Yöntem makalesi

2D-TAU Jel Elektroforezi Kullanılarak Histon Proteoformlarının Ortaya Çıkarılması

DOI:

10.3791/67321

⸱

18 Ekim 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center on Advanced Biochemistry and Molecular Biology, Department of Experimental and Clinical Medicine, Magna Græcia University of Catanzaro, 2Department of Pharmacy, Health and Nutritional Sciences, University of Calabria

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem, histon proteoform karakterizasyonu ve araştırması için basit ve hızlı bir stratejiyi tanımlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Histonlar, nükleozom dinamiklerini kontrol eden ve hücre kaderini belirleyen metilasyon, asetilasyon, fosforilasyon, asilasyon ve ubikitinasyon gibi çeşitli translasyon sonrası modifikasyonlara (PTM'ler) uğrar. Kromatinin fonksiyonel birimi olan nükleozom, DNA, küresel çekirdeği oluşturan dört çift histon (H3, H4, H2A ve H2B) ve kromatin yapısını stabilize eden bağlayıcı histon H1'den oluşur. Histonların amino (N)-terminal kuyrukları, küresel çekirdek alanlarından çıkıntı yapar ve kromatin manzarasını etkileyen farklı PTM'lere maruz kalır. Bazı kanıtlar, histon PTM homeostazının tüm fizyolojik aktiviteleri korumak için çok önemli olduğunu göstermektedir. Histon PTM'lerinin deregülasyonu, anormal hücresel proliferasyon, invazyon ve metastazın birincil nedenidir. Bu nedenle, histon PTM'lerini karakterize etmek için yöntemler geliştirmek çok önemlidir. Burada, histon izoformlarını izole etmek ve analiz etmek için etkili bir teknik açıklıyoruz. İki ortogonal ayırmanın kombinasyonuna dayanan yöntem, histon izoformlarının zenginleştirilmesine ve ardından kütle spektrometresi tanımlamasına izin verir. İlk olarak Shechter ve ark. tarafından tanımlanan teknik, temel histon proteinlerini boyut ve yüke göre ayırabilen asit-üre poliakrilamid jelleri (TAU-GEL) ve proteinleri moleküler ağırlığa göre ayırabilen Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jelleri (SDS-PAGE) birleştirir. Sonuç, jel içi sindirim için uygun olan histon izoformlarının iki boyutlu bir haritasıdır ve ardından kütle spektrometresi tanımlaması ve western blot analizidir. Sonuç, hem jel içi sindirim hem de kütle spektrometresi tanımlaması ve western blot analizi için uygun olan histon izoformlarının iki boyutlu bir haritasıdır. Bu proteomik yaklaşım, tek bir histon izoformunun zenginleştirilmesine ve yeni histon PTM'lerinin karakterizasyonuna izin veren sağlam bir yöntemdir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kanser başlangıcı, ilerlemesi ve kemorezistans, histon PTM'leri de dahil olmak üzere genetik ve epigenetik olaylarla ilişkilidir. Histonlar, kromatin dinamiklerini düzenleyen ve hücre kaderini belirleyen çeşitli PTM'lere maruz kalır1.

Nükleozom, kromatinin fonksiyonel birimidir ve DNA'nın çekirdeğe paketlenmesine izin veren moleküler bir DNA ve protein kompleksidir. Nükleozom çekirdeğini oluşturan dört çift histondan (H3, H4, H2A ve H2B) ve ayrıca kromatin yapısını stabilize etmeye yardımcı olan bağlayıcı histon H1'den oluşur. Histonlar amino (N)-terminal kuyrukları, küresel çekirdek alanlarından çıkıntı yapar ve kromatin manzarasını2 etkileyen spesifik translasyon sonrası modifikasyonlara uğrar.

Şimdiye kadar, en az 23 histon PTM sınıfı bilinmektedir. Bu PTM'ler, esas olarak metilasyon, asetilasyon, fosforilasyon, glikozilasyon, ubikitilasyon, SUMOylation ve ADP-ribosilasyon3'ten oluşan kovalent modifikasyonlardır. Ek olarak, epigenom homeostazı ile metabolik yeniden kablolama arasında yakın bir ilişki önerilmiştir, bu da PTM'lerinolası histon sayısı 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13'ün üstel büyümesini açıklamaktadır . Değiştirici enzimler tarafından biriktirilen, silinen ve dönüştürülen histon PTM'leri sırasıyla yazıcılar, silgiler ve okuyucular olarak adlandırılır. Kromatin yapısının fiziksel ve kimyasal özelliklerini etkilerler, tümör baskılayıcı genlerin ve onkogenlerin ekspresyonu dahil olmak üzere gen ekspresyon profilini etkilerler 14,15,16.

Histon proteoformlarının sayısı, histon varyantları olarak nükleozoma dahil edildiğinde artar. Bu varyantlar, kanonik histonların alelik olmayan izoformlarıdır ve kromatinin kimyasal ve fiziksel özelliklerini değiştirerek karmaşıklık katarlar. Kanonik histonlarla karşılaştırıldığında, histon varyantları, benzersiz translasyon sonrası modifikasyonlara uğrayan veya belirli kromatin bileşenleriyle etkileşime giren, nükleozom17'nin dinamiklerini ve stabilitesini etkileyen fonksiyonel alanlara sahiptir.

Kanser hücrelerinde, histon PTM'lerinin ve varyantlarının deregülasyonu, gen ekspresyon profilini etkileyerek anormal hücresel proliferasyona, istilaya, metastaza ve ilaç direnç yollarınınaktivasyonuna yol açar 3,18,19,20. Histionlar veya kromatin yeniden şekillenme kompleksleri içindeki mutasyonlar, hücre fenotipini değiştirerek neoplastik dönüşüme katkıda bulunabilir. Histon metilasyonu gibi epigenetik değişikliklerin birikmesi, ilaç direnç yollarının 21,22,23 aktive edilmesinde anahtar bir faktördür. 29 gen tarafından kodlanan 15 alt birimden oluşan SWI/SNF kompleksi içindeki mutasyonlar, birçok tümör tipinde insan kanserlerinin %20'sinden fazlasını etkiler. Son on yılda, epigenetik temelli ilaç stratejileri (epi-ilaçlar) geliştirilmiş ve anormal histon modifikasyon paternlerine sahip kanseri hedef alan birçok ilaç ABD Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tarafından onaylanmıştır23.

Histon proteinlerinin analizi oldukça zordur ve bu da onu zorlu bir çalışma alanı haline getirir. Son zamanlarda, kütle spektrometresi yöntemleri, histon proteoformlarını karakterize etmek ve incelemek için tercih edilen yol haline gelmiştir. Bununla birlikte, bazı varyantların zayıf çözünürlüğü ve yüksek dizi homolojisi ile birlikte sert ekstraksiyon koşulları, analizlerini zorlaştırır.

Son on yılda, histon profillemesi ve incelemesi için çeşitli kütle spektrometresi tabanlı yöntemler geliştirilmiştir 24,25,26,27. Bu çalışmada, histon proteoformlarının iki boyutlu bir haritasını oluşturmak için uygun maliyetli ve güvenilir bir yöntem sunuyoruz, bu da yeni translasyon sonrası modifikasyonları keşfetme şansını artırabilir.

2D TAU elektroforezi, asidik koşullarda separasyonu SDS PAGE ile birleştirir. Birinci boyutta, ortamın asidik durumu, bazik proteinlere net bir pozitif yük verir. Histonlar çok temel proteinler olduklarından ve ortama kıyasla daha yüksek bir izoelektrik noktaya (pH) sahip olduklarından, pozitif yüklü hale gelirler ve bir elektrik alanı altında göç ederler. İkinci boyutta, histonlar SDS ile denatüre edilir ve moleküler ağırlıklarına göre ayrılır. Elde edilen 2D harita, kütle spektrometresi analizi ve immünolojik çalışmalar için tek nokta çözünürlükte spesifik proteoformları zenginleştirmek için bir araç olarak kullanılabilir28,29. Elektroforezden sonra, 2D TAU lekeleri lekelenebilir, tripsin ile sindirilebilir ve kütle spektrometresi ile analiz edilebilir. Alternatif olarak, 2D TAU haritası bir nitroselüloz / PVDF filtresine lekelenebilir ve immün boyama27 ile incelenebilir.

Bu bağlamda, yöntemler, metabolik yeniden kablolama ile ilişkili yeni translasyon sonrası modifikasyonların tanımlanmasını ve analizini geliştirmek için stratejik olabilir30,31.

DNA bozunması ve protein çözünürlüğünün iyileştirilmesi için yardımcı olan bir sonikasyon adımı ekleyerek orijinal yöntemi daha da geliştirdik. Ek olarak, yüksek saflıkta bir protein örneği elde etmek için histon ekstraksiyonu için inkübasyon adımını uzattık. Ayrıca protokolümüzde daha iyi bir çözünürlük elde etmek için ilk boyutu düşük voltajda daha uzun süre çalıştırdık. Elde edilen jel, kanonik histonlar PTM'leri araştırmak ve glikasyon10,32 gibi yeni modifikasyonları karakterize etmek için kullanıldı.

Genel olarak, histonların ekstrakte edilmesi ve saflaştırılması için bir yöntem geliştirdik, ardından iki boyutlu bir harita kullanarak histon proteoformlarının çözünürlüğünü izledik. Çalışma ayrıca kütle spektrometresi analizi için jel içi sindirim prosedürünü ve iki boyutlu western blot analizi için adımları içerir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Histon ekstraksiyonu

  1. % 80 birleşik olan en az 1 x 106 hücreden histon ekstraksiyonu gerçekleştirin. Bu deney için ATCC'den MCF-10A hücre hatlarını kullandık. Kaplamadan sonra, hücreleri 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) 1x ile üç kez yıkayın. Tüm adımları buz üzerinde gerçekleştirin.
  2. 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM KCl ve 1.5 mMMgCl2 içeren bir hücre lizis tamponu hazırlayın. Kullanmadan hemen önce 1 mM ditioeritritol ve proteaz ve fosfataz inhibitörleri ekleyin.
  3. Hücre içeren Petri kabına 800 μL hücre lizis tamponu ekleyin, hücreleri kazıyın ve 1.5 mL'lik bir tüpte toplayın, daha sonra 300 rpm'de, 4 ° C'de 1 saat boyunca bir döndürücü üzerinde inkübe edin.
  4. 10.000 x g, 4 ° C'de, 1.5 mL tüpler için bir döndürücü ile önceden soğutulmuş bir mikro santrifüjde 10 dakika santrifüjleyin.
  5. Peleti 400 μL hücre lizis tamponu ile yıkayın ve 10.000 x g, 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Yıkama adımını 3 kez tekrarlayın.
    NOT: Tüm adımlar için 4 ml'lik tüpler için döndürücülü önceden soğutulmuş bir mikro santrifüj (1.5 °C) kullanın. Malzeme kaybını önlemek için peleti dikkatli bir şekilde kullanın.
  6. Peletleri 640 μL'lik 0,2 M H2S4'te yeniden süspanse edin ve 300 rpm'de, 4 ° C'de 16 saat boyunca bir döndürücü üzerinde inkübe edin.
    DİKKAT: Sülfürik asit tehlikeli bir kimyasaldır; Lütfen kimyasal çeker ocak altında kullanın.
  7. 16.000 x g, 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve aşağıdaki adımlara kadar saklayın. Nükleer kalıntıları atın.
  8. Damla damla 212 μL Trikloroasetik asit ekleyerek histonları çökeltin (TCA'nın nihai konsantrasyonu %33'tür). Tüpü 10x ters çevirerek çözeltiyi karıştırın. Karanlıkta buz üzerinde 16 saat kuluçkaya yatırın.
    DİKKAT: TCA tehlikeli bir kimyasaldır; Kimyasal çeker ocak altında kullanın.
  9. Önceden soğutulmuş bir santrifüjde 16.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika döndürülerek pelet histonları. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve peleti 3x 200 μL soğuk asetonla yıkayın.
  10. Peleti soğuk asetonla yeniden askıya alın, ardından buz üzerinde 10 dakikalık bir duraklama ile dönüşümlü olarak, 3 döngü 30 s açma / kapama ile yüksek gücü 2x sonikasyon yapın.
    NOT: İşlem bir ultrasonicator kullanılarak yapıldı. Bu adım, histon sarılı DNA'yı ortadan kaldırmak için gereklidir.
  11. 10 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin, asetonu atın ve numuneyi 100 μL çift damıtılmış suda yeniden süspanse edin. Üreticinin talimatlarına göre Bradford tahlil yöntemini kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin33.
    NOT: Santrifüjlemeden sonra, pelet bazen beyaz veya yarı saydam görünür. Beyaz ve opak bir çökelti, 2D ayrımını bozabilecek tuz kirleticilerinin varlığını gösterebilir. Eğer öyleyse, pelet yarı saydam hale gelene kadar aseton yıkama adımlarını tekrarlayın.
  12. Üreticinin talimatlarına göre 70 μg histonu liyofilize edin. Liyofilizatörü 60 dakika boyunca 30 °C'ye ayarlayın. Tüp hacmini kontrol edin ve numune tamamen liyofilize olana kadar adımı 30 °C'de tekrarlayın (genellikle numuneyi tamamen liyofilize etmek için 90 dakika gereklidir). 60 dakika sonra, işlem örneğe bağlı olduğu için hacmi her 10 dakikada bir kontrol edin.
    NOT: Histon proteinlerinin miktarı düşükse, 2 x 106 hücreden başlayın. Bu durumda, 1 x 106 hücre için kullanılan aynı hacimde reaktif kullanın. İşlem sırasında kullanılan tüm kimyasalların saflığını kontrol edin; tüm reaktifler HPLC sınıfı olmalıdır.

2. Mini 2D jel triton-asit-üre (TAU) elektroforezi

  1. Aşağıda açıklandığı gibi bir mini dikey poliakrilamid jel elektroforez sistemi için bir mini TAU jeli hazırlayın.
    1. Ayırma jeli hazırlayın: 6 M Üre, %15 akrilamid/bisakrilamid (29:1), %5 buzlu asit asetik, %0,25 Triton X-100 (h/h), %0,4 TEMED (h/v), %0,1 APS (p/v). Çözeltiyi hazırlamak için, üreyi akrilamid / bis ve 1 mL ultra saf su içinde oda sıcaklığında hafif çalkalama ile çözün; Diğer bileşenleri ekleyin ve ses seviyesini ayarlayın. Bir mini TAU jeli için 10 mL çözelti hazırlayın. Önceden ayarlanmış jel plakalarını solüsyonla doldurun ve üstten sadece 1,5 cm yükseklikte hava kabarcıkları oluşmasını önleyin. Jeli düzleştirmek için çözeltiyi 1 mL izopropanol ile kaplayın.
    2. İstifleme jeli hazırlayın: 6 M Üre, %6 akrilamid/bisakrilamid (29:1), %5 buzlu asit asetik, %0,25 Triton X-100 (h/h), %0,4 TEMED (h/v), %0,1 APS (p/v). Çözeltiyi hazırlamak için üreyi akrilamid / bis ve 1 mL ultra saf su içinde çözün; Diğer bileşenleri ekleyin ve ses seviyesine ayarlayın. Jel plakaları istifleme solüsyonu ile doldurun, plakalar arasına 10 oyuklu bir jel tarak yerleştirin ve jel solüsyonu tarağın dişlerinin yarısına gelene kadar yerleştirin. Jelin 4 °C'de 16 saat polimerize olmasına izin verin.
      NOT: Kuyuların düzenli oluşumunu sağlamak için tarağı dikkatlice yerleştirin.
  2. 6 M Üre, %5 buzlu asit asetik ve çift damıtılmış suyu çözerek 100 μL TAU numune tamponu hazırlayın. Hazırlanan liyofilize numuneyi 30 μL TAU numune tamponunda çözün.
  3. Mini kaseti TAU çalışma tamponu,% 5 asetik asit nihai konsantrasyonu ile doldurun. TAU-jelin kuyucuklarını çalışan tamponla doldurulmuş bir şırınga ile durulayın ve numuneyi bir mikropipet kullanarak kuyuya yükleyin.
  4. Elektroforetik odayı, pozitif (kırmızı) elektrot alta yerleştirilmiş olarak güç kaynağına bağlayın. IP pH > olduğunda, proteinler pozitif yüklüdür, bu nedenle göç pozitiften negatif elektrota doğru olur. Jeli önce 70 dakika boyunca 30 V'ta, ardından 17 saat boyunca 25 V'luk sabit voltajda çalıştırın.
    NOT: Bu süre zarfında, ara sıra güç kaynağını kapatın ve tek kullanımlık bir şırınga kullanarak jel kuyularını durulayın. Numune kaybını ve çözülen proteinlerde bir lekelenme olmasını önlemek için bir şırınga kullanarak jelin alt yüzeyindeki kabarcıkları çıkarmaya dikkat edin.
  5. Jeli jel plakalardan çıkarın ve ilgi hattını temiz bir neşter ile kesin. Jel kırılmasını önlemek için jeli dikkatlice kullanın. İlgi alanı renksiz olduğundan, ilgilenilen şeridi tam olarak tanımlamak ve kesmek için numuneyi 1 numaralı kuyuya yükleyin.
    NOT: Mini-TAU jel üzerindeki ayrılmayı kontrol etmek için, numuneyi iki kopya halinde hazırlayın ve çalıştırın. Bu jellerden biri Coomassie Brilliant Blue kullanılarak boyanabilir. Ayrılma modeli Şekil 1A'da rapor edilmiştir.
  6. Şeridi 15 mL 0.5 M Tris-HCl pH 8.8 ile 15 dakika boyunca yıkayın.
  7. 6 M Üre, 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8, %30 gliserol, %20 SDS ve %2 Ditioeritritol kullanarak 15 mL dengeleme tamponu 1 hazırlayın. 6 M Üre, 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8, %30 gliserol, %20 SDS ve %2 İyodoasetamid kullanarak 15 mL dengeleme tamponu 2 hazırlayın. Dengeleme tamponu 1 ve 2'yi kullanmadan hemen önce hazırlayın; Dengeleme tamponunu 2 karanlıkta saklayın.
  8. Jel şeridini hafif çalkalama altında 10 mL dengeleme tamponu 1 içinde 15 dakika inkübe edin, ardından boşaltın. Jel şeridini hafif çalkalama altında, 10 mL dengeleme tamponu 2 ile karanlıkta 15 dakika inkübe edin, ardından boşaltın.
  9. Tablo 15'i takip ederek çözülen bir SDS % 1 akrilamid jeli hazırlayın. Jel plakasını ayarlayın ve çözücü jel çözeltisi ile doldurun. Solüsyonu uzun jel plakanın ucundan 1,5 cm uzakta olana kadar doldurun. Jeli düzleştirmek ve polimerize olmasını sağlamak için yüzeye 1 mL izopropanol koyun.
  10. Jel polimerizasyonundan sonra, izopropanolü boşaltın ve kuyuyu 3MM Chr Selüloz Kromatografi Kağıdı ile kurulayın. Elde edilen şeridi 8. adımdan jel kuyusuna yerleştirin.
  11. 1x Tris/glisin/SDS tamponunda %0,5 düşük erime noktalı agaroz ve 5 μL %0,003 bromofenol mavisi sızdırmazlık solüsyonu ile çözme jeline giden şeridi kapatın. 30 dakika agaroz jel polimerizasyonuna izin verin.
    NOT: Jel bulaşmasını önlemek için agaroz sızdırmazlığı sırasında hava kabarcıkları oluşmasını önleyin.
  12. Jel plakaları kasete yerleştirin ve 1x Tris / glisin / SDS tamponu ile doldurun. Bromofenol mavisi boya dibe ulaşana kadar jeli 120 V'ta çalıştırın. Jeli plakalardan nazikçe çıkarın, fazla agarozu atın ve immünolojik test için kütle spektrometresi veya leke ile uyumlu bir prosedür kullanarak jeli gümüş lekeleyin.

3. Gümüş boyama 32

  1. Aşağıdaki reaktifleri hazırlayın - Fiksatif:% 50 metanol,% 5 asetik asit,% 45 deiyonize su; Yıkama çözeltisi: %50 metanol, %50 deiyonize su; Hassaslaştırıcı: Deiyonize suda %0,02Na2S2O35H2O; Gümüş reaktifi: soğuk (4°C) deiyonize suda %0.1 gümüş nitrat; Geliştirici:% 0.04 Formalin ve% 2 Na2CO3, Formaldehit (% 37) (kullanmadan hemen önce ekleyin) 0.4 mL deiyonize su ve 1000 mL'ye kadar doldurun; Durdurucu reaktif:% 5 asetik asit; Jel saklama çözeltisi:% 1 asetik asit.
    NOT: Boyama için kullanılan kimyasallar tehlikeli olduğundan, tüm adımları kimyasal çeker ocak altında gerçekleştirin.
  2. Aşağıdaki hususları göz önünde bulundurarak Tablo 2'deki prosedürü izleyin. Tüm inkübasyonları hafif çalkalama ile gerçekleştirin. Geliştirme adımına başlamadan önce durdurma reaktifini hazırlayın; Bu, uygun yoğunlukta jel gelişimini sağlayacaktır. Geliştirme aşaması sırasında, inkübasyonun sonunda açık kahverengiye dönüşecek olan sarı sinyaller olarak lekeler görünecektir. Farklı noktaların yoğunluğu, histon proteoformlarının miktarına bağlı olacaktır. Jel, nokta eksizyonu ve jel içi sindirim için hazırdır (Şekil 1B)

4. Jel içi sindirim

  1. Aşağıdaki çözeltileri hazırlayın: 50 mM amonyum bikarbonat (NH4HCO3)/%50 (h/h) asetonitril; 50 mM NH4HCO3 içinde 10 mM ditiyotreitol (DTT); 50 mM NH4HCO3 içinde 55 mM iyodoasetamid (IAA); % 0.1 TFA; 50 mM NH4HCO3, pH 8; HPLC sınıfı Asetonitril; 1 mL silikon tüpler.
    NOT: Saç veya ciltten insan keratin kontaminasyonunu önlemek için temiz eldiven kullanın ve temiz bir alanda çalışın.
  2. Temiz bir neşter kullanarak lekeli jelden ilgilenilen histon lekelerini çıkarın ve bunları yeni bir silikon tüpe (1.5 mL) yerleştirin. İzoform çapraz kontaminasyonunu önlemek için tek bir noktayı eksize etmeye ve tek bir tüpe koymaya özen gösterin.
  3. Her bir jel noktasına 250 μL 50 mM NH4HCO3/50% asetonitril ekleyin ve oda sıcaklığında bir termomikserde hafif çalkalama altında inkübe edin. Çözeltiyi boşaltın ve bu adımı 3 kez tekrarlayın. Jel parçaları şeffaf görünecektir.
  4. Asetonitril (200 μL) ekleyerek jel lekelerini kurutun. Bu aşamada jel parçaları opak-beyaz bir renk alacaktır.
  5. Asetonitrili boşaltın ve 10 dakika kurumaya bırakın. Jel parçası tüpte kurumuş görünecektir. Dengeleme aşaması sırasında histon proteinleri indirgendiği ve alkillendiği için indirgeme ve alkilasyon gerekli değildir.
  6. Jel lekelerini 20 μL tripsin çözeltisinde (0.1 mM HCl) veya jel parçalarını kaplamak için yeterli bir hacimde rehidre edin. Tüpleri termomiksere yerleştirin ve hafif çalkalama altında 37 °C'de en az 4 saat ila 16 saat arasında inkübe edin.
  7. Triptik peptitleri içeren süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Jel parçalarına 50 μL ekstraksiyon çözeltisi (% 60 asetonitril,% 1 TFA) ekleyin ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca ultrasonik bir su banyosunda 2x sonikat yapın.
  8. Ek triptik peptitler içeren süpernatanı taze tüpe aktarın. Havuzlanmış ekstrakte edilmiş peptitleri kurutmak için bir liyofilizatör kullanın. Liyofilizatörü 30 °C'ye ayarlayın ve çözeltiyi kurutun; Tüpte liyofilize bir pelet görünecektir.
    NOT: Bu adım hacme bağlıdır; Genellikle 1 saat yeterlidir, ancak numune tamamen kuruyana kadar hacmi her 10 dakikada bir kontrol edin.
  9. Her tüpe 15 μL %0,1 TFA ekleyin ve 25 °C'de bir termomikserde nazikçe inkübe edin. Süpernatanı LC-MS/MS analizi için şişeye aktarın.

5. 2DTAU batı lekesi

  1. Çift damıtılmış su kullanarak transfer tamponunu, 250 mM Tris bazını, 92 mM glisini ve% 10 metanolü hazırlayın.
  2. Nitroselüloz membranı ve filtre kağıdını jelin boyutlarına göre kesin.
  3. Jeli dengeleyin ve zarı, filtre kağıdını ve filtre kağıtlarını transfer tamponunda 15 dakika bekletin. Nitroselüloz veya PVDF membranları kullanın. PVDF (Poliviniliden diflorür) membranları kullanılıyorsa, bunları %100 MetOH'ye batırarak etkinleştirin.
  4. Kasetteki jel sandviçi Yarı kuru transfer için aşağıdaki gibi hazırlayın: Negatif elektrot / Filtre Kağıdı / Jel / Nitroselüloz membran / Filtre kağıdı / Pozitif elektrot. İyi sonuçlar elde etmek için jel ve zar arasındaki hava kabarcıklarını çıkarın.
  5. Kaseti Yarı kuru üniteye yerleştirin ve lekeyi 25 V'ta 30 dakika çalıştırın. Sonunda, kurutma sandviçini sökün ve immünolojik tahlil için zarı saklayın. Ponceau boyama ile transfer verimliliğini kontrol edin. Doğru filtre yönünü korumak için membranı sağ üstte bir işaretle işaretleyin.
  6. Deneye bağlı olarak birincil ve ikincil antikorlarla inkübe edin (Şekil 2).

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1A'da, histon proteinlerinin 1D bir jel içinde nasıl göç ettiğini gözlemlemek mümkündür. Bu, ilk boyutun çalışma süresini anlamak için önemli bir ön adımdır. Doğru ayrılma zamanı belirlendikten sonra, ikinci boyutu çalıştırın. Histon proteoformlarının 2B haritası, belirgin bir topografik model gösterir (Şekil 1B). Şekil 1B'deki her nokta belirli bir histon tipini temsil eder. Her bir histon proteoformunun bulunabileceği jelin tam bölgesini gözlemleyin. Her histon proteoformu için kütle spektrometresi tanımlaması Perri ve ark.32'de rapor edilmiştir. Bu nedenle, bu durumdaki her nokta belirli bir histon tipi ile ilişkilidir. Kanonik olanların yanı sıra ek noktaların varlığı, yeni değişikliklerin varlığına işaret edebilir. Jel görüntüler dansitometri kullanılarak elde edilebilir ve elde edilen görüntü, görüntü analiz yazılımı kullanılarak analiz edilebilir.

2D TAU haritasının güvenilirliği, noktanın yuvarlaklığına bağlıdır. Çalıştırma doğru bir şekilde gerçekleştirildiyse, noktalar farklı sinyaller olarak görünecek ve yatay ve dikey çizgiler görünmeyecektir. Tersine, numunedeki, çözeltilerdeki ve agaroz kaplamasındaki safsızlıklar jelde çizgilere ve/veya şeritlere neden olabilir. Jelin kalitesi, görüntü dijitalleştirmesini ve aşağıdaki nicel ve nitel analizi etkileyecektir. Ayrıca, Western Blot analizinin ve MS araştırmalarının başarısını etkileyebilir. Yöntemin güvenilirliğini doğrulamak için, birincil antikor Asetillenmiş-Lizin (Ac-K2-100) Tavşan mAb32 ile çözülmüş histon proteoformlarının nitroselüloz membranını inceledik (Şekil 2). Histon sinyallerini tespit etmek için bir anti-tavşan HRP ikincil antikoru kullanıldı. Beklendiği gibi, bir dansitometre kullanarak, lekede bulunan her bir histon varyantı üzerindeki tuhaf translasyon sonrası modifikasyonu ölçmek mümkündür.

figure-results-1
Resim 1: 1D ve 2D TAUgel. (A) 1D TAUgel kullanılarak elde edilen histon topografik deseninin temsili görüntüsü. (B) 2D TAUgel kullanılarak elde edilen histonların topografik deseninin temsili görüntüsü. Veri tanımlamaları Perri ve ark. 32. Beklendiği gibi, her nokta belirli bir histon proteoformunu temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Resim 2: Temsili 2DTAU Western blot. Görüntüde, her bir histon proteoformunda lizin asetilasyon seviyesini gözlemlemek mümkündür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

ReaktifKonsantrasyon:
@ Akrilamid/Bis3.75
1,5 m tris pH 8,82,5 mL
MilliQ su3,6 mL
SDS100 μL
APS50 μL
TEMED (TEMED)5 μL

Tablo 1: Jel çözeltisi bileşiminin çözülmesi.

AdımSaat
P metanol / %5 asetik asit sabitleme1 saat,
% 30 etanol yıkayın2 x 20 dk
Deiyonize suyu yıkayın1 x 20 dk
Hassaslaştırıcı Tiyosülfat reaktifi1 dk
Deiyonize suyu yıkayın3 x 20 sn
Gümüş Gümüş nitrat30 dk
Deiyonize suyu yıkayın3 x 1 dk
Geliştirme Geliştiricisi25-30 dk Not: Lekeler görünene kadar jeli geliştirin (açık kahverengi)
Durdurma Çözümü1 x 10 dk
Deiyonize suyu yıkayın2 x 5 dk
Deiyonize suyu yıkayın1 saat,

Tablo 2: Gümüş boyama yöntemi.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son on yılda, kanser hastası tedavisi, kanser gelişimini ve ilerlemesini yönlendiren çeşitli moleküler değişiklikleri tanımlayarak devrim yaratmıştır. Modern onkolojideki en önemli gelişme, kapsamlı moleküler analize dayalı tedavinin geliştirilmesidir. Genomik ve proteomikteki teknolojik gelişmeler, erken tespit, sürveyans, prognoz ve ilaç izleme için spesifik biyobelirteçlerin profillenmesinde çok önemli bir rol oynamıştır. Proteomik, belirli bir koşul altında bir hücrenin, dokunun veya organizmanın tam protein tamamlayıcısının analizi olarak tanımlanır ve aynı zamanda protein etkileşimleri, translasyon sonrası modifikasyonlar ve lokalizasyon çalışmalarını da içerir34. Proteomiklerin spesifik bir alanı, histon translasyon sonrası modifikasyonların sistematik çalışmasını içeren epi-proteomiktir. Bunlar kanserin gelişimi ve ilerlemesi ile ilişkilendirilmiştir35. Makale, hücresel fenotipe katkıda bulunan spesifik histon izoformlarını tanımlamak için bir yöntemi özetlemektedir.

Yöntemin kritik adımı, zayıf çözünürlükleri ve yüksek baziklikleri nedeniyle histonların çıkarılmasıdır. Başlıca sınırlamaları, 2B haritanın karmaşıklığı ve MS/MS analizini zorlaştırabilecek düşük varyant sayısıdır.

Genel olarak, bu yaklaşımın en büyük yararı, herhangi bir laboratuvarda gerçekleştirilebilmesi ve uygun önlemlerle bir mini jel aparatına sahip olunabilmesidir. Bu bağlamda, bu yöntemin, kurumlarında büyük bir tesisten yararlanamayanlar gibi çok sayıda bilim insanına, epi-proteom hakkındaki bilgileri geliştirmeyi amaçlayan yeni epi-belirteçleri belirlemede yardımcı olabileceğine inanıyoruz. Ayrıca, bu yöntem, yeni proteoformları keşfetmek için bir hizmet olarak dışarıdan temin edilebilen kütle spektrometresi ile birleştirilebilir. Ayrıca, ticari bir antikorun mevcut olduğu spesifik bir translasyon sonrası modifikasyondaki değişiklikleri doğrulamak için immünolojik tahlillerle de kullanılabilir.

Yöntem, meme kanseri gelişimi ile ilgili histon modifikasyonlarındakitipik değişiklikleri incelemek 28ve fare embriyonik kök hücrelerinde36 H1 modifikasyonlarını incelemek için kullanılmıştır. Ek olarak, yöntem, hızla büyüyen fibroblastlarda histon karbonilasyonu37 seviyesini ölçmek ve histon glikasyonu ve histon MARilasyonu38 gibi yeni histon modifikasyonlarını keşfetmek için başarıyla kullanılmıştır.

Bizim bakış açımıza göre, bu yöntemin, özellikle asetilasyon, malonilasyon, metilasyon, lipidasyon, laktilasyon, bütilasyon ve diğerleri gibi spesifik metabolik yolların anormal aktivasyonu ile ilişkili olanlar olmak üzere yeni histon PTM'lerinin profilini çıkarmak için başarılı bir şekilde uygulanabileceğinden eminiz. Sonuç olarak, yöntem aynı zamanda bireysel proteoformları izole etmek için bir mikro-hazırlayıcı araç olarak da hizmet edebilir ve metabolizmaya bağlı PTM'lerin analizini kolaylaştırabilir, böylece bu önemli araştırma alanı hakkındaki anlayışımızı geliştirebilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma PRIN2022, DS, CF ve AC tarafından PRIN2022 tarafından desteklenmiş ve MLC, UMG Doktora programı okulu, Moleküler Onkoloji Doktora programı tarafından desteklenmiştir. Çalışma aynı zamanda PNRR INSIDE CUP Projesi tarafından da desteklendi: B83C22003920001

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,4-DitiyoeritritolSIGMA- ALDRICHD8255 Bakım için reaktif &eksi; İndirgenmiş durumdaki SH grupları; disülfidleri kantitatif olarak azaltır.
1,5 M Tris-HCL tamponu, pH 8.8BIO-RAD161-0798Çözünen Jel Tamponu
10x Tris/Glisin/SDS BİYO-RAD 1610772Protein örneklerini SDS-PAGE ile ayırmak için bu önceden karıştırılmış 10x Tris/glisin/SDS çalışan tamponu kullanın.
2-PropanolSIGMA-ALDRICH335392-Propanol (İzopropanol) ikincil bir alkoldür. Çeşitli yakıt hücrelerinde kullanım için yakıtın yerine geçecek şekilde test edilmiştir. 2-propanol içinde çözünen CuO tozu, Cu kolloidlerinin lazer ablasyon destekli sentezi için kullanılmıştır. Zn (NO3) 2 ile 2-propanolün süspansiyonu, düzgün kalınlıkta P25-TiO2 tabakası ile kaplanmış titanyum dioksit kaplı paslanmaz çelik (P25-TiO2 / SS) fotoanotun imalatı için kullanılmıştır.
%30 Akrilamid/Bis Solüsyonu BIO-RAD1610158%2.6 Çapraz bağlayıcıdır. Elektroforez saflık reaktifi 
Asetik Asit BuzuluCarlo Erba Reagennts401392Asetik asit, birçok endüstriyel uygulamaya sahip önemli bir kimyasal reaktiftir.
AsetonPanreac Uygulaması211007.1214Aseton  çeşitli laboratuvar, üretim ve temizleme uygulamalarında çok yönlülüğü ile tanınan bir çözücüdür.
AsetonitilVWR83640320    LC-MS sınıfı
AgarozInvitrogen15510-027Agaroz  a  heteropolisakkarit  moleküler biyolojide sıklıkla kullanılır.
Amonyum bikarbonatSIGMA-ALDRICHA6141minimum %99,0
Amonyum persülfatSIGMA-ALDRICHA3678Moleküler Biyoloji için, Elektroforez için, vb; %98 ve nbsp;
Bioruptor plusDiagenodeB01020001 - B01020002- B01020003sonikatör
DithiothreitolSIGMA- ALDRICHD9163-5GProteinlerdeki disülfid bağlarını azaltmak için kullanılan indirgeyici ajan.
Dodeca Gümüş Leke Kiti BIO-RAD161-0480Dodeca gümüş leke kiti, poliakrilamid jellerdeki proteinlerin nonagram seviyelerinin tespiti için kullanımı kolaydır.
GliserolGE - Sağlık Yaşam Bilimleri171325010LGliserol basit bir triol bileşiğidir, gradyan jellerin, protein stabilizatörünün ve depolama tamponu bileşeninin dökümüne yardımcı olmak için kullanılır.
Halt Fosfataz İnhibitörü Thermo SCIENTIFIC78428Thermo Scientific Halt Fosfataz İnhibitörü Kokteyli, hücre lizizi veya doku proteini ekstraksiyonu sırasında ve sonrasında proteinlerin fosforilasyon durumunu korur  Tek Kullanımlık Kokteyl (100X).   
Halt Proteaz İnhibitörü Thermo SCIENTIFIC78430Thermo Scientific Halt Proteaz İnhibitör Kokteyli (100X), hücre lizisi ve protein ekstraksiyonu sırasında proteolitik bozulmayı önlemek için numunelere ilave olarak proteaz inhibitörlerinin kullanıma hazır konsantre stok çözeltileridir. Tek Kullanımlık Kokteyl (100X).   
hidroklorik asitSIGMA-ALDRICHH1758BioReagent,
İyodoasetamidSIGMA-ALDRICHI6125≥ %99 (NMR), kristal
KClSIGMA-ALDRICHP9541Potasyum klorür, KCl, is  Genellikle laboratuvar rutinlerinde kullanılır. pH elektrotları için bir depolama tamponu ve iletkenlik ölçümleri için bir referans çözelti olarak kullanımı iyi bilinmektedir.
MCF10 hücre hattıatccCRL-10317 1984 yılında fibrokistik göğüsleri olan 36 yaşında beyaz bir kadının meme bezinden izole edilen epitel hücre hattı. Bu hücre dizisi Michigan Kanser Vakfı tarafından yatırıldı.
MgCl2SIGMA-ALDRICH208337Magnezyum klorür renksiz kristal bir katıdır.
N, N, N', N'-Tetrametiletilen-diaminSIGMA-ALDRICHT9281Elektroforez için, yaklaşık% 99
Fosfat salin tamponu 1XCorning153736311 X PBS (fosfat tamponlu salin) is  arabelleğe alınmış  Dengeli tuz çözeltisi  Ayrışmadan önce hücrelerin yıkanması, hücrelerin veya dokunun taşınması, hücrelerin sayım için seyreltilmesi ve reaktiflerin hazırlanması gibi çeşitli biyolojik ve hücre kültürü uygulamaları için kullanılır.
Potasyum hekzasiyanoferratSIGMA-ALDRICH60299Elektron alıcısı, elektron taşınmasını içeren sistemlerde kullanılır,
SDS Çözeltisi% 20 (a / h)  BIO-RAD161-0418Sodyum dodesil sülfat. Elektroforez saflık reaktifi 
Sodyum tiyosülfat, ReagentPlus %99SIGMA-ALDRICH21,726-3Sodyum tiyosülfat, ReagentPlus %99
Sülfürik asitSIGMA-ALDRICH339741Sülfürik Asit, Reaktif, is  Sarımsı hafif viskoz sıvı olarak gelen son derece aşındırıcı bir asit. Suda çözünür ve diprotik bir asittir. Higroskopik olmasının yanı sıra çok güçlü aşındırıcı, dehidre edici ve oksitleyici özelliklere sahiptir.
Trikloroasetik asitSIGMA-ALDRICHT6399-5GTrikloroasetik asit (TCA)  proteinlerin 1,2< / sup> ve nükleik asitlerin 3< / sup>. 
Trifloroasetik asitRiedel-de Haë n34957Trifloroasetik asit
Triton X-100SIGMA- ALDRICHT9284-1LTriton X-100, proteinleri ekstrakte etmek ve çözündürmek için en sık kullanılan noniyonik bir polioksietilen yüzey aktif maddedir.
Domuz pankreasından elde edilen tripsinSIGMA-ALDRICHT6567Proteomik Sınıfı, BioReaktif, Dimetillenmiş
ÜRESIGMA-ALDRICH33247Üre, kaotropik bir ajandır ve protein denatürasyonu için kullanılır. Proteinlerin ikincil, üçüncül ve dördüncül yapısındaki hidrojen bağlarını bozar. Ayrıca DNA'nın ikincil yapısında bulunan hidrojen bağını da bozabilir
HPLC için Moleküler biyoloji için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  2. Cutter, A. R., Hayes, J. J. A brief review of nucleosome structure. FEBS Lett. 589 (20 Pt A), 2914-2922 (2015).
  3. Millán-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).
  4. Sun, L., et al. Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer. Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).
  5. Kinnaird, A., et al. Metabolic control of epigenetics in cancer. Nat Rev Cancer. 16 (11), 694-707 (2016).
  6. Díaz-Hirashi, Z., et al. Metabolic reprogramming and signaling to chromatin modifications in tumorigenesis. Adv Exp Med Biol. 1219, 225-241 (2020).
  7. Panatta, E., et al. Metabolic regulation by p53 prevents R-loop-associated genomic instability. Cell Rep. 41 (5), 111568(2022).
  8. Scumaci, D., Zheng, Q. Epigenetic meets metabolism: novel vulnerabilities to fight cancer. Cell Commun Signal. 21 (1), 249(2023).
  9. Chiaradonna, F., Scumaci, D. Cancer metabolism as a new real target in tumor therapy. Cells. 10 (6), 1393(2021).
  10. Scumaci, D., et al. DJ-1 proteoforms in breast cancer cells: The escape of metabolic epigenetic misregulation. Cells. 9 (9), 1968(2020).
  11. Olivo, E., et al. Moving beyond the tip of the iceberg: DJ-1 implications in cancer metabolism. Cells. 11 (9), 1432(2022).
  12. Zheng, Q., Maksimovic, I., Upad, A., David, Y. Non-enzymatic covalent modifications: a new link between metabolism and epigenetics. Protein Cell. 11 (6), 401-416 (2020).
  13. Maksimovic, I., David, Y. Non-enzymatic covalent modifications as a new chapter in the histone code. Trends Biochem Sci. 46 (9), 718-730 (2021).
  14. Lowe, B. R., et al. Histone H3 mutations: an updated view of their role in chromatin deregulation and cancer. Cancers. 11 (5), 660(2019).
  15. Karsli-Ceppioglu, S. The epigenetic landscape of promoter genome-wide analysis in breast cancer. Sci Rep. 7 (1), 6597(2017).
  16. Yang, C., et al. Histone methyltransferase and drug resistance in cancers. J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 173(2020).
  17. Vardabasso, C., et al. Histone variants: emerging players in cancer biology. Cell Mol Life Sci. 71 (3), 379-404 (2014).
  18. Ilango, S., Paital, B., Jayachandran, P., Padma, P. R., Nirmaladevi, R. Epigenetic alterations in cancer. Front Biosci. 25 (6), 1058-1109 (2020).
  19. Liu, Y., et al. Histone H2AX promotes metastatic progression by preserving glycolysis via hexokinase-2. Sci Rep. 12 (1), 3758(2022).
  20. Nowsheen, S., et al. ZNF506-dependent positive feedback loop regulates H2AX signaling after DNA damage. Nat Commun. 9 (1), 2736(2018).
  21. Ribeiro-Silva, C., Vermeulen, W., Lans, H. SWI/SNF: Complex complexes in genome stability and cancer. DNA Repair. 77, 87-95 (2019).
  22. Yang, Y., Wang, Y. Role of epigenetic regulation in plasticity of tumor immune microenvironment. Front Immunol. 12, 640369(2021).
  23. Miranda Furtado, C. L., et al. Epidrugs: targeting epigenetic marks in cancer treatment. Epigenetics. 14 (12), 1164-1176 (2019).
  24. Thomas, S. P., et al. A practical guide for analysis of histone post-translational modifications by mass spectrometry: best practices and pitfalls. Methods. 184, 53-60 (2020).
  25. Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges. FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).
  26. Kwak, H. G., Dohmae, N. Proteomic characterization of histone variants in the mouse testis by mass spectrometry-based top-down analysis. Biosci Trends. 10, 357-364 (2016).
  27. Sidoli, S., Simithy, J., Karch, K. R., Kulej, K., Garcia, B. A. Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-Orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications. Anal Chem. 87, 11448-11454 (2015).
  28. Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
  29. Basak, S. K., Ladisch, M. R. Correlation of electrophoretic mobilities of proteins and peptides with their physicochemical properties. Anal Biochem. 226 (1), 51-58 (1995).
  30. Nuccio, A. G., Bui, M., Dalal, Y., Nita-Lazar, A. Mass spectrometry-based methodology for identification of native histone variant modifications from mammalian tissues and solid tumors. Methods Enzymol. 586, 275-290 (2017).
  31. Zhang, S., Roche, K., Nasheuer, H. P., Lowndes, N. F. Modification of histones by sugar β-N-acetylglucosamine (GlcNAc) occurs on multiple residues, including histone H3 serine 10, and is cell cycle-regulated. J Biol Chem. 286 (43), 37483-37495 (2011).
  32. Perri, A. M., et al. Histone proteomics reveals novel post-translational modifications in breast cancer. Aging. 11, 11722-11755 (2019).
  33. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  34. Omenn, G. S., et al. Research on the human proteome reaches a major milestone: >90% of predicted human proteins now credibly detected, according to the HUPO human proteome project. J Proteome Res. 19 (12), 4735-4746 (2020).
  35. Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges. FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).
  36. Starkova, T. Y., et al. The profile of post-translational modifications of histone H1 in chromatin of mouse embryonic stem cells. Acta Naturae. 11 (2), 82-91 (2019).
  37. García-Giménez, J. L., et al. Histone carbonylation occurs in proliferating cells. Free Radic Biol Med. 52 (8), 1453-1464 (2012).
  38. García-Saura, A. G., Schüler, H. PARP10 multi-site auto- and histone MARylation visualized by acid-urea gel electrophoresis. Cells. 10, 654(2021).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

2D Jel ElektroforeziHiston PTM leriK tle SpektrometrisiKromatin Yap sSDS PAGEJel i SindirimG m BoyamaEpigenetik Modifikasyonlar

İlgili makaleler