Heterotrofik Mayayı Fototrofik Şeker Salgılayan Siyanobakterilerle Birleştiren Ko-Kültürlerin Birleştirilmesi ve Miktar Tayini

Özet

Bu protokol, fotoototrofik şeker salgılayan siyanobakteriler ve heterotrofik mayalar dahil olmak üzere ko-kültürlerin kurulumu ve kantitatif izlenmesi için kapsamlı bir kılavuz sağlar.

Özet

Sürdürülebilir biyoteknolojilere olan talebin artmasıyla birlikte, güneş enerjisiyle çalışan biyoüretim için bir yöntem olarak fototrofik bir mikrop ve heterotrofik ortak türler içeren karma konsorsiyumlar araştırılmaktadır. Bir yaklaşım, birlikte yetiştirilen bir heterotrof metabolizmasını desteklemek için organik karbon salgılayan CO₂ sabitleyici siyanobakterilerin kullanılmasını içerir ve bu da karbonu daha yüksek değerli mal veya hizmetlere dönüştürür. Bu protokolde, model maya türleri tarafından temsil edildiği gibi, sükroz salgılayan bir siyanobakteri suşunu bir mantar partner(ler)i ile birleştiren bir ko-kültürün oluşturulmasında deneyciye yardımcı olacak teknik bir açıklama sağlanmıştır. Protokol, ortak kültür kurulması için temel ön koşulları açıklamaktadır: Medya bileşiminin tanımlanması, bireysel ortakların büyüme özelliklerinin izlenmesi ve aynı büyüme kabında birleştirilmiş birden fazla türe sahip karma kültürlerin analizi. Mikroskopi, hücre sayacı ve tek hücreli akış sitometrisi dahil olmak üzere ko-kültür izleme için temel laboratuvar teknikleri özetlenmekte ve ham akış sitometrisi standart (FCS) dosyalarının FAIR (Bulunabilir, Erişilebilir, Birlikte Çalışabilir, Yeniden Kullanılabilir) ilkelerine uygun olarak veri analizi için kullanılacak tescilli olmayan yazılım örnekleri verilmektedir. Son olarak, şeker salgılayan siyanobakteriler ve yeni bir heterotrofik partner ile bir ko-kültür oluşturmaya çalışırken sıklıkla karşılaşılan darboğazlar ve tuzaklar hakkında yorumlar yer almaktadır. Bu protokol, bir siyanobakteri ve bir heterotrofik mikrop içeren yeni bir ko-kültürlenmiş mikrop çifti oluşturmaya çalışan araştırmacılar için bir kaynak sağlar.

Giriş

Son yıllarda genomik araçların ve DNA teknolojilerinin hızla genişlemesiyle, biyomühendislik çabaları, yalnızca aksenik kültürlere odaklanmak yerine, karışık mikrop topluluklarını biyoüretim stratejileri için uygun olarak giderek daha fazla düşünebilmektedir. Mikrobiyal konsorsiyumlar, uzmanlaşma ve iş bölümü, uyarlanabilirlik ve sağlamlık ve substrat kullanımının verimliliği dahil olmak üzere tek tür kültürlere göre birçok potansiyel avantaja sahiptir¹. Bununla birlikte, çok tür konsorsiyumlarının öngörülebilir mühendisliği, türler arası etkileşimlerden ortaya çıkan üst düzey davranışların neden olduğu belirsizlikler nedeniyle karmaşıktır². Türler arası sinyalleşme ve metabolit değişimi, iş bölümü ilkesinin merkezinde yer alır, ancak aynı zamanda konsorsiyumun^{katılımcıları} arasında beklenmedik sinerjilere ve düşmanlıklara yol açar 3. Mikrobiyal etkileşimi "aşağıdan yukarıya" daha iyi karakterize etmek ve anlamak için kullanılabilecek esnek 2 ve 3 ortaklı ko-kültür platformlarının kullanımı da dahil olmak üzere, karma mikrobiyal konsorsiyumların tam potansiyelinin gerçekleştirilebilmesi için bu alanda önemli bir gelişme gereklidir.

Ücretsiz oksotrofik ortaklar ve genellikle geniş bir mikrobiyal tür yelpazesine faydalı olan metabolitleri salgılayan mikroplar da dahil olmak üzere, şu anda bu alanda birkaç baskın ko-kültür platformu türü kullanılmaktadır. İkinci kategoride, siyanobakteriler, kolayca metabolize edilen karbonhidratların salgılanmasına yol açan yolların eklenmesiyle gelişmiş birincil üreticiler haline gelmek üzere tasarlanmıştır ve şimdi rasyonel olarak tasarlanmış çeşitli konsorsiyumlarda araştırılmıştır. Kısaca, bu tür tasarlanmış mikrobiyal topluluklarda, siyanobakteri ortağı, birincil girdi olarak ışık ve CO_2'yi kullanabilir ve oksijenli fotosentez süreci boyunca, bu suşlar bir kamu yararı olarak merkezi karbon şekerlerini salgılayabilir. Bu tür tasarlanmış siyanobakteri suşlarının bir sınıfı, disakkarit sükroz^4'ü salgılamak için tasarlanmış olanlardır. Bu tür suşlar muhtemelen başarılarından keyif almışlardır, çünkü sükroz birçok tür için merkezi karbon metabolizmasına yakın bir metabolittir ve aynı zamanda çeşitli çevresel abiyotik streslere uyum sağlamak için sıklıkla "uyumlu çözünen" olarak adlandırılan bir metabolittir⁵. Minimal sayıda genetik müdahale, bir dizi siyanobakteriyel model organizmada verimli sükroz salgılanmasına yol açabilir⁴.

Sükroz salgılayan siyanobakteriler, rasyonel olarak tasarlanmış mikrobiyal konsorsiyumların araştırılması için yararlı bir platformdur, çünkü çok çeşitli heterotrofik türler sakarozları baskın karbon ve enerji kaynağı olarak metabolize edebilir. Gerçekten de, sükroz salgılama kabiliyetine sahip birkaç model siyanobakteri kullanarak, birçok laboratuvar, bir veya daha fazla heterotrofik mikrop içeren ve nihayetinde organik karbon hammaddelerinin takviyesi olmaksızın ışık ve CO_2'nin birincil girdileri tarafından desteklenen rasyonel olarak tasarlanmış karma tür ko-kültürleri ve konsorsiyumları tasarlamıştır⁴. Heterotrofik suşlar basitçe siyanobakteriyelden türetilmiş karbonhidratlar üzerinde bulunabilir veya sükroz hammaddesini daha yüksek değerli biyoürünlere (örneğin yakıtlar, polimerler, pigmentler, vb.) dönüştürmek için kullanılabilir. Sürdürülebilir biyoüretim için potansiyel bir strateji olmasının yanı sıra, bu tür basit ortak kültürler, ilgisiz mikrobiyal türler arasında ortaya çıkan etkileşimlerin araştırılması için bir platform olarak da yararlı olabilir.

Bu video makalesi, şeker üreten siyanobakterilerin yalnızca hafif ve inorganik karbon girdilerini destekleyerek stabil olabilen basit mikrobiyal konsorsiyumların tasarımı için esnek bir platform olarak kullanılmasına yönelik metodolojilere ve ön koşullara odaklanmaktadır. Tek yerleşik mikroorganizmalar içeren kültürlerin kurulumu ve izlenmesi çoğunlukla basit olsa da ve optik yoğunluk (OD) veya geri saçılma metodolojisi kullanılarak kolayca elde edilebilirken, iki veya daha fazla organizma bir kapta birleştirildiğinde bu mümkün değildir. Bunun ana nedeni, bu yöntemlerin farklı mikroorganizmalar arasında ayrım yapmamasıdır, bu nedenle, yalnızca kültürün genel bir resmini sağlarlar ve bireysel organizmaların büyümesini çözmezler. Ayrıca, siyanobakteriler 400-750 nm aralığında geniş bir absorpsiyon spektrumuna sahiptir, bu nedenle bir heterotraffın OD_600'ünü ölçmek, fikosiyanin (620 nm'de absorbe eden) nedeniyle yanlış sonuçlara yol açacaktır. Bu nedenle, laboratuvar içinde siyanobakteri-heterotrof karışık toplulukların kurulması için özel protokollerin yanı sıra bu konsorsiyumların zaman içindeki performansının analizi için yararlı jenerik protokoller sağlanmaktadır. Protokoller, bir modelin, sükroz salgılayan siyanobakteri türlerinin bir veya daha fazla model heterotrofik mikropla belirli bir eşleşmesine odaklanırken, bu çalışmanın amacı, yeni tür eşleşmeleri tasarlamak isteyebilecek araştırmacılar için bir kaynak sağlamak ve bu tür kültürlerin kurulması için optimizasyon aşamasını hızlandırmaktır. Bu nedenle, türe özgü protokollere ek olarak, okuyucunun ihtiyaçlarına göre tanımlandığı şekilde, bu protokolleri özel topluluklar için uyarlamak ve genelleştirmek için kullanılabilecek bilgi ve stratejiler dahil edilir.

Burada tarif edilen ko-kültür platformunun esnekliği nedeniyle, daha önce şeker salgılayan siyanobakterilerle birlikte yetiştiricilikte rapor edilen bir dizi farklı heterotrofik tür için protokoller açıklanmaktadır. Örneğin, Synechococcus elongatus PCC 7942'nin ortak laboratuvar mayası Saccharomyces cerevisiae ile birlikte kültürü için adım adım protokol sağlanmıştır. Bununla birlikte, makale aynı zamanda Ustilago maydis'in maya formu da dahil olmak üzere diğer model türleri içeren ko-kültürlerin performansını test etmek için uygun olan protokolleri de içermektedir.

Makale, bir siyanobakteri/heterotrofik ko-kültür oluşturmak ve bu karma konsorsiyumların zaman içindeki performansının temel karakterizasyonunu gerçekleştirmek için gerekli olan bir dizi temel protokole odaklanmaktadır. Spesifik olarak, farklı türlerin doğru bir sayımını almaya uygun tek hücreli akış sitometrisi ve partikül sayma yöntemlerinin yanı sıra hücre morfolojisini değerlendirmek için mikroskopi yaklaşımları vurgulanmaktadır. Bu protokoller, ihtiyaçlara ve mevcut ekipmana uyum sağlamak için temel teşkil etmek içindir. Daha da önemlisi, laboratuvar içinde ko-kültürlerin oluşturulması ve izlenmesi için önemli olan teknik notlar ve diğer hususlar sağlanır. Son olarak, Python paketleri kullanılarak ham FCS⁶ dosyalarının veri analizleri için tescilli olmayan alternatiflerin örnekleri dahil edilmiştir. Özetle amaç, siyanobakteri bazlı ko-kültür tekniklerini daha geniş bir bilimsel kitle için daha erişilebilir hale getirmektir.

Protokol

NOT: Bu protokol, şeker salgılayan S. elongatus ve heterotrofik model maya türlerinin ko-kültürlerinin nasıl kurulacağı ve miktarının nasıl belirleneceği hakkında ayrıntılı talimatlar içerir. Genel olarak, protokol genetik manipülasyona uygun herhangi bir maya türüne uygulanabilir.

1. Fototrofik siyanobakteriler ve heterotrofik mayaları birleştiren ko-kültürlerin kurulması

1. Birlikte yetiştirme için hazırlıklar: Medya ve ön yetiştirme
   NOT: Tüm medya ve stok çözeltilerini ultra saf filtrelenmiş su kullanarak hazırlayın. Tüm cam eşyalar (ölçü kapları, dereceli silindirler, saklama şişeleri ve yetiştirme şişeleri) temizlenmeli ve otoklavlanmalıdır. Steril ortamlar oda sıcaklığında (RT) saklanabilir. Fotoototrofik yetiştirme gerekliliklerine uygun bir cihazın mevcut olması gerekir.
   1. Ko-kültür ortamını, ko-kültürün amaçlanan başlangıcından en az 3-4 gün önce hazırlayın. Çoğu ko-kültür ortamı tarifi, birçok siyanobakteriyel model türünün rutin yetiştiriciliği için kullanılan ortak BG-11 ortamı^7'nin varyasyonlarıdır. Bu protokol, örnek olarak daha önce bildirilen CoYBG-11 ortamını kullanır (⁸; Tablo 1'e bakınız). Otoklav (121 °C, 20 dk) veya filtre, hazırlanan ortamı uygun şekilde sterilize eder (0,22 μm gözenek boyutu).
      NOT: Diğer tür eşleşmelerine uygun bir ortamın uyarlanmasına ilişkin öneriler için Tartışma bölümüne bakın.
   2. Moleküler reaktifleri hazırlayın: CscB ekspresyonunun indüksiyonu ve sükroz ihracatı ^9,10,11 için 1 M'lik bir izopropil-β-tiyogalaktozit (IPTG) stoğu hazırlayın.
      NOT: Ko-kültür sırasında antibiyotik kullanımı optimalin altındadır, ancak tüm suşlar direnç kasetleri taşıyorsa, bunlar kullanılabilir. Bu durumda, kullanılan suşların ihtiyaçlarına göre antibiyotik stokları hazırlayın.
   3. Bir siyanobakteri ön kültürü hazırlayın: Ko-kültürün başlamasından en az 3 gün önce, hücreleri BG-11 ortamında büyüyen şeker salgılayan siyanobakteri suşunun bir ön kültüründen CoY^BG-11 ortamı içeren taze bir şaşkın şişeye aktarın (Tablo 1).
      NOT: Birden fazla siyanobakteri türü ve suşu artık şeker salgılayacak şekilde modifiye edilmiştir. Bu yazının yazıldığı sırada mevcut olan suşların kapsamlı bir incelemesi için^4'e bakınız. Bu referans aynı zamanda siyanobakteriyel ko-kültürün daha önce bildirildiği heterotrofik türleri de listeler (bkz. 1.1.4).
      1. Ön kültürün OD_750'sini ölçün. V₁ = C₂ x V₂ / C₁ denklemini kullanarak 0.3 (C₁) hedef OD_750'ye ulaşmak için gerekli ön kültür hacmini hesaplayın, burada C₂ = hedef OD, V₂ = hedef hacim ve V₁ = gerekli ön kültür hacmi. Örneğin, 30 mL'lik bir kültür (V₂) aşılanırken, kullanılacak x sıvı kültür miktarı V₁ (mL) = (0.3 x 30) / (ölçülen OD₇₅₀)'dir.
         NOT: Optik yoğunluk, hücre yoğunluğunun yaklaşık bir değeridir ve büyüme koşullarına ve hücre morfolojisine bağlıdır; Bu nedenle, araştırmacıların, ko-kültür performansının uygun bir şekilde değerlendirilmesi için optik yoğunluğu mutlak hücre sayılarıyla ilişkilendirmek için yöntemler kullanmaları gerekmektedir (bakınız bölüm 2.1, 2.2 ve 2.3). Siyanobakteriler için, fotosentetik olarak aktif spektrumdaki ışık dalga boyları (yani 400-700 nm), klorofil ve diğer pigmentler tarafından emildiklerinden optik yoğunluğu belirlemek için kullanılmamalıdır; Bu nedenle, uzak kırmızı dalga boyları rutin olarak kullanılır (örneğin, 750 nm).
      2. Seyreltilmiş kültürü uygun bir fotoinkübatörde inkübe edin. Tipik kuluçka
         Model siyanobakteriler için koşullar aşağıdaki gibidir: 30 °C, 150 rpm (25 mm atış), %2 CO₂ tepe boşluğu, ~200 μmol foton ^m-2·^s-1 LED aydınlatma, u nem.
         NOT: Salınan sakaroz miktarını optimize etmek için CO₂ takviyesi şiddetle tavsiye edilir.
      3. Siyanobakterilerin üstel büyüme içinde olduğundan emin olmak için ko-kültürü kurmadan önce bu seyreltme işlemini her gün en az 3 gün tekrarlayın. Bu, farklı günlük deneyler arasındaki ortak kültür performansındaki tutarlılığı artırmaya yardımcı olacaktır.
   4. Ko-kültürün başlamasından en az 2 gün önce, bir heterotrof prekültür hazırlayın. Belirtildiği gibi, bir dizi maya türü ve alt suşu daha önce siyanobakteriler ^8,12,13 ile birlikte kültürde yetiştirilmiştir.
      1. Zengin bir yetiştirme suyunda büyüyen heterotrofik türlerin sıvı bir kültüründen 1:100 seyreltmede (250 μL) hücreleri aktarın (bakınız Tablo 1), 250 mL'lik şaşkın bir şişede 20 g / L sükroz ile desteklenmiş 50 mL CoY^BG-11 ortamına aktarın.
      2. Siyanobakteri ortağı için kullanılan yetiştirme koşullarıyla aynı sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin.
   5. Heterotrofik suşun deneysel ihtiyaçlar için yeterince büyüdüğünden emin olmak için ko-kültürün amaçlanan aşılama zamanından en az 24 saat önce OD_600'ü kontrol edin (bkz. 1.2): gerekirse üstel büyümeyi sürdürmek için taze ortamda seyreltin.
2. Ko-kültür aşılaması ve bakımı
   NOT: Foto ve heterotrofik mikroorganizmalar arasındaki aşılama oranıyla ilgili hususlar için Tartışma bölümüne bakın.
   1. Ko-kültürün aşılanması için, her iki ön kültürü de santrifüjleme ile zenginleştirin.
      1. Standart C₁ x V₁ = C₂ x V₂ denklemini kullanarak her iki tür için istenen başlangıç yoğunluğunu elde etmek için konsantre hücre süspansiyonunun hacmini hesaplayın, burada C₁ = zenginleştirilmiş kültürün OD'si. Örneğin, 25 mL'lik bir S. elongatus kültürü yapmak için başlangıç OD₇₅₀ 0.5 (1.5 OD aksenik kültürden) ve S. cerevisiae başlangıç OD₆₀₀ 0.05 (0.7 OD aksenik kültürden), yukarıdaki denkleme dayanarak, 8.33 mL S. elongatus başlangıç kültürü, 1.79 mL zenginleştirilmiş heterotrof kültüre ihtiyaç vardır, ve 14.88 mL CoY^BG-11 ortamı.
      2. RT'de 10 dakika boyunca 13.000 x g kullanarak kültürleri santrifüjleyin. Steril koşullar altında, süpernatanı boşaltın ve atın.
         NOT: S. elongatus'a kıyasla daha büyük hücreler (2x-3x kat) oldukları için S. cerevisiae'yi peletlemek için daha az bağıl merkezkaç kuvveti (RCF; xg) kullanılabilir, ancak süpernatantın şeffaf hale gelmesine dikkat edin. Siyanobakteriyel biyokütlenin toplanması için 13.000 x g'dan daha azı da kullanılabilir, ancak santrifüjleme için daha uzun bir süre gerekir (örneğin, 20 dakika boyunca 4.000 x g kullanılabilir).
      3. Siyanobakteri peletini 25 mL steril CoY^BG-11 ortamında yeniden süspanse edin. Daha önce olduğu gibi aynı santrifüjleme koşullarını kullanın, daha sonra süpernatanı atın ve boşaltın.
      4. Bu işlemi S. elongatus için iki kez ve S. cerevisiae için 4 kez daha tekrarlayın.
         NOT: Artık ortam bileşenlerini uzaklaştırmak için siyanobakteri ve heterotrof (S. cerevisiae) peletlerini yıkamak önemlidir. S. cerevisiae daha önce sakaroz varlığında büyüdüğü için, artan yıkama adımları miktarı, olası kalıntı şekerin uzaklaştırılmasını sağlayacaktır.
      5. OD doğrulandıktan sonra, S. elongatus ve S. cerevisiae hacimlerini steril koşullar altında 250 mL'lik şaşkın bir şişede birleştirin ve 50 mL'lik bir nihai hacme CoY^BG-11 ekleyin. Önceden hazırlanmış 1 M IPTG stoğundan 1 mM'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin (bu, siyanobakterilerin sakarozları ortama ihraç etmesini sağlamak içindir). 50 mL'lik bir kültür için, 1 M IPTG stoğundan 50 μL kullanın.
         NOT: Şaşkın şişeler genellikle daha iyidir çünkü siyanobakteriler için daha iyi havalandırma ve karıştırma sağlarlar.
      6. Şişeyi önceki adımdan 200 μmol ^{fotonlara yerleştirin m-2}·^s-1 LED aydınlatma, 30 °C'de %2 CO₂ ile desteklenmiş, 150 rpm'de (25 mm atış) yörünge sallaması ve u nem ile.
         NOT: Yukarıda belirtilen koşullar değişebilir ve deney sonucuna göre optimize edilmeleri gerekir.
      7. Her 12 veya 24 saatte bir steril numune alma (1 mL) ile kültürün büyümesini izleyin (bkz. bölüm 2). İsteğe bağlı olarak, standart canlı hücre mikroskobu yapmak ve hücre morfolojisini ve uygunluğunu izlemek ve canlı heterotrofik hücrelerin miktarını ve kontaminasyonu izlemek için uygun bir ortamda maya hücrelerinin koloni oluşturan birimlerini (CFU¹⁴) belirlemek için numuneleri kullanın.
         NOT: CFU'lar, sıvı-katı ortamda ekimden katıya geçişte önemli stres yaşayabilen siyanobakteri türlerinin kesin hücre yoğunluğunu izlemek için bir yöntem olarak önerilmez. Bu nedenle, maya özütü pepton dekstroz (YEPD)¹⁵ gibi maya ortağı/türlerinin büyümesi için uygun zengin bir ortama sahip agar plakaları seçilmelidir.

Bileşik	BG-11 (konsantrasyon mg / L)	CoY BG-11 (konsantrasyon mg / L)
NaNO3	1500	1500
K2HPO4	40	40
MgSO4·7H2O	75	75
CaCl2 · 2H2O	36	36
Sitrik asit	6	6
Ferrik amonyum sitrat	6	6
EDTA (disodyum tuzu)	1	1
Na2CO3	20	20
Eser metal bileşimi
H3BO3	2.86	2.86
ZnSO4·7H2O	0.222	0.222
Co(HAYIR3)2 · 6H2O	0.0494	0.0494
MnCl2·4H2O	1.81	1.81
CuSO4 · 5H2O	0.079	0.079
NaMoO4·2H2O	0.39	0.39
İlave
HEPPSO (Türkçe)	7160	7160
Maya Azot Baz (YNB), amino asit içermez, amonyum sülfat içermez	–	3608, 120013
pH 8.3 titrasyon ajanı	KOH	KOH
KPO3	–	118
Sükroz (sadece heterotroflar için)	–	13690

Tablo 1: BG-11 ve CoY^BG-11'in ortam bileşimi. CoY^BG-11'deki maya-nitrojen baz konsantrasyonlarının verilen konsantrasyonları, yayınlanmış kaynaklardan^{elde edilmiştir 8,12,13}.

2. Ko-kültürlerin büyümesini izlemek için araçlar ve metodoloji

NOT: Bu protokol, mikroskopi ve sayma odaları gibi basit ama yoğun iş gücü gerektiren tekniklerden parçacık sayaçları ve tek hücreli akış sitometrisi gibi yüksek verimli uygulamalara kadar ko-kültür analizi ve izleme için bir kılavuzdur. Gerçek ko-kültürün yanı sıra, kapsamlı bir analize izin vermek için tek mikroorganizmaların aksenik kültürlerinin dahil edilmesi tavsiye edilir. Analitik için genel bir başlangıç noktası olarak, kültürlerin OD'sini belirleyin. Bu bölümde, hücre yoğunluğunun göreceli ölçümlerini (yani OD) hacim başına hücre sayısının mutlak değerlerine dönüştürmek için kullanılabilecek farklı metodolojiler detaylandırılmıştır. OD₇₅₀ ölçümü genellikle siyanobakteri kültürlerinin hücre yoğunluğunu belirlemek için kullanılır (400-700 nm dalga boylarının absorpsiyonu nedeniyle), OD₆₀₀ ise heterotrofik organizmalar için kullanılır. Her iki ölçüm de rastgele birimlerle yaklaşık kılavuz değerleri sağlar. Değerlerin enstrümanlar arasında büyük farklılıklar gösterebileceğini unutmayın.

1. Sayma odaları ile mikroskobik miktar tayini
   NOT: Sayma odaları (yani, Neubauer (geliştirilmiş)/hemositometreler), morfolojik olarak kolayca ayırt edilebilen hücrelerden oluşan ko-kültürlerin bileşimini belirlemek için basit ve ucuz bir araçtır, i.e., hücre şekillerine göre (Şekil 1A). Kalın bir cam mikroskop lamı ve bir kapak camından oluşur. Kapak camı sürgünün üstüne doğru şekilde yerleştirilirse, oyulmuş ızgaralara sahip iki hassas hacim bölmesi oluşturur (Şekil 1B-D). Bir ızgaranın tanımlanmış bir alanını sayarak, bir süspansiyonun hücre konsantrasyonu hesaplanabilir. Sayma odaları farklı derinliklerde mevcuttur. Hücre kalınlığına bağlı olarak uygun bir odacık derinliği seçilmelidir. Mantar hücreleri için U. maydis veya S. cerevisiae, 0,1 mm'lik bir derinlik iyi sonuç verir. Bu hazne derinliği, siyanobakteriler gibi daha küçük hücreler için çok büyüktür ve hücreler hazne içinde yüzer. 0,02 mm derinliğe sahip bir oda, hem siyanobakteriler hem de siyanobakteri ve mantar kokültürleri için uygundur.
   1. Sayım haznesinin ve kapak camının toz ve hücrelerden arındırılmış olduğundan emin olun.
      NOT: Kullanımdan hemen önce p (h/h) etanol ve tüy bırakmayan mendillerle temizlik yapılması önerilir.
   2. Kapak camını doğru bir şekilde yerleştirmek için, biraz basınçla iki destek çubuğunun üzerine kaydırın, ancak kırılmayı önlemek için dikkatli olun.
      NOT: Bu uygulama için özel, kalın bir kapak camı gereklidir (hazne kılavuzuna bakın). Kapak camı bazen montaj sırasında kırıldığından, yedek parçaların elinizin altında olması iyidir.
   3. Kapak camı düzgün bir şekilde yerleştirildiğinde, iki cam yüzey arasındaki Newton halkalarını (Şekil 1B) ve kapak camının artık kaymadığını gözlemleyin.
      NOT: Montajdan önce kapak camına hafif bir nefes almak genellikle sonucu iyileştirir.
   4. Hücre süspansiyonunu iyice karıştırın ve hücre süspansiyonundan birkaç mikrolitre (hazne derinliğine bağlı olarak ~-2-10 μL) haznenin kenarına uygulayın ve kılcal kuvvet ile tamamen dolmasına izin verin. Güvenilir sayıma izin vermek için hücre süspansiyonunun uygun bir seyreltmesini kullanın, örneğin, büyük kare başına 20 ila 200 hücre elde edilir (Şekil 1D, kırmızı dikdörtgen).
   5. Bir ışık mikroskobunun uygun (örn. 10x) bir objektifini (parlak alan veya faz kontrast modu) kullanın ve sayma odası ızgara çizgilerine odaklanın. Oryantasyon ızgara tarafından sağlanır. Verilen hücre boyutuna uygun karelerdeki hücreleri saymaya başlayın.
      NOT: Sayma için el sayacı veya uygun bir akıllı telefon uygulaması gibi bir teknik yardım kullanın (örneğin, genel "şey sayacı" veya son derece yararlı özellikler sağlayan özel hemositometre uygulamaları). Çift sayımları önlemek için ızgara sınırlarında bulunan hücreleri saymak için bir kural tanımlayın. Örneğin, her karenin üst ve sol kenarlıklarında bulunan hücreler, sağ ve alt kenarlıklardakiler hariç tutularak sayılabilir. Alternatif kurallar mevcuttur¹⁶. Bir floresan mikroskobu kullanılırsa, hücreler otofloresan veya floresan işaretleyicilerine göre de ayırt edilebilir.
   6. Örneğin, köşelerdeki dört büyük kareyi de saydıktan sonra, her hücre türü için ortalama değeri belirleyin. Bu ortalama değerlerle, kullanılan karenin alanı ve verilen odanın derinliği (üreticilerin bilgilerine danışın), hücre konsantrasyonlarını hesaplayın (bkz.
      NOT: Hücre boyutuna bağlı olarak, sayma için farklı kareler kullanılabilir. Maya ve siyanobakteri hücreleri için, köşelerdeki dört büyük kare iyi çalışıyor (Şekil 1D, kırmızı dikdörtgen).
   7. Kullandıktan sonra, numunelerin gereksinimlerini göz önünde bulundurarak hazneyi temizleyin (örneğin, genetiği değiştirilmiş organizmaları uygun şekilde etkisiz hale getirin).
2. Partikül sayaçları kullanarak miktar tayini
   NOT: Bir ko-kültürdeki hücrelerin özelliklerine bağlı olarak, ortakların hücre sayılarını belirlemek için bir parçacık sayacı uygulanabilir. Bu yöntemin uygulanabilirliği için, hücrelerin boyutlarına göre güçlü bir şekilde farklılık göstermesi gerekir; Örneğin, bakteri ve maya hücrelerinin ayrımı sağlanabilir. Sonuçların yorumlanmasına izin vermek için konsorsiyumun tek mikroorganizmalarının aksenik kültürlerinin dahil edilmesi gerekir. Benzer büyüklükte veya 2'den fazla partnere sahip hücreleri barındıran ko-kültürler, bölüm 2.1 veya 2.3'te açıklanan metodoloji ile analiz edilmelidir.
   1. Hazırlık
      1. Kültürün OD'sini 0.1'e ayarlayın ve numuneyi toplam 10 mL hacimde izotonik bir ölçüm tamponu (cihaz kılavuzuna bakın) ile 1.000 kat seyreltin. Tüm numunelerin teknik üçlülerini hazırlayın.
      2. Deney için kılcal damar için uygun bir gözenek boyutu seçin.
         NOT: Gözenek boyutu, ko-kültürdeki en küçük hücrelerin aralığında olmalıdır, ancak aynı zamanda daha büyük hücreleri de içermelidir. Çok küçük gitmeyin çünkü gözenek, hücre bölünmesi nedeniyle meydana gelebilecek hücre toplanması nedeniyle tıkanabilir. Mevcut gözenek boyutları farklıdır. Örneğin 45 μm'lik bir kılcal damar, 0.7 μm çapındaki hücreleri tespit etmeye başlar (U. maydis ve S. cerevisiae 3.5 μm-5.5 μm, S. elongatus/Synechocystis sp. ~1-2.5 μm).
   2. Bir partikül sayacındaki hücrelerin miktar tayini
      1. Cihazı başlatın. Sonunda, kalite kontrol için kendi kendine bir test yapın (belirli cihazın kılavuzuna bakın).
      2. Numuneleri numune kaplarına yükleyin, kapağı sabitleyin ve kabı hafifçe eğerek numuneyi karıştırın.
         NOT: Köpürme ve kabarcıklardan kaçınmaya çalışın. Her ölçüm için her zaman bir fincan kullanın. Bardaklar birden çok kez temizlenebilir ve tekrar kullanılabilir. Çıkarılamayan herhangi bir kalıntı varsa bardakları atın. Numune kapta daha uzun süre kalırsa, ölçmeden önce tekrar karıştırın.
      3. Hücre agregalarının potansiyel olarak tek hücrelerden daha büyük olması nedeniyle 0-30 μm aralığında kayıt yapın.
         NOT: İlk olarak, hücrelerin boyutu hakkında bir fikir edinmek ve boyutlarına göre ayırt edilip edilemeyeceğini belirlemek için ko-kültür ortaklarının aksenik kültürlerinin her birini kullanın.
      4. Değerlendirmeden sonra, ortak kültürün bileşimini de aynı şekilde belirleyin.
3. Tek hücreli akış sitometrisi kullanarak konsorsiyum miktar tayini
   NOT: Tek hücreli akış sitometrisi, ortakların boyutlarına/ışık saçılma özelliklerine ve/veya floresanslarına göre ayırt edilebileceği göz önüne alındığında, ko-kültürdeki bireysel ortakların hücre sayılarını belirlemek için kullanılabilecek yüksek verimli bir yöntemdir. Daha da önemlisi, yöntem kurulumu için, sitometredeki özelliklerini analiz etmek ve popülasyon kapılarını buna göre ayarlamak için ko-kültür ortaklarının aksenik kültürlerine ihtiyaç vardır. Floresan raportör taşıyan suşlar için, negatif kontroller olarak floresan raportör içermeyen suşlara ihtiyaç vardır. Sitometre uygulamalarına temel bir aşinalık, aşağıdaki protokolün başarılı bir şekilde uygulanmasını kolaylaştıracaktır^{17,18,19,20,21}. Bu örnekte, 3 mikroorganizmanın yapay bir karışımı analiz edilmiştir (bkz. Temsili sonuçlar): Synechocystis (sitozolik bir raportör florofor, mVenüs'ü ifade eder) ve iki maya S. cerevisiae ve U. maydis. Kesin bir ayrım için S. cerevisiae ve U. maydis, floresan belirteçleri sitoplazmik yeşil floresan proteini (GFP) (U. maydis eGFP) ve kırmızı floresan proteini (RFP) mKate2 (S. cerevisiae mKate2) temel moleküler klonlama tekniklerini kullanarak. Mümkünse, sürekli seçim baskısı gereksinimini önlemek için raportörlerin genomik entegrasyonuna sahip suşlar tercih edilmelidir.
   1. Numune hazırlama
      1. Analiz edilecek belirli bir büyüme aşamasında kültürlerin OD'sini ölçün.
      2. Numunelerin OD'sini ölçüm için uygun bir aralığa ayarlayın. Siyanobakteriler için yaklaşık OD₇₅₀ 0.05-0.5 ve taze kültür ortamı kullanan maya için 0.2-1.5 OD₆₀₀ kullanın (nihai hacim: en az 500 μL). Ko-kültürler için, ~ 0.1 ile 0.5 arasında bir OD₇₅₀ hedefleyin ve seyreltme faktörünü kaydedin. Hesaplama için adım 1.1.3.1'de verilen formülü uygulayın. Bu, hücre sayısının 10 μL/dk (6.000 - 60.000 hücre/μL'ye eşdeğer) akış hızında 1.000 - 10.000 hücre/sn aralığında kalmasını sağlayacaktır.
         NOT: Seyreltme için, otofloresan ve partikül içermeyen ortam veya tampon kullanılabilir (örn., BG-11). Ölçümde partikül olarak görünebilecek maya özü gibi karmaşık bileşenler içeren ortamlara dikkat edin.
      3. Her bir numune hücresi süspansiyonunun 300 μL'sini 96 oyuklu bir plakada (standart yuvarlak kuyu, şeffaf, düz dipli) ayrı bir kuyucuğa aktarın.
         NOT: Alternatif olarak, plaka okuyucu modu yerine yarı otomatik numune modu kullanılıyorsa, floresanla etkinleştirilen hücre sıralama (FACS) tüpüne 0,5-2 mL aktarın.
   2. Sitometri ölçümü
      1. Sitometreyi başlatın ve üreticinin talimatlarına göre başlatma programını ve kalite kontrolünü (QC) gerçekleştirin.
      2. Numuneleri yükleyin (plaka yükleyici veya yarı otomatik numune alma) ve çalıştırın. Bir ko-kültür numunesinde ayırmayı hedeflemeden önce her bir türü özelliklerine göre tanımlamak için her bir ko-kültür ortağının aksenik kültürlerini kullanarak kontrol numuneleriyle başlayın.
      3. Numunelerle ilgili floresan ve saçılma (örneğin, ileri saçılma [FSC] veya yan saçılma [SSC] yüksekliği [-H] veya alan [-A]) kanalları için açık nokta grafikleri ve/veya histogramlar.
      4. Gerekli hücre popülasyonlarını arayın ve teknik gürültüyü ve küçük parçacıkları ortamdan çıkarmak için eşiği ayarlayın.
         NOT: Hücre popülasyonunu FSC genişliği üzerinden FSC-H'de veya SSC-H nokta grafiği üzerinde FSC-H'de aramanız ve bakteriler gibi küçük hücreler için (tipik olarak 1-3 μm) ölçeği doğrusaldan logaritmik olarak ayarlamanız önerilir. FSC-H veya SSC-H kanalında eşiği ayarlayın. Çapı 1 μm'den küçük hücreler için, daha iyi bir çözünürlük için mor lazerde 405 nm'de mor SSC'yi (VSSC) kullanın.
      5. İlgilenilen her kanal için kazancı manuel olarak 25-2.500 aralığına ayarlayın. En iyi ayrımı elde etmek ve 1 x 10^1-1 x 10⁷ aralığında kalmak için kazançları negatif kontrol (örn. floresan işaretleyici olmadan) 1 x 10^2-1 x 10³ aralığında ve pozitif kontrol (örn. floresan işaretleyici ile) 1 x 10^5-1 x 10⁶ aralığında olacak şekilde ayarlayın.
         NOT: QC'den elde edilen standart kazançlar da iyi bir referans olarak saklanabilir.
      6. Numunedeki hücre konsantrasyonunu belirlemek için, kayıt fonksiyonunu kullanarak tanımlanmış bir numune hacmini kaydedin (örn. 10 μL/dk akış hızında 10 μL). Daha sonra, her popülasyon için μL başına bir hücre sayısı elde etmek için bu hacim için ölçülen tek tek hücre sayımlarını kaydedilen hacme bölün.
         NOT: Kültürdeki/numunedeki hücre konsantrasyonunu hesaplarken ilk seyreltme faktörünü göz önünde bulundurun.
   3. Hücre popülasyonlarının kapılanması/seçimi
      NOT: Ölçümleri çalıştırmak için kullanılan cihazdan bağımsız olarak, analiz ve geçitleme, aşağıda örneklendiği gibi sitometre işletim yazılımında veya ticari analiz yazılımında gerçekleştirilebilir.²². Ek olarak, tescilli olmayan yazılım kullanarak akış sitometrisi verilerinin analizi, FlowCytometryTools gibi çeşitli açık kaynaklı araçlarla verimli bir şekilde yapılabilir²³ veya FlowUtils'i kullanarak FlowKit²⁴ Python'daki paketler. Açık bilim ruhuna uygun olarak, bu protokol, bu paketlerin temel veri keşfi için kullanımını gösteren örnek bir JupyterNotebook'u paylaşır. Tabii ki, alternatif yazılımlar akış sitometrisi biyoinformatiği gerçekleştirmek için eşit derecede uygun olabilir²⁵.
      1. Bir nokta grafiğinde etraflarına kapılar çizerek veya bir histogramda tepe noktalarının etrafına bölücü veya çizgi parçaları ayarlayarak belirli hücre popülasyonlarını seçin (Şekil 4).
         NOT: Programın otomatik kapı işlevi referans olarak kullanılabilir.
      2. Spektrumun kırmızı bölgesindeki fototrofik organizmanın (esas olarak klorofilin neden olduğu) otofloresansına dayalı olarak foto- ve heterotrofik organizmalar için sinyalleri ayırın. Örnek: APC-H kanalının histogramını kullanın (638 nm'de uyarma (örn.), 660/10 nm'de emisyon (em.), ve sağ tepe (fototrofik = klorofil otofloresan pozitif popülasyon) ve sol tepe / s (heterotrofik = klorofil otofloresan negatif popülasyon) arasında dikey bir bölücü ayarlayın (Şekil 4A).
         NOT: Floresan işaretleyiciler, aynı kültür içindeki iki (veya daha fazla) fototrofik partneri ayırt etmek için de kullanılabilir (örneğin, Synechocystis için mVenüs).
      3. İki heterotrofik organizmayı floresan işaretleyicilerine veya saçılma özelliklerine (mümkünse FSC, SSC) göre ayırın.
         NOT: Saçılma özelliklerine dayalı ayırma, yalnızca hücrelerin, örneğin, saçılmada gözle görülür değişikliklere neden olan farklı hücre boyutuna veya morfolojisine sahip olması durumunda geçerlidir (örneğin, Synechocystis: ~1.5-3 μm çapında küresel hücreler vs. 10 μm uzunluğunda ve yaklaşık 1-2 μm çapında U. maydis uzatılmış hücreler²⁶).
      4. Örnek: GFP içeren heterotrofik hücreleri (örneğin, U. maydis eGFP) ve GFP'si olmayanları (örneğin, S. cerevisiae RFP/mKate2) ayırt etmek için yalnızca "heterotrofik" popülasyonu gösteren FITC-H kanalının histogramını (örn.: 488 nm, em.: 525/40 nm) kullanın (Şekil 4B). Alternatif olarak, RFP içeren heterotrofik hücreleri (örneğin, S. cerevisiae RFP/mKate2) ve RFP'si olmayanları (örneğin, U. maydis GFP) ayırt etmek için yalnızca "heterotrofik" popülasyonu gösteren PC5.5-H kanalının histogramını (örn.: 561 nm, em.: 710/50 nm) kullanın (Şekil 4C).
         NOT: Ölçüm sırasında iki (veya daha fazla) farklı hücre tipinin birbirine "yapışabileceğini" unutmayın. Bu "çiftler" veya "çoklar", her iki floresan işaretleyicinin nokta grafiklerinde kolayca tespit edilebilir (örneğin, fototrof ve GFP etiketli heterotrofik partner çiftlerini tanımlamak için FITC-H üzerinden APC-H).
      5. Python'da temel veri analizi için bu Jupyter (https://git.rwth-aachen.de/computational-life-science/cytoflow) içindeki yönergeleri izleyin.
         NOT: Bu not defteri üç adımlı veri analizini destekler. i) Verileri içe aktar: FCS dosyalarının içe aktarılması. ii) Kalite kontrolünü gerçekleştirin: Veri bütünlüğünü ve olay sayısını kontrol edin. iii) Verileri görselleştirin: Verileri görselleştirmek için histogramlar, dağılım grafikleri ve yoğunluk grafikleri gibi grafikleri kullanın. Ek olarak, Şekil 4'ü çoğaltan ilgili popülasyonları izole etmek için geçitlemenin nasıl yapılacağı prosedürü gösterilmektedir.
         Uzun vadeli projelerde ko-kültürlerin analizini kolaylaştırmak için, araştırmacının hücre sayılarını saymak ve OD değerlerini mutlak hücre sayımlarıyla karşılaştırmak için standart eğriler oluşturmak için yukarıdaki yöntemleri kullanması önerilir. Optik yoğunluk, türe, türe, büyüme koşullarına ve spektrometreye göre değişebilen göreceli bir ölçümdür. Bu nedenle, OD değerlerinin hücre numaralarına doğru bir şekilde dönüştürülmesi için "kurum içi" standart eğrilerin oluşturulması gereklidir.

Şekil 1: Morfolojik olarak ayırt edilebilir hücrelerin mikroskobik miktar tayini. (A) Bir Neubauer sayma odası. (B) Newton'un halkaları, özel kapak kaymasının doğru konumlandırıldığını gösterir. (C) Hücre sayımı için tanımlanmış hacmin merkezi boşluğu ile oda mimarisinin şematik tasviri. (D) Tasvir edilen Neubauer sayım odasının ızgarası, 1 mm² (kırmızı) boyutunda dokuz büyük kareden oluşur. Köşelerdeki dört büyük kare ayrıca 16 kareye (mavi) bölünmüştür. Ortadaki büyük kare, 0,04 mm² (turuncu) boyutunda 25 grup karesine bölünmüştür. Her grup karesi 16 en küçük kareden (yeşil) oluşur. Rakam, halka açık üreticilerin bilgilerine dayanarak oluşturulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Fototrofik S. elongatus ve heterotrofik mayaların ko-kültürlerinin oluşturulması
Synechococcus elongatus PCC 7942'nin S. cerevisiae'nin çeşitli alt suşları ile birlikte yetiştirilmesinden elde edilen ayrıntılı sonuçları daha önce bildirmiştik. Bu siyanobakteri / maya çifti ile ko-kültür sonuçlarının kapsamlı bir açıklaması için, bakınız⁸. Kısalık ve doğruluk adına, bu sonuçlar burada çoğaltılmamıştır. Kısaca, önceki sonuçlar, uzun vadeli siyanobakteriyel-maya ko-kültürlerinin kurulması için önemli olan bir dizi hususu göstermektedir. Birincil endişe kaynağı, mayanın siyanobakterilerin tek sabit karbon formlarını sağladığı koşullar altında hayatta kalma kapasitesi, maya suşunun sakarozdan yararlanabileceği verimliliğe büyük ölçüde bağlıdır. Sakaroz^27,28'i daha verimli bir şekilde metabolize etmek için evrimleşen veya tasarlanan S. cerevisiae suşlarının, ko-kültür büyüme moduna geçişte hayatta kalma olasılığı daha yüksekti, daha yüksek hücre yoğunlukları elde etti ve uzun süreli (günler ila haftalar) siyanobakteriyel ko-kültür deneylerinde daha yüksek sağlamlık sergiledi⁸. Bir ko-kültürü aşılamanın ilk aşaması, muhtemelen kültür seyreltme, ortam bileşimini değiştirme ve / veya daha konsantre bir karbon kaynağının geri çekilmesi stresleri nedeniyle, maya canlılığı için özellikle önemliydi. Bu nedenle, ko-kültür başlangıcında daha zengin bir büyüme ortamından minimum karbon mevcudiyetine geçişi kolaylaştırma çabaları, deneysel performansı ve tutarlılığı artırabilir (bkz. adım 1.2.1.1). Ek olarak, S. cerevisiae, oksijenli fotosentezin birincil yan ürünü olarak_O2 oluşumu ile tutarlı olarak, yoğun S. elongatus kültürlerine aşılandığında hiperoksi ile tutarlı stres tepkileri sergiledi. Bu nedenle, siyanobakteriyel partnerin aşırı büyümesini ve / veya alternatif "gündüz / gece" ışık döngülerini önleme çabaları, S. cerevisiae'nin uzun vadeli ko-kültürlerde yaşayabilirliğini önemli ölçüde artırabilir. Aksenik kontrol örneklerine göre ko-kültürlerde yaygın olan fenomenlerin ek bir özeti için Tartışma bölümüne bakın.

Farklı metodolojiler kullanarak ortak kültürlerin büyümesinin izlenmesi
Aşağıdaki bölümde, Synechocystis ve iki maya S. cerevisiae ve U. maydis'in yapay olarak karıştırılmış üçlü konsorsiyumunun üç farklı yöntem kullanılarak örnek olarak nicelleştirilmesi açıklanmaktadır. Karışım için, tek kültürlerin OD₇₅₀ (siyanobakteriler için) ve OD₆₀₀ (heterotroflar için) belirlendi ve OD 0.1'e ayarlandı. Tek kültürler, optik yoğunluk kullanılarak 1: 1: 1 oranında karıştırıldı (hücre sayımlarından farklıdır, yukarıya bakın). Sitometredeki mayaların ayrımını kolaylaştırmak için, genetik olarak modifiye edilmiş S. cerevisiae FY1679-O1B^29'un raportör suşları yapısal olarak sitoplazmik mKate2 üretir (genotip: URA3Δ/pTDH3::mKate2; suş: S. cerevisiae mKate2³⁰) ve U. maydis suşu AB33³¹ yapısal olarak eGFP üretir (genotip: pep4Δ/pRpl40::egfp; suş: U. maydis eGFP³²) kullanılmıştır. Dikkat çekici bir şekilde, siyanobakteriyel suşu, sarı floresan protein versiyonu mVenüs'ün (Synechocystis sp. PCC 6803 pSHDY-Pcpc560-mVenüs, Synechocystis mVenüs suşu,^33'e benzer) ve ek olarak, fotosentetik makinelerin varlığına bağlı olarak tipik güçlü otofloresan sergiler.

Sayma odalarını kullanarak mikroskobik niceleme: Kullanılan üç mikroorganizmanın yapay karışımındaki tüm hücre tipleri mikroskobik olarak kolayca ayırt edilebilir (Şekil 2A): Synechocystis ve S. cerevisiae , çapları bakımından büyük farklılıklar gösteren küresel hücrelerle temsil edilir (Synechocystis: yaklaşık 1.5-3 μm çap, S. cerevisiae: yaklaşık 3-6 μm çap), U. maydis hücreleri ise uzun, puro şeklinde bir morfolojiye ve en az 10 μm uzunluğa sahiptir (Şekil 2A). Bu açık morfolojik özellikler, karışımdaki her bir ortağın tam olarak ölçülmesine izin verir. Açıklayıcı bir örnek olarak, 37, 18, 36 ve 21 S. cerevisiae hücreleri sırasıyla dört büyük karede sayılır (Şekil 2B). Ortalama değer 28 hücredir. Kullanılan hemositometrenin büyük bir karesi 1^mm2'lik bir alana sahip olduğundan ve odacık derinliği 0.02 mm olduğundan, bu 0.02 μL'de 28 hücre ile sonuçlanır. Bu, 1.4 x 10⁶ hücre/mL'ye eşdeğer olan 1.400 hücre/μL'ye karşılık gelir. Diğer hücre tipleri sayıldı ve konsantrasyonlar buna göre belirlendi (Şekil 2C, Tablo 2).

Şekil 2: Synechocystis ve S. cerevisiae ve U. maydis mayalarından oluşan üçlü bir konsorsiyumun mikroskobik miktar tayini. (A) Belirtilen mikroorganizmaların yapay olarak birleştirilmiş bir karışımının mikroskobik diferansiyel kontrast (DIC) görüntüsü. Tüm türler morfolojileri ile kolayca ayırt edilebilir. Ölçek çubuğu: 10 μm. (B) OD'si 0.1 olan aksenik kültürlere dayalı olarak belirtilen suşların yapay olarak bir araya getirilmiş bir karışımı için örnek sayım sonuçları. Izgara kenarlarındaki dört büyük kare analiz edildi ( Şekil 1D'deki kırmızı işaret). (C) Dört karede sayılan farklı hücrelerin ortalama değeri, aşağıdaki denklem kullanılarak süspansiyondaki hücrelerin konsantrasyonunu hesaplamak için kullanıldı: Ortalama değer/(oda derinliği [0.02 mm] x sayılan karenin boyutu [1 mm²] x 1.000). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Partikül sayaçları kullanarak miktar tayini: Partikül sayaçları, boyutlarına bağlı olarak bir süspansiyondaki partikül sayısını belirler. Örnek veri setinde, 45 μm kılcal damarlı bir partikül sayacı kullanılmıştır. S. cerevisiae ve U. maydis hücreleri benzer boyutlar gösterdiğinden, partikül sayacında ayırt edilemezken, daha küçük Synechocystis hücreleri net bir şekilde ayrılabilir. Bu nedenle, tek kültürlerin analizi, iki maya için 3 ila 6 μm'ye atıfta bulunan aynı konumlarda zirveleri gösterir (Şekil 3A). Ölçüm sırasında, hücrelerin kılcal damara girmesine neden olan negatif bir basınç uygulanır. Bu, elektrik direncini kısaca değiştirir, böylece cihaz, değişikliğe bağlı olarak partikül boyutunu belirleyebilir. Karışık kültürde, biri daha küçük siyanobakteri hücreleriyle ilişkili ve diğeri iki maya türünün ortak bir fraksiyonunu temsil eden iki farklı tepe tespit edilebilir (Şekil 3B). Daha da önemlisi, canlı hücreleri yansıtan tepe noktalarına ek olarak, hücre kalıntılarına ve daha küçük parçacıklara karşılık gelen yaklaşık 1 μm'de ek tepe noktaları tespit edildi (Şekil 3). Beklenenden daha büyük çaplarda görünecek sinyaller, hücre kümelenmelerinden kaynaklanabilir. Dikkat çekici bir şekilde, tepelerin şekli hücrelerin homojenliğini yansıtır: Keskin bir tepe, bir ko-kültür için olası olmayan çok homojen hücreleri gösterir. Bir ortak kültürde, ortak kültürün ortaklarının büyüklükleri açıkça farklıysa, çok geniş bir zirve veya hatta iki zirve görmesi beklenir. Heterotrofik mantarların aksenik kültürleri için, tepe orta geniş bir tepe olabilir.

Şekil 3: Synechocystis mVenus ve S. cerevisiae mKate2 ve U. maydis eGFP mayalarından oluşan üçlü bir konsorsiyumun bir parçacık sayacı kullanılarak miktar tayini. (A) Grafiklerde gösterildiği gibi üç suşun aksenik kültürlerinin analizlerinin görsel çıktısı (45 μm kılcal hücre sayacı). (B) Yapay üçlü konsorsiyumun aynı koşullar kullanılarak analizi için örnek görsel çıktı dosyası. Parçacık sayacı, her ikisi de ikinci tepe noktası tarafından temsil edilen iki maya türünün ayrımını desteklemez. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tek hücreli sitometri kullanarak miktar tayini: Tek hücreli akış sitometresi kullanılarak, farklı hücre popülasyonları (otomatik) floresan ve ışık saçılma özelliklerine göre kolayca ayırt edilebilir. Fototrofik hücreler (Synechocystis), APC-H kanalında ölçülen fotosentetik pigmentlerin kırmızı otofloresansına bağlı olarak heterotrofik hücrelerden (U. maydis ve S. cerevisiae) ayırt edilebilir (Şekil 4A). Fototrofik ve heterotrofik hücrelerin bu ilk ayrımına dayanarak, iki heterotrofik popülasyon, FITC-H kanalındaki floresan belirteçleri eGFP ve PC5.5 kanalındaki mKate2'ye göre ayırt edilebilir (Şekil 4B,C). Her üç popülasyonun (FSC-H ve FSC-Genişliği) saçılma özelliklerini gösteren bir nokta grafiğinde, popülasyonlar, popülasyonların yalnızca bazı küçük örtüşmeleriyle de ayırt edilebilir (Şekil 4D).

Bu yöntemle, seyreltilmiş numunelerin 10 μL'si 10 μL/dk'lık bir akış hızı ile analiz edildi ve 1 dakikada yaklaşık 70.000 hücrenin miktar tayinine izin verildi. Bu hücrelerin yaklaşık `'ı Synechocystis'e (4.23 x 10⁶ hücre/mL) atanabilirken, kalan @'ı U. maydis (1.35 x 10⁶ hücre/mL) ve S. cerevisiae (1.36 x 10⁶ hücre/mL, Şekil 4E, Tablo 2) arasında eşit olarak dağıtılmıştır.

Şekil 4: Siyanobakteri Synechocystis mVenus ve U. maydis eGFP ve S. cerevisiae mKate2 mayalarından oluşan üçlü bir konsorsiyumun tek hücreli akış sitometrisi kullanılarak miktar tayini. Synechocystis mVenus (koyu yeşil), U. maydis eGFP (açık yeşil) ve S. cerevisiae mKate2 (kırmızı) karışık kültürünün 1/3 OD₇₅₀ / 1/3 OD₆₀₀ / 1/3 OD₆₀₀ oranında ölçülmesinden sonra elde edilen örnek grafikler APC-H kanalındaki olay sayısı ve floresan histogramını gösteren bir sitometre (A) üzerinde (örn.: 638 nm, em.: 660/10 nm) otofloresanlarına göre fototrofik ve heterotrofik hücreleri ayırt etmek için kullanılan tüm hücrelerin. (B) U. maydis eGFP ve S. cerevisiae mKate2 hücrelerini yeşil floresan özelliklerine göre ayırt etmek için kullanılan tüm heterotrofik hücrelerin FITC-H kanalındaki (örn.: 488 nm, em.: 525/40 nm) olay sayısı ve floresan histogramı. (C) U. maydis eGFP ve S. cerevisiae mKate2 hücrelerini kırmızı floresan özelliklerine göre ayırt etmek için kullanılan tüm heterotrofik hücrelerin PC5.5-H kanalındaki (örn.: 561 nm, em.: 710/50 nm) olay sayısı ve floresan histogramı. (D) Floresan özellikleri olmayan hücre popülasyonlarını tanımlamak için kullanılan FSC-H kanalı üzerindeki FSC-Genişliğindeki saçılma sinyallerinin bir nokta grafiği. (E) İlgili floresan kanallarının olay sayıları, yüzdeleri ve aritmetik ortalamaları ve standart sapmaları (SD) dahil olmak üzere nüfus istatistikleri. Hücrelerin toplam miktarı, boyutları ve floresanları ile birlikte, 10 μL/dk'lık bir akış hızı ile 10 μL'lik bir hacimde belirlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Farklı niceleme yöntemlerinin çıktısını karşılaştırmalı olarak görselleştirmek için, belirlenen hücre sayıları aşağıdaki iki tabloda sunulmuştur (Tablo 2 ve Tablo 3). Daha önce tarif edilen üç yöntem kullanılarak belirlenen nihai hücre konsantrasyonları, tüm yöntemler için benzer bir aralıktadır. Sitometre, en yüksek numune boyutunu, ardından partikül sayacını ve mikroskobik nicelemeyi, yöntemler arasında yaklaşık bir büyüklük sırası azalmasıyla sağlar.

Ortak kültür 1:1:1		Işıkölçer	Sitometre		Partikül Sayacı		Mikroskopi Sayım Odası
Organizma		Dış Çap750/600	Hücre sayısı	hücreler / mL	Hücre sayısı	hücreler / mL	Hücre sayısı	hücreler / mL
Saccharomyces cerevisiae mKate2		0.0333	13,618	1,36 × 106	1,546*	2,58 x 106*	112	1,40 x 106
Ustilago maydis eGFP		0.0333	13,541	1,35 x 106			89	1,11 × 106
Synechocystis sp. PCC 6803 mVenüs		0.0333	42,330	4,23 × 106	3,094	5,16 x 106	271	3,39 × 106

Tablo 2: Farklı kantifikasyon yöntemlerinin karşılaştırılması: Yapay karma kültür. U. maydis ve S. cerevisiae'nin bir parçacık sayacı (*) kullanılarak ayırt edilemeyeceğine dikkat edin.

Tek kültür		Işıkölçer	Sitometre		Partikül Sayacı		Mikroskopi Sayım Odası
Organizma		Dış Çap750/600	Hücre sayısı	hücreler / mL	Hücre sayısı	hücreler / mL	Hücre sayısı	hücreler / mL
Saccharomyces cerevisiae mKate2		0.1	38,936	3,89 × 106	1,928	3,21 × 106	403	4,03 x 106
Ustilago maydis eGFP		0.1	36,927	3,69 × 106	2,465	4,11 × 106	307	3,07 x 106
Synechocystis sp. PCC 6803 mVenüs		0.1	127,864	1,28 × 107	8,186	1,36 x 107	428	1,07 x 107

Tablo 3: Farklı kantifikasyon yöntemlerinin karşılaştırılması: Tek/aksenik kültürlerle kalibrasyon.

Tartışma

Tek aksenik kültürlerde mikroorganizmaların laboratuvar bağlamında ele alınması, birçok mikrobiyal model için onlarca yıldır kurulmuştur. Yine de, doğada hakim olan yaşam biçimi mikrobiyal topluluklar olsa da, iki veya daha fazla ortağın tek bir yetiştirme kabında kombinasyonu daha az yerleşiktir ve zorluklar mevcut bilgi ve metodolojideki boşluklar tarafından sunulur. Bir topluluktaki hücrelerin davranışını tahmin etmek de daha zordur, çünkü hücreler arasında ortaya çıkan etkileşimler ve metabolit değişimi ortaya çıkar ve ko-kültürün^kaderini güçlü bir şekilde etkiler ^34,35. Bu nedenle, büyüme ortamı tanımı düzeyi, ortak büyüme koşullarının tanımlanması, eser metabolitlerin/sinyallerin türler arası değişimi ve zaman içinde ortaya çıkan ortak kültür bileşimi dahil olmak üzere ortak kültür oluşumu önemsiz değildir. Fototrofik, şeker salgılayan siyanobakterilerin heterotrofik ortaklarla bir araya getirilmesinde son yıllarda kaydedilen ilerleme, şimdi yeni birlikte yetiştirme çiftlerinin tasarımına yardımcı bir kılavuz sağlayabilecek ilk kuralların ve metodolojinin çıkarılmasına izin vermektedir. Bu bilgiye dayanarak, bu protokolün ilk bölümünde, bir sakaroz salgılayan siyanobakteri ve bir veya daha fazla maya içeren ko-kültürlerin montajı için adım adım bir kılavuz sağlanmıştır.

İlişkisiz mikroplar arasında bir ortak kültür oluşturmaya çalışırken ilk kez göz önünde bulundurulması gereken kritik bir husus, iki veya daha fazla tür için tüm besin gereksinimlerini karşılayan ortak bir büyüme ortamının bileşimidir. Alan sınırlamaları nedeniyle, burada bu işlem için tam olarak ayrıntılı bir protokol sağlamak mümkün değildir, bu da bazı durumlarda yüksek derecede özelleştirme gerektirebilir, ancak bunun yerine aşağıda akılda tutulması gereken önemli hususlar özetlenmektedir. Basit bir başlangıç yaklaşımı, tipik siyanobakteriyel büyüme ortamının (örneğin, BG11; bakınız Tablo 1), ilgilenilen heterotrofik türler için oluşturulmuş herhangi bir yerleşik minimal ortamla karşılaştırılmasını içerir. Standart siyanobakteriyel ortamın, heterotrofik minimal ortam içinde bulunan herhangi bir eksik bileşenle desteklenmesi, ilk test ^8,36 için iyi bir başlangıç noktasıdır. Minimal ortamın genellikle heterotrofik büyüme için önemli bir organik karbon kaynağı (örneğin, %1-%4 glikoz) ile desteklendiğinden, genellikle ilk ko-kültür deneylerinde elde edilebilecek olandan daha yüksek heterotrof hücre yoğunluğunu desteklemek üzere tasarlandığını unutmayın. Benzer şekilde, bazı yaygın ortam bileşenleri, siyanobakteri ortağı (örneğin sitrat) tarafından sağlanan fotosentezden bağımsız olarak organik bir karbon kaynağı olarak da işlev görebilir, bu da siyanobakteri / heterotrof ko-kültürlerinin daha sonraki analizini karmaşıklaştırabilir. Bu nedenle, bir ko-kültür ortamı tasarlarken, minimal siyanobakteriyel ortamı eksik elementlerin tam konsantrasyonu ile tamamlamak gerekli olmayabilir. Örneğin, birçok organizma, farklı çevresel nitrojen formlarının (örneğin,_N2, nitrat, nitrit, üre) kullanım verimliliğinde farklılık gösterir ve daha fazla oksitlenmiş nitrojen kaynaklarının bazılarını tamamen kullanamayabilir. Benzer şekilde, birçok mikrop, esansiyel vitaminlerin (örneğin, B₁₂ vitamini), kofaktörlerin veya esansiyel amino asitlerin takviyesine ihtiyaç duyabilir, çünkü bu bileşiklerin doğrudan sentezi için tam biyosentetik yollardan yoksundurlar. Bu nedenlerden dolayı, siyanobakteriyel partnerin yerleşik minimal ortamını (örneğin, BG11) heterotraffın iyi tanımlanmış bir minimal ortamıyla (örneğin, sentetik tanımlı [SD]) basitçe "birleştirerek" başlamak en pratik olabilir. Gereksiz bileşenlerin tekrar tekrar çıkarılması / azaltılmasının daha sonraki döngüleri, ortamı optimize etmek ve ortaklardan birinin büyümesine engel olabilecek herhangi bir bileşiğin bolluğunu azaltmak için kullanılabilir. Yararlı bir başlangıç noktası, ortamı nötr veya hafif bazik bir pH'ta tamponlamaktır, çünkü bunlar çoğu siyanobakteriyel model türü tarafından tercih edilen koşullar olma eğilimindedir.

Bu noktada, fazla miktarda sükroz sağlandığında, yeni ko-kültür ortamında desteklenen heterotraffın büyümesinin ön testlerinin yapılması genellikle yararlıdır. Tabii ki, potansiyel bir heterotrof seçerken, siyanobakteriyel partner tarafından sağlanacak birincil organik karbon kaynaklarını katabolize edebilen birini seçmek önemlidir. Burada, birçok mühendislik ürünü siyanobakteriyel/heterotrofik kültürde⁴ sağlanan baskın karbonhidrat olarak sakarozun, heterotrofik mikroplar tarafından evrensel olarak glikoz kadar evrensel olarak kullanılan bir karbonhidrat olmadığına dikkat etmek yararlıdır: özel sükroz taşıyıcıları heterotrofik türler tarafından kodlanmalıdır veya sakarozu, genellikle daha yüksek afiniteli taşıyıcılar tarafından tanınan fruktoz ve glikoza dönüştürmek için hücre dışı invertazlar gerekebilir⁸. Karışık mikrobiyal toplulukları araştıran çok sayıda laboratuvar tarafından yaygın olarak bildirilen önemli bir gözlem, fototrofik ve heterotrofik ortaklar^arasında daha yüksek dereceli sinerjilerin ve antagonizmaların ortaya çıkmasıdır ^4,8,13. Örneğin, doğal olarak salgılanan diğer metabolitler (örneğin, organik asitler, indirgenmiş nitrojen formları) veya kofaktörler (örneğin, sideroforlar), aksenik kontrollere göre aynı ortamda yetiştirildiğinde bir veya her iki ortağın daha yüksek büyüme oranlarını sağlayabilir. Tersine, fotosentetik su ayırma yoluyla ortamın hiperoksijenasyonu gibi potansiyel olarak zararlı metabolik yan ürünlerin, ortaklardan biri veya her ikisi için türler arası büyümenin engellenmesine neden olduğu bildirilmiştir⁸. Bu nedenle, aksenik kontroller yararlı bir kıyaslama sağlayabilir, ancak ortaya çıkan bu özellikler nedeniyle ko-kültür performansı beklentilerden farklı olabilir.

Heterotrofik ortağa ve S. elongatus'un sakaroz salgılama yeteneklerine bağlı olarak (indüksiyon seviyesine, kullanılan IPTG konsantrasyonuna bağlı olarak), her iki organizmanın farklı oranları test edilmelidir. Kültürlerin başarısı öncelikle S. elongatus'un heterotrofik partnerin büyümesini sürdürme yeteneğine bağlıdır (yani, yeterli karbon kaynağı üretebilir mi). Heterotrofik suşun aşırı büyümesi tipik olarak ko-kültür ortamı bileşiminde sağlanan organik karbon eksikliği ile sınırlıyken, siyanobakteriler heterotrofisi geride bırakabilir ve bu da ortaya çıkan inhibitör etkileşimlere yol açabilir (örneğin, hiperoksik koşullar ^8,13). Başlangıçta siyanobakteri: maya için uygun hücre yoğunluğu oranlarını belirlemeye çalışırken, iyi bir yaklaşık kural, siyanobakteriyel partnerin eşlik eden heterotrofik hücrelerin eşit bir hücre hacmini destekleyebilmesidir. Ökaryotik mayalar, model sakaroz salgılayan siyanobakterilerden önemli ölçüde daha büyük hücre hacimlerine sahip olma eğiliminde olduğundan, bu muhtemelen siyanobakteriyel hücrelerin yoğunluğunun kararlı bir durumda önemli ölçüde daha yüksek olacağı anlamına gelebilir (örneğin, S. cerevisiae için 50-100 kat). Bu nedenle, araştırmacıya özgü laboratuvar ve tür koşullarıyla yeni bir ko-kültür kurarken iyi bir başlangıç noktası, hacimsel oranı tahmin etmek için hem siyanobakteri hem de maya için ortalama hücre hacmini hesaplamak olacaktır (yayınlanmış değerlere dayanarak; örneğin, bkz. B10NUMB3R5³⁷). İlk şişeler bu hücre oranı ile tohumlanabilir. Çözelti alanını keşfetmek için, araştırmacı, siyanobakteri konsantrasyonunu sabit tutmak isteyebilir (örneğin, OD₇₅₀ = 0.3), maya hücrelerinin konsantrasyonunu, araştırmacının mevcut fototrofik yetiştirme alanının izin verdiği verime dayalı olarak artışlarla yaklaşık bir büyüklük sırasına göre yukarı veya aşağı değiştirirken. Tabii ki, bu hacimsel 'temel kural', fototrofik partnerin, heterotrofik partner tarafından kullanılabilecek organik fotosentezleri (örneğin, sakaroz) salgılama hızına bağlıdır. Birlikte yetiştirme koşulları oluşturulduktan sonra, her iki ortağın zaman içindeki büyüme performansının dikkatli bir şekilde izlenmesi, özellikle erken ortak kültürler günler ila haftalar boyunca korunabiliyorsa, ideal tür oranları hakkında değerli veriler sağlayacak ve böylece araştırmacının bir ortak kültürün sonuna yakın ulaşılan kararlı durum oranını belirlemesine izin verecektir. Bu bilgi, kültürün kendi belirlediği ideal tür oranına daha hızlı ulaşmasına yardımcı olmak için sonraki deneylerde her bir ortak tür için ilk aşılama yoğunluğunu seçerken kullanılabilir.

Protokolün ikinci bölümünde, ortak kültür analitiği için ayrıntılı talimatlar verilmiştir. Ko-kültürlerin güvenilir bir şekilde ölçülmesi, başarılı bir şekilde uygulanmalarının anahtarıdır: Fototropik, karbon salgılayan partnerin büyümesi (veya en azından metabolik aktivitesi), heterotrofları sürdürmek için gereklidir. Kültürü aşılamak için kullanılan siyanobakteri:heterotrof oranı optimize etmek için her zaman kritik olmasa da, daha uzun vadeli ko-kültürler istikrarlı oranlara doğru yakınsama eğiliminde olduğundan, bir veya daha fazla türün kültür seyreltmesi veya kapsüllenmesi yoluyla her iki partnerin de sınırsız büyümesini kontrol etmek için yöntemleri entegre etmek önemli olabilir ^36,38,39,40. Yukarıda bahsedildiği gibi, siyanobakteriyel ortağın yan ürünleri yüksek konsantrasyonlarda (örneğin, O₂) heterotrof için inhibe edici olabilir ve bazı heterotrofik metabolizma ürünleri de siyanobakteri sağlığına zararlı olabilir. Yayınlanmış ko-kültürlerin çoğu, çoğu model siyanobakteri türünden daha hızlı bir büyüme oranına sahip heterotrofları kullanır; Bu nedenle, heterotrofik büyüme hızı, siyanobakteri tarafından üretilen organik karbon arzı ile sınırlandırılma eğilimindedir. Bununla birlikte, zaman içindeki tür bolluğu dinamiklerinin belirlenmesi, stabilitedeki başarısızlıkları aydınlatmak ve uzun vadeli yetiştiricilikte sağlam ortak kültürleri optimize etmek için kritik bir değerdir.

Sayma odaları, partikül sayaçları ve tek hücreli akış sitometrisi kullanılarak miktar tayini için protokoller sağlanır. Bununla birlikte, tüm teknikler, farklı önkoşullar, avantajlar ve sınırlamalar ile ortak kültürlerin karakterizasyonu için değerli araçlardır. Sayma odaları, kültürdeki tüm ortakların hücre şekilleri veya diğer özellikleri ile görsel olarak ayırt edilebilmesi şartıyla, ko-kültür miktar tayini için çok geniş bir şekilde uygulanabilir. En büyük avantaj, bu cihazın düşük fiyatıdır, öyle ki temelde her laboratuvar için ulaşılabilir. Farklı ortakların ko-kültür bileşimi ve oranı hakkındaki bilgilerin yanı sıra, hücrenin morfolojisi ve uygunluğu hakkında bir izlenim edinilebilir ve potansiyel kirleticiler tespit edilebilir. Bununla birlikte, sayım odasının uygulanması da çok zaman alıcıdır, yüksek bir iş yükü ile birlikte gelir ve yalnızca düşük bir verimi destekleyebilir.

Hem partikül sayaçları hem de tek hücreli akış sitometrisi, yüksek verim ve kullanışlı, zaman kazandıran kullanımın büyük avantajlarını sağlar. Hücre sayacı, ko-kültürdeki ortakların hücre boyutlarındaki açık farklılıklara dayanırken, tek hücreli sitometri aynı zamanda floresan etiketlerini ayırt edebilir, bu da aynı boyutta ikiden fazla üyeye sahip ko-kültürleri veya hatta farklı floresan belirteçlerine dayalı olarak aynı organizmanın iki farklı mutantını ölçme yeteneği ile sonuçlanır. Synechocystis'in S. cerevisiae ve U. maydis ile yapay bir araya getirilmesinin sağlanan örneğinde, iki mayayı ayırt etmek için hücre içi floresan raportörleri mKate2 ve eGFP kullanıldı. Aynı floresan raportörler, aynı organizmanın (örneğin S. cerevisiae) genetik olarak değiştirilmiş iki suşunu, yalnızca ışık saçılma özelliklerine dayanarak ayrılamayan ayırt etmek için de kullanılabilir. Sentetik bakteri konsorsiyumlarını izlemek için benzer stratejiler uygulanmıştır⁴¹. Hücre tipine, bir konsorsiyumdaki ortakların sayısına ve potansiyel otofloresan (lar) aralığına bağlı olarak, floresan belirteçlerin seçimi, özellikle siyanobakterilerin otofloresan özellikleri göz önüne alındığında, spektral niteliklerin örtüşmesini önlemek için ekstra dikkat gerektirir. ⁴²

Burada, bilimsel verilerin depolanması, yönetimi ve paylaşımı açısından FAIR yol gösterici ilkelerine nasıl uyulacağını savunuyoruz. FAIR, Bulunabilir, Erişilebilir, Birlikte Çalışabilir ve Yeniden Kullanılabilir⁴³ anlamına gelen bir kısaltmadır. Bu ilkeler daha geniş bir kabul gördükçe, veri yönetimi ve kullanımına daha açık, işbirlikçi ve verimli bir yaklaşımı teşvik ederek biyolojik araştırma ortamını dönüştürmeyi vaat ediyorlar. Erişilebilirliğin kritik bileşenleri, verilerin Açıklamalı Araştırma Bağlamı (ARC)⁴⁴ üzerine depolanmasıyla sağlanabilirken, veri işleme adımlarının açık erişimli yazılımlarla çoğaltılmasını sağlamak önemlidir. Ham FCS dosyaları, akış sitometrisi deneyleri hakkında hem verileri hem de meta verileri (dalga boyları, filtreler vb. dahil olmak üzere lazerler ve dedektörler hakkında bilgiler) depolar⁴⁵. Bunlar, karmaşık veri analizine izin veren özel yazılımların dışında yüklenebilir ve okunabilir, örneğin, Python ortamında ham verilerle çalışmak için bir dizi paket mevcuttur. Geliştirilen paket, Python^23'teki mevcut birçok paketten birini kullanarak özel yazılım dışında sitometri verilerini içeren ham .fcs dosyalarının nasıl yükleneceğini, okunacağını ve görselleştirileceğini gösterir. Yukarıda açıklandığı gibi açık yazılımların kullanılması, özel mülk yazılımla ilişkili maliyetli lisans ücretlerine olan ihtiyacı ortadan kaldırır, veri işleme üzerinde tam kontrol sağlar (örneğin, dönüştürme, tazminat, geçitleme) ve ayrıca çok sayıda aracın tek bir yerde entegrasyonuna izin verir.

Tek hücreli sitometrinin bir hücre sıralayıcı ile birlikte kullanılmasının değerli bir ekstra yararı, FACS ile farklı bir tipteki hücreleri de toplama fırsatıdır. Bu, RNASeq veya metabolomik gibi ko-kültür içindeki tür etkileşimine ilişkin ayrıntılı bilgiler için herhangi bir -omik teknolojisinin uygulanması için son derece değerli olabilir. Bu cihazların açık dezavantajı yüksek fiyatlarıdır, bu nedenle bu tür makinelerin satın alınabilirliği ve kullanılabilirliği bazı laboratuvarlarda belirgin bir sınırlama olabilir.

İlginç bir şekilde, bir konsorsiyumdaki üç ortağın nicelleştirilmesi için sunulan yöntemlerin doğrudan karşılaştırılması, farklı teknikler arasında çok iyi bir uyum olduğunu ortaya çıkardı ve bu da OD ölçümlerine dayalı olarak bir araya getirilen karışımın açıklanan tüm yöntemlerle güvenilir bir şekilde ölçüldüğünü gösterdi. İlginç bir şekilde, toplam siyanobakteri sayısı, iki maya türünün sayısından yaklaşık 3-4 kat daha fazlaydı, bu muhtemelen daha küçük hücre boyutlarından dolayı bir fenomendi. Bu gözlem, OD'lerin kalibrasyon yapılmadan gerçek hücre sayıları hakkında bilgi sağlamadığına dair yaygın bilgiyle^{uyumludur 46}. Bununla birlikte, mayalar karşılaştırılabilir bir düzeyde sayım gösterdi (Tablo 2 ve Tablo 3). Ek olarak, tek kültürlerin miktar tayini ile yapılan karşılaştırma, iki maya türünü ayırmayan parçacık sayacı dışında, her üç yöntemin de hücre tiplerini ayırt etmek için güvenilir araçlar olduğunu göstermektedir.

Özünde, tek hücreli sitometri uygulamaları, saniyede 1.000-10.000 hücrenin sayılmasına izin veren, ko-kültürlerin bileşimini izlemek için açıkça en güçlü araçtır. Bu, özellikle ortakların sayısı ikiden fazla artarsa veya ortakların şekil ve/veya çap olarak benzer olması durumunda geçerlidir. Özellikle, ortak kültürlerin izlenmesine izin veren birçok alternatif vardır. Ko-kültürlerde floresan etiketli mikropların büyümesi, örneğin, florimetri veya mikrobiyoreaktörler⁴⁷ tarafından sürekli olarak izlenebilir. Bununla birlikte, bunlar genellikle iki ortaktan oluşan bir ortak kültürle sınırlıdır ve örneğin floresan belirteçlerinin seçiminde dikkatli bir deneysel tasarım gerektirir. Amplikon dizileme (16S rRNA dizileme) ve sofistike biyoinformatiklerle birlikte diğer yeni nesil dizileme teknikleri, sentetik toplulukların karakterizasyonu için başka bir seçenektir 48,49,50. Bu teknikler, yüksek verimli yaklaşımlar için uygundur ve uzun vadeli ekimlerde, evrimsel sorularda veya birden fazla mikrobiyal ortakla mutasyonların izlenmesinde yerleşik etkileşimleri ele alabilir.

Birlikte ele alındığında, rasyonel olarak tasarlanmış basit mikrobiyal ko-kültürler, doğal dünyaya hakim olan çok türlü topluluklar içinde yaklaşılması daha zor olabilen türler arası dinamikleri sorgulamak için güçlü bir "aşağıdan yukarıya" yaklaşım sağlar 51,52,53. Burada, yeni siyanobakteri çiftlerinin ve heterotrofik ortakların kurulması ve analizi için bilim camiası tarafından kolayca uyarlanabilecek aerodinamik bir protokol sağlanmaktadır. Hem yapay mikrobiyal ko-kültürlerden elde edilebilecek potansiyel temel içgörülerden yararlanmak hem de sentetik olarak tasarlanmış mikrobiyal konsorsiyumların biyoteknolojik uygulamalar için literatürde sıklıkla kendilerine atfedilen potansiyelle eşleşip eşleşemeyeceğini belirlemek için çok fazla araştırmaya ihtiyaç olduğu açıktır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10x Ph1 objektif	Carl Zeiss AG	46 04 01-9904
525/40 nm Bant Geçiren Filtre	Beckman Coulter, Inc.	A01-1-0051	FITC filtresi (488 nm lazerde)
660/10 nm Bant Geçiren Filtre	Beckman Coulter, Inc.	A01-1-0055	APC kanalı (638 nm lazerde)
710/50 nm Bant Geçiren Filtre	Beckman Coulter, Inc.	B71092	PC5.5 kanal (561 nm lazerde)
Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	A35473	Kapaklı numune kapları
Diyafram tüpü 30 & mu; Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	C92760	Kılcal
Otoklav	Lab Associates	malzemenin sterilizasyonu için	EQM-ARBP
Şaşkın şişeler ROTILABO®, Düz boyunlu, 250 ml	Carl Roth GmbH + Co. KG	LY95.1
BG11 / CoYBG11 bileşenleri	farklı tedarikçiler		Tablo 1'e bakınız;
Şişe üstü steril filtre	Sigmaaldrich	,	otoklav kullanmak istemiyorsanız steril ortamlara
Capillary 45 µ m	Omni Yaşam Bilimleri	OLS 5651738
CASY Hücre Sayacı Modeli TTC	Schaerfe Sistemleri
CASY bardakları	Omni Yaşam Bilimleri	OLS 5651794
CASYclean	Omni Yaşam Bilimleri	OLS 5651786	Temizleme çözeltisi
CASYton çözeltisi	Omni Life Science	OLS 5651808	İzotonik çözelti
Santrifüj tüpleri (50 mL)	Sigmaaldrich	CLS430828
CO2	BOC	270182-L	, siyanobakteriler, aksenik kültürler ve ko-kültürler tedarik etmek için
CONTRAD & reg; 70	Beckman Coulter, Inc.	81911	Derin temiz çözelti
Kapak camı 20 > 26 x 0,4 mm	VWR International GmbH	631-1190	Sayma haznesi için kapak
camı	Küvetler Sarstedt	67.742
Siyanobakteriler BG-11 Tatlı Su Çözeltisi	Merck KGaA	C3061
CytExpert Yazılımı v. 2.6	Beckman Coulter, Inc.		Sitometre uygulama yazılımı
CytoFLEX Kılıf Sıvısı	Beckman Coulter, Inc.	B51503	Kılıf sıvısı
Sitometresi CytoFLEX S	Beckman Coulter, Inc.
BE51180 Multisizer 4e Beckman	Coulter, Inc.	628022	Temizleme solüsyonu
Eppendorf tüp santrifüj (küçük)	mL'den daha az kültürü santrifüjlemek için	Labstac	CEN16-15
Etanol	Carl Roth GmbH + Co. KG	K928.1
FACS tüpleri	Beckman Coulter, Inc.	Yarı otomatik mod için	2523749
FlowClean Temizlik Maddesi, 500ml	Beckman Coulter, Inc.	C48093	Günlük temiz çözelti
Dereceli silindirler	Ortamın hazırlanması için	Sigmaaldrich	Z131121
HEPPSO	Merck KGaA	R426725
Infors MultiTron fotoinkübatör	Infors AG		beyaz LED ışık
IPTG	Merck KGaA	I6758	Alikotları hazırlayın, -20 ° C'de saklayın; C, çözdürün ve buz üzerinde tutun
Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	8448011	İzotonik çözelti
Kaluza v. 2.2	Beckman Coulter, Inc.	B16406	Sitometri veri analiz yazılımı
KimWipes	VWR International GmbH	115-2221	Tüy bırakmayan dokular
KOH	Merck KGaA	221473
KPO3	Noah Chemicals	7790-53-6
Ölçüm beherleri	VWR	213-3747
Mikro test plakası, 96 kuyulu, geçmeli kapak, düz taban, PS, şeffaf	SARSTEDT AG & Co. KG	82.1581.001
Mikroskop tabanı	Carl Zeiss AG	47 09 18-9902/16
Mikrosope kafası	Carl Zeiss AG	47 30 14
Milli-Q su arıtma sistemi	Merck Millipore	C85358
Mulitisizer 4e partikül sayacı	Beckman Coulter, Inc.	B23005	CASY Hücre Sayacına Alternatif
Neubauer geliştirilmiş, derinlik 0,02 mm	Yardımcı Almanya		Sayma haznesi
Neubauer geliştirilmiş, derinlik 0,1 mm	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	640010	Sayma
haznesi Kullanıma Hazır Günlük QC Florosferler	Beckman Coulter, Inc.	C65719	QC
SCHOTT şişeleri	referans Dutscher	90347	depolama için
Specord® 200 Plus Spektrofotometre	Analitik Jena GmbH		OD600/750
Sükroz	Merck KGaA	84100
Masa üstü santrifüj (büyük)	Labstac	CEN18-06R	kültür biyokütlesi
Maya Azot Bazı, amino asitler olmadan, amonyum sülfat olmadan	Thermo Fisher Scientific Inc.