Method Article

Çevresel Kirleticilerin Nükleer Reseptörlere Bağlanma Afinitesini Değerlendirmek için Yüksek Verimli Bir Tarama Yaklaşımı

DOI:

10.3791/67327

⸱

September 20th, 2024

 , 
1School of Public Health, Qingdao University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, çevresel kirleticileri taramak için bir okuma olarak bir nükleer reseptöre bağlanan belirli bir floresan probun floresan polarizasyonunu kullanan yüksek verimli bir tarama sistemini tanımlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çevrede artan seviyelerde bileşikler tespit edilmiş, yaygın kirliliğe neden olan ve insan sağlığı için risk oluşturan bileşikler tespit edilmiştir. Bununla birlikte, yüksek çevresel oluşumlarına rağmen, toksikolojik etkileri hakkında çok sınırlı bilgi vardır. Toksikolojik çalışmalara rehberlik etmek için yüksek verimli tarama (HTS) yöntemlerinin geliştirilmesi acildir. Bu çalışmada, çevresel kirleticilerin nükleer reseptörler üzerindeki bağlanma potansiyelini belirlemek için bir HTS sistemi kullanan bir reseptör-ligand bağlanma testi geliştirilmiştir. Test, belirli bir floresan probun floresan polarizasyonunu (FP) ölçerek bir mikroplaka okuyucu (yani çeşitli kimyasallar içeren 96 oyuklu bir plaka) kullanılarak gerçekleştirilir. Bu test dört bölümden oluşur: rekombinant vektörlerin inşası ve dönüşümü, reseptör proteininin ekspresyonu ve saflaştırılması (ligand bağlama alanı), reseptör-prob bağlanması ve kimyasalların reseptör ile rekabetçi bağlanması. İki çevresel kirleticinin, perflorooktansülfonik asit (PFOS) ve trifenil fosfatın (TPHP) peroksizom proliferatörle aktive edilen reseptör gama (PPARy) ile bağlanma potansiyeli, test prosedürünü göstermek için belirlendi. Son olarak, bu yöntemin avantaj ve dezavantajları ve potansiyel uygulamaları da tartışılmıştır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çevrede ve insan vücudunda çok sayıda kimyasal madde yaygın olarak tespit edilmiştir ve bu da ekolojik çevre ve insan sağlığı üzerindeki etkileri konusunda önemli endişelere yol açmaktadır 1,2,3. Yüksek çevresel oluşumlarına rağmen, toksikolojik etkileri ile ilgili bilgiler azdır. Bu nedenle, kimyasal toksisitenin değerlendirilmesini kolaylaştırmak için yüksek verimli tarama (HTS) yöntemlerinin geliştirilmesi acildir.

Kimyasal toksisite değerlendirmesi için Tox21 ve ToxCast programlarında kullanılan HTS biyo-tahlillerigibi çeşitli yüksek verimli tarama (HTS) yöntemleri bildirilmiştir 4,5. Bu yöntemler, potansiyel toksik maddeleri hızlı bir şekilde tanımlayabilir ve kimyasal toksisite mekanizmaları hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Bununla birlikte, bu HTS biyo-tahlilleri esas olarak karmaşık ve pahalı olabilen hücre bazlı sistemlere dayanır. Ek olarak, kimyasal toksisite değerlendirmesi için yüksek verimli sıralama yöntemleri de kullanılmıştır, ancak kimyasalların yüksek verimli değerlendirmesinin elde edilmesi zor olmaya devam etmektedir6. Önceki çalışmalar, peroksizom proliferatörle aktive olan reseptör (PPAR)7,8,9, bisfenol A (BPA)10,11 ve partikül madde (PM)12 dahil olmak üzere çeşitli çevresel kirleticilerin bağlanma potansiyelini belirlemek için floresan polarizasyon (FP) tabanlı reseptör-ligand rekabetçi bağlanma testleri geliştirmiştir. 8,9,10,13, farnesoid X reseptörü (FXR)11,12 ve tiroid reseptörü (TR)14,15. Bu yaklaşım verimlidir, uygun maliyetlidir ve mekanik içgörüler sağlar.

Bu çalışmada, küçük bir floresan probun floresan polarizasyonunun (FP) saptanmasına dayalı olarak reseptör-ligand bağlanma testi için protokol açıklanmaktadır. FP bazlı reseptör-ligand bağlanma testinin prensibi Şekil 1'de gösterilmiştir. Küçük bir floresan molekülü düzlem polarize ışık tarafından uyarıldığında, yayılan ışık hızlı moleküler rotasyon nedeniyle yüksek oranda depolarize olur. Bununla birlikte, izleyici daha büyük bir reseptöre bağlandığında, dönüşü yavaşlar. İzleyici büyük reseptöre bağlandığında yüksek bir FP değeri tespit edilirken, izleyici serbest olduğunda düşük bir FP değeri gözlenir. Peroksizom proliferatör ile aktive edilen reseptör gama (PPARγ), probun reseptöre bağlanması için saflaştırıldı. Probun reseptör ile bağlanması için rekabet etmek için rosiglitazon (Rosi), perflorooktansülfonik asit (PFOS) ve trifenil fosfat (TPHP) kullanıldı. PPARy'nin spesifik bir agonisti olan Rosi, reseptör rekabetçi bağlanma deneylerinde pozitif bir kontrol olarak kullanıldı. Ek olarak, PFOS ve TPHP daha önce geçmiş çalışmalarda PPARγ'nın zayıf agonistleri olarak tanımlanmıştır 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Ayrıca, çevresel maruziyet için bilinen farklı yapısal bileşik kategorilerine aittirler ve insan popülasyonlarında nispeten yüksek tespit oranları ile dikkat çekicidirler. Bu bileşikler, rekabet bağlama testinin geniş uygulanabilirliğini daha da doğrulamak için kullanıldı. Prosedür dört adımdan oluşur: rekombinant vektörlerin inşası ve dönüşümü, reseptör proteininin ekspresyonu ve saflaştırılması (ligand bağlama alanı), reseptör-prob bağlanması ve kimyasalların reseptör ile rekabetçi bağlanması.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Rekombinant vektörlerin inşası ve dönüşümü

NOT: PPARγ, hedef genleri düzenleyen bir DNA bağlama alanı ve ligandlar tarafından aktive edilen bir ligand bağlama alanı içeren klasik bir nükleer reseptör yapısına sahip ligand'a bağımlı bir transkripsiyon faktörüdür. Ligand aktivasyonu üzerine, PPARγ başka bir nükleer reseptör olan retinoid X reseptörü (RXR) ile bir heterodimer oluşturur ve PPARy'nin yanıt elemanlarına bağlanır, böylece aşağı akış hedef genlerinintranskripsiyonunu düzenler 9,16.

  1. PPARγ-LBD için primerler tasarlayın (bakınız Tablo 1) ve PPARγ-LBD DNA segmentini çoğaltın (bakınız Tablo 2 ve Tablo 3).
  2. His×6 etiketli pET28a vektörünü, kısıtlama endonükleazları XhoI ve BamHI18 ile sindirerek doğrusallaştırın.
  3. Piyasada bulunan klonlama kitini kullanarak PPARγ-LBD DNA segmentini His×6 etiketli pET28a vektörüne klonlayın, bu da rekombinant plazmid pET28a-PPARγ-LBD-6×His18 ile sonuçlanır.
  4. Rekombinant ekspresyon plazmidi pET28a-PPARγ-LBD-6×His protein ekspresyonu için BL21 (DE3) Escherichia coli hücrelerineaktarın 18.
  5. Yetkili BL21 (DE3) hücrelerine 5 μL rekombinant vektör ekleyin, 30 dakika buz üzerinde inkübe edin, 45 s boyunca 42 ° C'de bir ısı şoku uygulayın, ardından hemen buza geri dönün.
  6. 900 μL LB ortamı ekleyin, 37 °C'de 1 saat (160-200 rpm) çalkalayın, ardından oda sıcaklığında 5 dakika boyunca ~3000 x g'da santrifüjleyin.
  7. Süpernatanı atın, bakteri peletini 100 μL LB ortamında yeniden süspanse edin ve katı bir ortama yayın. Plakaları ve kültürü 37 °C'de 12-16 saat ters çevirin.
  8. Sıralama, tanımlama ve müteakip protein ekspresyonu ve saflaştırma için tek tek kolonileri seçin.

2. Reseptör proteininin ekspresyonu ve saflaştırılması

  1. Dönüştürülmüş BL21 (DE3) hücrelerini, 100 μg / mL ampisilin ile desteklenmiş 200 mL LB ortamında, 37 ° C'de 1-2 saat boyunca bir orbital çalkalayıcı (230 rpm) üzerinde inkübe edin.
  2. OD600 , 10 μM izopropil β-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) ekleyerek 0.4-0.6 absorbans birimine ulaştığında hücreleri indükleyin ve 16 ° C'de 16 saat inkübe edin.
  3. Bakteriyel süspansiyonu toplayın ve 8000 × g, 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
  4. Hücreleri 20 μL çözünür lizis tamponunda (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8.0) parçalayın, 200 μL fenilmetilsülfonil florür (PMSF) ve 200 μL lizozim ekleyin. Bakteriyel peleti 5 mL'lik bir pipet kullanarak yeniden süspanse edin, ardından 20 dakika boyunca% 30 güçte sonikasyona devam edin.
  5. Nikel kolonunu dengelemek için kolon hacminin 5 katına eşit lizis tamponu ekleyin. Bu işlemi iki kez tekrarlayın ve bir kenara koyun.
  6. Bakteriyel süpernatan lizatı (CL) elde etmek için sonikasyonlu bakteriyel süspansiyonu 8000 × g'da 4 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin.
  7. Akış (FT) elde etmek için CL'yi nikel kolonuna (protein adsorpsiyonu için) yükleyin.
  8. Yıkama elüatını (W1-W6) elde etmek için sütunu, sütun hacminin 5 katı yıkama tamponu (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8.0) ile yıkayın.
  9. Hedef proteini elüte etmek ve protein fraksiyonlarını (E1-E5) elde etmek için kolonu 1 mL elüsyon tamponu (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8.0) ile yıkayın.
  10. Her fraksiyondan (CL, FT, W1-W6 ve E1-E5) 20 μL'lik bir alikot alın ve Coomassie Brilliant Blue boyama ile SDS-PAGE18 kullanarak analiz edin. PPARγ-LBD, denatüre edici bir jel üzerinde 34.9 kDa'lık bir protein olarak çalışır.

3. Reseptör bağlanma testi

NOT: Bu testte, C1-BODIPY-C12, reseptör-ligand bağlanma sistemini kurmak için bölgeye özgü bir floresan probu olarak kullanıldı. PPAR için spesifik bir ligand olan C1-BODIPY-C12, C1 konumunda yağ asidine dahil edilen BODIPY floresan grubu ile yağ asidinin floresan bir analogudur.

  1. Saflaştırılmış insan PPARγ-LBD'yi Tris-HCl tamponunda (20 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0) 1 nM ila 6400 nM konsantrasyon aralığına seyreltin. Ayrıca, C1-BODIPY-C12 probunu Tris-HCl tamponunda 50 nM'lik bir konsantrasyona seyreltin.
  2. Seyreltilmiş PPARγ-LBD çözeltisini (kuyu başına 55 μL) ve C1-BODIPY-C12 prob çözeltisini (kuyu başına 55 μL) 96 oyuklu siyah bir plakada karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  3. Mikroplaka okuyucu ile floresan polarizasyonunu (FP) ölçün.
  4. FP değerlerini reseptör konsantrasyonuna göre çizin, istatistiksel ve grafik yazılımı kullanarak Hill eğim denklemi ile spesifik bağlamayı kullanarak eğriyi uydurun ve Kd değerini hesaplayın.

4. Rekabetçi bağlayıcı tahlil

NOT: Bu testte, reseptör bağlanması için 800 nM insan PPARγ-LBD ve 50 nM C1-BODIPY-C12 probu kullanıldı. Probun PPARy'ye bağlanması ile rekabet etmek için rosiglitazon (Rosi), trifenil fosfat (TPHP) ve perflorooktansülfonik asit (PFOS) kullanıldı.

  1. Tris-HCl tamponundaki üç bileşiği 0-200 μM arasında bir konsantrasyon aralığında seyreltin.
  2. Reseptör-prob bağlama çözeltisini, 800 nM insan PPARγ-LBD ve 50 nM C1-BODIPY-C12 probu nihai konsantrasyonu ile hazırlayın.
  3. Reseptör-prob bağlama çözeltisini (oyuk başına 55 μL) ve bileşik çözeltiyi (oyuk başına 55 μL) 96 oyuklu siyah bir plakada karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  4. Mikroplaka okuyucu ile floresan polarizasyonunu (FP) ölçün.
  5. FP değerlerini ligand konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizin. Bir grafik ve analiz yazılımı tarafından işlenen sigmoidal modeli kullanarak rekabet eğrisinden her ligandın yarı maksimal inhibitör konsantrasyonunu (IC50) elde edin.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PPARγ-LBD'nin protein ekspresyonu ve saflaştırılması
PPARγ-LBD, BL21'de (DE3) histidin etiketli bir protein olarak heterolog olarak eksprese edildi. Protein, çözünür fraksiyonlarda tespit edildi ve saflaştırılmış PPARγ-LBD, SDS-PAGE üzerinde, proteinin tahmin edilen moleküler ağırlığı ile tutarlı olarak, yaklaşık 34.9 kDa'lık bir görünür moleküler ağırlığa sahip tek bir bant gösterdi (Şekil 2).

C 1-BODIPY-C12 probunun PPARγ-LBD'ye bağlanması
Reseptör bağlanma testinde, PPARyγ-LBD'ye bağlanabilen BODILY etiketli bir yağ asidi olan C1-BODIPY-C12, çevresel kirleticilerin hPPARγ-LBD ile bağlanma gücünü incelemek için bir floresan probu olarak kullanıldı. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, PPARγ-LBD ilavesi üzerine floresan polarizasyon (FP) değerleri 20'den 250'ye yükselmiştir, bu da C1-BODIPY-C12'nin reseptöre bağlandığını gösterir. Bağlanma eğrisi, 253.5 nM ± 10.05 nM'lik bir ayrışma sabiti (Kd) ile 800 nM PPARγ-LBD'de doygunluğa ulaştı. Bu nedenle, sonraki rekabetçi bağlama testleri için 800 nM PPARγ-LBD seçildi.

Çevresel kirleticilerin PPARγ-LBD'ye rekabetçi bir şekilde bağlanması
PPARy'nin spesifik bir agonisti olan rosiglitazon (Rosi), rekabetçi ligand bağlanma deneylerinde floresan probunun yerini almak için pozitif bir kontrol olarak kullanıldı. Şekil 3B'de gösterildiği gibi, Rosi, C1-BODIPY-C12 probunun PPARγ-LBD'ye bağlanmasını, testin fizibilitesini gösteren 6.89 μM'lik bir IC50 ile doza bağlı bir şekilde inhibe etti. Daha sonra, TPHP ve PFOS'un PPARγ-LBD'ye bağlanma afiniteleri belirlendi. Şekil 3C,D'de gösterildiği gibi, TPHP ve PFOS ayrıca C1-BODIPY-C12 probunun PPARγ-LBD'ye doza bağlı bir şekilde, sırasıyla 60.45 μM ve 37.27 μM IC50 değerleri ile bağlanmasını inhibe etti.

figure-results-1
Şekil 1: Floresan polarizasyon (FP) tabanlı reseptör rekabetçi bağlanma testlerinin şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Saflaştırılmış PPARγ-LBD'nin SDS-PAGE analizi. M, protein moleküler ağırlık belirtecidir. Cl hücre lizatıdır, FT akış fraksiyonudur, W1-W6 yıkama çözeltileridir, E1 elüattır ve E2-E4 saflaştırılmış PPARγ-LBD proteinleridir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Floresan polarizasyon (FP) tabanlı reseptör bağlanma eğrisi ve rekabetçi bağlanma eğrileri. (A) C 1-BODIPY-C 12'nin insan PPARγ-LBD'sine FP bazlı bağlanma eğrisi. (B-D) Rosi, TPHP ve PFOS'un İnsan PPARγ-LBD'sine FP tabanlı rekabetçi bağlanma eğrileri. Hata çubukları, üç bağımsız deney için standart sapmayı (SD) gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

KİMLİĞİDevamı
pET28a-İnsan PPARG-P1CAAATGGGTCGCGGATCCATGATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCC
pET28a-İnsan PPARG-P2GTGGTGGTGCTCGAGTCAGTACAAGTCCTTGTAGATCTC
PPARγ-LBD nükleotid dizisiAGACGACATTCCCTCTAGAATAATTTTTTTTTTAACTTTAAGAAGGAGAT
ATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCGGCCTG
GTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAA
TGGGTCGCGGATCCATGATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCCGCTGAC
CTCCGGGCCCTGGCAAAACATTTGTATGACTCATACATAAAGTCCTTCC
CGCTGACCAAAGCAAAGGCGGCGATCTTGACAGGAAAGACAACA
GACAAATCACCATTCGTTATCTATGACATGAATTCCTTAATGATGGGAGA
AGATAAAATCAAGTTCAAACACATCACCCCTGCAGGAGCAGCAA
AGAGGTGGCCATCCGCATCTTTCAGGGCTGCCAGTTTCGCTCCGTGG
AGGCTGTGCAGCACACAGAGTATGCCAAAAGCATTCCTGGTTTTG
TAAATCTTGACTTGAACGACCAAGTAACTCTCCTCAAATATGGAGTCCA
CGAGATCATTTACACAATGCTGGCCTCCTTGATGAATAAAGATGGGGT
TCTCATATCCGAGGGCCAAGGCTTCATGACAAGGGAGTTTCTAAAG
AGCCTGCGAAAGCCTTTTGGTGACTTTATGGAGCCCAAGTTTGAGT
TTGCTGTGAAGTTCAATGCACTGGAATTAGATGACAGCGACTTGGCAA
TATTTATTGCTGTCATTATTCTCAGTGGAGACCGCCCAGGTTTGCTGAA
TGTGAAGCCCATTGAAGACATTCAAGACAACCTGCTACAAGCCCTGG
AGCTCCAGCTGAAGCTGAACCACCCTGAGTCCTCACAGCTGTTTG
CCAAGCTGCTCCAGAAAATGACAGACCTCAGACAGATTGTCACGGA
ACACGTGCAGCTACTGCAGGTGATCAAGACGGAAACCGACATG
AGTCTTCACCCGCTCCTGCAGGAGATCTACAAGGACTTGGACTGG
CTCGAGGCCACCCACCC

Tablo 1: PPARγ ligand bağlama alanının primer ve nükleotid dizisi.

Deneysel Reaktif isimleriHacim / Doz
pET28a-İnsan PPARG-P11 μL
pET28a-İnsan PPARG-P21 μL
2×phanta Max Master Karışımı12,5 μL
cDNA (cDNA)2 μL
ddH2O8,5 μL

Tablo 2: PCR deneysel reaktif sistemi.

Deney adlarıSıcaklıkSaat
Ön denatürasyon95 °C3 dk
denatürasyon95 °C15 Saniye
Tavlama65 °C15 Saniye
Uzantı72 °C6 dk
Mağaza12 °C--

Tablo 3: PCR deneysel reaksiyon programı.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Floresan polarizasyonu (FP), yüzey plazmon rezonansı (SPR) ve nükleer manyetik rezonans (NMR), proteinler ve bileşikler19,20 arasındaki doğrudan bağlanma etkileşimlerini değerlendirmek için kullanılan yaygın tekniklerdir. FP, ilaç keşfi ve kimyasal tarama için moleküler etkileşimlerin araştırılmasında yaygın olarak kullanılmaktadır 21,22,23. Karşılaştırıldığında, SPR ve NMR tahlilleri pahalı ve zaman alıcıdır, bu da onları yüksek verimli tarama (HTS) uygulamaları için daha az uygun hale getirir. Bu protokol, kimyasalların HTS'sini sağlayan çok kuyulu bir plaka algılama sistemi ile FP'ye dayalı bir reseptör-ligand analiz yöntemini tanımlar.

Bir reseptör bağlanma testi için uygun probu seçmek çok önemlidir. Prob iki bileşenden oluşmalıdır: nükleer reseptör için spesifik bir ligand ve bir floresan grubu. Tipik olarak, bu tür problar, bu çalışmada kullanılan C1-BODIPY-C12 probu ile örneklendiği gibi ticari olarak elde edilebilir. C1-BODIPY-C12, BODIPY floresan grubunun C1 pozisyonunda dahil edildiği bir floresan yağ asidi analoğudur ve PPAR için spesifik bir liganddır. Ticari olarak temin edilebilen bir floresan probu bir seçenek değilse, bilinen spesifik bir ligand'a bir floresan grubu eklenerek kimyasal olarak sentezlenmelidir.

Bir nükleer reseptörün klasik yapısı, hedef gen ekspresyonunu düzenlemekten sorumlu bir DNA bağlama alanı ve tipik olarak reseptörün C-terminali24'te bulunan bir ligand bağlama alanı (LBD) içerir. Yardımcı düzenleyici bağlanma bölgesi genellikle nükleer reseptörün transkripsiyonel aktivasyon fonksiyon alanı içinde bulunur ve burada nükleer düzenleyici faktörler25 ile etkileşime girer. Bu koregülatörler, reseptörün transkripsiyonel aktivitesini artırabilir veya baskılayabilir, böylece gen ekspresyonunu modüle edebilir. Reseptör proteininin belirli bir bölgesinde bulunan LBD, ligand bağlanması üzerine reseptörün konformasyonel değişikliklerini düzenler ve bu da transkripsiyonel aktivitesini aktive eder veya inhibe eder. LBD, spesifik küçük moleküllü ligandları24 tanımak ve bağlamak için çok önemli olan iyi tanımlanmış bir alan olduğundan, bu çalışmada reseptör rekabetçi bağlanma testinde sadece reseptör-LBD kullanılmıştır. PPARy'nin ligand bağlayıcı alanının eksprese edilmesini ve saflaştırılmasını içeren bu yaklaşım, tahlil maliyetlerini düşürdü.

Protein saflaştırması için tamponlar, C1-BODIPY-C12 probu ve Tris-HCl dahil olmak üzere bu yöntemde kullanılan reaktifler ticari olarak temin edilebilir ve ucuzdur, bu da test için önemli bir avantajdır. Floresan polarizasyon (FP) tespiti, çok kuyulu bir plakada (96 kuyulu veya 384 oyuklu) gerçekleştirilir ve plaka başına 3-5 dakikalık hızlı okuma süresiyle test verimini ve verimliliğini artırır. Reseptör-ligand bağlanma yaklaşımı oldukça esnektir ve reseptör proteinlerinin mevcut olması koşuluyla çeşitli reseptörlere kolayca uyarlanabilir. Bu uyarlanabilirlik, bu yöntem kullanılarak yürütülebilecek araştırmanın kapsamını genişletir. Genel olarak, bu avantajların kombinasyonu - kullanım kolaylığı, maliyet verimliliği, yüksek verim kapasitesi, hızlı işleme ve reseptör adaptasyonunda esneklik - bu yöntemi toksik çevresel kirleticilerin taranması için umut verici bir seçenek haline getirir.

Mevcut sonuçlar, PFOS ve TPHP'nin PPARy'ye bağlanabileceğini göstermektedir, bu da moleküler yerleştirme ve raportör gen deneylerindenelde edilen önceki bulgularla tutarlıdır 9,26. Ek olarak, bu el yazmasında açıklanan yöntem, çeşitli çevresel kirleticilerin nükleer reseptörlerle bağlanma potansiyelini değerlendirmek için kullanılmıştır. Örneğin, FP bazlı reseptör-ligand rekabetçi bağlanma testi kullanılarak, 19 per- ve polifloroalkil maddenin (PFAS) ve 7 bisfenol A (BPA) bileşiğinin peroksizom proliferatörle aktive edilen reseptör β/δ (PPARβ/δ)7,10, PPARγ 9,13'e 12 PFAS, 7 BPA bileşiği ve 3 partikül madde (PM2.5) bileşenine farnesoid X reseptörüne (FXR)11, 12 ve 8 polibromlu difenil eter (PBDE) ve 6 poliklorlu bifenil (PCB) ile tiroid reseptörüne (TR)14,15 belirlenmiştir. Bu bulgular, çevresel kirleticiler ve nükleer reseptörler arasındaki bağlanma etkileşimlerini taramak için bu yöntemin potansiyelini vurgulamaktadır.

Önceki çalışmalar, tek bir bileşiğin23 bağlanmasını tespit etmek için en az 1,5 saat gerektiren bağlanmayı ölçmek için jel filtrasyonunun kullanılmasını içeren PPARγ için floresan polarizasyon (FP) test yöntemleri bildirmiştir. Buna karşılık, bu yöntem, 10 dakika içinde PPARγ ile en az 12 bileşik için bağlanma afinitelerinin saptanmasına izin verir. Ek olarak, ticari olarak temin edilebilen bazı tahlil kitleri (Malzeme Tablosuna bakınız) 800 × 20 μL formatı için 3000 doların üzerinde fiyatlandırılır. Bu yöntemler özellikle pahalı ve zaman alıcıdır. Bu çalışma, mevcut bu yöntemler üzerinde iyileştirmeler sunmaktadır.

Bu yöntemin potansiyel bir sınırlaması, floresan probunun reseptör için bir ligand olması gerektiği ve floresan problarının çevresel kirleticilerle doğrudan etkileşime girmemesidir. Bu nedenle, prob ve çevresel kirleticilerin çözelti içinde ayrı tutulmasını sağlamak çok önemlidir. Ek olarak, bu test in vitro bir durumu yansıtır ve reseptörler in vivo27 heterodimerik olduğundan in vivo etkileşimleri tam olarak yakalayamaz. Sonuç olarak, bu yöntem hızlı bir tarama aracı olarak hizmet ederken, reseptör aktivasyonunun ve ilgili toksikolojik mekanizmaların in vivo olarak daha fazla araştırılması gereklidir.

Diğer bir dezavantaj, bağlanma afinitesini değerlendirirken floresan polarizasyon (FP) tahlillerinde gözlemlenen "sağa kayma" olgusudur ve bu, ölçülen afinitelerin sistematik olarak hafife alınmasına yol açabilir. Önceki çalışmalarda, rosiglitazonun PPARγ ile bağlanma afinitesi, ligand-reseptör bağlanma afinitesini ölçmek için oldukça hassas bir yöntem olan zamana bağlı floresan rezonans enerji transferi (TR-FRET) testi28 kullanılarak değerlendirildi. Bununla birlikte, TR-FRET tahlili nispeten zaman alıcı ve hantaldır ve tespit edilmeden önce reaksiyon çözeltisinin oda sıcaklığında 4 saatlik bir inkübasyonunu gerektirir. FP testi, TR-FRET testine kıyasla daha düşük hassasiyet göstermesine rağmen, nükleer reseptörlere bağlanan çevresel ligandların yüksek verimli taraması için daha uygundur. Bununla birlikte, FP testi bazı zayıf çevresel ligandları gözden kaçırabilir. Ek olarak, önceki çalışmalarda, PFOS'un PPARγ ile bağlanma afinitesi, ligand-reseptör bağlanma afinitesini ölçmek için oldukça hassas bir başka yöntem olan denge diyalizi (EqD)29 kullanılarak belirlendi. Bununla birlikte, EqD, uygulamasını sınırlayan ve yüksek verimli tarama yeteneklerini engelleyen pahalı analitik ekipmana (LC-MS/MS) güvenir.

Bu floresan polarizasyon (FP) testi, genellikle daha yüksek hesaplanmış IC50 değerleriyle sonuçlanabilecek bir "sağa kayma" fenomeni sergilese de, göreceli afinite sıralamasını veya sonraki risk değerlendirme tahminlerini etkilemez. Ayrıca, FP testi uygun maliyetlidir, zaman açısından verimlidir ve çok çeşitli bileşikleri çoklu nükleer reseptörlere olan afiniteleri açısından tarayabilir. Genel olarak, çevresel ligandların FP tabanlı yüksek verimli taraması, toksik çevresel kirleticilerin hızlı bir şekilde tanımlanmasını kolaylaştırır.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 82103875) tarafından desteklenmiştir.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
C1-BODIPY-C12 ProbThermo Fisher Scientific, Çin102209-82-3PPARγ-LBD'ye bağlanır ve floresan yayar.
Coomassie Brilliant Blue R-250Solarbio, Çin6104-59-2Protein bantlarını boyayın.
GraphPad prizmaDotmaticshttps://www.graphpad.com/features
imidazolSolarbio, ÇinI8090Protein saflaştırma işlemi için tamponlar hazırlayın.
İzopropil β-D-1-tiyogalaktopiranosidSolarbio, Çin367-93-1PPAR&gamma&-LBD ekspresyonunu indükleyin;-LBD
Mikroplaka okuyucuBiotek, ABDSinerji H1 FP değerini algılama
NaClŞangay Reaktifi7647-15-5Protein saflaştırma işlemi için tamponlar hazırlayın.
NaH2PO4 & middot; 2H2OŞangay Reaktifi13472-35-0Protein saflaştırma işlemi için tamponlar hazırlayın.
Ni NTA Boncuk 6FFAkıllı Yaşam Bilimleri, ÇinSA005005Protein saflaştırma.
Menşei 8.5 OriginLab, Northampton, MA, ABD
Perflorooktansülfonik asit (PFOS)J& K Scientific Ltd, Çin1763-23-1Tespit edilen çevresel kirleticiler
Fenilmetilsülfonil florür (PMSF)Solarbio, ÇinP0100Protein bozulmasını engeller.
PPARγ-Rakip Test KitiThermo Fisher ScientificPV6136https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/PV6136
PPARγ-LBD Ligand Tarama Test KitiCayman600616https://www.caymanchem.com/product/600616
Rosiglitazone (Rosi)aladdin, Çin122320-73-4PPAR ve gama'nın agonistleri;
ShakerZHICHENG, ÇinZWY-211CBakteri kültürü genişlemesi ve protein ekspresyonunun indüksiyonu
Trifenil fosfat (TPHP)Macklin, ÇinT819317Tespit edilen çevresel kirleticiler
TrisSolarbio, ÇinT8230Protein saflaştırma işlemi için tamponlar hazırlayın.
TriptonOXOID Limited, ÇinLP0042BLizojeni Et Suyu (LB) ortamı hazırlayın.
Ultrasonik TemizleyiciKimberly, ÇinLHO-1Tam lizis elde etmek için bakterileri bozun
ÜreSolarbio, ÇinU8020Protein saflaştırma işlemi için tamponlar hazırlayın.
Maya özüOXOID Limited, ÇinLP0021BLizojeni Et Suyu (LB) ortamı hazırlayın.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maddela, N. R., Ramakrishnan, B., Dueñas-Rivadeneira, A. A., Venkateswarlu, K., Megharaj, M. Chemicals/materials of emerging concern in farmlands: sources, crop uptake, and potential human health risks. Environ Sci Process Impacts. 24 (12), 2217-2236 (2022).
  2. Naidu, R., et al. Chemical pollution: A growing peril and potential catastrophic risk to humanity. Environ Int. 156, 106616(2021).
  3. Ryu, H., Li, B., De Guise, S., McCutcheon, J., Lei, Y. Recent progress in the detection of emerging contaminants PFASs. J Hazard Mater. 408, 124437(2021).
  4. Alofe, O., et al. Determining the endocrine disruption potential of industrial chemicals using an integrative approach: Public databases, in vitro exposure, and modeling receptor interactions. Environ Int. 131, 104969(2019).
  5. Bajard, L., et al. Endocrine disrupting potential of replacement flame retardants - Review of current knowledge for nuclear receptors associated with reproductive outcomes. Environ Int. 153, 106550(2021).
  6. Chen, Q., Chou, W. C., Lin, Z. Integration of toxicogenomics and physiologically based pharmacokinetic modeling in human health risk assessment of perfluorooctane sulfonate. Environ Sci Technol. 56 (6), 3623-3633 (2022).
  7. Li, C. H., Ren, X. M., Cao, L. Y., Qin, W. P., Guo, L. H. Investigation of binding and activity of perfluoroalkyl substances to the human peroxisome proliferator-activated receptor β/δ. Environ Sci Process Impacts. 21 (11), 1908-1914 (2019).
  8. Li, C. H., et al. Chlorinated polyfluorinated ether sulfonates exhibit higher activity toward peroxisome proliferator-activated receptors signaling pathways than perfluorooctanesulfonate. Environ Sci Technol. 52 (5), 3232-3239 (2018).
  9. Li, C. H., Shi, Y. L., Li, M., Guo, L. H., Cai, Y. Q. Receptor-bound perfluoroalkyl carboxylic acids dictate their activity on human and mouse peroxisome proliferator-activated receptor γ. Environ Sci Technol. 54 (15), 9529-9536 (2020).
  10. Li, C. H., Zhang, D. H., Jiang, L. D., Qi, Y., Guo, L. H. Binding and activity of bisphenol analogues to human peroxisome proliferator-activated receptor β/δ. Ecotoxicol Environ Saf. 226, 112849(2021).
  11. Zhang, D., et al. Binding activity and risk assessment of bisphenols toward farnesoid X receptor pathway: In vitro and in silico study. Sci Total Environ. 869, 161701(2023).
  12. Zhang, D., et al. Fine particulate matter disrupts bile acid homeostasis in hepatocytes via binding to and activating farnesoid X receptor. Toxicology. 506, 153850(2024).
  13. Li, C. H., Ren, X. M., Guo, L. H. Adipogenic activity of oligomeric hexafluoropropylene oxide (perfluorooctanoic acid alternative) through peroxisome proliferator-activated receptor γ pathway. Environ Sci Technol. 53 (6), 3287-3295 (2019).
  14. Qin, W. P., Li, C. H., Guo, L. H., Ren, X. M., Zhang, J. Q. Binding and activity of polybrominated diphenyl ether sulfates to thyroid hormone transport proteins and nuclear receptors. Environ Sci Process Impacts. 21 (6), 950-956 (2019).
  15. Ren, X. M., Li, C. H., Zhang, J. Q., Guo, L. H. Binding and activity of sulfated metabolites of lower-chlorinated polychlorinated biphenyls towards thyroid hormone receptor alpha. Ecotoxicol Environ Saf. 180, 686-692 (2019).
  16. Evans, N., et al. In vitro activity of a panel of per- and polyfluoroalkyl substances (PFAS), fatty acids, and pharmaceuticals in peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) alpha, PPAR gamma, and estrogen receptor assays. Toxicol Appl Pharmacol. 449, 116136(2022).
  17. Kim, S., et al. Triphenyl phosphate is a selective PPARγ modulator that does not induce brite adipogenesis in vitro and in vivo. Arch Toxicol. 94 (9), 3087-3103 (2020).
  18. Matsumoto, H., Haniu, H., Komori, N. Determination of protein molecular weights on SDS-PAGE. Methods Mol Biol. 1855, 101-105 (2019).
  19. Nguyen, H. H., Park, J., Kang, S., Kim, M. Surface plasmon resonance: A versatile technique for biosensor applications. Sensors (Basel). 15 (5), 10481-10510 (2015).
  20. Hu, J., Kim, J., Hilty, C. Detection of protein-ligand interactions by 19F nuclear magnetic resonance using hyperpolarized water. J Phys Chem Lett. 13 (17), 3819-3823 (2022).
  21. LeBlanc, E. V., Shekhar-Guturja, T., Whitesell, L., Cowen, L. E. Fluorescence polarization-based measurement of protein-ligand interaction in fungal cell lysates. Curr Protoc. 1 (1), e17(2021).
  22. Huang, X., Aulabaugh, A. Application of fluorescence polarization in HTS assays. Methods Mol Biol. 1439, 115-130 (2016).
  23. Seethala, R., et al. A rapid homogeneous fluorescence polarization binding assay for peroxisome proliferator-activated receptors alpha and gamma using a fluorescein-tagged dual PPARalpha/gamma activator. Anal Biochem. 363 (2), 263-274 (2007).
  24. Hu, W., et al. Activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma and disruption of progesterone synthesis of 2-ethylhexyl diphenyl phosphate in human placental choriocarcinoma cells: Comparison with triphenyl phosphate. Environ Sci Technol. 51 (7), 4061-4068 (2017).
  25. Weatherman, R. V., Fletterick, R. J., Scanlan, T. S. Nuclear-receptor ligands and ligand-binding domains. Annu Rev Biochem. 68, 559-581 (1999).
  26. Khazaee, M., et al. Perfluoroalkyl acid binding with peroxisome proliferator-activated receptors α, γ, and δ and fatty acid binding proteins by equilibrium dialysis with a comparison of methods. Toxics. 9 (3), 45(2021).
  27. de Vera, I. M. S., et al. Synergistic regulation of coregulator/nuclear receptor interaction by ligand and DNA. Structure. 25 (10), 1506-1518.e4 (2017).
  28. Hendrickson, O. D., Taranova, N. A., Zherdev, A. V., Dzantiev, B. B., Eremin, S. A. Fluorescence polarization-based bioassays: New horizons. Sensors (Basel). 20 (24), 7132(2020).
  29. Liu, C., et al. Identification of a novel selective agonist of PPARγ with no promotion of adipogenesis and less inhibition of osteoblastogenesis. Sci Rep. 5, 9530(2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

High Throughput ScreeningNuclear ReceptorsBinding AffinityEnvironmental PollutantsReceptor Ligand BindingFluorescence PolarizationMicroplate ReaderProtein ExpressionCompetitive BindingPPAR Gamma
Video Coming Soon

Related Articles