Yöntem makalesi

Kornea Sütürleri ile Kombine Kornea Epitel Küretajına Dayalı Sıçanlarda Şiddetli Kornea İnflamasyonu Modelinin Oluşturulması

1.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67305

⸱

22 Kasım 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, 2School of Clinical Medicine, Guizhou Medical University, 3The Second People's Hospital of Guiyang City, 4Department of Biomedical Sciences, School of Infection, Inflammation and Immunology, College of Medicine and Health, University of Birmingham

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Kornea sütürleri ile birlikte kornea epitel küretajı yoluyla şiddetli kornea iltihabının bir sıçan modeli geliştirdik. Çalışma, enflamatuar koşullar altında kornea iltihabı paternlerini, epitel proliferasyonunu ve limbal kök hücrelerdeki değişiklikleri değerlendirdi.

Özet

Kornea iltihabı, özellikle şiddetli kornea iltihabı, kornea limbal kök hücre disfonksiyonunun gelişiminde önemli bir rol oynar. Uygun hayvan modelleri oluşturmak, şiddetli inflamasyonun kornea limbal kök hücreleri üzerindeki etkilerine odaklanmamıza yardımcı olabilir. Sprague Dawley (SD) sıçanlarının merkezi kornea epitelini çıkarmak için 2 mm'lik bir pas sökücü kullanıldı. Daha sonra, korneanın merkezi stroması, kalıcı inflamasyonu indüklemek için naylon dikişlerle dikildi. Bu şekilde, ciddi kornea iltihabına neden olan merkezi kornea epitel aşınması ve merkezi stroma sütürü ile bir kornea iltihabı modeli oluşturuldu. Modellemeden 1, 3 ve 7 gün sonra kornea iltihabındaki değişiklikler ve limbal kök hücrelerin durumu gözlendi. Modellemeden sonraki 3. günde , sıçanların kornea limbusu, limbal kök hücre eksikliğinin tipik belirtileri olan belirgin neovaskülarizasyon ve lokal hiperplazi ile ciddi şekilde ödemliydi. 7.günde , kornea ödemi giderek kötüleşti ve neovaskülarizasyon artmaya devam etti. Kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) ve immünofloresan boyama yoluyla, kornea epitelyal inflamatuar faktörlerinin önemli ölçüde yukarı regüle olduğunu, kornea epitel farklılaşmasının anormal olduğunu, kornea epitel kök hücrelerinin önemli ölçüde azaldığını ve hücre proliferasyonunun ve sapının da azaldığını bulduk. Bu nedenle, bu model, şiddetli inflamasyonun limbal kök hücrelere doğrudan zarar vermeden limbal kök hücre hasarına neden olabileceğini göstermektedir. Model, şiddetli inflamasyonun kök hücrelerin biyolojik mekanizmaları üzerindeki etkilerini gözlemlemek için faydalıdır ve inflamasyonun neden olduğu kornea epitelyal kök hücre disfonksiyonunun mekanizmalarını incelemek için ideal bir platform sağlar.

Giriş

Limbal kök hücre disfonksiyonu (LSCD), kalıcı epitel defektleri, kornea vaskülarizasyonu, kronik inflamasyon, yara izi ve korneanın konjonktivalizasyonu ile karakterizedir 1,2. Kimyasal yanıklar, termal yanıklar, Stevens-Johnson sendromu ve oküler ameliyatların neden olduğu iyatrojenik yaralanma gibi ciddi oküler yüzey hastalıklarından sonra limbal kök hücrelerin tükenmesinden veya işlev bozukluğundan kaynaklanabilir 2,3,4. LSCD'nin patojenik mekanizmaları esas olarak kök hücrelerdeki değişiklikleri ve kornea epitelinin 2,7 homeostazını etkileyen kök hücre mikro ortamındaki 5,6 bozuklukları içerir. LSCD'de limbal kök hücrelerde iki ana kader değişikliği türü vardır: 1) Kornea epitel kök hücrelerinin yönlü farklılaşma potansiyeli anormal hale gelir ve bu da cilt epitel hücrelerine farklılaşmalarına yol açar. Bu, kornea epitel hücresine özgü transkripsiyon faktörü Pax6 ve korneaya özgü keratinler Krt12 ve Krt3'ün ekspresyonunda bir azalma ve ayrıca cilt ile ilişkili skuamöz epitelyal metaplazi belirteçleri Krt10, Krt1 ve Sprr1b8'in ekspresyonunda önemli bir artış ile kanıtlanır; 2) Oküler yüzey yaralanması, kornea limbal kök hücrelerini doğrudan yok ederek nekroz veya apoptoz ile sonuçlanır ve ardından korneayı kaplayan konjonktival doku proliferasyonuna neden olur9. LSCD'nin gelişimi sırasında, makrofajlar, nötrofiller ve dendritik hücreler gibi inflamatuar hücrelerin kornea epitelyal kök hücre mikroçevresinde önemli ölçüde arttığı bildirilmiştir. Buna bağlı olarak, interferon-gama (IFN)-γ, tümör nekroz faktörü (TNF)-α, interlökin (IL)-1β ve makrofaj inflamatuar proteinler (MIP)-1α/β gibi sitokinler de önemli yükselmeler gösterir10.

Sütürler, kimyasal yaralanmalar ve benzalkonyum klorür lekelenmesi11 tarafından indüklenenler de dahil olmak üzere çeşitli LSCD modelleri oluşturulmuştur. Bu modellerin her birinin avantajları ve dezavantajları vardır. Kimyasal yaralanmalar tüm oküler yüzeye zarar verebilir ve limbal kök hücreleri doğrudan yok edebilir12. Benzalkonyum klorür, kimyasal yaralanmalara benzer şekilde işlev görür, ancak nispeten yavaş bir etkiye sahiptir13. Kornea sütür modeli, stabil ve uzun süreli bir inflamatuar yanıtı indükleyebilir, ancak enflamatuar reaksiyon nispeten hafiftir ve LSCD'ye neden olamaz.

Kornea LSCD gelişiminde inflamasyonun rolünü ve mekanizmalarını araştırmak için, merkezi kornea epitelinin küretajını kornea sütürleri ile birleştiren bir hayvan modeli oluşturulmuştur. Bu model, limbal kök hücrelere doğrudan zarar vermeden kornea epitelinin kalıcı iltihaplanmasına neden olur.

Protokol

Tüm prosedürler, hayvanların oftalmik ve görme araştırmalarında kullanılmasına ilişkin ARVO yönergelerine uygundur ve Guizhou Tıp Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (Onay No. 2305192). Sıçanlar, ilgili hayvan yönetimi yönetmeliklerine bağlı kalarak Guizhou Tıp Üniversitesi Hayvan Merkezi'ne yerleştirildi.

1. Hayvan seçimi

  1. 7-8 haftalık dişi Sprague-Dawley (SD) sıçanlarını kullanın. Yarık lamba muayenesi altında oküler yüzey lezyonları olmadığından emin olun.
  2. Aletleri hızlı bir sterilizatör kullanarak sterilize edin. Gerekli aletler arasında kornea pas halkası çıkarıcı, 2 mm boyutunda cilt örnekleme kalemi, iğne tutucular, plaka tabakası bıçakları, oftalmik cerrahi makas ve forseps bulunur.
  3. Sıçanları, 100 g vücut ağırlığı başına 0.3 mL'lik bir dozda intraperitoneal enjeksiyon yoluyla% 1.25 tribromoetanol ile anesteziyin. Anestezi derinliğini ayak parmağınızı sıkıştırarak değerlendirin. Göz bebeği genişlemesi için bir damla tropikamid göz damlası damlatın. Göze bupivakain hidroklorür göz damlası uygulayın. Nemi korumak için karşı gözde oküler kayganlaştırıcı merhem kullanın.
  4. Göz çevresindeki cildi ve saçları iyodofor ile dezenfekte edin.
  5. Enflamasyon modelini oluşturun.
    1. Fareyi lateral dekübit pozisyonuna getirin. Göz küresini ameliyat mikroskobu altında açığa çıkarın.
    2. Santral kornea, 2 mm boyutunda bir cilt örnekleme markörü kullanılarak etiketlendi ve etiketli merkezi kornea epiteli, bir Kornea pas halkası çıkarıcı kullanılarak kazındı.
    3. Limbustan yaklaşık 3 mm uzağa 10-0 naylon tel, iğne tutucu ve oftalmik cerrahi makas ve forseps kullanarak üç adet 120° kornea sütürü yerleştirin, korneaya nüfuz etmeyin14,15.
  6. Enfeksiyonu önlemek için işlemin sonunda Ofloksasin göz merhemi uygulayın.
  7. Ameliyattan sonraki 1., 3. ve 7. günlerde yarık lamba ile büyütülmüş 10x lens kullanarak korneayı gözlemleyin ve fotoğraflayın. Kornea epitel iyileşmesi, konjonktival hiperemi, kornea ödemi, limbal hiperemi ve kornea neovaskülarizasyonu gibi semptomları kaydedin.

2. Enflamatuar indeksin hesaplanması

  1. Hayvan modelini oluşturduktan sonra oküler yüzeyin enflamatuar indeksini hesaplayın.
    1. Siliyer cisim tıkanıklığını aşağıdaki gibi puanlayın: tıkanıklık yok (0 puan); 1 mm'den (1 puan) daha az tıkanıklık varlığı; 1 mm ile 2 mm arasında hiperemi (2 puan); 1 mm ile 2 mm arasında hiperemi (3 puan).
    2. Merkezi kornea ödemini aşağıdaki gibi puanlayın: ödem yok (0 puan); net iris görünürlüğü ile ödem (1 puan); belirsiz iris görünürlüğü olan ödem (2 puan); iris görünmezken ödem (3 puan).
    3. Parasantral kornea ödemini aşağıdaki gibi puanlayın: ödem yok (0 puan); net iris görünürlüğü ile ödem (1 puan); belirsiz iris görünürlüğü olan ödem (2 puan); iris görünmezken ödem (3 puan).
    4. Tüm puanları toplayıp 9'a bölerek inflamasyon indeksini hesaplayın.

3. Kornea neovaskülarizasyonunun değerlendirilmesi

  1. Bir yarık lamba ile kornea neovaskülarizasyonunu gözlemleyin.
    1. Yarık lamba görüntü işleme yazılımı16 kullanarak görüntüleri analiz edin ve işleyin.
    2. Her gözlem zaman noktasında kornea neovaskülarizasyonunun büyümesini kaydedin ve minimum eğrilik ile merkezi korneaya doğru en uzun kornea neovaskülarizasyonunu ölçün.
    3. Bunları aşağıdaki gibi derecelendirin: Sınıf 0: Avasküler; Derece 1: Mikro (<1 mm); 2. Derece: Hafif (1 mm ila 1,5 mm); 3. Derece: Orta (>1,5 mm ila 2 mm); Derece 4: Şiddetli (>2 mm).

4. Modelin biyolojisini analiz etmek

  1. Dondurulmuş göz örnekleri hazırlayın.
    1. Sıçatanı% 4-5 izofluran ile uyuşturun ve servikal çıkık ile ötenazi yapın.
    2. Lateral dekübit pozisyonunda, sıçan göz küresini mikro cımbızla dışarı doğru kaldırın ve konjonktivayı göz makası ile üst ve alt göz kubbesi boyunca kesin.
    3. Kornea epitelinin bütünlüğünün korunmasına dikkat ederek optik siniri kesin.
    4. Göz küresi yüzeyindeki kan lekelerini ve suyu filtre kağıdı ile kurutun ve bunları optimum kesme sıcaklığı (OCT) gömme ortamına sahip gömme kutusuna koyun.
    5. Gömme kutusundaki baloncukları 200 μL'lik bir pipetle çıkarın, sıvı nitrojen kullanarak dondurun ve ardından gömülü numuneleri ultra düşük sıcaklıktaki buzdolabında saklayın.
  2. Göz kürelerinin donmuş kısımlarını hazırlayın.
    1. Donmuş bölümü hazırlamadan önce, kriyostatı yaklaşık -28 °C'ye ve numune tutucuyu -26 °C'ye kadar önceden soğutun.
    2. Dondurulmuş örnekleri soğuk dondurucudan çıkarın ve yaklaşık 1 saat kriyotomda bekletin.
    3. Dondurulmuş numuneyi bir kriyotomda 10 dakika önceden soğutun. Numuneyi bir kalemle işaretleyin, OCT ile numune pedine sabitleyin ve soğuduktan sonra bunları kesit rafına sabitleyin.
    4. Donmuş numunenin konumunu ve yönünü ayarlayın ve sabitleyin. İlk olarak, merkezi kornea görülene kadar 20 μm'lik bölümler kesin. Daha sonra sürekli dilimleme ile 6 μm'lik kesitler elde edin ve kesitleri önceden hazırlanmış yapıştırma slaytları üzerinde toplayın.
    5. Slayttaki dokunun adını, malzemesini, kesit süresini, adını ve numarasını işaretleyin. Yaklaşık 30 dakika oda sıcaklığında (RT) bekletin.
    6. Bölümleri kuruttuktan sonra bir kutuya koyun ve rezerv için ultra düşük sıcaklıktaki buzdolabında saklayın.
  3. Hematoksilen ve eozin boyama yapın.
    1. Önceden hazırlanmış donmuş bölümleri ultra düşük sıcaklıktaki buzdolabından çıkarın ve kuruması için RT'deki çeker ocak içine yerleştirin.
    2. RT'de 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit kullanarak bölümleri sabitleyin. Örnekleri 1x PBS ile 5 dakika durulayın.
    3. Slaytlar içeren numune bölümlerini bir slayt tutucuya yerleştirin ve bunları RT'de 5 dakika boyunca hematoksilen boya çözeltisi ile boya silindirine daldırın.
    4. Yüzen boyayı yıkamak için slaytlar içeren numuneyi musluk suyuyla yavaşça durulayın, bunları %0.1 hidroklorik asit alkol ile boya tankına koyun ve 1-2 saniye sonra hızlı bir şekilde çıkarın.
    5. Numuneyi 15 dakika boyunca musluk suyuyla yavaşça durulayın.
    6. Numuneyi sudan çıkarın ve slaytları eozin boya tankına daldırın; RT'de 3 dakika bekletin.
    7. Numuneyi musluk suyuyla yavaşça durulayın, fazla boyayı yıkayın ve %75 alkol, %80 alkol, %95 alkol, %100 alkol (bir) ve %100 alkol (iki) kullanarak gradyan alkol dehidrasyonu gerçekleştirin. Her konsantrasyondaki bölümleri 2 dakika boyunca immsere edin.
    8. Numuneleri sırasıyla ksilen (1) ve ksilen (2) içinde 2 dakika boyunca şeffaf hale getirin.
    9. Numuneyi çeker ocakta kurutun, bölümleri bir sızdırmazlık maddesi kullanarak kapatın ve kabarcık oluşturmamaya dikkat edin.
    10. Slaytları RT'deki bir slayt kutusuna yerleştirin. Mikroskop kullanarak bölümleri görüntüleyin.
  4. İmmünofloresan boyama yapın.
    1. Donmuş bölümleri çıkarın ve kuruması için çeker ocaktaki RT'de bir kutuya koyun.
    2. Donmuş numunenin boş cam slaytında lekelenecek antikorun adını işaretleyin.
    3. Numuneleri RT'de %4 paraformaldehit ile 15 dakika sabitleyin. Numunenin kurumasını önlemek için kutuya az miktarda musluk suyu eklendi.
    4. Paraformaldehit fiksatifini çıkarın ve numuneyi 1x PBS tamponu ile üç kez yıkayın. Numuneyi yıkamamaya dikkat edin.
    5. Doku bölümünün etrafındaki sıvıyı kurutun, numuneyi hücre zarı çözeltisi (% 0.2 TritonX-100) ile kaplayın ve RT'de 20 dakika inkübe edin.
    6. Hücre zarı çözeltisini çıkarın ve bölümleri her biri 1x PBS tamponu ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
    7. Doku bölümlerini kurutun, numuneyi immünofloresan bloke edici solüsyon (% 2 BSA) ile örtün ve RT'de 1 saat inkübe edin.
    8. Üreticinin talimatlarına göre inkübasyon sırasında birincil antikoru ve seyrelticiyi (% 1 BSA) hazırlayın.
    9. Blokaj sıvısını çıkarın ve numuneyi bir emme pompası ile kurutun. Hazırlanan primer antikoru ekleyin, kutuyu kapatın ve gece boyunca 4 ° C'lik bir buzdolabında inkübe edin (yaklaşık 12-16 saat inkübe edin) ışıktan uzakta.
    10. Birincil antikoru atın ve numuneyi PBS'de her biri 10 dakika boyunca dört kez yıkayın.
    11. Temizleme adımı sırasında, ikincil antikor seyreltmesini üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
    12. PBS'yi çıkarın, numuneyi kurutun ve hazırlanan ikincil antikoru numuneye ekleyin. Numuneyi örtün ve RT'de ışıktan 1 saat uzakta inkübe edin.
    13. İkincil antikoru çıkarın, numuneyi her biri 10 dakika boyunca 1x PBS tamponu ile 4 kez yıkayın ve tüm slaydı 1x PBS tamponu ile kaplayın.
    14. PBS'yi çıkarın, numuneyi kurutun ve hava kabarcığı olmadığından emin olarak bölümleri DAPI içeren bir montaj ortamıyla kapatın. Slaytları kalay folyoya sarın ve ışıktan 4 °C'de tutun.
    15. Lazer konfokal mikroskop sistemi veya dik floresan mikroskop kamera sistemi ile fotoğraf çekin (tarama hızı: 4 μs/piksel, tarama çözünürlüğü: 1024 x 1024).
  5. Sıçan kornea epitelinin tek hücreli süspansiyon hazırlığı
    1. Ötenaziden sonra,% 75 alkole batırılmış cımbızla gözbebeklerini çıkarın ve önceden hazırlanmış% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 10 penisilin-streptomisin içeren 1x Hanks'in dengeli tuz çözeltisine (HBSS) koyun.
    2. Göz kürelerini temizleyin ve% 10 FBS ve% 10 penisilin-streptomisin içeren 1x HBBS'yi her biri 5 dakika boyunca iki kez kullanın.
    3. Konjonktivayı skleral kenar boyunca çıkarın; skleral marjı yaklaşık 1 mm'de bırakın. Yine kornea dokusunu %10 FBS ve %10 penisilin-streptomisin içeren 1x HBBS ile iki kez yıkayınız.
    4. Temiz kornea dokusunu 2U / mL Dispas II içeren takviye edilmiş bir hormonal epidermal ortama (SHEM) aktarın. Contayı kapatın ve 4-14 saat boyunca 16°C'ye yerleştirin.
    5. Bir cımbız, dişsiz cımbız, iris kurtarma cihazı ve cerrahi sterilizatör bulundurun.
    6. Cerrahi mikroskop altında, kornea epitelini korneanın kenarı boyunca nazikçe ayırın.
    7. Kornea epitelini %10 penisilin-streptomisin içeren 1x HBSS ile 5 dakika boyunca yıkayın.
    8. Kornea epitel dokusunu 200 mL tripsin içeren 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve% 5 CO2, 37 ° C'lik bir inkübatörde inkübe edin. Her 5 dakikada bir, kornea epitel tabakasını tek hücreli bir süspansiyona sindirmek için santrifüj tüpünü üç kez sallayın.
    9. Tripsin sindirim çözeltisinin etkisini durdurmak için eşit miktarda SHEM ortamı ekleyin ve RT'ye yerleştirin.
  6. Kornea epitel hücrelerinin klon kültürü
    1. Trofoblast hücrelerini hazırlayın.
      1. NIH 3T3 fare hücrelerinin büyüme yoğunluğu %80-90'a ulaştığında, hücre kültürü ortamını atın. Önceden hazırlanmış 10 mg / mL NIH 3T3 mitomisin kültür ortamını ekleyin ve 37 ° C'de 2,5 saat inkübe edin.
      2. Ortamı çıkarın, hücreleri 1x HBSS ile durulayın, yeni NIH 3T3 hücre ortamı ile değiştirin ve bir CO2 inkübatöründe (% 5 CO2, 37 ° C) inkübasyona devam edin.
    2. Kornea epitel hücresi süspansiyonunu hazırlayın ve hücreleri gerekli orana göre sayın.
    3. Kornea epitel hücresi süspansiyonunu hazırlarken, mitomisin ile muamele edilmiş NIH 3T3 hücrelerini işleyin.
      1. Süpernatanı atın, hücreleri 1x HBSS ile durulayın, 1 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve RT'de 2-3 dakika inkübe edin.
      2. Eşit miktarda ek hormonal epitel ortamı ekleyin (SHEM ortamı: DMEM / F12, 10 ng / mL fare epidermal büyüme faktörü [EGF], 10 μg / mL İnsülin-Transferrin-Selenyum [ITS,% 5 FBS,% 1 penisilin-streptomisin,% 0.5 dimetil sülfoksit [DMSO], 0.5 mg / mL hidrokortizon), bir hücre süspansiyonu yapmak için hafifçe pipetleyin ve hücreleri sayın.
    4. 12 oyuklu bir plaka kullanın ve her oyuğa 0,5 mL SHEM ortamı ekleyin.
    5. Kornea epitel hücrelerini 500 kornea epitel hücresi/cm2 ve 5 x 105 NIH 3T3 hücre/cm2 yoğunluğunda NIH 3T3 hücreleri ile NIH 3T3 hücreleri ile karıştırın. Her kuyucuğa 1 mL SHEM ortamı ekleyin.
    6. Her bir oyuğa 1 mL hücre karışımı ekleyin ve hücreleri eşit şekilde dağıtmak için hafifçe pipetleyin.
    7. Bir inkübatörde (% 5 CO2, 37 ° C) inkübe edin, ortamı her 2-3 günde bir değiştirin. 12-14 gün boyunca kültür.
  7. Kristal menekşe boyama
    1. Yaklaşık 12 gün sonra, kornea epitel klonları kaynaşmak üzereyken, kültür ortamını çıkarın ve hücreleri tamamen kaplayacak şekilde her oyuğa 1 mL% 4 paraformaldehit çözeltisi ekleyin. Hücreleri RT'de 15 dakika sabitleyin.
    2. % 4 paraformaldehiti çıkarın ve kuyuları her biri 5 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez yıkayın.
    3. 1x PBS tamponunu çıkarın ve her oyuğa% 0.4 kristal viyole boya çözeltisi ekleyin. RT'de 30 dakika boyayın.
    4. Kristal viyole boya solüsyonunu çıkarın veya geri dönüştürün ve her biri 10 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez yıkayın.
    5. Kuyuları tamamen kuruyana kadar RT'de havayla kurutun.
    6. Normal bir dik mikroskop fotoğraf sistemi kullanın (tarama hızı: 4 μs/piksel, tarama çözünürlüğü: 1024 x 1024).
  8. Kornea mRNA'sının ekstraksiyonu
    1. Oftalmik makas, kornea makası, dişli forseps, elektrikli kornea epitel kazıyıcı, Trizol, RNaz içermeyen 1.5 mL santrifüj tüpleri ve bir buz kutusu toplayın.
    2. Epitel edinimi
      1. Sıçatanı% 4-5 izofluran ile uyuşturun ve servikal çıkıktan sonra ötenazi yapın. Hayvanı yanal pozisyonda yerleştirin. Görünümü engellememek için farenin bıyıklarını göz makasıyla kesin.
      2. Fareyi cerrahi mikroskop altına yerleştirin ve göz küresine odaklanmak için uygun bir yüksekliğe ayarlayın. Göz küresini nazikçe itmek ve ortaya çıkarmak için dişli forseps kullanın. Sıçanın konjonktivasını kaldırın ve kornea epitelinin merkezi 2 mm'lik alanını kazımak için temiz bir elektrikli kornea epitel kazıyıcı kullanın.
      3. Kazınmış kornea epitelini alkol püskürtülmüş temiz, dişli forseps ile toplayın. Toplanan dokuyu 1 mL Trizol içeren bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
      4. Toplanan dokuyu çift deiyonize su içeren 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde durulamak için mümkün olduğunca çabuk çalışın. Fazla suyu filtre kağıdı ile emdirin. % 75 alkol püskürtün ve bir sonraki adıma geçin.
      5. Dişli forseps kullanarak sıçanın konjonktivasını tekrar kaldırın. Konjonktivayı limbus boyunca kesmek için içbükey tarafı yukarı bakacak şekilde kornea makası kullanın ve yaklaşık 0,5 mm beyaz konjonktiva bırakın.
      6. Elektrikli kazıyıcı kullanarak kornea epitelini kornea limpusunda 2 mm'lik bir aralıkta kazıyın. Dokuyu daha önce anlatıldığı gibi toplayın. Merkezi kornea epitelini üç göz küresinden ve limbal epiteli üç göz küresinden toplayın.
      7. Toplanan dokuları ayrı 1 mL Trizol RNA ekstraksiyon reaktif tüplerine yerleştirin. RNA bütünlüğünü korumak için tüm işlemi buz üzerinde gerçekleştirin. Sonraki adımlara hemen geçin veya numuneleri daha sonra kullanmak üzere -80 °C'de ultra düşük sıcaklıktaki bir dondurucuda saklayın.
    3. Numuneyi buz üzerinde çözdürün, hücreleri parçalamak için ultrasonik bir doku homojenizatörü kullanın. Ultrasonik homojenizatörün gücünü% 25'e, patlama başına 2 s'ye, aralık süresini 5 s'ye ve toplam süreyi 2 dakikaya ayarlayın. 10 dakika buz üzerinde bekletin.
    4. Her numuneye kloroform (toplam hacmin 1/5'i, yaklaşık 200 μL) ekleyin, 30 saniye ters çevirerek iyice karıştırın ve 400 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
    5. RNA çökelmesi
      1. Santrifüjlemeden sonra, santrifüj tüpünün içindeki sıvı üç parçaya bölünür. En üstteki şeffaf tabaka RNA, ortadaki beyaz bulutlu tabaka DNA ve proteinler ve alt tabaka Trizol'dür. Üst şeffaf tabakanın yaklaşık 500 μL'sini yeni bir 1,5 mL'lik santrifüj tüpüne dikkatlice pipetleyin, orta tabakadaki beyaz çökeltiyi aspire etmemeye dikkat edin. Yanlışlıkla aspire edilirse, şeffaf tabakayı tekrar toplamak için santrifüjlemeyi tekrarlayın.
      2. Yaklaşık 500 μL'lik şeffaf tabakayı içeren santrifüj tüpüne eşit miktarda önceden soğutulmuş izopropanol ekleyin, iyice karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin, ardından hemen 20-30 dakika boyunca -80 °C ultra düşük sıcaklıklı bir dondurucuya koyun. Bu adım, RNA'nın çökelmesini hızlandırmayı amaçlar.
    6. Numuneyi çıkarın ve hemen 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Santrifüj tüpünün dibinde az miktarda beyaz, pul pul çökelti görülür; Süpernatanı atın.
    7. Her tüpe önceden hazırlanmış ve buzla soğutulmuş% 70 etanol ekleyin. Hemen 4 °C'de 400 x g'da soğutmalı bir santrifüjde yaklaşık 10 dakika santrifüjleyin; Çökeltiyi iyice yıkamak için yukarıdaki adımları bir kez tekrarlayın. Bu adımda, çeker ocak UV ışığı ile 15 dakika önceden sterilize edin.
    8. Santrifüj tüplerini çıkardıktan ve süpernatanı attıktan sonra, 4 ° C'de yaklaşık 250 x g'da 2 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak fazla alkolü çökeltinin karşı tarafından dikkatlice aspire edin ve mümkün olduğunca iyice kurulayın. Kuruması için UV ile sterilize edilmiş bir çeker ocak içine yerleştirin, çökeltiyi yaklaşık 15 dakika havayla kurutun.
    9. 40 mL Dietil pirokarbonat (DEPC) suya 1 mL RNaz inhibitörü ekleyerek çözeltiyi hazırlayın. Numuneyi çözmek için yaklaşık 20-30 μL olan uygun miktarda DEPC su/RNaz inhibitörü karışımı ekleyin. Çok fazla çökelti varsa, 30-50 μL ekleyin. Hemen ters transkripsiyon PCR ile devam edin.
  9. Ters transkripsiyon PCR
    1. Şu öğelerin mevcut olduğundan emin olun: PCR makinesi, RNaz içermeyen 1,5 mL santrifüj tüpleri, 0,2 mL PCR tüpleri, buz banyosu veya buz kutusu, pipet ve RNaz içermeyen uçlar.
    2. Mikrohacim spektrofotometresini kullanarak RNA konsantrasyonunu ölçün. Her numune için reaksiyon sistemine 1 μg RNA eklendiğinden emin olun.
    3. Ters transkripsiyon sisteminin toplam hacmi 20 μL'dir. Numune sayısına göre ihtiyaç duyulan toplam reaktif miktarını hesaplayın. Talimatlarda belirtilen orana göre karıştırın.
    4. Reaksiyon sistemini buz üzerinde hazırlayın, girdaplayın ve kısaca santrifüjleyin. 42 °C'de 15 dakika ve 90 °C'de 30 saniye inkübe edin.
    5. Ters transkripsiyon işleminden elde edilen cDNA'yı doğrudan gerçek zamanlı kantitatif PCR analizi için kullanın veya -80 °C'lik bir buzdolabında saklayın.
  10. Gerçek zamanlı kantitatif PCR reaksiyonu
    1. 17 μL reaksiyon sistemine sahip gerçek zamanlı kantitatif bir PCR reaktif kiti10 kullanın. Tablo 1'de gösterilen astar dizilerini kullanın.
    2. Yukarıda açıklanan reaksiyon sistemini, özellikle RT-PCR için 96 oyuklu bir plakaya veya sekiz şeritli bir tüpe ekleyin. Numunelerin iyi karıştırıldığından emin olun. PCR makinesine yerleştirmeden önce tüplerde kabarcık olup olmadığını kontrol edin.
    3. PCR döngüsü (5 dakika boyunca 95 ° C), 40 döngü (10 saniye boyunca 95 ° C, 30 saniye için 60 ° C) kullanarak geni amplifiye edin ve 2-ΔΔ Ct değerini hesaplamak için verileri tamamlayın. Uygun veri analizi yazılımını kullanarak verileri işleyin, analiz edin ve çizin.

Sonuçlar

Şekil 1A'da görüldüğü gibi, yarık lamba ile yapılan gözlem sonucunda kornea epitelinin iyileşmesinin bozulduğunu bulduk. Normal şartlar altında, merkezi kornea epiteli çıkarıldıktan sonra 24-48 saat içinde tamamen iyileşirdi, ancak kornea merkezi epitel eksizyonu bir sütür modeli ile birleştirildiğinde yeni kan damarları var olmaya devam etti. Model kurulduktan sonraki üçüncü günde, önemli kornea limbal ödemi ve neovaskülarizasyon gözlendi ve tipik kornea limbal kök hücre eksikliği belirtileri lokal olarak ortaya çıktı. Zamanla, 7. güne kadar iyileşme hala tamamlanmamıştı. Kornea inflamasyon indeksi siliyer tıkanıklık, parasantral kornea ödemi ve santral kornea ödemi kullanılarak değerlendirildi. Kornea ödemi giderek kötüleşti ve kornea iltihabı (Şekil 1A) bozulmaya devam etti. Ek olarak, kornea neovaskülarizasyonu inflamasyonun bir göstergesidir. İnflamasyonun ilerlemesi ile kornea neovaskülarizasyonu (Şekil 1B) ve inflamasyon indeksi (Şekil 1C) sürekli bir artış göstermiştir.

Model oluşturulduktan 7 gün sonra göz dokularına kriyo yerleştirme işlemi gerçekleştirdik. Hematoksilen ve eozin boyaması (Şekil 2A), limbus ve santral korneada epitel kalınlaşmasını gösterdi ve epitel düzenlemesi normal morfolojisini kaybetti ve atipik hiperplaziyi gösterdi. Kornea stroması, enflamatuar hücrelerin önemli ölçüde infiltrasyonu ile ödemli görünüyordu. PMN ve ED1 immünofloresan boyama (Şekil 2B) kullanılarak, nötrofillerin ve makrofajların infiltrasyonunda belirgin bir artış gözlendi. Çalışma, IL-1β (Şekil 2C) ve MIP-1α (Şekil 2D) kullanarak inflamatuar faktörleri değerlendirdi ve IL-1β'nın 3. günde zirve yaptığını ve daha sonra kademeli olarak azaldığını, MIP-1α'nın ise zamanla sürekli arttığını buldu.

Kronik inflamasyon tipik olarak Pax6 aşağı regülasyonu, azalmış Krt12 ekspresyonu ve kornea epitelinin skuamöz metaplazisi gibi bir dizi limbal kök hücre eksikliğine yol açar. Bu çalışmada geliştirilen modelin kornea epitel fenotipinde bu değişiklikleri indükleyip indükleyemeyeceğini doğrulamak için, kornea epitelinde Krt12 (Şekil 3A) ve Pax6 (Şekil 3B) için immünofloresan boyama yapıldı. Krt12 ekspresyonu uzun süreli inflamasyon ile azaldı, 7. günde sadece tek Krt12 pozitif hücreler gözlendi ve kornea epitelinde Pax6 ekspresyonu önemli ölçüde azaldı. mRNA düzeyinde, normal kornea epitel belirteçleri Krt12 (Şekil 3C) ve Pax6'nın (Şekil 3D) ekspresyon seviyeleri 7. günde önemli ölçüde azalmıştır. Bununla birlikte, skuamöz metaplazi belirteçleri Krt10 (Şekil 3E) ve Sprr1b'nin (Şekil 3F) ekspresyon seviyeleri 7. günde önemli ölçüde artmıştır.

Kornea epitelini boyamak için proliferasyon belirteci Ki67'yi kullandık ve sonuçlar 7. güne kadar Ki67 pozitif kornea epitel hücrelerinin sayısında önemli bir azalma olduğunu gösterdi (Şekil 4A). Kornea epitel kök hücrelerinin durumu, korneal limbal kök hücreye özgü belirteç ABCG2 (Şekil 4B) ve epitelyal progenitör hücre belirteci P63 (Şekil 4C) kullanılarak değerlendirildi. ABCG2 ve P63 düzeyleri normal gruptakilere göre anlamlı derecede düşüktü. Ek olarak, bu işlem sırasında kornea limbal kök hücrelerindeki değişiklikleri değerlendirmek için kök hücreler için altın standart olan klonal kültür yöntemini kullandık. Kornea limbal kök hücrelerinin klonal oluşum hızının (Şekil 4D) 3. günde azaldığını ve 7. günde önemli ölçüde azaldığını, ortalama klon alanının küçüldüğünü ve 7. günde sadece birkaç holoklonun görülebildiğini gözlemledik. Koloni oluşturma verimliliği (CFE), kültür kabının mikroskop alanında görülebilen hücre klonlarının sayılmasıyla elde edildi. CFE (Şekil 4E), enflamatuar koşullar altında kornea limbal kök hücrelerinin sayısında kademeli bir azalma olduğunu göstermiştir. Bu, bu modeldeki şiddetli inflamasyonun kornea limbal epitel kök hücrelerinin tükenmesine yol açtığını ve bu sürecin kornea limbal kök hücrelerinin fenotipik bir dönüşümünü indüklemediğini, bunun yerine farklılaşma veya kendini yenileme sorunları ortaya çıkardığını göstermektedir.

Bu çalışmada kullanılan inflamasyon modeli, enflamatuar hücrelerin korneaya geniş infiltrasyonu, kornea epitelinin displazisi ve normal kornea epitel fenotipinde Pax6 ve Krt12'nin ekspresyonunun bozulması veya azalması dahil olmak üzere LSCD'nin karakteristik kornea değişiklikleri ile sonuçlandı. Ek olarak, Krt10 mRNA ekspresyonunda önemli bir artış oldu. Özetle, bu deneysel model, inflamasyonun neden olduğu kornea epitel kök hücrelerinin anormal farklılaşmasını incelemek için çok uygundur.

figure-results-1
Şekil 1: Enflamasyon modelinin kurulması. Şiddetli inflamasyonun kornea epitel kök hücreleri üzerindeki etkilerini incelemek için ciddi bir inflamasyon modeli oluşturulmuştur. (A) Model indüklendikten sonra, kornea yarık lamba fotoğrafçılığı kullanılarak gözlendi. Modellemeden üç gün sonra, sıçan kornea limbaus limbal kök hücre eksikliğinin tipik belirtileri olan belirgin neovaskülarizasyon ve lokalize hiperplazi ile ciddi ödemliydi. Yedinci günde, kornea ödemi giderek kötüleşti ve neovaskülarizasyon büyümeye devam etti. İnflamasyonun ilerlemesi ile birlikte (B) kornea neovaskülarizasyonu ve (C) inflamasyon indeksi sürekli artış göstermiştir. *P < 0.05, ****P < 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Modelleme sonrası inflamatuar yanıt. Modelin korneada indüklediği inflamatuar yanıt değerlendirildi. (A) Göz küresinin hematoksilen ve eozin boyaması, enflamatuar süreç sırasında hem limbal hem de merkezi kornea epitelinin kalınlaştığını ve kornea epitel düzenlemesinin normal morfolojisini kaybettiğini ve atipik hiperplazi belirtileri gösterdiğini gösterdi. (B) Makrofaj belirteci ED1 (yeşil) ve nötrofil belirteci PMN (kırmızı) önemli ölçüde artmıştır. RT-qPCR, kornea epitelyal inflamatuar faktörleri (C) IL-1β ve (D) MIP-1α'da önemli bir artış gösterdi. Mavi, DAPI ile nükleer lekelenmeyi temsil eder, ölçek çubuğu = 50 μm; p < 0.001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Enflamatuar koşullar altında hücrelerin fenotipik değişiklikleri. Limbal epitelde (A, kırmızı) KRT12 ve (B) PAX6 için immün boyama. (C) KRT12 mRNA ekspresyon seviyeleri, inflamasyon ilerledikçe önemli bir azalma gösterir. (D) PAX6 mRNA ekspresyonu, enflamatuar koşullar altında limbal epitelde anormal bir dağılım ve belirgin bir azalma ortaya çıkarır. Tersine, (E) Krt10'un mRNA ekspresyonu ve anormal şekilde farklılaşmış kornea epitel belirteci (F) Sprr1b, inflamasyon sırasında önemli ölçüde artar. Mavi, DAPI ile nükleer lekelenmeyi temsil eder, ölçek çubuğu = 50 μm; **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Enflamatuar bir durum altında limbal kök hücrelerin değişiklikleri. (A, kırmızı) Ki67'nin immünofloresan görüntüleri, inflamasyonun indüksiyonunu takiben çoğalan hücrelerdeki değişiklikleri göstermektedir. Kök hücre markörü (B) ABCG2'nin mRNA ekspresyonu önemli ölçüde azalır. Progenitör hücre markörü (C) p63 de eksprese edilir. (D) Kristal viyole boyama görüntüleri ve (E) CFE, enflamatuar koşullar altında limbal kök hücrelerin sayısında bir azalma olduğunu göstermektedir. Mavi, DAPI ile boyanmış çekirdekleri gösterir; ölçek çubuğu 50 μm'dir; *p < 0.05, **p < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Astar adıAstar dizisi
TNF-aİletmek5'-TCAGTTCCATGGCCCAGAC-3'
Ters5'-GTTGTCTTTGAGATCCATGCCATT-3'
IL-1βİletmek5'-CCTCGTCCTAAGTCACTCGC-3'
Ters5'-GGCTGGTTCCACTAGGCTTT-3'
Kişi 6İletmek5'-GTGTTCAGTGCAGAGCCTTC-3'
Ters5'-TTCACCGTTGCTGTTCACTG-3'
Krt12 Serisiİletmek5'-AGCTAACGGGAACTGGAAA-3'
Ters5'-CTCTCCGCTCTTGGTGAGGT-3'
Krt10İletmek5'-TCCGGGATCTGGAAGAGTCAA-3'
Ters5'-TTGGGTAAGCTTTGCTAAGTGGAA-3'
Sprr1bİletmek5'-CCATCCCAAGGCACCTGAG-3'
Ters5'-TGCTGGTATGGTGATGGAGT-3'
Aktinİletmek5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'
Ters5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'

Tablo 1: Kantitatif RT-PCR için kullanılan primerlerin sırası.

Tartışma

Enflamasyon, limbal kök hücre eksikliğinin18 gelişiminde önemli bir rol oynar, ancak spesifik mekanizmaları ve etkileri daha fazla araştırma gerektirir. Bu sorunu çözmek için, merkezi kornea epitelini kazıyarak ve merkezi kornea stromasını ciddi kornea iltihabına neden olacak şekilde dikerek LSCD'yi indükledik. Modelleme sonrası 1, 3 ve 7. günlerde kornea iltihabının evrimini ve limbal kök hücrelerin durumunu gözlemledik. Modelleme sonrası üçüncü günde, limbal kök hücre eksikliğinin tipik özellikleri olan sıçan limbusunda belirgin ödem, belirgin neovaskülarizasyon ve artmış lokal doku proliferasyonu gözlendi. 7. günde, kornea ödemi daha da yoğunlaştı ve yeni kan damarlarının sayısı artmaya devam etti. RT-qPCR ve immünofloresan boyama teknikleri sayesinde, modelleme sonrası 7. günde, makrofaj belirteci ED1, nötrofil belirteci PMN ve merkezi kornea epitelyal inflamatuar faktörleri MIP-1α ve IL-1β'nın ekspresyon seviyelerinin önemli ölçüde yükseldiğini gözlemledik. Enflamasyonun ilerlemesi sırasında, kornea epitel hücresine özgü transkripsiyon faktörü Pax6 ve korneaya özgü keratin Krt12'nin immün boyama görüntüleme ve ilgili mRNA ekspresyon seviyeleri önemli ölçüde azalmıştır. Deri ile ilişkili skuamöz epitelyal metaplazi belirteci Krt10 ve kornea epitel belirteci Sprr1b'nin mRNA ekspresyonu, inflamasyonun ilerlemesi sırasında artarak anormal farklılaşmayı gösterir. Kök hücre belirteci ABCG2'nin mRNA ekspresyonu önemli ölçüde azaldı. Prekürsör hücre markörü p63 de eksprese edildi. Kristal viyole boyama görüntüleri ve CFE, enflamatuar koşullar altında limbal kök hücre sayısının azaldığını gösterdi. Kapsamlı bir analiz, modellemeden yedi gün sonra, kornea epitelindeki inflamatuar faktörlerin önemli ölçüde arttığını, kornea epitelinin farklılaşmasının anormal olduğunu, kornea epitel kök hücrelerinin sayısının önemli ölçüde azaldığını ve hücresel proliferasyon kapasitesinin ve kök hücre özelliklerinin azaldığını gösterdi.

Bu model, limbal epitel kök hücrelerine doğrudan zarar vermeden kornea iltihabını indükler, böylece kornea iltihabının limbal epitel kök hücreleri üzerindeki etkileri ve mekanizmaları üzerine araştırmaları teşvik eder. Kornea epiteli de dahil olmak üzere epitel dokularında, kök hücre yeniden programlaması epitelyal transdiferansiasyon olarak kendini gösterir. Bu süreç iltihaplanma ile yakından ilişkilidir ve mikro çevredeki çeşitli sitokinler, büyüme faktörleri ve diğer çözünür faktörlerin neden olduğu anormal farklılaşma ile karakterizedir 19,20,21,22. Enflamatuar bir durumda, özellikle kuru göz sendromu ve diğer oküler yüzey hastalıkları 23,24,26 gibi uzun süreli kalıcı enflamatuar durumlarda, kornea epiteli, skuamöz metaplazi olarak bilinen bir durum olan cilt epiteline yeniden programlanabilir. Bu geçiş, cilde özgü belirteçler Krt10 ve Sprr12 ile değiştirilen kornea epitelyal spesifik belirteçleri Krt12'nin zayıflamasını veya kaybını içerir27,28. Bu protokolde açıklanan model de benzer fenomenler sergilemektedir. Başlangıçta, limbal kök hücreler aktive edilir ve daha sonra sürekli iltihaplanma altında kornea epitelyal skuamöz metaplazisi meydana gelir. Kornea epitelinde tipik skuamöz epitel hücrelerini, Krt12 ve Pax6'nın ekspresyonunun azalması ve Krt10 ve Sprr1b'nin (skuamöz metaplazi belirteçleri) ekspresyonunun artması ile karakterize ettik. Erken inflamasyon, kornea epitelinin proliferasyonunu arttırırken, daha sonraki aşamalarda proliferasyonda bir azalma görüldü. Stevens-Johnson sendromu veya konjenital aniridinin neden olduğu LSCD ile ilgili çalışmalarımızda bulduklarımızla tutarlı olarak, limbal kök hücre belirteçleri ABCG2 ve kök hücreleri değerlendirmek için altın standart olan koloni oluşturma etkinliği önemli ölçüde azaldı. Bununla birlikte, klonal hücreler, olgun kornea epitel hücrelerine farklılaşma yeteneğini korudu. Önceki çalışmalarda, hava-sıvı arayüz kültürlerinde kornea epitelinin skuamöz metaplazisi gözlenmiştir, ancak kornea epitel kök hücreleri hala normal bir kornea epitel fenotipine farklılaşma potansiyeli ve artmış proliferatif kapasite sergilemiştir. Bu, şu anki araştırmamıza çok benziyor29.

Bu nedenle, bu protokolde geliştirilen araştırma modeli, şiddetli inflamasyonun limbal kök hücre nişine doğrudan zarar vermeden limbal kök hücrelere zarar verebileceğini doğrulamaktadır. Bu bulgu, şiddetli inflamasyonun limbal kök hücrelerin biyolojik mekanizmaları üzerindeki etkilerini gözlemlemek için çok faydalıdır ve kornea inflamasyonunun neden olduğu LSCD mekanizmalarını incelemek için ideal bir deneysel platform sağlar.

Ancak, bu modelin sınırlamaları vardır. Anestezi uygulanmış sıçanlar, kornea epitelinin mekanik olarak kazınmasına ve ardından kornea sütürlenmesine tabi tutulur, her ikisi de intraoperatif ve postoperatif enfeksiyon riski yüksek olan invaziv prosedürlerdir30. Ayrıca, sıçan korneasının inceliği, dikiş sırasında delinmeye eğilimli hale getirir ve yüksek operatör yeterliliği gerektirir.

Bu nedenle işlem sırasında aşağıdaki noktalara dikkat etmeliyiz: (i) temizlik ve dezenfeksiyon: Ameliyattan önce tüm aletler sterilize edilmelidir. Enfeksiyon riskini azaltmak için işlemden bir gün önce ve işlem günü antibiyotikli göz damlaları uygulanmalıdır. Kornea ipliği iltihap ve enfeksiyona neden olabilecek yabancı bir cisim olduğundan, sıkı aseptik teknik izlenmeli ve ameliyat sonrası üç gün boyunca antibiyotikli göz damlalarına devam edilmelidir. (ii) Sıçan korneasının işlenmesi: Sıçan korneası nispeten incedir ve dikiş sırasında delinmeye eğilimlidir. Göz küresini stabilize etmek ve operasyonu kolaylaştırmak için konjonktivayı dikiş bölgesinin karşı tarafında tutmak için dişli forseps kullanın. Sütürü, limbal kök hücrelere zarar vermekten kaçınırken korneanın daha kalın ve delinmeye daha az eğilimli olduğu kornea limpusundan yaklaşık 1,5-2 mm uzağa yerleştirin. (iii) Kornea epitelinin çıkarılması: Kornea trephine ve kornea epitel kazıyıcı, kornea epitelini hızlı bir şekilde çıkarabilir ve kullanımı kolaydır, ancak oldukça keskindir ve stroma'ya zarar verebilir veya perforasyona neden olabilir. Delinmeyi önlemek için çıkarma sırasında kuvvetin yoğunluğunu kontrol edin. Çıkarılan alanda homojenliği sağlamak için, kornea epitelini çıkarmadan önce alanı işaretlemek için dairesel bir işaretleyici kullanın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Guizhou İl Bilim ve Teknoloji Projeleri (QKHJC-ZK[2024]ZD043), Fujian Eyaleti Seçkin Genç Akademisyenler Bilim Fonu (2023J06053 [SO]); Çin Doğa Bilimleri Vakfı (No.82101084 [S.O.'ya] ve Çin Burs Konseyi (CSC, 202306310049 [YW'ye]).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10-0 sütür hattıAlcon, Inc., ABD8065698001
2 mm kornea trephineSuzhou XVI Vision Company, Çinhttp://www.66vision.com/
20 & mu; L, 100 μ L, 1 mL pipet tabancası kafaları, hücre kültürü plakası kültür plakaları, santrifüj tüpleriGuangzhou Jiete Biological Co., Ltd., Çinhttps://www.jetbiofil.com/index.html-20
/ -80 derece; C buzdolabıQingdao Haier Company, Çinhttps://www.haier.com/cn/
10 mL'lik bir şırınga  Zhejiang Condelai Medical Device Co., Ltd., Çinhttps://en.kdlchina.com/zhejiang/25.html
ShiTai Company'ninslaytına bağlı kalın
. Macklin Biochemical, Çinhttp://www.macklin.cn/products/
Anti-CytokertinAbcam, Birleşik Krallıkab76318
Anti-Keratin 12 antikoru EPR17882Abcam, Birleşik Krallıkab185627
Anti-PAX6 antikoruAbcam, Birleşik Krallıkab195045
Sıyırma önleyici slaytlar, kapak fişleriJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd. , Çinhttps://cn.citotest.com/
OtoklavHirayama, Japonyahttps://hirayama.com.cn/about/
AvertinShanghai Aladdin Biyokimyasal Teknoloji, Çinhttps://www.aladdin-e.com/zh_cn/A111225.html
ChloroformShanghai Biological Engineering Co., Ltd., Çinhttps://www.siobp.com/web
CO2 Fırın inkübatörü, ultrasonik kırıcı, santrifüjThermo Fisher Technologies Inc., ABDhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
Konfokal mikroskopŞangay Qinxiang Scientific Instrument Co., Ltd., Çinhttps://www.clinx.cn/about
Kornea epitel forsepsSuzhou XVI Vizyon Şirketi, Çin53418D
DAPIVektör. Inc., ABDH-1000
DEPC suyu  Shanghai Biological Engineering Co., Ltd., Çinhttps://www.siobp.com/web
Dicuro göz kremi (ofloksasin göz kremi)Santian Pharmaceutical Corporation, Japonyahttps://www.santen.com/asia
D-KSFM, kültür ortamı, çift antikor ve PBSThermo Fisher Scientific, Inc., ABDhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
ED1AbD Serote c, Birleşik Krallık 
Elektronik dengeŞanghay Ohaus Biyoteknoloji Şirketi, Çinhttp://shbio.com/company
Membranın MuhafazasıParafilm, Inc., ABDhttps://www.sigmaaldrich.cn
Floresein sodyum test şeridi oftalmolojide kullanıldıTianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd., Chinahttps://www.eworldtrade.com/c/jingmingtechnological/
Floresan ters faz kontrastlı mikrografik sistemTE-2000U, Nikon, Japonyahttps://www.microscopyu.com/museum/eclipse-te2000-inverted-microscope
Dondurulmuş masa üstü santrifüjEppendorf, Almanyahttps://www.eppendorf.sh.cn 
Cam levha çerçeveXiamen Tianjing Biotechnology Co., Ltd., Çinhttp://www.tagene.net/
H-1200, DAPI sızdırmazlık maddesi ileXiamen Juin Biotechnology Co., Ltd., Çinhttps://www.bosonbio.com.cn/
HE boyama kitiAuragene, Çinhttp://jushengwu.com/a048/
Hematoksilen-eozin boya çözeltisi kitiAURAGEN, Amerika Birleşik DevletleriP032IH
Yüksek ve düşük hassasiyetli elektronik teraziSdolis, Almanyahttps://www.solisinverters.com/global
İzopropanolShanghai Sinopharm Chemical Reagents Co., Ltd., Çinhttps://en.reagent.com.cn/
Ki-67 antikoruAbcam, Birleşik Krallıkab16667
sıvı nitrojenXiamen Yidong Gas Co., Ltd., Çinhttps://www.china.tdk.com.cn/tdk_chn_en/tdk_xiamen/
Mikro el tutucuSuzhou XVI Vision Company, Çinhttp://www.66vision.com/
Multiformaldehit tozuSigm, Amerikahttps://www.sigmaaldrich.cn
Normal sıcaklık santrifüjü 46Eppendorf, Almanyahttps://www.thermofisher.cn
EKİM Şanghay Maokang Biotechnology Co., Ltd., Çin4583
Sıradan biyolojik mikrografik sistemEclipse 50i, Nikon, Japonyahttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/zh_CN/products/upright-microscopes/eclipse-ni-series
PBSShanghai Anjin Biotechnology Co., Ltd, ÇinSH30256.01
PCR ve reaktör aparatıBiometra Thermocycler, Almanyahttps://www.analytik-jena.com/products/life-science/pcr-qpcr-thermal-cycler/thermal-cycler-pcr/biometra-tone-series/
Çeşitli özelliklerde pipetlerEppendorf Company, Almanyahttps://www.eppendorf.com/cn-zh/
Rt-PCR için astarlarShanghai Bio-Tech Co., Ltd.
Promeaine hidroklorür% 0.5 göz damlasıAlcon, Inc., ABDhttps://www.alcon.com/about-us
Sıçan PMN antikoruFitzgerald, Amerika Birleşik Devletleri20R-PR020
Gerçek zamanlı floresan kantitatif PCRUygulamalı Biyosistemler,  Amerika Birleşik Devletlerihttps://www.thermofisher.cn
Ters transkripsiyon kitiTAKARA, Japonyahttps://www.takarabiomed.com.cn/
Yarık lambaTOPCON, Japonyahttps://topconchina.cn/
Pürüzsüz forsepsSuzhou XVI Vision Company, Çinhttp://www.66vision.com/
Numune kutusuLambolid (Fuzhou) Biotechnology Co., Ltd., Çinhttp://chuangdianbio.com/
Superclean tezgahYeni Plus Pi Art Yüksek Teknoloji Limited Şirketi, Singapurhttps://www.hi-p.com/
Dişli forsepsSuzhou XVI Vision Company, Çinhttp://www.66vision.com/
Toppicamide göz damlası (Medol)Alcon, Inc., ABDhttps://www.alcon.com/about-us
Eser nükleik asit proteini konsantrasyon test cihazıThermo Fisher Technologies Inc., ABDhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
TrizolInvitrogen Amerika Birleşik Devletlerihttps://www.fishersci.com/us/en/brands/IIAM0WMR/invitrogen.html
Zeiss, cerrahi mikroskop ileCarl ZEIS, Almanyahttps://www.zeiss.com/corporate/en/about-zeiss.html
Amylene alkol Şangay 188105 MCA341GA

Kaynaklar

  1. Ang, L. P., Tan, D. T. Ocular surface stem cells and disease: Current concepts and clinical applications. Ann Acad Med Singap. 33 (5), 576-580 (2004).
  2. Mao, Y., et al. Downregulation of p38 MAPK signaling pathway ameliorates tissue-engineered corneal epithelium. Tissue Eng Part A. 28 (23-24), 977-989 (2022).
  3. Sprogyte, L., Park, M., Di Girolamo, N. Pathogenesis of alkali injury-induced limbal stem cell deficiency: A literature survey of animal models. Cells. 12 (9), 1294(2023).
  4. He, X., et al. Lacrimal gland microenvironment changes after obstruction of lacrimal gland ducts. Invest Ophthalmol Vis Sci. 63 (3), 15(2022).
  5. Le, Q., Chauhan, T., Deng, S. X. Diagnostic criteria for limbal stem cell deficiency before surgical intervention- A systematic literature review and analysis. Surv Ophthalmol. 65 (1), 32-40 (2020).
  6. Li, W., Hayashida, Y., Chen, Y. T., Tseng, S. C. Niche regulation of corneal epithelial stem cells at the limbus. Cell Res. 17 (1), 26-36 (2007).
  7. Ou, S. K., et al. The role of ectodysplasin a on the ocular surface homeostasis. Int J Mol Sci. 23 (24), 12(2022).
  8. Lin, S., et al. Limbal stem cell dysfunction induced by severe dry eye via activation of the p38 MAPK signaling pathway. Am J Pathol. 193 (11), 1863-1878 (2023).
  9. Jiang, G. J., Li, B. B., Fan, T. J. Timolol induces necroptosis, apoptosis and senescence concentration-dependently in rabbit limbal stem cells in vitro. Life Sci. 277, 119453(2021).
  10. Castro-Munozledo, F. Review: Corneal epithelial stem cells, their niche and wound healing. Mol Vis. 19, 1600-1613 (2013).
  11. Atalay, E., et al. Animal models for limbal stem cell deficiency: A critical narrative literature review. Ophthalmol Ther. 13 (3), 671-696 (2024).
  12. Delic, N. C., Cai, J. R., Watson, S. L., Downie, L. E., Di Girolamo, N. Evaluating the clinical translational relevance of animal models for limbal stem cell deficiency: A systematic review. Ocul Surf. 23, 169-183 (2022).
  13. Lin, Z., et al. A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).
  14. Ye, J., et al. Biomimetic nanocomplex based corneal neovascularization theranostics. J Control Release. 374, 50-60 (2024).
  15. Zhu, H. M., et al. A synergistic therapy with antioxidant and anti-VEGF: Toward its safe and effective elimination for corneal neovascularization. Adv Healthc Mater. 13 (5), 10(2024).
  16. Yu, J. W., et al. In vivo assembly drug delivery strategy based on ultra-small nanoparticles: Toward high drug permeation and accumulation for CNV treatment. Chem Eng J. 450, 137968(2022).
  17. Wu, H., et al. A SU6668 pure nanoparticle-based eyedrops: Toward its high drug accumulation and long-time treatment for corneal neovascularization. J Nanobiotechnol. 22 (1), 290(2024).
  18. Long, Q., et al. A novel tissue-engineered corneal epithelium based on ultra-thin amniotic membrane and mesenchymal stem cells. Sci Rep. 14 (1), 17407(2024).
  19. Giroux, V., Rustgi, A. K. Metaplasia: Tissue injury adaptation and a precursor to the dysplasia-cancer sequence. Nat Rev Cancer. 17 (10), 594-604 (2017).
  20. Herfs, M., Hubert, P., Delvenne, P. Epithelial metaplasia: Adult stem cell reprogramming and (pre)neoplastic transformation mediated by inflammation. Trends Mol Med. 15 (6), 245-253 (2009).
  21. Slack, J. M. Metaplasia and transdifferentiation: From pure biology to the clinic. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 369-378 (2007).
  22. Slack, J. M., Tosh, D. Transdifferentiation and metaplasia--switching cell types. Curr Opin Genet Dev. 11 (5), 581-586 (2001).
  23. Wang, S., et al. Impact of chronic smoking on meibomian gland dysfunction. PLoS One. 11 (12), e0168763(2016).
  24. Wu, Y., et al. Evolution of therapeutic strategy based on oxidant-antioxidant balance for fuchs endothelial corneal dystrophy. Ocul Surf. 34, 247-261 (2024).
  25. Li, Y., et al. Meibomian gland alteration in patients with systemic lupus erythematosus. Lupus. 31 (4), 407-414 (2022).
  26. Zhang, Y., et al. Histopathology-based diagnosis of Mooren's ulcer concealed beneath the pterygium on eye. J Histotechnol. 45 (4), 195-201 (2022).
  27. Tseng, S. C., Hatchell, D., Tierney, N., Huang, A. J., Sun, T. T. Expression of specific keratin markers by rabbit corneal, conjunctival, and esophageal epithelia during vitamin A deficiency. J Cell Biol. 99 (6), 2279-2286 (1984).
  28. Espana, E. M., et al. Characterization of corneal pannus removed from patients with total limbal stem cell deficiency. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (9), 2961-2966 (2004).
  29. Li, W., et al. Air exposure induced squamous metaplasia of human limbal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (1), 154-162 (2008).
  30. Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Exp Eye Res. 161, 101-105 (2017).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Limbal K k H crelerKorneal Neovask larizasyonS an Kornea Modelimm nofloresan BoyamaRT qPCR AnaliziKornea demiK k H cre Disfonksiyonu
Kornea Sütürleri ile Kombine Kornea Epitel Küretajına Dayalı Sıçanlarda Şiddetli Kornea İnflamasyonu Modelinin Oluşturulması
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.