Method Article

Kolorimetrik Analiz ile Elastaz Enzim Aktivitesinin Modülasyonunun Ölçülmesi

DOI:

10.3791/67331

⸱

January 17th, 2025

 ,  ,  , 
1Institute for Research, Development and Innovation in Health Biotechnology of Elche (IDiBE), Miguel Hernández University (UMH), 2CIBER, Pathophysiology of Obesity and Nutrition, CIBERobn, Carlos III Health Institute (CB12/03/30038)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, bileşiklerin elastaz aktivitesini inhibe etme veya aktive etme yeteneğini belirlemek için bir kolorimetrik tahlil yönteminin geliştirilmesini açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir serin proteaz olan elastaz, elastin yıkımında önemli bir rol oynar. Elastin, akciğerlerde, deride ve kan damarlarında doku elastikiyetinin korunmasına yardımcı olan hücre dışı bir proteindir. Elastaz aktivitesinin sıkı bir şekilde düzenlenmesi doku homeostazı için çok önemlidir, çünkü düzensizlik amfizem, kırışıklıklar ve ateroskleroz gibi patolojilere katkıda bulunabilir. Doğal olarak oluşan fitokimyasallar gibi bazı bileşikler, terapötik müdahale potansiyeli göstermiş ve önemli ilgi görmüştür. Farklı bileşiklerin elastaz üzerindeki modülatör etkilerinin aydınlatılması, ister inhibitör ister uyarıcı olsun, elastaz ile ilişkili bozuklukları hedef alan yeni terapötik ve kozmetik stratejiler geliştirmek için çok önemlidir. Elastaz aktivitesini ölçmek için yaygın olarak kabul edilen bir yöntem, kolorimetrik elastaz testidir. Bu tahlilde, elastazı parçalamak için spesifik bir substrat kullanılır ve saptanabilir sarı bir bileşik olan p-nitroanilin (pNA) açığa çıkar. Üretilen pNA miktarı, numunedeki elastaz aktivitesini yansıtır ve kolorimetri ile ölçülebilir. Bu tahlil, basitlik, yüksek hassasiyet, hızlı sonuçlar ve çeşitli araştırma ihtiyaçlarına uyarlanabilirlik dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sunar. Kolorimetrik elastaz testi, bileşiklerin elastaz aktivitesini nasıl etkilediğini incelemek için değerli bir araç olmaya devam etmektedir. Kullanım kolaylığı ve etkinliği nedeniyle, bu tahlil bu alandaki araştırmaların temel taşıdır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elastaz, akciğerler, cilt ve kan damarları dahil olmak üzere vücuttaki çeşitli dokulara elastikiyet sağlayan bir protein olan elastinin parçalanmasında çok önemli bir rol oynayan bir serin proteaz enzimidir. Elastaz aktivitesi, doku homeostazını korumak için sıkı bir şekilde düzenlenir ve düzensizlik, amfizem, ateroskleroz ve cilt kırışıklıkları gibi patolojik ve dermal durumlara yol açabilir1.

Her biri belirli özelliklere ve işlevlere sahip birkaç elastaz türü vardır. Nötrofiller tarafından üretilen nötrofil elastazlar, bağışıklık tepkisi ve inflamasyonda önemlidir. Bu enzimler çok ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma için kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. 0.2 M Tris baz reaksiyon tamponunun (RB) hazırlanması

  1. Analitik bir terazi kullanarak ilgili Tris bazını tartın.
  2. Tris tabanını bir behere aktarın ve dereceli bir silindir kullanarak deiyonize su ekleyin.
  3. Tris tabanı tamamen eriyene kadar çözeltiyi manyetik bir karıştırıcı ile karıştırın.
  4. Damla damla 4 N HCl ekleyerek pH'ı 8.0'a ayarlayın. pH'ı izlemek için bir pH metre kullanın.
  5. İstenilen pH'a ulaşıldığında, çözeltiyi hacims....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol tamamlandıktan sonra, ilgili hesaplamaları gerçekleştirmek ve numunelerin elastaz aktivitesini modüle etme kapasitesini ölçmek için gerekli absorbans verileri elde edilebilir. Şekil 3 , farklı kontroller ve numunelerle kuyuların konumunu vurgulamaktadır. Bu örnekte kullanılanlar gibi renkli numuneler söz konusu olduğunda, renk, 410 nm'de pNA'nın sarı renginin ölçümünü engelleyebileceğinden, spektrofotometrik paraziti en aza indirmek için renk kontrolleri eklemek gerekir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut yöntemde, fitokimyasalların elastaz enzimleri üzerindeki modülatör etkileri kolorimetrik bir test kullanılarak incelenmiştir. Elastin yıkımı için çok önemli olan bir serin proteaz olan elastaz, çeşitli organlarda doku elastikiyetinin korunmasında önemli bir rol oynar. Bu çalışmada açıklanan kolorimetrik elastaz testi, elastaz aktivitesini ölçmek için basit, hassas ve hızlı bir yöntem sunar.

Bu bağlamda araştırmacılar, elastaz aktivitesini modüle etme po.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma İspanya Bilim ve Yenilik Bakanlığı (MCIN/AEI/10.13039/501100011033/FEDER, UE; projeler: RTI2018-096724-B-C21, TED2021-129932B-C21 ve PID2021-125188OB-C32) ve Generalitat Valenciana (PROMETEO/2021/059) tarafından finanse edilmiştir. Bu çalışma aynı zamanda İspanyol Hükümeti Biyomedikal Araştırma Resmi Fon Ajansı, Sağlık Enstitüsü Carlos III (ISCIII) tarafından CIBEROBN (CB12/03/30038), Agencia Valenciana de la Innovación: INNEST/2022/103; Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu tarafından ortaklaşa finanse edilmektedir. E.B.-C ve M.H.-L. 2021/2023 hibesi için İspanyol Üniversite Sisteminin Yeniden Yeterliliği ile desteklenmiştir. F.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96 Kuyu Hücre Kültürü PlakasıCorning Incorporated3599Kapaklı düz tabanlı, polistiren
Hücre Görüntüleme Çok Modlu OkuyucuAgilentBioTek Cytation 1Gen5 yazılımı ile kullanılır
Domuz Pankreasından ElastazSigma-AldrichE7885CAS 39445-21-1; 25,9 kDa
İzopropanol %99,5Fisher ScientificAC184130010CAS 67-63-0; C3H8O; 60.10 g/mol
N-Süksinil-(Ala)3-nitroanilidSigma-AldrichS4760CAS 52299-14-6; C19H25N5O8 ; 451,43 g/mol
pH Ölçüm CihazıHach LangesensION+ PH31Manyetik karıştırıcı ve sensör tutucu ile
Fenilmetansülfonil FlorürSigma-AldrichP7626CAS 329-98-6; C7H7FO2S; Moleküler Biyoloji için 174,19 g/mol
TrisPanReac AppliChemA2264CAS 77-86-1; C4H11NO3; 121,14 g/mol

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Imokawa, G., Ishida, K. Biological mechanisms underlying the ultraviolet radiation-induced formation of skin wrinkling and sagging I: Reduced skin elasticity, highly associated with enhanced dermal elastase activity, triggers wrinkling and sagging. Int J Mol Sci. 16 (4), 7753-7775 (2015).
  2. Voynow, J. A., ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Elastase ActivityColorimetric AssayElastin DegradationEnzyme InhibitionSerine ProteasePlant ExtractsMicroplate ReaderTissue ElasticityAbsorbance MeasurementReaction Buffer

Related Articles