Yöntem makalesi

Yetişkin Farelerden Hipokampal Mikroglia'nın İzolasyonu ve Tam Hücre Yama-Kelepçe Kaydı

DOI:

10.3791/67315

⸱

27 Eylül 2024

 ,  , 
1School of Life Sciences, South China Normal University, 2School of Life Sciences, Guangzhou University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, yetişkin farelerden primer hipokampal mikroglianın nasıl izole edileceğini ve saflaştırılacağını, ardından bu akut olarak izole edilmiş hücreler üzerinde tam hücre yama kelepçesi kayıtlarının yürütülmesi için talimatları açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglia, merkezi sinir sisteminin (CNS) homeostazını sürdürmek için nöronlarla etkileşime giren beyindeki yerleşik bağışıklık hücreleridir. Araştırmalar, mikroglial yüzeyin mikroglial aktivasyonu düzenleyen potasyum kanallarını eksprese ettiğini, bu potasyum kanallarındaki anormalliklerin ise sinirsel hastalıklara yol açabileceğini göstermektedir. Şu anda, mikroglianın tüm hücre yama-klemp kayıtları, akut izole mikroglia üzerinde elektrofizyolojik değerlendirmelerin yürütülmesindeki zorluklar nedeniyle çoğunlukla fetal veya yenidoğan farelerden kültürlenmiş primer mikroglia üzerinde gerçekleştirilmektedir. Bu çalışma, yetişkin farelerden hipokampal mikroglia'yı izole etmek ve izole edilen hücreler üzerinde tam hücre yama kelepçesi kayıtları yapmak için takip etmesi kolay bir protokol sunmaktadır. Kısaca, dekapitasyondan sonra beyin bir fareden çıkarıldı, hipokampus bilateral olarak diseke edildi ve mikroglia, yetişkin bir fare beyin ayrışma kiti kullanılarak izole edildi. Mikroglia daha sonra manyetik olarak aktive edilmiş bir hücre sıralama (MACS) yöntemi kullanılarak saflaştırıldı ve lameller üzerine tohumlandı. Başarılı mikroglial izolasyon, anti-CD11 ve anti-Iba1 antikorları ile immünofloresan boyama ile doğrulandı. Bir kayıt odasına bir kapak fişi yerleştirildi ve akut olarak izole edilen mikroglianın tüm hücre potasyum akımları, voltaj-kelepçe koşulları altında kaydedildi.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İlkel yumurta sarısı kesesindeki miyeloid progenitörlerden türeyen mikroglia, CNS'de yerleşiktir ve toplam sinir hücrelerinin yaklaşık %10 ila %15'ini oluşturur 1,2. İşlevsel olarak, yerel çevreyi gözetlemeye, bağışıklık savunma işlevlerini yerine getirmeye ve nöronlar için beslenme ve destek sağlamayaek olarak 3,4, mikroglia ayrıca nöronal yüzey reseptörlerini ve karşılık gelen ligand bağlanmasını düzenlemek için nöronlarla doğrudan temas edebilir ve sitokinlerin salgılanması yoluyla nöronlarla dolaylı olarak etkileşime girebilir5. İn vitro ve in vivo çalışmalar, mikroglia'nın, negatif membran potansiyelinin6 korunmasına katkıda bulunan ve mikroglial aktivasyonu düzenleyen çeşitli potasyum kanallarını eksprese ettiğini göstermiştir. Çeşitli beyin hastalıklarındaanormal mikroglial potasyum kanallarının gözlemlendiği göz önüne alındığında 7, araştırmacıların bu potasyum kanallarını hedef alan potansiyel ilaçları belirlemeleri ve mikroglial fonksiyonu düzenlemek için stratejiler geliştirmeleri çok önemlidir.

Mikroglia için geleneksel sindirim ve saflaştırma yöntemleri genellikle beynin tamamını kullanır, bu da mikroglia'nın farklı beyin bölgelerindeki heterojenliğini gözden kaçırır8. Serum içeren ortamlarda in vitro ayrışma ve uzun süreli kültür, mikrogliaları fizyolojik özelliklerini ve gerçek durumlarını doğru bir şekilde yansıtmayabilecek aktif bir duruma9 yerleştirir.

Ek olarak, birincil kültürlenmiş yenidoğan mikrogliasında ve hücre hatlarında10 dışa doğru doğrultucu potasyum akımları kaydedilmiş olsa da, fetal veya yenidoğan fare beyin dokusunun uzun süreli kültürlerinden elde edilen veriler olgun mikroglialarınkinden farklı olabilir. Mevcut protokol, mikroglia'yı akut olarak izole etmeyi ve yetişkin fare beyin dokusunu kullanarak mikroglial potasyum akımlarının tam hücre kayıtlarını hemen gerçekleştirmeyi amaçlamaktadır.

Biyokimyasal ve potasyum kanal özellikleri, küçük dokulardan mikrogliaların izolasyonu ve saflaştırılması için uygun bir yöntem kullanılarak incelendi 11,12,13,14,15. Bu nedenle, bu protokol, araştırmacılara fizyolojik ve hastalık koşulları altında mikroglia'nın biyokimyasal ve fonksiyonel özelliklerini aydınlatmaları için rehberlik sağlar. Bu protokol örnek olarak hipokampus ve potasyum kanallarını kullansa da, diğer beyin bölgelerinin ve kanal / hücre elektrofizyolojik özelliklerinin incelenmesine de uygulanabilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneyler, Güney Çin Normal Üniversitesi Yaşam Bilimleri Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı ve uygun hayvan refahı standartları korundu (etik onay: SCNU-SLS-2023-048). Bu çalışma için erkek veya dişi 3-5 aylık C57BL / 6J fareleri kullanıldı. Kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Çözeltilerin hazırlanması

  1. 160 mM KF, 10 mM HEPES, 10 mM EGTA ve 10 mM MgCl2 içeren 50 mL hücre içi çözelti hazırlayın. 1 M KOH çözeltisi ile pH'ı 7,2'ye ayarlayın ve ozmotik basıncı D-sükroz13,16 ile 300 mOsm'ye ayarlayın. -20 °C'de saklayın.
  2. PBS'de% 0.5 sığır serum albümini (BSA) ve 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren 50 mL manyetik ile aktive edilmiş hücre sıralama (MACS) tamponu hazırlayın.
  3. Poli-L-lizin (PLL) su içinde 1:1000 oranında seyreltme hazırlayın.
    NOT: Lameller deneyden bir gün önce PLL ile kaplanmalıdır. Kaplanmış astarları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. İkinci gün PLL'yi geri dönüştürün ve kaplanmış astarları 37 °C'de kurutun.

2. Beyin dokusundan tek hücreli süspansiyonun hazırlanması

  1. Fareleri% 2.5 kloral hidrat (0.15 mL / 10 g, ip) ile uyuşturun (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri takip ederek). Farelerde ayak parmaklarının sıkışması veya cildin sıkışması ile kornea refleksinin ve ağrı refleksinin kaybolması derin anesteziyi doğrular. Hayvanları sırtüstü bir diseksiyon masasına yerleştirin ve uzuvlarını sabitleyin.
    1. Göğsü açığa çıkarın ve intravasküler dolaşımdaki kan hücrelerini çıkarmak için kalbi17 buz gibi steril PBS ile perfüze edin. Kafasını tutun ve kafatasını ortaya çıkarmak için beynin orta hattı boyunca cildi makasla kesin.
    2. Kafatasının arka tarafını iki taraflı olarak ve göz yuvaları arasında küçük bir makasla kesin. Kafatasını sagital sütür boyunca kesin ve kafatasını cımbızla çıkarın. Beyin dokusunu cımbızla hızlı bir şekilde çıkarın17.
  2. Beyin dokusunu buz gibi soğuk PBS içeren 10 cm'lik kültür kaplarına yerleştirin. Serebral korteksi cımbızla iki taraflı olarak inceleyin, hipokampal dokuyu izole edin ve daha küçük parçalara ayırın. Parçaları 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
    NOT: Serebral korteksin bilateral diseksiyonu, beynin her iki yarım küresindeki hipokampal dokunun hilalini ortaya çıkarır.
  3. Küçük hipokampal doku parçalarını 2 mL buz gibi Hank'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) yeniden süspanse edin ve 3 dakika (oda sıcaklığında) 300 × g'da santrifüjleyin, ardından HBSS'yi atın.
  4. Hipokampal doku parçalarını içeren 15 mL'lik santrifüj tüpüne 1950 μL enzim karışımı 1 ekleyin. Santrifüj tüpünü 37 °C'lik bir su banyosunda 5 dakika boyunca sürekli çalkalayın.
    NOT: Enzim karışımı 1, 50 μL enzim P ve 1900 μL tampon Y'nin bir kombinasyonudur, önceden 37 °C'ye ısıtılmıştır (ticari olarak temin edilebilen kitin bir parçası olarak mevcuttur, Malzeme Tablosuna bakınız).
  5. Santrifüj tüpünü su banyosundan çıkarın. 15 mL'lik santrifüj tüpüne 30 μL taze hazırlanmış enzim karışımı 2 ekleyin. Doku parçalarını 1 mL pipet ucuyla 20 kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve 37 ° C'de sürekli çalkalayarak 5 dakika su banyosunda inkübe edin.
    NOT: Enzim karışımı 2, 20 μL tampon Y ve 10 μL enzim A'nın bir kombinasyonudur. Yukarıdaki iki sindirim adımı, beyin dokusunu hücresel bir süspansiyona dönüştürür. Toplam sindirim süresi 15 dakikayı geçmemelidir.
  6. Santrifüj tüpünü çıkarın ve süspansiyonu 1 mL'lik bir pipetle büyük doku parçaları kalmayana kadar birçok kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
  7. Hücre süspansiyonunu 70 μm'lik bir hücre tarama filtresinden süzün ve süzüntüyü temiz bir 50 mL santrifüj tüpünde toplayın.
    NOT: Bu adım, sindirilmemiş büyük doku parçalarını çıkarır.
  8. Süzüntüyü 15 mL'lik yeni bir santrifüj tüpüne aktarın ve 4 °C, 300 × g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı 1 mL'lik bir pipetle atın.
  9. Hücre süspansiyonunu 15 mL HBSS ile 20 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek yıkayın ve 4 ° C, 300 × g'da 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve
    hücre peletini 1 mL MACS tamponunda yeniden süspanse edin.
    NOT: Bu adım, sonraki deneylerde kullanılan tek hücreli süspansiyonu sağlar.

3. Mikroglia'nın akut ayrılması

  1. Tek hücreli süspansiyonun 1 mL'sini 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 4 ° C'de, 300 × g'da 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
  2. Tek hücreli peleti 90 μL MACS tamponunda yeniden süspanse edin. 10 μL CD11b/c mikro boncuk ekleyin ve süspansiyonu yatay bir çalkalayıcı üzerinde 15 dakika boyunca 4 °C'de inkübe edin.
  3. Sıralama kolonunu uygun bir MACS ayırıcının manyetik alanına yerleştirin ve kolon 500 μL MACS tamponu ile iki kez nemlendirin.
  4. Tek hücreli süspansiyonu doğrudan tüpe 1 mL MACS tamponu ekleyerek yıkayın ve 4 ° C, 300 × g'da 3 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen aspire edin.
  5. Hücre peletini 500 μL MACS tamponunda yeniden süspanse edin.
  6. Yeniden askıya alınmış hücre süspansiyonunu 1 mL'lik bir pipet kullanarak manyetik alandaki sıralama sütununa aktarın. Akışı atın. Kolonu manyetik alanda kalırken 500 μL MACS tamponu ile üç kez yıkayın.
    NOT: Akış, etiketlenmemiş hücreler içerir. Kolon, manyetik alandan çıkarılmadan yıkanmalıdır.
  7. Sıralama sütununu manyetik alandan çıkarın. Kolona 1 mL MACS tamponu ekleyin ve pistonla yavaşça itin. Akışı toplayın.
    NOT: Akış, etiketli hücreleri (yani mikroglia) içerir. Mikroglia'nın saflığını artırmak için, işlem yeni bir sıralama sütunu (isteğe bağlı) ile tekrarlanabilir.
  8. Seçilen hücreleri, PLL ile kaplanmış bir lamel içeren 24 oyuklu bir plakaya tohumlayın. 200 μL kültür ortamı ekleyin ve %95 O2,% 5 CO2 ve% 60 -% 80 nem ile 37 ° C'lik bir inkübatörde 20 dakika inkübe edin. Bu adım, mikroglia'nın sonraki tam hücre yama kelepçesi ve immünofloresan deneyleri için lamele yapışmasına izin verir.

4. İmmünofloresan

  1. Kültür ortamını plaka kuyucuklarından aspire edin ve hücreleri çalkalayıcı üzerinde 0.1 M PBS ile üç kez durulayın.
  2. PBS'yi atın ve mikrogliayı oda sıcaklığında (RT) 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit (PFA) ile lamel üzerine sabitleyin.
  3. Sabitleyiciyi çıkarın ve kapak kızağını 0,1 M PBS ile üç kez durulayın.
  4. PBS'yi atın ve çalkalayıcı üzerinde RT'de 1 saat boyunca PBS'de% 0.2 Triton X-100 ve% 5 BSA içeren 200 μL engelleme tamponu ile hücrelere geçirgen hale getirin.
  5. Mikroglia'yı bloke edici tampon artı anti-Iba1 ve anti-CD11b primer antikorları18 ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  6. Ertesi gün, birincil antikorları çıkarın ve kapak kızağını çalkalayıcı üzerinde RT'de PBS ile üç kez durulayın.
  7. Mikrogliayı, RT'de 2 saat boyunca floroforla birleştirilmiş ikincil antikorlar içeren bloke edici tampon ile inkübe edin. İnkübasyonun son 15 dakikası için DAPI boyası ekleyin.
  8. İkincil antikorları çıkarın ve kapak kızağını PBS ile üç kez durulayın. Görüntüleme için kapak kızaklarını mikroskop slaytlarına monte edin.

5. Mikroglia'da potasyum akımlarının tüm hücre yama-kelepçe kaydı

  1. Hücre içi çözeltiyi çözün ve buz üzerinde tutun.
  2. Dikey bir çektirme17 kullanarak ince duvarlı borosilikat cam kılcal damarlardan yama pipetlerini (elektrotlar) çekin.
    NOT: Elektrot direnci 10 MΩ'dan az olmalıdır.
  3. Kayıt odasına bir lamel aktarın ve 160 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 ve 10 mM HEPES içeren hücre dışı çözeltiyi ekleyin. 13,16 kullanmadan önce 1 M NaOH çözeltisi ile pH'ı 7,2'ye ayarlayın ve D-sükroz ile ozmotik basıncı 300 mOsm'ye ayarlayın.
  4. 40x objektifi kullanarak küresel mikrogliayı bir su mikroskobu altında bulun.
  5. Elektrodu hücre içi çözelti ile doldurun, elektrofizyoloji kurulumunun amplifikatör kafa aşamasına takın ve pozitif basınç uygulayın. 4x objektife geçin ve elektrodu bulun.
    1. Elektrodu banyo solüsyonuna indirin ve membran testini banyo modunda gerçekleştirmek için amplifikatörü voltaj-clamp moduna ayarlayın. 40x objektife geri dönün ve elektrot ucunu mikrogliaya yaklaştırın.
      NOT: Elektrot ucu bir mikroglial hücreye çok yakın olduğunda, direnç biraz artmalıdır.
    2. Hücreyi tutmak için küçük bir negatif basınç uygulayın. Direnç 100 MΩ'a ulaştığında, membran testinde banyodan yama moduna geçin. Direnç 300 MΩ'a ulaştığında, negatif basıncı serbest bırakın.
    3. Direnç, elektrot ve mikroglial membran arasında bir gigaohm conta (yani >1 GΩ) oluşumunu gösterdiğinde, membran testinde yamadan hücre moduna geçin.
  6. Az miktarda emme uygulayın ve zarı yırtmak için bir elektrik çarpması başlatın. Büyük kapasitif geçici akımların ortaya çıkması, başarılı membran yırtılmasını gösterir.
  7. Voltaj-clamp moduna geçin ve kayıt programını açın. 200 ms için potasyum akımlarını kaydedin. Potansiyelleri test etmek için, 1 Hz'de -120 mV ile +40 mV arasında 20 mV'luk artışlarla voltaj adımları uygulayın.
  8. Elde edilen verileri uygun yazılımı kullanarak çevrimdışı olarak analiz edin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kısaca süreç, yetişkin fare beyninden hipokampal mikroglia'nın izolasyonunu ve ardından bu hücrelerin tam hücre yama-klemp kaydını içerir (Şekil 1). Prosedür, 3 ila 5 aylık C57BL / 6J yetişkin farelerin hipokampusunun diseke edilmesiyle başlar. Spesifik olarak, perfüzyondan sonra tüm beyin çıkarılır ve buz gibi soğuk PBS içeren bir kültür kabına yerleştirilir (Şekil 2A). Hücrelerin hipokampustan akut izolasyonunu sağlamak için serebral korteks çıkarılır ve hilal şeklindeki hipokampal doku sağlam olarak izole edilir (Şekil 2B).

Optimum hücre kalitesi ve müteakip yüksek kaliteli tam hücre yama kelepçesi kayıtları için, tek hücreli süspansiyonun hazırlanması sırasında sindirim süresini kontrol etmek çok önemlidir. Çalışma, enzim karışımındaki hipokampal dokuyu tutarlı bir şekilde manuel olarak çalkaladı ve sindirim süresini 15 dakikadan fazla olmayacak şekilde kesin olarak sınırladı (Şekil 3

figure-results-1

figure-results-2

figure-results-3

figure-results-4

figure-results-5

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fetal veya yenidoğan farelerden elde edilen kültürlenmiş mikroglia, yetişkin mikroglia'yı incelemek için açıkça uygun değildir. Ek olarak, mikroglia'nın farklı beyin bölgelerindeki heterojenliği göz önüne alındığında21, tüm beyinden izole edilen mikroglia, belirli bir beyin yapısındaki mikroglia'nın özelliklerini doğru bir şekilde temsil etmeyebilir. Bu protokol, özellikle bu hücrelerin elektriksel özelliklerini değerlendirmek için hipokampal mikroglia'yı izole etmek için bir yöntem sağlar. Mikroglial potasyum kanalları tarafından yönetilen akımları kaydetme yöntemlerini içerir.

Birincil hücre kültürü ve sonraki deneyler sırasında bu hücrelerin özelliklerinden ödün vermemek için tek hücreli süspansiyonlar hazırlanırken doku sindiriminin sıkı bir şekilde kontrol edilmesi gerektiği iyi bilinmektedir. Tipik olarak, pankreas enzimi sindirimi ve fiziksel homojenizasyon yoluyla tüm beyinden tek hücreli bir süspansiyon elde edilir. Bununla birlikte, mikroglia'yı hipokampus gibi belirli bir beyin bölgesinden izole ederken, fiziksel homojenizasyon tek başına anlamlı deneyler için yeterli miktarda hücre vermez. Ek olarak, pankreas enzimleri, hücre canlılığını etkileyebilecek güçlü sindirim aktivitesine sahiptir.

Bu sorunları ele almak için, çalışma nispeten hafif bir ayrışma prosedürü benimsedi ve yetişkin fare beyin ayrışma Kitini kullanarak sindirim süresini 15 dakikadan fazla olmayacak şekilde manuel olarak kontrol etti. Bu yaklaşım, mikrogliayı aktif bir durumda tutar ve bu, sonraki tüm hücre yama kelepçesi kayıtları için kritik öneme sahiptir. Hafif ayrışma prosedürü, hız ve maliyet etkinliği açısından da avantajlar sunar.

Birincil mikroglianın saflaştırılması için yöntemler arasında tabakalı çalkalama yöntemi (SSM)22, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme yöntemi (DGCM)23 ve floresanla aktive edilen hücre sıralama yöntemi (FACS)11,24 bulunur. Bunlar arasında SSM, nöronların veya glial hücrelerin saflaştırılması için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, SSM'nin önemli bir sınırlaması, yüksek saflık seviyelerineulaşamamasıdır 25. Benzer şekilde, DGCM de düşük saflık seviyelerine neden olur. FACS yöntemi, hücrelerin 15 dakika ila 1 saat arasında boyanmasını ve ardından hücre canlılığını bozabilecek yüksek hızlı bir hücre sıralayıcı ile sıralamayı gerektirir. Buna karşılık, bu protokol, azaltılmış bir izolasyon süresi sunan ve aletlerin ve boyama prosedürlerinin tekrarlayan ve zaman alıcı kullanımını önleyen MACS yöntemini kullanır. Sonuç olarak, bazı alternatif yöntemlere kıyasla potansiyel olarak daha küçük miktarlarda olsa da, yüksek saflıkta mikroglia elde edilir.

Bu tekniğin sınırlamaları vardır. Örneğin, manyetik ile aktive edilmiş hücre sıralama (MACS) yöntemi nispeten az sayıda mikroglia verir ve akut olarak izole edilen mikroglia uzun süreler boyunca kültürlenemez. Bununla birlikte, bu yaklaşım değerlidir, çünkü uzun süre kültürlenmiş hücrelere güvenmek yerine, yetişkin fare hipokampusundan taze hazırlanmış mikrogliaların elektrofizyolojik özelliklerinin araştırılmasına izin verir.

Tam hücre yama-klemp tekniği, sinirbilim, farmakoloji ve sitobiyoloji gibi alanlarda hücresel, özellikle nöronal, elektrofizyolojik özellikleri incelemek için çok önemli ve yaygın olarak kullanılan bir araçtır26. Tam hücre yama-klemp kaydı, akut diseke beyin dilimlerinin, birincil kültürlerin ve hücre hatlarının özelliklerini araştırmak için çok sayıda çalışmada kullanılmıştır. Bununla birlikte, yetişkin fare beyninden akut olarak izole edilen mikroglia'nın tüm hücre yama kelepçesi kayıtları, araştırmalarımıza kadar eksikti.

Bu çalışma sadece yetişkin hipokampal mikroglia'yı izole etmek için bir protokol sağlamakla kalmaz, aynı zamanda bu izole mikroglialarda potasyum akımlarının başarılı bir şekilde kaydedilmesini de göstermektedir. Özellikle, bu protokolün hipokampus dışındaki beyin yapılarındaki mikroglia çalışmalarına uygulanması muhtemeldir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32170950, 32371065), Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı, No. 2023A1515010899 ve 2021A1515010804 tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
100 mm Petri kabıCorning353003
15 mL Falcon tüpleriBD352096
24 oyuklu plakalarBD353047
35 mm Petri kabıCorning
353001-50 mL Falcon tüpleriBD352070
70 & mu; m hücre taramasıMiltenyi130-095-823Hücre sıralamasından önce hücre kümelerini çıkarmak için
Yetişkin Fare Beyin Ayrışma KitiMiltenyi130- 107-677
Anti-CD11b AntikoruBio-RadMCA74Keçi Anti-fare IgG de mevcuttur. Endojen immünoglobulinleri bloke etmek için.
Anti-Iba 1 AntikoruSYSY234308Keçi Anti-kobay IgG) ayrıca mevcuttur. Endojen immünoglobulinleri bloke etmek için.
Axon Digidata 1440AABD
Axon MultiClamp 700B AmplifikatörABD
BSA Albümin Fraksiyonu VBioFrox4240GR500Serum
C57BL / 6 fare Guangdong Tıbbi Laboratuvar Hayvan Merkezi
CD11 b / c MicroBeadsMiltenyi130-105-634
Kloral hidratAbsinabs47051394Farelerde anestezi olarak yaygın olarak kullanılır
Clampfit 10.6ABD
Konfokal MikroskopZeiss  LSM 800
Kültür ortamıFisher ScientificC11995500BT-DAPI
boyaBeyotimeC1002
Elektrot çektirmeNarishigePC-10
HBSSServicebioG4203
Yatay çalkalayıcıSCILOGEXSLK-O3000-S
Görüntü analiz yazılımıFiji
MACS SütunlarıMiltenyi130-042-201
MACS AyırıcılarMiltenyi130-042-102
ParaformaldehitFisher ScientificT353-5001X PBS'de taze% 4'lük çözelti kullanın, pH 7.2-7.4.
Poli-L-lizinBeyotime  C0313Lamel kaplama
Triton X-100SigmaX100

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  2. Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8 (11), e1000527(2010).
  3. Voet, S., Prinz, M., Van Loo, G. Microglia in central nervous system inflammation and multiple sclerosis pathology. Trends Mol Med. 25 (2), 112-123 (2019).
  4. Salter, M. W., Beggs, S. Sublime microglia: Expanding roles for the guardians of the CNS. Cell. 158 (1), 15-24 (2014).
  5. Wohleb, E. S. Neuron-microglia interactions in mental health disorders: For better, and for worse. Front Immunol. 7, 544(2016).
  6. Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratskya, A. Physiology of microglia. Physiol Rev. 91 (2), 461-553 (2011).
  7. Sarkar, S. Microglial ion channels: Key players in non-cell autonomous neurodegeneration. Neurobiol Dis. 174, 105861(2022).
  8. Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: Active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
  9. Collins, H. Y., Bohlen, C. J. Isolation and culture of rodent microglia to promote a dynamic ramified morphology in serum-free medium. J Vis Exp. 133, e57122(2018).
  10. Lyons, S. A., et al. Distinct physiologic properties of microglia and blood-borne cells in rat brain slices after permanent middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab. 20 (11), 1537-1549 (2000).
  11. Li, Q., Lan, X., Han, X., Wang, J. Expression of tmem119/SALL1 and CCR2/CD69 in FACS-sorted microglia- and monocyte/macrophage-enriched cell populations after intracerebral hemorrhage. Front Cell Neurosci. 12, 520(2018).
  12. Sarkar, S., et al. Kv1.3 modulates neuroinflammation and neurodegeneration in Parkinson's disease. J Clin Invest. 130 (8), 4195-4212 (2020).
  13. Maezawa, I., et al. Kv1.3 inhibition as a potential microglia-targeted therapy for Alzheimer's disease: Preclinical proof of concept. Brain. 141 (2), 596-612 (2018).
  14. Delbridge, A. R. D., et al. Organotypic brain slice culture microglia exhibit molecular similarity to acutely isolated adult microglia and provide a platform to study neuroinflammation. Front Cell Neurosci. 14, 592005(2020).
  15. Volden, T. A., Reyelts, C. D., Hoke, T. A., Arikkath, J., Bonasera, S. J. Validation of flow cytometry and magnetic bead-based methods to enrich cns single cell suspensions for quiescent microglia. J Neuroimmune Pharmacol. 10 (4), 65-665 (2015).
  16. Wulff, H., et al. The voltage-gated kv1.3 k(+) channel in effector memory t cells as new target for ms. J Clin Invest. 111 (11), 1703-1713 (2003).
  17. Tan, S., et al. Biocytin-labeling in whole-cell recording: Electrophysiological and morphological properties of pyramidal neurons in CYLD-deficient mice. Molecules. 28 (10), 4092(2023).
  18. Manitz, M. P., et al. Flow cytometric characterization of microglia in the offspring of polyi:C treated mice. Brain Res. 1636, 172-182 (2016).
  19. Xu, Y. N., et al. A modified protocol of mouse hippocampal primary microglia culture by using manual dissociation, magnetic activated cell sorting and tic medium. Sheng Li Xue Bao. 71 (6), 883-893 (2019).
  20. Zelenka, L., et al. Novel protocol for the isolation of highly purified neonatal murine microglia and astrocytes. J Neurosci Methods. 366, 109420(2022).
  21. Keren-Shaul, H., et al. A unique microglia type associated with restricting development of alzheimer's disease. Cell. 169 (7), 1276-1290.e17 (2017).
  22. Yang, B., et al. Various cell populations within the mononuclear fraction of bone marrow contribute to the beneficial effects of autologous bone marrow cell therapy in a rodent stroke model. Transl Stroke Res. 7 (4), 322-330 (2016).
  23. Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
  24. Ramesha, S., Rayaprolu, S., Rangaraju, S. Flow cytometry approach to characterize phagocytic properties of acutely-isolated adult microglia and brain macrophages in vitro. J Vis Exp. 160, e61467(2020).
  25. Mccarthy, K. D., De Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  26. Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain. Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mikroglia zolasyonuEri kin Fare BeyniPotasyum Ak mlarManyetik Etkinle tirilmi H cre Ayr t rmamm nofloresan BoyamaVoltaj Kenetleme KaydPoli L Lizin KaplamaCD11b Mikroboncuklar

İlgili makaleler