırlanması
- 1-2 yaşında, kuvvetli büyüyen kavak fidanlarını seçin.
- Kavak fidanlarından (1-2 cm çapında, hastalık ve haşere istilasından arındırılmış) olgun sap/dalları seçin.
- Kavak saplarının/dallarının aşılama bölgelerini (yerden veya dalların tabanından yaklaşık 30 cm yükseklikte) yıkayın; Sapları/dalları %75 alkol solüsyonu ile sterilize edin.
- Floem kuşaklama-inokülasyon yoluyla AR'lerin indüksiyonu
- Sterilize edilmiş kavak saplarının / dallarının epidermisini ve floemini dikkatlice kuşatın, kuşaklı floem halkalarını (kısmi kambiyum dahil 1 cm genişliğinde) çıkarın ve beyaz, iç kambiyum / ksilem dokularını ortaya çıkarın.
NOT: Adım 1.3.2-1.3.4, alternatif aşılama yöntemlerini detaylandırır. - Floem kuşaklama aşılama tedavisi (GP) olarak kuşak bölgesini misel kayışlarıyla (1,2 cm genişliğinde) tamamen örtün. Mantar hifleri, maruz kalan ksilem ile karşı karşıyadır.
- Açıkta kalan iç kambiyum dokusunu sterilize bıçaklarla kazıyın ve hasar verin ve ardından PDA kayışlarını (1,2 cm genişliğinde) kuşak kambiyum çıkarma tedavisi (GR) olarak kuşak bölgelerine aşılayın.
- Kuşak bölgelerini doğrudan kültürlenmemiş PDA orta kayışlarla (1,2 cm genişliğinde) bir kuşak kontrolü (GC) olarak aşılayın.
- Aşılanmış gövdeleri/dalları gerilebilir, renksiz ve şeffaf aşılama bandı (veya PE plastik film) ile sarın. Nemi içeride tutmak için 4 kat sarın.
- Aşılanmış gövdeleri/dalları rüzgar siperinden korumak için (metal, plastik veya odunsu) çubuklarla (50 cm'den fazla) bağlayın.
- Deney sırasında kuşaklı kavak malzemelerini düzenli sulama ile yetiştirin.
- Dışarıdan gözlemleyin ve aşılamadan 14-30 gün sonra kavak AR'lerinin oluşumunu kaydedin.
- Sterilize edilmiş kavak saplarının / dallarının epidermisini ve floemini dikkatlice kuşatın, kuşaklı floem halkalarını (kısmi kambiyum dahil 1 cm genişliğinde) çıkarın ve beyaz, iç kambiyum / ksilem dokularını ortaya çıkarın.
- Epidermis kuşaklama-aşılama yoluyla AR'lerin indüksiyonu
- Adım 1.2'de açıklandığı gibi aşılanmış malzemeleri seçin ve hazırlayın.
- Kavak saplarının/dallarının epidermisini dikkatlice kuşatın.
- Epidermis halkalarını (1.0 cm genişliğinde) çıkarın ve yeşil floem dokusunu ortaya çıkarın.
- Floem dokusunu dört kez hafifçe ve dikey olarak kazıyın ve floemin iç yapısını ortaya çıkarın.
- Kuşaklı epidermis bölgesini mantar miselyum (eGP) ve PDA kayışları (eGC) ile aşılayın. Adım 1.3.2-1.3.4'e benzer aşılama manipülasyonları gerçekleştirin.
- Aşılanmış sapları adım 1.3.5'te açıklandığı gibi aşılama bandı (veya PE plastik film) ile sarın.
- Kavakları yönetin ve 1.3.6-1.3.8 adımlarında açıklandığı gibi AR'leri gözlemleyin.
2. Işıkla ilişkili genlerin kuşak aşılama yöntemi ile araştırılması için deneysel bir sistemin kurulması
- Floem kuşak aşılama yöntemini kullanarak kavak AR'lerini indükleyin (adım 1.3.2-1.3.4).
- Alternatif olarak, adım 1.4.5'te açıklandığı gibi epidermis kuşak aşılama yöntemini kullanarak kavak AR'lerini indükleyin.
- Kavak saplarının/dallarının (15 cm yüksekliğinde) patojen aşılanmış bölgelerini alüminyum folyo ile (gölgelendirme işlemi, S) veya alüminyum folyo sargısı olmadan (aydınlatma işlemi, L) sarın.
- Sapları/dalları rüzgar kırılmasını önlemek için >50 cm uzunluğunda çubuklara bağlayın. Kavakları düzenli olarak yetiştirin ve yönetin ve deney sırasında 1.3.6-1.3.7 adımlarında açıklandığı gibi iyi sulanmalarını sağlayın.
- Aşılamadan ~ 20 gün sonra alüminyum folyoyu gövdelerinden çıkarın.
- Alüminyum folyo gölgeli (S) ve gölgesiz kavak AR'lerini (L) hemen gözlemleyin ve fotoğraflayın.
- Gölgeli kavak AR'lerini güneş ışığında veya diğer yapay ışık kaynaklarında/koşullarında yetiştirin.
- Aşılama bantlarını (veya PE plastik filmleri) çıkarın ve kavak AR'lerini ışığa maruz kaldıktan 1-5 gün sonra hasat edin.
- Tüm AR örneklerini alüminyum folyo ile sarın. Gölgelendirme işlemi görmüş kavak AR'leri için numuneleri karanlıkta hasat edin.
- AR örneklerini sıvı nitrojene batırın ve daha fazla araştırma için -80 °C'de saklayın.
- Işığa maruz kalan veya maruz kalmayan kavak AR'lerini (karanlıkta yapılan) alüminyum folyo ile sardıktan sonra hasat edin ve morfolojik ve diğer yerinde analizler için 4 °C'de saklayın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Kuşak aşılaması yoluyla adventif kökleri indükleyen kök pamukçuk patojenlerinin iş akışı Şekil 1'de gösterilmektedir. Burada yapılan deneyler, hem kök pamukçuk patojenlerinin, V. sordida, B. dothidea'nın hem de izolatlarının (farklı konakçılardan, bölgelerden veya patojeniteden) kavak türlerinde AR oluşumunu indükleyebileceğini göstermiştir. Bu protokolde, P. alba var. pyramidalis'te AR'ler üretmek için V. sordida izolatı CZC, CFCC86775 ve B. dothidea<...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Kavak türleri, üremelerine katkıda bulunan ve ağaç bitkilerinde incelenen kök biyolojisi için model olarakgövde kesimlerinden AR'ler veya yanal Kökler (LR'ler) üretmeye yatkındır 7,8. Ayrıca araştırmalar, faydalı bakteriler gibi belirli mikroorganizmaların aşılanmasının (Agrobacterium rhizogenes 9,10; Bitki büyümesini teşvik eden rizobakteriler [PGPR]
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu araştırma, Merkezi Kamu Yararına Bilimsel Kurum, Devlet Anahtar Ağaç Genetiği ve Islahı Laboratuvarı Temel Araştırma Fonu (hibe numarası CAFYBB2020ZY001-2) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (hibe numarası 32171776) tarafından Jiaping Zhao'ya ortaklaşa finanse edildi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Agar | Güneş Enerjisi | A8190 | Mantar büyümesi için besin sağlayın |
| Alüminyum folyo | Biyokeskin | BS-QT-027B | Enfekte bölge için gölgeleme sağlamak için |
| Kuşak bıçağı | MoGong Donanım aracı firmaları | Kavak saplarının/dallarının epidermisini kuşatın | |
| Aşılama bandı | CAPI | 5 cm | Bitkilerdeki mantarları düzeltmek için |
| PD (Patates ekstraksiyonu, Dekstroz) | Güneş Enerjisi | P7360 Serisi | Mantar büyümesi için besin sağlayın |
| PE plastik film | MiaoJie | 413703 | Bitkilerdeki mantarları düzeltmek için |
| Petri kapları | Bkman biyolojik Co.,Ltd | 90 mm | PDA ortamını hazırlayın |
| Termostatik inkübatör | Shanghai Kuntian Laboratuvar Enstrümanı Co, Ltd | KTD-6000 Serisi | Mantar büyümesi için bir ortam sağlayın |
Kaynaklar
- Xing, J., et al. Fungal pathogens of canker disease trigger canopy dieback in poplar saplings by inducing functional failure of the phloem and cambium and carbon starvation in the xylem. Physiol Mol Plant Pathol. 101523, 112(2020).
- Xing, J., et al. Stem canker pathogen Botryosphaeria dothidea inhibits poplar leaf photosynthesis in the early stage of inoculation. Front Plant Sci. 13, 1008834(2022).
- Li, P., et al. Fungal canker pathogens trigger carbon starvation by inhibiting carbon metabolism in poplar stems. Sci Rep. 9, 10111(2019).
- Li, J., et al. Effects of Valsa sordida infection on photosynthetic characteristics and carbon-water metabolism in Populus alba var. Pyramidalis. For Res. 34 (05), 58-68 (2021).
- Xing, J., et al. Comparisons of photosythetic response and characteristics in leaves of Populus alba var. pyramidalis infected by the stem canker pathogen Valsa sordida and Botryosphaeria dothidea at Early Stage. Scientia Silvae Sinicae. 57 (09), 121-129 (2021).
- Li, M. Physiological and molecular mechanisms of adventitious root formation in poplar induced by stem canker pathogens [Master's Thesis]. , Chinese Academy of Forestry. (2023).
- Ahkami, A. H. Systems biology of root development in Populus: Review and perspectives. Plant Sci. 335, 111818(2023).
- Dickmann, D. I. Silviculture and biology of short-rotation woody crops in temperate regions: then and now. Biomass Bioenergy. 30, 696-705 (2006).
- De Almeida, M. R., et al. Environmental control of adventitious rooting in Eucalyptus and Populus cuttings. Trees. 31, 1377-1390 (2017).
- Zavattieri, M. A., Ragonezi, C., Klimaszewska, K. Adventitious rooting of conifers: influence of biological factors. Trees. 30, 1021-1032 (2016).
- Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture. World J Microbiol Biotechnol. 28, 1327-1350 (2012).
- Khan, Z., et al. Growth enhancement and drought tolerance of hybrid poplar upon inoculation with endophyte consortia. Curr Plant Biol. 6, 38-47 (2016).
- Paz, I. C., et al. Eucalyptus growth promotion by endophytic Bacillus spp. Genet Mol Res. 11, 3711-3720 (2012).
- Olah, B., Briere, C., Becard, G., Denarie, J., Gough, C. Nod factors and a diffusible factor from arbuscular mycorrhizal fungi stimulate lateral root formation in Medicago truncatula via the DMI1/DMI2 signalling pathway. Plant J. 44, 195-207 (2005).
- Maillet, F., et al. Fungal lipochitooligosaccharide symbiotic signals in arbuscular mycorrhiza. Nature. 469, 58-63 (2011).
- Felten, J., et al. The ectomycorrhizal fungus Laccaria bicolor stimulates lateral root formation in poplar and Arabidopsis through auxin transport and signaling. Plant Physiol. 151, 1991-2005 (1991).
- Splivallo, R., Fischer, U., Gobel, C., Feussner, I., Karlovsky, P. Truffles regulate plant root morphogenesis via the production of auxin and ethylene. Plant Physiol. 150, 2018-2029 (2009).
- Druege, U., et al. Molecular and physiological control of adventitious rooting in cuttings: phytohormone action meets resource allocation. Ann Bot. 123, 929-949 (2019).
- Steffens, B., Rasmussen, A. The physiology of adventitious roots. Plant Physiol. 170, 603-617 (2016).
- Bannoud, F., Bellini, C. Adventitious rooting in Populus species: update and perspectives. Front Plant Sci. 12, 668837(2021).
- Li, Y., et al. Signal communication during microbial modulation of root system architecture. J Exp Bot. 75 (2), 526-537 (2024).
- Pascale, A., Proietti, S., Pantelides, I. S., Stringlis, I. A. Modulation of the root microbiome by plant molecules: the basis for targeted disease suppression and plant growth promotion. Front Plant Sci. 10, 1741(2020).
- Zoratti, L., Karppinen, K., Luengo Escobar, A., Häggman, H., Jaakola, L. Light-controlled flavonoid biosynthesis in fruits. Front Plant Sci. 5, 534(2014).
- Bellini, C., Pacurar, D. I., Perrone, I. Adventitious roots and lateral roots: similarities and differences. Annu Rev Plant Biol. 65, 639-666 (2014).
- Sorin, C., et al. Auxin and light control of adventitious rooting in Arabidopsis require ARGONAUTE1. Plant Cell. 17 (5), 1343-1359 (2005).
- Jung, J. K., McCouch, S. Getting to the roots of it: Genetic and hormonal control of root architecture. Front Plant Sci. 4, 186(2013).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
