NMR Bazlı Metabolomikler Kullanılarak Kritik Hastalarda Düzensiz Metabolitlerin Tanımlanması ve Miktar Tayini

Summary

Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, çeşitli hastalıkları olan hastalarda metabolitlerdeki düzensizliği tanımlamak için kullanılır. Bu teknik, patofizyolojik içgörüleri çözerek düzensiz metabolitlerin nicelleştirilmesine izin verir. Burada, hastaların metabolik karakterizasyonu için NMR tabanlı yaklaşımın adım adım prosedürünü açıklıyoruz.

Abstract

Metabolomik, bireyin patofizyolojik durumlara verdiği yanıtı yansıtmak için önemli bir yaklaşım olarak ortaya çıkmaktadır. Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS), şiddetli akut pankreatit (SAP), akut böbrek hasarı (AKI) ve sepsis gibi durumlardan muzdarip kritik hastalarda metabolik düzensizlikleri tanımlamak için bir araç olarak gelişmiştir. Çalışma ve kontrol grubunun serum örneğinden elde edilen spektral veriler, 800 MHz NMR spektrometresi kullanılarak kaydedildi ve NMR işleme ve analiz araçları kullanılarak işlendi. Ayrıca, önemli metabolitleri belirlemek için tek değişkenli ve çok değişkenli testler gibi titiz bir istatistiksel analiz yapılır ve bunlar daha sonra NMR metabolit miktar tayin yazılımı kullanılarak doğru bir şekilde tanımlanır ve niceliklendirilir. Ek olarak, yol analizi, hastalığın ciddiyetine neden olan düzensiz biyokimyasal döngüleri vurgular. Bu kapsamlı yaklaşım sayesinde araştırmacılar, bu kritik hastalıklarla ilişkili metabolik değişiklikler hakkında daha derin bilgiler edinmeyi, potansiyel olarak hastalığın daha iyi anlaşılmasının ve teşhis ve tedavi stratejilerinin iyileştirilmesinin yolunu açmayı amaçlamaktadır.

Introduction

Dünya çapında etkili hastalık teşhisi sağlamaya yönelik sürekli çabalara rağmen, hedefe yönelik tedavi hala gerçek potansiyeline ulaşmamıştır. Transkriptomik, proteomik vb. gibi çeşitli yaklaşımlar, birkaç biyobelirteçin tanımlanmasıyla sonuçlanmıştır, ancak bunlar, duyarlılık ve özgüllük eksikliği nedeniyle yeterli klinik faydaya sahip değildi ^1,2. Hedefe yönelik tedavi, bazı multifaktöriyel hastalıklarda büyük bir zorluktur ve sonunda daha yüksek mortaliteye yol açar. Geniş heterojenliğe sahip kompleks hastalıkların altında yatan mekanizmanın ve patofizyolojinin daha iyi anlaşılmasına ihtiyaç vardır. Bu nedenle, bu bağlamda, metabolomiklerin evrimi, sonunda akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS), sepsis ve şiddetli akut pankreatit (SAP) gibi çeşitli kritik hastalıklar için tedavi rejimlerinin uyarlanmasına yardımcı olabilecek terapötik gelişimde devrim yaratmıştır.

Metabolomik, çeşitli biyosıvılar, hücreler veya doku ekstraktları arasında küçük moleküler ağırlıklı molekülleri (amino asitler, lipitler, peptitler, organik asitler ve vitaminler gibi metabolitler) tanımlamayı ve ölçmeyi amaçlayan kapsamlı bir yaklaşımdır. Tipik olarak 1500 Da'dan daha hafif olan bu metabolitler, organizmanın biyolojik durumunun ilerleyici bir taslağını yansıtan biyokimyasal süreçlerde aktif rol oynar. Anahtar enzimatik süreçler için substratları, biyolojik yollardaki ara ürünleri ve hücresel metabolizmanın yan ürünlerini içerirler. Sonuç olarak, metabolomik, diyet etkilerinin, ilaç etkileşimlerinin ve hastalık durumlarının ayrıntılı bir parmak izini yakalar. Metabolit değişiklikleri, metabolizmanın ve biyolojik yolların oldukça hassas göstergeleridir ve fenotipik ekspresyonlar ve bunun sonucunda ortaya çıkan patofizyolojik anormallikler ile korelasyonlara izin verir ^3,4. Metabolitlerdeki ilk varyasyonlar, hastalık şiddetinin erken göstergeleri olarak hizmet edebilirken, zamansal değişiklikler tedavi etkinliğinin, hastalığın ilerlemesinin ve klinik sonuçların izlenmesine yardımcı olabilir ^5,6,7. Metabolomikler böylece klinik, fizyolojik ve biyokimyasal uç noktalar aracılığıyla hastalıkları yeniden tanımlayarak klinik tahlilleri ve diğer çeşitli omik yaklaşımları geliştirir 8,9,10,11,12,13. Metabolomiklerin analitik yetenekleri, değişmiş metabolit konsantrasyonları^14,15 yoluyla hastalığa yatkınlığı izlemek ve belirlemek için kullanılır.

Bu bağlamda, hem kütle spektrometresi (MS) hem de nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, biyolojik örneklerde metabolit profillemesi için birincil analitik platformlar olarak ortaya çıkmıştır. Bu yöntemler, metabolitlerin hem hedefli hem de hedefsiz tanımlanması ve miktar tayini için kullanılır 16,17,18. Her platformun avantajları ve sınırlamaları vardır, ancak NMR'nin tahribatsız doğası, çeşitli in vivo çalışmalarda ve özellikle metabolomik araştırmaların ilk aşamalarında bilinmeyen bileşiklerin yapısının karakterizasyonu için tercih edilmesini sağlar. MS'den önce gerekli olan numune fraksiyonlama, türevlendirme ve iyonizasyon, yanlılıklara neden olabilir ve genellikle numune kaybına neden olabilir, bu da NMR spektroskopisinin minimum numune hazırlığı ile veya hiç numune hazırlığı olmadan yakalayabileceği dinamik özellikleri etkiler. NMR'nin birincil sınırlaması, daha düşük bir tespit limiti sunan MS'ye kıyasla daha düşük duyarlılığıdır ve daha az miktarda metabolitin tespit edilmesini zorlaştırır¹⁹. Bununla birlikte, yüksek çözünürlüklü süper iletken mıknatıslar, kriyojenik olarak soğutulmuş NMR probları ve hassasiyeti artıran teknikler gibi gelişmeler bu sınırlamayı azaltmıştır^20,21,22. Genomik ve proteomiklere tamamlayıcı bir yaklaşım olarak, NMR spektroskopisi kullanılarak metabolik profilleme tercih edilen bir teknik olarak ilgi görmektedir 23,24,25. NMR'nin minimum numune hazırlama, tekrarlanabilirliği ve tekrarlanabilirliği, hassasiyet zorluklarına rağmen onu metabolitlerin doğal dinamik özelliklerini yakalamak için değerli bir araç haline getirir²⁶.

Çeşitli araştırma grupları, ARDS^{28,29,30,31,32,33}, pnömoni³⁴, sepsis⁷, safra kesesi taşları 35 ve pankreatit³⁶ gibi çeşitli hastalıklar²⁷ için hastaların düzensiz metabolik profilini belirleyerek metabolomikleri başarılı bir şekilde gerçekleştirmiştir. Kritik hastaların NMR tabanlı metabolomik çalışmaları, sistemik inflamatuar yanıt sendromundan (SIRS) yoğun bakım ünitesi (YBÜ) mortalite ve morbiditesinin önde gelen nedeni olan çoklu organ disfonksiyonu sendromuna (MODS) ilerlemenin izlenmesinde etkili olmuştur³⁷. Stringer ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada, sepsise bağlı akut akciğer hasarı (ALI) olan hastalarda kontrol hastalarına kıyasla metabolik değişiklikleri incelemek için plazma örnekleri kullanılmıştır³⁸. Bu pilot çalışmada yüksek bulunan anahtar metabolitler, ilgili metabolik yolları ve bunların klinik puanlarla ilişkisini yansıtıyordu. Bu araştırma, ARDS^32'de sepsisi akciğer hasarı mekanizmalarının erken evrelerinden ayırt etmek için serum metabolomiklerine genişletildi. Ek olarak, ARDS'de yapılan başka bir çalışma, akut akciğer hasarı/ARDS ile sağlıklı kontroller arasında belirgin bir ayrım yapan ve akciğer hasarının akut başlangıcına karşılık gelen sistemik metabolik değişiklikler hakkında içgörüler sunan güçlü serum biyobelirteçlerini tanımlamıştır^39,40.

NMR spektroskopisi, altta yatan patofizyolojiyi ortaya çıkaran metabolik parmak izi hakkında sağlam ve tarafsız bilgiler sağlayan yüksek verimli ve otomatik bir analitik tekniktir³⁸. NMR verilerinin klinik uygulaması ve biyolojik yorumlanması, zengin bilgi içeren yüksek kaliteli spektrumların elde edilmesine bağlıdır. Bu nedenle, doğru, tek tip ve iyi formüle edilmiş veri toplama, işleme ve analiz sağlamak çok önemlidir. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, metabolitlerin tanımlanması ve miktarının belirlenmesi için NMR tabanlı metabolomiklerin temel adımlarından yararlanmaktır. Bu çalışma, klinik metabolomik çalışma için gerekli protokolün temel adımlarını vurgulamaktadır (Şekil 1), örneğin uygun örneklerin seçimi, toplama ve saklama, örnek işleme ve hazırlama, veri toplama ve analizi, ilgilenilen metabolitin tanımlanması ve niceliklerinin belirlenmesi ve sonuç olarak, ilgili içgörüler elde etmek için sonuçların klinik bağlamda yorumlanması. Bu adımların her biri, önemli biyolojik ve klinik içgörüleri ortaya çıkarmak için metabolomikte NMR spektroskopisinden yararlanmak için gereklidir.

Protocol

Etik onay (IEC kodu: 2022-71-PhD-126), Lucknow'daki Sanjay Gandhi Tıp Bilimleri Lisansüstü Enstitüsü (SGPGIMS) IEC'den alınmıştır. Çalışmanın gerçekleştirilmesi ve verilerin araştırma amaçlı yayınlanması için hasta veya yakınlarından yazılı ve bilgilendirilmiş onam alındı. Ayrıca, araştırma kurumsal yönergelere uygun olarak yürütülmüştür.

1. Çalışma tasarımı ve etik izin

1. Her grup için örnek boyutunu belirleyin. Katılımcılar için seçim kriterlerini dikkatlice gözden geçirin ve oluşturun. Ek olarak, çalışma tasarımı insan veya hayvan örneklerinin dahil edilmesini gerektiriyorsa, örnek toplamaya başlamadan önce uygun kurumsal etik komiteden (IEC) etik izin alın.
2. Arteriyel kandaki oksijenin kısmi basıncının (PaO2) solunan oksijen (FiO2) fraksiyonuna (P/F) oranına dayalı Berlin 2012 tanımının tanı kriterlerine göre hafif, orta ve şiddetli olarak kategorize edilen ARDS hastalarını seçin. P/F aralığı 300-200 arasında olan ARDS hastaları hafif, 200-100 yaş arası orta, 100'ün altı olanlar ise ağır olarak kabul edilir³⁸. Burada hafif ve orta şiddette ARDS hastaları olmak üzere iki grup üzerinde yoğunlaştık (bakınız Tablo 1).
   NOT: Çalışma, NMR bazlı metabolomikleri gerçekleştirmek için kan örneklerinden elde edilen serumun kullanımını içermektedir. Bu çalışmada, referans olarak dahil edilen katılımcıların yaş ortalaması 42 (± 10.9 yıl) olup, cinsiyet dağılımı 2 erkek ve 6 kadındır.

Kategori	F/K oranı
Hafif	300-200
Ilımlı	200-100
Şiddetli	100-0

Tablo 1: ARDS hastalarının kategorizasyonu.

2. Numune seçimi, toplanması ve işlenmesi

1. Aşağıda açıklanan adımları izleyerek serum izolasyonu gerçekleştirin.
   1. Deney için, düz (hiçbir katkı maddesi içermeyen) ve steril bir şişede steril bir iğne kullanarak arterlerden 2 mL kan örneği toplayın. Numuneyi oda sıcaklığında 30 dakika pıhtılaşmaya bırakın. Bu çalışma için hafif derecede ARDS tanısı alan 4 hasta ve orta derecede ARDS tanısı alan 4 hasta seçildi.
   2. Serumu²⁵ ayırmak için numuneyi 3100 x g'da 15 dakika santrifüjleyin. Serumu steril mikrosantrifüj tüplerine aktarın, daha küçük hacimli (yani 400-500 μL) alikotlar yapın, uygun şekilde etiketleyin (Hasta adı, CR no., gün noktası, vb.) ve gelecekteki analizler için -80 ° C'de saklayın.
      NOT: Bu noktada, deney uygun bir zamanda duraklatılabilir ve devam ettirilebilir.
2. Aşağıdaki adımları kullanarak NMR deneylerinden önce serum örneğini işleyin.
   1. NMR deneylerini gerçekleştirmeden önce numuneyi çözün. PH değişimini en aza indirmek için serumun 250 μL alikotunu 250 μL tuzlu fosfat tampon çözeltisi (% 100 D₂O,% 0.9 NaCl, 50 mM sodyum fosfat tamponu, pH 7.4 içeren) ile karıştırın.
   2. Homojen bir şekilde karıştığından emin olmak için karışımı birkaç saniye (~ 15 sn) vorteksleyin. Son olarak, hazırlanan numuneyi, kalibrasyon ve miktar tayini için harici bir standart görevi gören 0,05 mM'lik bir konsantrasyonda trimetilsilil propiyonat (TSP) içeren bir koaksiyel ek parçaya sahip temiz bir NMR tüpüne aktarın⁴¹.
      NOT: Referans olarak, analitlerle etkileşime girmeyen inert ve reaktif olmayan bir bileşik kullanılır. Yaygın olarak kullanılan diğer referans bileşikler arasında Tetrametilsilan (TMS) ve sodyum trimetilsililpropansülfonat (DSS) bulunur.

3. NMR deneyi

NOT: Odak noktası, serum örneklerindeki küçük molekülleri tanımlamaktır, bu nedenle, makromolekül sinyallerini baskılayan Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) darbe dizisini kullandık. Bu çalışmadaki tüm serum örnekleri, kriyojenik olarak soğutulmuş üçlü rezonans TCI 5 mm geniş bant ters prob kafası ve korumalı z-gradyanı ile donatılmış 800 MHz NMR spektrometresi kullanılarak kaydedildi.

1. Numuneyi mıknatısın içine yerleştirin. cpmg nabız programı ile bir proton deneyi ayarlamak için wrpa (deney numarasını belirtin) komutunu yazın ve enter tuşuna basın. Başlık seçeneğine tıklayarak hastanın adını ve gerekli diğer ayrıntıları belirtin.
2. Lock komutunu yazarak manyetik alanı kilitleyin, enter tuşuna basın ve
6. 
   

5. 
   

Results

Bir metabolomik çalışma yapmak için, örneklem büyüklüğünü ve analiz edilecek spesifik grupları belirlemek önemlidir. Hastalık şiddeti⁴⁸ ile doğru bir şekilde ilişkili olan önemli sonuçlar elde etmek için yeterli bir örneklem büyüklüğünün seçilmesi esastır. Bununla birlikte, bu özel çalışmada, öncelikle referans amaçlı olan NMR bazlı metabolomikler kullanılarak metabolitlerin tanımlanması ve miktarının belirlenmesinde yer alan adımları göstermek için küçük bir örneklem boyutu kullandık. Bu çalışmada, YBÜ'ye yatışlarının 1. gününde ARDS'nin hafif ve orta evrelerindeki hastalar arasındaki metabolik farklılıkları toplam 8 denek dahil olmak üzere inceledik. Protokolün ardından, tüm numunelerin NMR spektrumları alındı ve işlendi ve sonunda gruplama sonuçlarıyla bir elektronik tablo oluşturuldu.

Daha sonra, gruplama sayfalarının giriş dosyaları olarak kullanıldığı ve sum, log ve Pareto kullanarak verileri normalleştiren titiz bir istatistiksel analiz gerçekleştirdik. PCA (Şekil 2A) ve OPLS-DA (Şekil 2B) gerçekleştirdik, burada birincisi kümelenme gösterdi, ancak ikincisi gruplar arasında net bir ayrım olduğunu ortaya koydu ve metabolik farklılıkları vurguladı. Permütasyon testi istatistiksel analizi (20x) R2Y=0.99 ve Q2=0.47 değerlerini verdi. Daha sonra, düzensiz metabolitleri tanımlamak için bir öğrencinin t-testi (Şekil 2C) ve biyobelirteç analizi (Şekil 2D) gerçekleştirdik. Protokol bölümünde belirtilen kriterleri takiben, sonuçları önemli metabolitlere göre filtreledik (Tablo 2).

Şekil 2: Çok değişkenli ve tek değişkenli analiz. (A) Hafif ARDS hastalarının (kırmızı renkle temsil edilir) ve orta ARDS hastalarının (yeşil renkle temsil edilir) ortogonal kısmi en küçük kareler diskriminant analizi (OPLS-DA). (C) Kutu-cum-bıyık çizimleri, serum örneklerinde proton nükleer manyetik rezonans spektroskopisi ile tespit edilen hafif ve orta dereceli ARDS hastaları arasındaki metabolitlerin nispi konsantrasyonundaki farklılıkları vurgulamaktadır. X ekseni çalışma gruplarını temsil eder ve y ekseni, hafif ARDS hastaları (kırmızı renkle temsil edilir) ve orta ARDS hastaları (yeşil renkle temsil edilir) yoğun bakım ünitesine kabulün 1. gününde karşılaştırıldığında nispi konsantrasyonu gösterir. (D) Yoğun bakım ünitesine kabulün 1. gününde hafif ve orta şiddette ARDS hastalarını karşılaştıran biyobelirteç analizi yapıldıktan sonra elde edilen şiddeti öngören önemli metabolitlerin eğri altındaki alan (AUC) grafiği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

S.No.	Ad	Spektral konum (ppm)	p-değeri	VIP	AUC değeri
1	Laktat	1.34	0.04	1.99	1
2	İzolösin	1.42	0.03	2.01	0.875

Tablo 2: Yoğun bakım ünitesine kabulün 1. gününde hafif ve orta şiddette ARDS hastaları karşılaştırıldıktan sonra elde edilen önemli metabolitlerin listesi.

Sonuçlar ppm değerlerinde elde edildiğinden, önceki literatürü kullanarak metabolitleri atadık ve bunları profilleyici aracılığıyla doğruladık. Atamadan sonra, laktat ve izolösin önemli metabolitler olarak elde edildi ve bunlar daha önceki bazı ARDS çalışmalarında da bildirilmiştir^30,40. İyi çözümlenmiş, örtüşmeyen tepe noktalarının seçimini sağladık. Tanımlamadan sonra, protokolde belirtilen kriterleri kullanarak önemli metabolitlerin listesini filtreledik. Daha sonra, spektrumları açarak, ilgilenilen metaboliti arayarak ve yazılım zirvesini spektrumlarda elde edilen zirveye uydurarak profil oluşturucu modülünü kullanarak ilgilenilen metabolitleri ölçtük. Bu, mM cinsinden metabolitlerin niceliksel değerlerini sağladı. Referans için numune adlarını, metabolit adlarını ve konsantrasyonları içeren bir elektronik tablo oluşturuldu. Yazılımla miktar tayininden sonra, proteomik gibi diğer yaklaşımlarla doğrulama gerçekleştirilebilir.

Ayrıca, tanımlanan metabolitler, hastalık şiddeti ile korelasyonlarını belirlemek ve bu metabolitlerin aktif olarak yer aldığı biyokimyasal yolakları belirlemek için kapsamlı bir şekilde analiz edilir. Gereç ve yöntem bölümünde belirtilen kriterler kullanıldıktan sonra sadece iki anlamlı metabolit tanımlandığından, yazılım kullanılarak yolak analizi mümkün olmamıştır. Bu nedenle, düzensiz metabolik döngüleri vurgulamak için kapsamlı bir literatür taraması yapılmıştır. Bu çalışmada tanımlanan iki metabolit, ARDS'nin şiddeti ile başarılı bir şekilde korelasyon gösterdi. Artan laktat, akciğer iltihabını ve anaerobik solunumu gösterirken, artan izolösin, akciğer hasarı, enfeksiyon ve enerji metabolizması ile ilişkili protein katabolizmasını gösterdi⁴⁰. Bu metabolik yolları anlamak ikili bir amaca hizmet eder. İlk olarak, hastalığın karmaşıklığını ortaya çıkarır ve biyolojik mekanizmaları hakkında fikir verir. İkinci olarak, klinisyenlere tedavileri hastalara göre uyarlamada rehberlik ederek ve sonuçta klinik sonuçları iyileştirerek terapötik ilerlemelere yardımcı olur.

Discussion

Metabolomik, hastalık sırasında bozulan metabolik döngüleri hedefleyerek metabolitleri verimli bir şekilde tanımlar ve ölçer. Sonuçların kalitesi, metabolomik yaklaşımdaki her adımın titiz bir şekilde yürütülmesine bağlıdır. Numune seçimi ve toplanmasından yol tanımlamasına kadar her aşama, hastalığa katkıda bulunan birincil faktörlerin doğru bir şekilde tanımlanmasında kritik öneme sahiptir. Metabolomik yapmadan önce, literatürün kapsamlı bir şekilde gözden geçirilmesi esastır ve her aşamada dikkatli dikkat gösterilmelidir.

Bir metabolomik çalışma tasarlarken, bir numunenin seçimi, dikkate alınan klinik durumun hedefli veya hedefsiz metabolik parmak izi için önemli bilgilerin çıkarılması ve ideal numune hazırlığının sağlanması için çok önemlidir. Uygun ilk numune işleme çok önemlidir ve çalışma boyunca tüm numuneler için protokoller tutarlı bir şekilde takip edilmelidir⁴⁹. Klinik numunelerle çalışırken ekstra dikkatli olunması gerekir. NMR bazlı metabolomikler için yaygın olarak kullanılan numuneler arasında biyosıvılar, hücre ekstraktları ve doku ekstraktları^{bulunur 50,51}. Beyin omurilik sıvısı (BOS) ve idrar genellikle minimal ön tedavi gerektirir ve sıklıkla böbrekle ilgili rahatsızlıklar, nörodejeneratif hastalıklar ve ilaç toksisitesi gibi bağlamlarda incelenir. Tam kan, plazma ve serum, geniş bir kritik hastalık yelpazesi için kapsamlı bilgi sağlar ve toplanma kolaylığı nedeniyle tercih edilir. Seminal sıvı, tükürük, safra, diyaliz sıvısı, amniyotik sıvı, ekshale edilen nefes kondensatı, akciğer aspiratları, sinovyal sıvı ve mini bronkoalveoler lavaj sıvısı (mBALF) gibi çok çeşitli diğer biyosıvılar, NMR^52,53,54 kullanılarak özgüllükleri ve doğrulukları nedeniyle yaygın olarak kullanılmaktadır. Her biyoakışkan, çalışmaya veya deneysel tasarıma bağlı olarak toplama, kullanılabilirlik ve bilgi içeriği ile ilgili avantajlarını ve zorluklarını sunar⁵⁵. Bu çalışma için ARDS hastalarının serum örneklerine odaklandık, çünkü kan örnekleri tipik olarak tüm vücut düzeyinde bilgi sunar ve aşırı günlük değişikliklerden önemli ölçüde etkilenmez. Öte yandan, idrar örnekleri çeşitli dalgalanmalara maruz kalır ve diyet, yaşam tarzı, ilaçlar ve çevresel faktörlerden etkilenebilir²⁷. Enzimatik aktiviteyi veya mikrobiyal bozulmayı önlemek için numunenin uygun şekilde saklanması da önemlidir. Numuneler tipik olarak metabolik bozulmayı önlemek ve numunenin stabilitesini korumak için minimum donma-çözülme döngüleri ile -80 °C'de dondurularak saklanır. Numune, uzun süreler boyunca -80 °C'de saklanabilir, bu da NMR deneyinin uygun şekilde yürütülmesine olanak tanır. Bununla birlikte, en iyi sonuçlar için deneyin mümkün olan en kısa sürede planlanması ve gerçekleştirilmesi tavsiye edilir.

Bu çalışmada, veri toplama için yüksek çözünürlüklü spektral veri sağlayan 800 MHz NMR spektrometresi kullandık. Bu deney için, yukarıda belirtilen aynı edinme parametrelerine bağlı kaldık. Bununla birlikte, bu protokolde özetlenen aynı edinim parametrelerinin, diğer manyetik alan kuvvetlerinde çalışan NMR spektrometreleri kullanılarak uygulanabileceğine dikkat etmek önemlidir. Çözünürlüğü iyileştirmek için daha düşük bir manyetik alanda çalışırken tarama sayısı artırılabilir. Daha yüksek alan kuvvetleri gelişmiş çözünürlük sunabilse de, darbe dizileri, gevşeme gecikmeleri ve sıcaklık kontrolü gibi edinim sürecinin temel yönleri, sonuçların tekrarlanabilirliğini ve güvenilirliğini sağlayarak farklı cihazlar arasında tutarlı kalır.

Sapmalar sonraki veri analizini ve değerlendirmesini engelleyebileceğinden, tekrarlanabilirliği ve tarafsızlığı korumak için standartlaştırılmış bir prosedürün izlenmesi çok önemlidir. NMR deneyinin her adımı, spektrumların kalitesi bunlara bağlı olduğu için titizlikle gerçekleştirilmelidir. Tepe şeklini tanımladığı için şimlemeye özel dikkat gösterilmeli ve edinim parametreleri numuneye ve çalışma tasarımına göre optimize edilmelidir. Numunedeki düşük metabolik konsantrasyona sahip numuneler için tarama sayısı artırılabilir. NMR'de veri toplama, numune seçimine ve gereken özel bilgilere göre uyarlanmış hem 1D hem de 2D deneylerin standart optimizasyonunu içerir. İstenmeyen makromoleküllerin etkisini en aza indirerek biyoakışkanlardan yüksek kaliteli spektrumlar elde etmek için çeşitli NMR deneyleri optimize edilmiştir. CPMG nabız dizisi⁵⁶ , serum, plazma veya beyin omurilik sıvısı gibi numuneler için tercih edilir. Bu teknik, uzun enine gevşeme sürelerine sahip olan ve düşük moleküler ağırlıklı metabolitlerin rezonanslarını gizleyebilen lipitler ve proteinler gibi makromoleküllerden gelen geniş sinyalleri bastırır.

Veri ön işleme, tek tip ve homojen veri analizini ve yorumlanmasını sağlamak için kullanılan ara yöntemleri kapsar. Bu süreç, istenmeyen sinyallerden veya tutarsızlıklara eğilimli spektral bölgelerden kaçınmayı ve tepe kaymalarını düzeltmeyi içerir. Biyoakışkanlarda, istenmeyen bölgeleri hariç tutmak, genellikle 4.6 ppm ila 5 ppm aralığına hakim olan sudan gelenler gibi sinyallerin çıkarılması anlamına gelir. pH, sıcaklık, tuz konsantrasyonu, seyreltme faktörleri ve iyonik bileşimdeki değişikliklerin neden olduğu tepe kaymaları, homeostatik bir pH'ta tamponlar kullanılarak en aza indirilebilir. Ek olarak, standart referans bileşiklerinin, tepe hizalamasının ve gruplamanın kullanılması, tepe kaymalarının azaltılmasına yardımcı olabilir. Tepe hizalaması, aynı koşullar altında elde edilen farklı spektrumlardaki desenleri ilişkilendirmek için çok önemlidir.

Analizin ilerleyen aşamalarında doğru gruplamayı sağlamak için spektrum işleme uygun şekilde yapılmalıdır. Tüm spektrumlar kalibre edilmeli ve eşit şekilde hizalanmalıdır ve baz ve faz düzeltmeleri manuel veya otomatik olarak gerçekleştirilebilir. Uygun faz ve baz düzeltmesinin yanı sıra kalibrasyon da kritik öneme sahiptir. Metabolitlerin⁵⁷ tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini etkileyebilecek bozulmaları önlemek için taban çizgisi düzeltmesi yapmak çok önemlidir. Çarpık veya ters çevrilmiş tepe noktalarının sonuçların yorumlanmasını etkilememesini sağlamak için faz düzeltmesi gereklidir. Önemli metabolitleri seçme kriterlerine dikkatlice karar verin ve sonuçları buna göre filtreleyin. Gruplama, ppm değerleri şeklinde sonuçlar sağladığından, protokolde belirtilen çeşitli kaynakları kullanarak metabolitin adını doğru bir şekilde tanımlayın. Aynı ppm değerlerinde birden fazla metabolit varsa, bunları tepe şekli ile tanımlayın.

İstatistiksel analizi gerçekleştirmeden önce, büyüklükteki farklılıklar ve metabolit konsantrasyonlarındaki dalgalanmalar nedeniyle, indüklenmiş olsun veya olmasın, veri setindeki varyasyonları azaltmak için normalleştirme yapılır. Bu süreç, verilerin dağılımına ve değişkenliğine göre seçilen çeşitli merkezleme, ölçeklendirme ve dönüştürme yöntemlerini içerir. Amaç, ilgilenilen biyolojik faktörleri korurken istenmeyen sistematik önyargıyı en aza indirmektir. PCA, PLS-DA ve OPLS-DA dahil olmak üzere çok değişkenli yöntemler, VIP değerleri 1'den büyük olan diferansiyel metabolitleri oluşturmak için kullanılır. Model öngörülebilirliği ve çapraz doğrulama, R2 (uyum iyiliği) ve Q2 (tahmin iyiliği) değerleri kullanılarak belirlenirken, permütasyon testi istatistikleri modeli doğrular. Pearson korelasyon tabanlı bir ısı haritası, alt fenotiplerdeki yukarı regüle edilmiş ve aşağı regüle edilmiş metabolitleri ve sonuçta ortaya çıkan endotipleri numaralandırarak model sağlamlığını değerlendirir.

Yanlış pozitiflerin olasılığını azaltmak için Bonferroni düzeltmesi veya FDR'nin en aza indirilmesi (yanlış keşif oranı) ve Benjamini-Hochberg gibi öğrenci t-testi ve ANOVA gibi tek değişkenli yöntemler kullanılır. Bu yöntemler, moleküller ve diğer kafa karıştırıcı faktörler içindeki veya arasındaki korelasyonlarından bağımsız olarak potansiyel olarak önemli özelliklerin kaba bir ölçümünü sağlar. Önemli metabolitler, 0.05'ten daha düşük bir p değerine dayalı olarak tanımlanır ve bunlar daha sonra sonuç alt gruplarında metabolik endotipleri doğrulamak için kullanılır⁴⁵.

Sonuç alt gruplarındaki endotiplerin özgüllüğünü ve duyarlılığını değerlendirmek için bireysel kutu bıyık grafikleri ve AUROC kullanılır. Klinik puan, modelin doğruluğunu doğrulamak için AUROC'taki modelle birleştirilir. 0.8 > AUC değeri önemli⁴⁶ olarak kabul edilir. Tanımlanan metabolitlerin ayrımcılığının ve etkinliğinin doğruluğunu test etmek için çevrimiçi olarak çeşitli başka testler de mevcuttur. Bunlardan bazıları rastgele orman sınıflandırması, ısı haritası, korelasyon ^vb.45'tir.

Gelişmiş yapıları nedeniyle yeni başlayanlar için zor olabilen tepe entegrasyonu da dahil olmak üzere önemli metabolitleri ölçmek için çeşitli yaklaşımlar kullanılır. Kesin tanımlama için bireysel kimyasal kaymalara başvurarak metabolitler için karakteristik tepe noktalarını tanımlayın. Bu karakteristik tepe noktalarının alanını, referans tepe noktası olan TSP'nin alanına göre belirleyin. Bir metabolitin (Cm) mutlak konsantrasyonunu hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın:

Cm = Im.nr.Cr/Ir.nm

Cr, çözeltideki referans bileşiğin (TSP) konsantrasyonu olduğunda, Im ve Ir, sırasıyla metabolit ve referansın (TSP) entegre tepe alanlarıdır (NMR işleme ve analiz aracı kullanılarak elde edilebilir) ve nm ve nr, metabolit ve referans tepe noktalarını temsil eden proton sayısıdır, sırasıyla²⁴.

Alternatif olarak, referans standardı olan TSP'nin konsantrasyonuna dayalı olarak tek veya çoklu spektrumlar için metabolit konsantrasyonları elde etmek için otomatik NMR metabolit miktar tayin yazılımı kullanılır. Yazılım kullanarak miktar tayini, süreci basitleştirir ve diğer yöntemlere kıyasla hata olasılığını azaltır. Bu araştırma makalesi, metabolit ölçümü için yazılımın kullanımını vurgulasa da, ilgilenilen metabolitin yazılım kitaplığında bulunmaması durumunda sorunlar olabilir. Ek olarak, yazılım ücretlidir, bu nedenle yalnızca yetkili lisansa sahip araştırmacılar onu kullanabilir.

Metabolomiklerin, hastalık şiddetine katkıda bulunan düzensiz metabolik döngüleri tanımlayarak çeşitli hastalıkların karmaşıklıklarını çözmede etkili olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, bu bulguları klinik uygulamaya dönüştürmek zor olmuştur. Tıp camiası şimdi hastalık sonuçlarını iyileştirmek için kişiselleştirilmiş bir tıp yaklaşımını vurguluyor. Düzensiz metabolitlerin tanımlanması daha önce yeterli olsa da, mevcut çabalar hastalığa özgü aralıkları tanımlamak için kesin nicelemeye odaklanmaktadır. Bu bilgiler, klinisyenler için tedavi stratejilerini özelleştirmede paha biçilmezdir. Niceleme tekniklerindeki ilerlemeler, dünya çapında çok sayıda araştırma grubunun bu yaklaşımları özel yazılımlar kullanarak başarıyla kullanmasıyla araştırma çabalarını kolaylaştırmıştır.

Bu ilerleme, metabolomiklerin kişiselleştirilmiş tıbbı önemli ölçüde etkileme ve klinik sonuçları iyileştirme potansiyelinin altını çizmektedir. Ayrıca, metabolomik verilerin genomik ve proteomik gibi diğer omik verilerle entegrasyonu, hastalık mekanizmalarının daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını ve terapötik müdahalelerin daha da rafine edilmesini vaat ediyor. Teknoloji gelişmeye devam ettikçe, klinik ortamlarda metabolomiklerin hassasiyetinin ve faydasının artması, daha etkili ve kişiselleştirilmiş sağlık çözümlerinin önünü açması bekleniyor.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centirfuge	Sigma aldrich	3-18KS
Chenomx NMR süiti	NMR Suite, v9, Chenomx Inc., Edmonton, Kanada		NMR metabolit miktar tayin yazılımı
Koaksiyel kesici uç	Sigma aldrich	Z278513
Deuterim oksit	Sigma aldrich	151882
Eppendorf tüpleri	Tarsons	500020
Metaboanalyst	Wishart Araştırma Grubu		Metabolomik istatistiksel analiz yazılımı
NMR tüp	Wilmad	Z412007	5mm çaplı
Pipet	Eppendorf araştırma artı	3123000039	0-100 μ l
Örnek toplama	şişeleri Tarsons cryo chill şişeleri	523194
Sodyum azid	Sigma aldrich	S2002
Sodyum klorür kristali	Sigma aldrich	S9625
Sodyum fosfat dibazik	Sigma aldrich	567550
Sodyum fosfat monobazik	Sigma aldrich	S0751
Topspin 3.6.4	Bruker		NMR işleme ve analiz aracı
Tsp tuzu	Sigma aldrich	269913