Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Deneysel akut nöbet için bir hayvan modeli olarak düzlemsel

1.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67307

⸱

14 Şubat 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical and Translational Sciences, Macon and Joan Brock Virginia Health Sciences Eastern Virginia Medical School, Old Dominion University

Bu makalede

Özet

Nöbetler çeşitli fonksiyonları ve yaşam kalitesini olumsuz yönde etkiler. Planarya solucanları, nöbet fenotiplerini ve bozucu motilitelerini değerlendirmek için değişen konsantrasyonlarda kemokonvülsanlara maruz bırakıldı. Bu çalışma, insanlarda akut nöbetler için bir model olarak planarya solucanlarının kullanılmasını önermektedir ve epilepsi için ilaç geliştirmede önem taşımaktadır.

Özet

Epilepsi, tekrarlayan spontan nöbetlerle karakterize en sık görülen nörolojik hastalıklar arasındadır. Nöbetler, kontrolsüz, aşırı senkronize nöral hücre aktivitesinin klinik bir tezahürünü temsil eder. Nöbetlerden kaynaklanan beyin hasarının derecesi, sürelerine ve yoğunluğuna bağlıdır. Ne yazık ki, epilepsi için etkili bir çare yoktur. Bu araştırmanın amacı, planarya kurdu Dugesia dorotocephala'nın akut nöbetleri hedefleyebilecek epilepsi tedavilerinin belirlenmesine ve geliştirilmesine yardımcı olacak bir model olarak hizmet edip edemeyeceğini değerlendirmektir. Şu anda, nöbet önleyici ilaçları (ASM) değerlendirmek için deniz modelleri gibi çeşitli modeller kullanılmaktadır. Ancak, çok pahalıdırlar ve etik kaygılar vardır. Alternatif olarak, omurgasız modelleri, ASM için ilaç keşif sürecinde uygun maliyetli bir araştırma fırsatı sunar. Planarya, yassı solucan ailesine aittir ve deniz, tatlı su ve karasal ortamlarda yaşar. Dugesia dorotocephala Kuzey Amerika'daki baskın su planaryası türüdür. D. dorototosefala , diğer omurgasızlardan veya daha büyük hayvanlardan farklı olarak, maliyet etkinliği, omurgalı benzeri nöronları ve ölçülebilir davranışları nedeniyle epilepsi çalışmaları için uygun bir omurgasız modeli olarak sunulmaktadır. Yaş, hafıza ve rejenerasyon ile ilgili çeşitli farmakoloji ve çevresel toksikoloji çalışmalarında kullanılmıştır. Bu çalışmada, planaryalar, maruz kalma durumlarındaki davranışlarını incelemek için yaygın bir kemokonvülsan olan farklı konsantrasyonlarda pilokarpine maruz bırakıldı. Gözlemi takiben, planarya ötenazi yapıldı ve nörohistolojik değerlendirme için formaldehit veya Golgi solüsyonunda korundu. Planaryada altı farklı davranışsal fenotip gözlendi: dorsal salınımlar, kafa salınımları, kuyruk sırt genişlemesi, C şekli, kafa hareketi ve kuyruk hareketi. Dorsal salınım frekansları deney grupları arasında kontrol grubuna göre anlamlı olarak artmış ve doz bağımlılığı sergilemiştir. Ek olarak, pilokarpin planaryanın hareketliliğini bozdu. Planaryadaki pilokarpin kaynaklı nöbetler, epilepsiden muzdarip insan hastalar için terapötik müdahalelerin geliştirilmesinde gerekli olan akut nöbetleri ve nöbet önleyici ilaçları değerlendirmek için bir model görevi görebilir.

Giriş

Belirgin bir neden olmaksızın 24 saat içinde iki veya daha fazla nöbet ile karakterize edilen epilepsi, dünya çapında ~ 50 milyon insanı etkilemektedir1. Bunların arasında 10-15 milyon bireyin ilaca dirençli epilepsi hastası olduğu bildirilmektedir2. Bu nedenle epilepsi ilaçlarının araştırılması çok önemlidir. Bu durum, boş bakıştan vücut sertleşmesine ve sallanmasına kadar değişen kısmi veya genelleştirilmiş istemsiz hareketin kısa bölümlerini gerektirir ve beyindeki elektriksel aktivite dalgalanması ile bağlantılıdır3.

Tarihsel olarak, epilepsi araştırmaları, insanlarla evrimsel benzerlikleri nedeniyle kemirgenlere ve diğer memelilere dayanmıştır. Bununla birlikte, bu yöntemler zaman alıcı ve pahalı olabilir ve alternatif bir yaklaşım gerektirir 4,5. Meyve sinekleri, sülükler, kurbağa yavruları, zebra balığı ve yuvarlak kurtlar gibi memeli olmayan canlılar çalışmalarda kullanılmış ve umut verici sonuçlar göstermiştir6. Ayrıca, planaryanın omurgasız ve insan genomları arasında karşılaştırmalı bir genomik çalışma modeli sağlayabileceği ve ayrıca pro-konvülsan, nöbet önleyici ilaçları (ASM) ve davranış kalıplarını test etme yeteneği sağlayabileceği gösterilmiştir6. Yassı solucanlar ve Turbellaria sınıfının üyeleri olarak bilinen Planarya (Phylum Platyhelminthes), öncelikle rejeneratif yetenekleriyle ünlüdür; Bununla birlikte, bu araştırma, nöbete neden olan maddelere verdikleri tepkiye odaklanmaktadır.

Planarya, serotonin ve dopamine yanıt verme gibi insanlarla temel nörolojik mekanizmaları paylaşır, memeli beynindeki sinir sistemi ile ilgili genlere %95 benzerlik gösterir ve tanınabilir bir beyin yapısına sahiptir7. Ek olarak, laboratuvar koşullarında gözlemlenebilir hareketler sergilerler ve kemirgenlere veya diğer memelilere kıyasla uygun maliyetli, zaman açısından verimli ve etiktirler. Vida benzeri, C benzeri ve ceviz şeklindeki hareketler gibi bu gözlemlenebilir davranışlar, onlarca yıldır kapsamlı bir şekilde belgelenmiştir ve kokain, nikotin, dopamin ve pilokarpin 7,8,9,10,11,12,13,14 gibi maddelerle ilişkilidir. Bu nedenle, planarya, insanlarda epilepsi ilaç araştırmaları için uygun bir model olarak ortaya çıkmaktadır.

Bu yöntem, bir Golgi boyası kullanılarak pilokarpine maruz bırakılan planarya nöronlarını karakterize etmeyi amaçlar. Golgi boyası, ışık mikroskobu altında nöronları görselleştirmek için kullanılır ve morfolojideki bir değişikliğin nöbetlerle ilişkili olup olmadığını araştırmak için kullanılmıştır 15,16,17. Mevcut literatürde Golgi boyamanın düzlemsel beyinler üzerinde yapıldığına dair bir kanıt yoktur. Önceki çalışmalar davranışsal fenotipleri gözlemleyerek farmakolojik etkileri belgelemiş olsa da, bu el yazması Golgi boyaması11,18 kullanarak pilokarpine maruz kalan planarya nöronlarını karakterize eden ilk çalışmadır. Bu teknik, nöbetlerle ilişkili morfolojik değişiklikleri görselleştirmede ve anlamada değerli olduğunu kanıtlamaktadır. Bu çalışma, pilokarpin konsantrasyonu arttıkça düzlemsel solucanlarda salınımlı dorsal salınım davranışı sıklığında önemli bir artış olduğunu kaydetti.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Genel deney tasarımı Şekil 1'de açıklanmıştır.

1. Davranış fenotip tahlili

  1. Kaynak suyunda çözünmüş 1 mM ve 2 mM pilokarpin konsantrasyonlarını hazırlayın ve sadece Kaynak Suyu ile kontrol edin.
  2. Her çözeltinin 3 mL'sini 4 x 3 oyuklu bir plakaya pipetleyin, her sıra farklı bir pilokarpin konsantrasyonunu temsil eder.
  3. Ucu kesilmiş bir transfer pipeti kullanarak 12 kuyucuğun her birine yaklaşık 2 haftalık olan, laboratuvarda yetiştirilen bir Dugesia dorotocephala yerleştirin.
    NOT: Ucu, düzleme zarar vermeden sığacak kadar büyük olacak şekilde kesin.
  4. Normal iç mekan aydınlatma koşullarında 4 x 3 kuyulu plakanın üzerine yerleştirilmiş, davranışları iyi kaydeden ve insan gözüyle gözlemlenebilen herhangi bir kamerayı kullanarak planaryanın davranışını 1 saat boyunca kaydedin.
  5. Kaynak suyunda çözünmüş 3 mM, 4 mM ve 6 mM pilokarpin konsantrasyonları ile 1.1-1.4 adımlarını tekrarlayın.

2. Motilite analizi

NOT: Planarya davranışları 2.5 cm çapındaki kuyucuklarda kaydedilmiştir. 1 saat uzunluğundaki video kayıtları 30 dakikalık parçalara bölündü ve planaryaları ayrı ayrı analiz etmek için ticari yazılım kullanılarak kırpıldı.

  1. Otomatik davranış analizi yazılımını kullanarak yeni bir deney başlatın. Gelişmiş otomatik davranış izleme sistemini açın. Yeni deneme'nin altında Yeni'ye tıklayın. Deneye bir ad verin.
  2. Deneysel ayarları aşağıda açıklandığı gibi ayarlayın.
    1. Menü isteminde Deneme Ayarları'nı tıklayın. Ayarların varsayılan olduğundan emin olun: video kaynağı (video dosyasından), Arena Sayısı (1), İzlenen Özellikler (Merkez noktası algılama), Vücut Noktası Algılama Tekniği (Kontur tabanlı), Analiz Seçenekleri (yok), Birimler (cm, s, derece).
  3. Arena ayarlarını aşağıda açıklandığı gibi ayarlayın.
    1. Sol üst Kurulum panelindeki Arena Ayarları sekmesi altında Arena Ayarları'na tıklayın. Bir video yüklemeniz istendiğinde, depolanan dosya konumundan planaryanın kaydedilmiş görüntüsünü seçin. Video seçildikten sonra Yakala'yı tıklayın.
    2. Ekranın sağ üst panelindeki istemleri izleyin. 1'e tıklayın. Kalibre etmek için ölçek çizin. Kuyucuğun video görüntüsünde, numune kuyusunun kenarından kenarına bir ölçek çizgisini sürükleyin. Kuyunun gerçek dünya mesafesini (2,5 cm) girin.
    3. 2'ye tıklayın. Şekli seçin ve arenayı çizin. Sağ panelde Arena 1'in seçili olduğundan emin olun. Fare imlecini ekranın üst ortasına getirin ve Daire Simgesini tıklayın.
    4. Arenanın bir çevresinden diğerine sürükleyerek yüklenen video görüntüsünde bir daire oluşturun. Arenanın turuncu bölgede olduğundan emin olun. Şekli arenaya uyacak şekilde ayarlayın. Arena 1 etiketinin arena sınırları içinde olduğundan emin olun.
    5. Sağ panelin alt kısmında, Şekil, Boyut ve Konum (Genişlik: 2.75, Yükseklik: 2.75, X: 0, Y: 0) istediğiniz ölçülere değiştirin.
    6. 3'e tıklayın. Şekli seçin ve bölgeleri çizin (isteğe bağlı). Sağ paneldeki Bölge Grubu 1 şimdi seçilecektir. Fare imlecini ekranın üst ortasına getirin ve Daire Simgesini seçin. Arena görüntüsünde içine sürükleyerek daha küçük bir daire oluşturun.
    7. Sağ alt panelde Şekil, Boyut ve Konum'u istediğiniz ölçülere değiştirin (Genişlik: 1.75, Yükseklik: 1.75, X: 0, Y: 0).
    8. Daireyle aynı menü çubuğunda bulunan Bölge Etiketi Ekle düğmesini tıklayın. Küçük dairenin ortasını tıklatın. Bölge Merkezi'ni yeniden adlandırmak için sağ paneldeki Bölge 1 etiketini sağ tıklatın.
    9. Bölge Etiketi Ekle düğmesine tekrar tıklayın. Merkez bölgenin dışında, arenanın çevresine tıklayın. Bölgeyi Çevre olarak yeniden adlandırmak için sağ panelde Bölge 2'ye sağ tıklayın.
    10. 4'e tıklayın. Geçerli Arena Ayarlarını sağlamak için Kurulumu Doğrulayın.
  4. Deneme sürümü kontrol ayarlarını aşağıda açıklandığı gibi yapın.
    1. Sol üstteki Kurulum panelindeki Deneme Kontrolü Ayarları sekmesi altında Deneme Kontrolü Ayarları'na tıklayın. Altı bileşen kutusu görünecektir. Zaman (1) ve Sonsuz zaman (koşul hiçbir zaman karşılanmadı) öğelerini içeren Koşul etiketli dördüncü kutudaki Ayarlar'ı tıklayın.
    2. Sonra'nın yanındaki Baloncuk'a tıklayın, ardından sağdaki metin kutusuna süreyi (30 dk) girin. Ayrıca h, min ve s arasında seçim yapmak için zaman metin kutusunun sağında bir açılır menü olacaktır.
      NOT: Kaydedilen çekim için algılama ayarları, çekim kalitesine bağlı olacaktır. Aşağıdaki yöntemler, tek tek çekimlere özgü en iyi sonuçları gözlemlemek için manipüle edilebilir.
  5. Algılama ayarlarını aşağıda açıklandığı gibi ayarlayın.
    1. Sol üst Kurulum panelindeki Algılama Ayarları sekmesi altında Algılama Ayarları'na tıklayın. Tıkla Video Seç sağ üst paneldeki düğmesine basın. İstenen videoyu temel algılama ayarlarına yükleyin.
    2. Aynı sağ paneldeki Gelişmiş sekmesine tıklayın. Şimdi, Yöntem sekmesi altında, Gri Ölçekleme olarak ayarlandığından emin olun. Aralığı değiştirin (0 - 100).
    3. Sağ panelin Düzgünleştirme sekmesi altında, Video pikseli yumuşatmanın Yok, Atlanan kareler düzeltmenin Kapalı ve Parça gürültüsü azaltmanın Kapalı olduğundan emin olun.
    4. Sağ panelin Konu Konturu sekmesi altında, sıra ayarını yapın ve Erozyon, Genişleme ve Erozyon'u sırasıyla 1, 1 ve 0 olarak değiştirin.
    5. Konu Boyutu sekmesi altında, Minimum (0) ve Maksimum (125000) seçeneklerini değiştirin. Sağ alttaki Kaydet'e tıklayın.
  6. Aşağıda açıklandığı gibi gözlem için bir dizi video denemesi ayarlayın.
    1. Sol üstteki Kurulum panelindeki Deneme Listesi'ne tıklayın. Sistem Video dosyası sütununun altındaki Üç Noktaya tıklayarak numunelerin video görüntülerini istediğiniz sırayla yükleyin. Daha fazla deneme sürümü eklemek için Deneme Sürümü Listesi Paneli'nin sol üst tarafındaki Deneme Ekle seçeneğini tıklayın.
  7. Edinme ayarlarını yapın.
    1. Sol üstteki Edinme sekmesinin altındaki Edinme'ye tıklayın. Sağ paneldeki Edinme ayarları altında, Tüm planlı denemeleri izle'ye tıklayın.
    2. Alıma başlamak için, ekranın alt ortasındaki Başlamaya Hazır'ın yanındaki Kırmızı Düğmeye tıklayın. Video edinme işlemi şimdi başlayacak ve yüklenen video denemelerinin miktarına ve uzunluğuna bağlı olarak belirli bir süre alacaktır.
  8. Analiz ayarlarını aşağıda açıklandığı gibi ayarlayın.
    1. Sol paneldeki Analiz sekmesinin altındaki Analiz Profili'ne tıklayın. Varsayılan olarak seçilen bağımlı değişkenlere, Taşınan Hız ve Mesafe'ye tıklayın ve bunları silin.
    2. Bağımlı değişkenler panelinde, Konum sekmesinin altında, Bölgede'yi tıklatın. Merkez ve Çevre Bölgesi kutularını onay işaretli olacak şekilde tıklatın.
    3. Bölgede kutusundaki Deneme İstatistikleri sekmesine tıklayın. Gecikme Süresi Önce seçeneğinin işaretini kaldırmak için tıklayın. Ekle'ye tıklayın.
    4. Body (Gövde) sekmesi altında, Rotation (Döndürme) düğmesine tıklayın. Saat yönünde'ye tıklayın ve Eşik (50,00 derece) ve taşınan minimum mesafe'yi (2,00 cm) varsayılan olarak bırakın. Ekle'ye tıklayın.
    5. Döndürme düğmesine tekrar tıklayın ve Saat yönünün tersine tıklayın. Ekle'ye tıklayın.
  9. İzleri aşağıda açıklandığı gibi analiz edin.
    1. Sonuçlar sekmesi altında, Görselleştirmeyi İzle'yi tıklatın. Sağ panelde, Filtre altında, Son'un işaretini kaldırın. Ekranın alt orta panelindeki oynatma kontrol çubuğu, belirli gözlem zamanları sırasında numunelerin iz görselleştirmesini gösterecektir.
  10. Sonuçları analiz edin ve dışa aktarın. Sonuçlar, sol alt panel sekmelerinin geri kalanında bulunabilir. Verileri dışa aktarmak için, sol paneldeki Dışa Aktar altında Ham Veri veya İstatistikler'i tıklayın.

3. Ötenazi

  1. Kaynak suyunda 22 mM'lik bir öjenol çözeltisi hazırlayın. Planaryayı, her konsantrasyonu ayrı tutarak kesilmiş transfer pipetini kullanarak 9 mL 22 mM öjenol çözeltisi ile Petri kaplarına yerleştirin. 3 dakika boyunca veya tüm hareket durana kadar ötenazi yapın.
  2. Planaryayı 1x-2x durulamak için 9 mL kaynak suyu ile doldurulmuş taze bir Petri kabına koyun ve aşağıda açıklanan Golgi çözeltisine (Golgi boyası) veya% 4 paraformaldehit (immünofloresan boyası) içine yerleştirin.

4. Histolojik analiz

  1. Golgi boyama
    1. Planaryalar ötenazi yapıldıktan sonra, bunları Golgi Leke Kitinden Çözelti A ve B'nin 1: 1 karışımı ile doldurulmuş bir beher veya Petri kabına yerleştirin. Ertesi gün A ve B çözeltilerini, A ve B çözeltilerinin bir karışımı ile doldurulmuş yeni bir behere planarya yerleştirerek değiştirin.
    2. Planaryanın A ve B çözeltilerinde 1 hafta oturmasına izin verin.
    3. Planaryayı A ve B çözeltilerinden çıkarın ve başka bir beherdeki C çözeltisine yerleştirin. Ertesi gün C çözeltisini değiştirin. Planaryanın C çözeltisinde en az 72 saat ve 1 haftaya kadar oturmasına izin verin.
    4. Planaryayı bir transfer pipeti ile çözelti C'den çıkarın ve bir ayna üzerine az miktarda OCT bileşiği yerleştirerek, planaryayı ekleyerek ve ardından planaryayı OCT bileşiği ile çevreleyerek gömün. Kriyostat makinesi ile planaryayı -24 ° C'de enine 5 μM bölümlere kesin.
    5. Planaryayı bir transfer pipeti ve çözelti C kullanarak jelatin kaplı slaytlara monte edin ve RT'de karanlıkta 3 güne kadar kurumaya bırakın.
    6. Boyama solüsyonunu (1 kısım çözelti D, 1 kısım çözelti E, 2 kısım Kaynak suyu) kullanarak slaytları aşağıdaki solüsyonlarla beherlere daldırarak lekeleyin: 10 dakika boyama çözeltisi, daha sonra Kaynak suyunda 2x her biri 4 dakika, daha sonra 4 dakika boyunca% 50 etanol, daha sonra 4 dakika% 75 etanol, daha sonra 4 dakika% 95 etanol, daha sonra 4 dakika boyunca% 100 etanol 4x içinde ve son olarak 4 dakika boyunca ksilen 3x içinde.
    7. Lamel histolojik montaj ortamı ile kayar ve Parlak alan Mikroskobu altında dokuyu gözlemleyin.
  2. İmmünofloresan boyama
    1. Planarya ötenazi yapıldıktan sonra, en az 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit içine yerleştirin. Bu adımdan sonra buzdolabında da saklanabilir.
    2. Planaryayı %4 PFA'dan %20 sakaroza aktarın ve 1 gün içinde bırakın. Planaryayı sakarozdan çıkarın ve 5 dakika boyunca PBS tamponuna yerleştirin.
    3. 3-4 yıkama PBS tamponu ile durulayın ve lekelenmeye hazır olana kadar saklamak için% 20 sükroza aktarın.
    4. Her biri 1 dakika boyunca %70, %95 ve %100 alkol solüsyonlarına koyun. 1 dakika ksilen içine koyun.
    5. Her biri 1 dakika boyunca %95 ve %70 alkole koyun. Her biri 3 dakika boyunca 5x PBS arabelleğine yerleştirin. 10-15 dakika boyunca 60:40 metanol ve hidrojen peroksit çözeltisine koyun.
    6. PBS 3x'te her biri 5 dakika durulayın. Daha önce 4.2.1'de kullanılan %4 paraformaldehit hacmini bu PBS tamponuna ekleyin.
    7. PBS 3x'te her biri 5 dakika durulayın. Planaryayı onunla kaplayarak süt tozu ile 1 saat bloke edin.
    8. Birincil antikoru (1H6) PBS ile 5 μg / mL'ye seyreltin ve slaytları antikor çözeltisinde 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, planaryayı PBS'de 10 dakika durulayın.
    9. İkincil antikoru (keçi anti-fare IgG) PBS'de 1 μg / mL'ye seyreltin ve slaytları antikor çözeltisinde RT'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, planaryayı PBS'de 15 dakika durulayın.
      NOT: Farklı antikorların farklı optimal konsantrasyonları vardır; Denemeye başlamadan önce bunu belirleyin.
    10. Tüm planaryayı lamel üzerine monte edin, bir lamel ile örtün, sulu montaj ortamı ile kapatın ve dokuyu floresan mikroskop altında gözlemleyin.

5. Görüntü analizi

  1. Açık kaynaklı görüntü analizi yazılımı uygulamasını açın. Eklentiyi uygulamaya sürükleyerek colour_deconvolution2.jar eklentisini açık kaynaklı görüntü analizi yazılımı uygulamasına yükleyin.
  2. Analiz etmek için görüntüyü seçin ve açık kaynaklı görüntü analizi yazılımı uygulamasına sürükleyin. Görüntü sekmesine gidin. Renk'i tıklatın. Renk Evrişimini Kaldırma2 v2.1'e tıklayın.
  3. Vektörler seçeneğinde, H DAB'ı tıklatın. Çıktı seçeneğinde 8bit_Transmittance tıklayın. Simülasyon LUT'ları, Renk 3 için çapraz ürün, Matrisleri göster ve Göstergeyi gizle'nin seçili olduğundan emin olun. Tamam'a tıklayın.
  4. Açık kaynaklı görüntü analizi yazılım uygulamasının görüntüyü etkili bir şekilde analiz edebilmesini sağlamak için Görüntüyü Siyah Beyaz olarak seçin.
  5. Görüntü sekmesine gidin. Ayarla'yı tıklayın. Eşik'i tıklayın. Eşiği, DAB boyaması veya ön plan kırmızı renkte ve beyaz bir arka plan olacak şekilde ayarlayın. Birden fazla görüntü ölçülüyorsa, eşiğin her görüntü için aynı olduğundan emin olun.
  6. Analiz et'i tıklayın. Ölçümleri Ayarla'ya tıklayın. Alan, Minimum ve maksimum gri değer, Eşik sınırı, Görüntü etiketi, Medyan ve Ortalama gri değer'i seçin. Tamam'a tıklayın. Analiz et'i tıklayın. Ölç'e tıklayın. Sonucu elde edin.
  7. 1.2 ile 1 arasındaki adımları tekrarlayın. U6ntil tüm görüntüler nicelleştirilir. Sonuçlar resmine tıklayın. Dosya'ya tıklayın. Farklı Kaydet'i tıklayın. Dosyayı elektronik tablo olarak kaydedin ve verileri elektronik tablo yazılımında görüntüleyin.

6. İstatistiksel Analiz

  1. İstatistiksel anlamlılık için Varyans Analizi (ANOVA) ve Student t-testini kullanarak planaryanın davranışı için ortalamanın (SEM) ortalama ve standart hatalarını hesaplayın (p < 0.05).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Aşağıdaki davranış, değişen pilokarpin konsantrasyonlarına maruz kalan planarya tarafından gözlenmiştir:
Dorsal salınımlar: Planaryanın vücudunun kafatası ucundan kaudal uca doğru hareket eden kabarcık benzeri bir oluşum.
Kafa salınımları: kurbağa yavrusu benzeri bir görünüm oluşturan düzlemin başı tarafından kabarcık benzeri oluşum.
C-Şekli: kafa saat yönünde hareket eder ve kuyruk bir C oluşturmak için saat yönünün tersine hareket eder.
Kafa hareketi: Planaryanın başı anide...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma, farklı konsantrasyonlarda planaryada pilokarpinin neden olduğu davranışı göstermiştir. En uygun davranış salınımlı dorsal genişlemeydi, çünkü bu davranış planarya 9,10,11,12'deki nöbet benzeri davranışla ilgili diğer çalışmalarda belgelenmemiştir. Pilokarpinin planaryada nöbet benzeri davranışlara neden olduğu mekanizma hala bilinmemektedir. Bununla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

EVMS Araştırma Teşvik Fonu'na (PI: A.E. Musto) ve Dr. Jorge Jacot'a immünofloresan protokolünü optimize etme konusundaki yardımcı önerileri için teşekkür etmek istiyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 mL santrifüj tüpleri
% 4 paraformaldehit çözeltisiHimediaTCL119
Sulu montaj ortamıClini SciencesNB-47-02240-30ML
Beherler (test edilen her konsantrasyon için bir tane)
Carolina Springwatercarolina132450
Kriyostat
Seyreltilmiş primer ve sekonder antikorlar
Etanol (%100)sigma Aldrich
EthosVision XT 16noldus
Fiji Sürüm 2.9.0
Jelatin kaplı slaytlarsigma Aldrich643203
Golgi Antikoru 1H6DSHBAB_2619608
Golgi lekesi kit_Neuroscience AssociatePK 401/401A
Hidrojen Peroksit
Metanol
Montaj ortamıtermo fischer bilimsel
OCT bileşiği
PBS tamponsigma AldrichP4417
Süt Tozu
Kalay folyo
Transfer pipetleri
Ksilen

Kaynaklar

  1. World Health Organization. Epilepsy. , (2024).
  2. Dalic, L., Cook, M. J. Managing drug-resistant epilepsy: challenges and solutions. Neuropsychiatr Dis Treat. 12, 2605-2616 (2016).
  3. Mayo Clinic. Seizures - Symptoms and causes. , (2023).
  4. Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. J Exp Biol. 216 (20), 3799-3810 (2013).
  5. Moreira-Lobo, D. C., et al. Eugenol modifies the excitability of rat sciatic nerve and superior cervical ganglion neurons. Neurosci Lett. 472 (3), 220-224 (2010).
  6. Johan Arief, M. F., Choo, B. K. M., Yap, J. L., Kumari, Y., Shaikh, M. F. A systematic review on non-mammalian models in epilepsy research. Front Pharmacol. 9, 655(2018).
  7. Mineta, K., et al. Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7666-7671 (2003).
  8. Wu, J. P., Lee, H. L., Li, M. H. Cadmium neurotoxicity to a freshwater planarian. Arch Environ Contam Toxicol. 67 (4), 639-650 (2014).
  9. Kim, A., Rawls, S. M. Nicotine-induced C-shape movements in planarians are reduced by antinociceptive drugs: Implications for pain in planarian paroxysm etiology. Brain Res. 1778, 147770(2022).
  10. Reho, G., Lelièvre, V., Cadiou, H. Planarian nociception: Lessons from a scrunching flatworm. Front Mol Neurosci. 15, 935918(2022).
  11. Pagán, O. R., et al. Planarians require an intact brain to behaviorally react to cocaine, but not to react to nicotine. Neuroscience. 246, 265-270 (2013).
  12. Raffa, R. B., Holland, L. J., Schulingkamp, R. J. Quantitative assessment of dopamine D2 antagonist activity using invertebrate (Planaria) locomotion as a functional endpoint. J Pharmacol Toxicol Methods. 45 (3), 223-226 (2001).
  13. Bhatt, P., Reitz, A. B., Tallarida, C. Mephedrone ("bath salt") pharmacology: insights from invertebrates. Neuroscience. 208, 79-84 (2012).
  14. Neufeld, T., Carniello, T., Dotta, B. A single hypoxic event ameliorates pilocarpine-induced hyperkinetic movements in Planaria. Nat Sci. 14, 149-156 (2022).
  15. Rossini, L., et al. Dendritic pathology, spine loss, and synaptic reorganization in human cortex from epilepsy patients. Brain. 144 (1), 251-265 (2021).
  16. Owuor, K., et al. LGI1-associated epilepsy through altered ADAM23-dependent neuronal morphology. Mol Cell Neurosci. 42 (4), 448-457 (2009).
  17. Dubey, V., et al. Dendritic reorganization in the hippocampus, anterior temporal lobe, and frontal neocortex of lithium-pilocarpine induced Status Epilepticus (SE). J Chem Neuroanat. 133, 102329(2023).
  18. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
  19. Musto, A. E., Walker, C. P., Petasis, N. A., Bazan, N. G. Hippocampal neuro-networks and dendritic spine perturbations in epileptogenesis are attenuated by neuroprotectin D1. PLoS One. 10 (1), e0116543(2015).
  20. Omuro, K. G., et al. Novel monoclonal antibodies to study tissue regeneration in planarians. BMC Dev Biol. 15 (2), (2015).
  21. Keenan, C. L., et al. Cytoarchitecture of primitive brains: Golgi studies in flatworms. J Comp Neurol. 195, 4(1981).
  22. Pronin, A. N., Wang, Q., Slepak, V. Z. Teaching an old drug new trick: Agonism, antagonism, and biased signaling of pilocarpine through M3 muscarinic acetylcholine receptor. Mol Pharmacol. 92 (5), 601-612 (2017).
  23. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods Mol Biol. 1897, 299-311 (2019).
  24. Vogt, R. V., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates. J Immunol Meth. 101 (1), 43-50 (1987).
  25. Duhamel, R. C., Johnson, D. A. Use of nonfat dry milk to block nonspecific nuclear and membrane staining by avidin conjugates. J Histochem Cytochem. 33 (7), 711-714 (1985).
  26. Chen, T. S., Huang, T. H., Lai, M. C., Huang, C. W. The role of glutamate receptors in epilepsy. Biomedicines. 11 (3), 783(2023).
  27. Kreshchenko, N. Immunocytochemical identification of serotoninergic neurons in Planaria Girardia tigrina. Biochem. Moscow Suppl Ser A. 11, 68-76 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Planarya Nöbet ModeliPilokarpin ile İndüklenen NöbetDugesia dorotocephalaNöbet Karşıtı İlaç TestiNörohistolojik DeğerlendirmeGolgi Boyamaİmmünofloresan BoyamaDavranışsal FenotiplerEpilepsi İlacı Keşfi
Deneysel akut nöbet için bir hayvan modeli olarak düzlemsel
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.