Yöntem makalesi

Attine Karıncalarının Bahçelerinin Mikrobiyotası: Elektron Mikroskobunu Tarayarak Mikrobiyal Bir Manzarayı Görselleştirmek

DOI:

10.3791/67334

⸱

4 Ekim 2024

 ,  ,  , 
1Institute of Biosciences, Rio Claro, Department of General and Applied Biology, São Paulo State University (UNESP), 2Plant Pathology and Nematology Department, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, University of São Paulo (USP)

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrobiyota ve biyofilm ile birlikte bitki ve mantar biyokütlesi içeren oldukça heterojen ve hassas numuneleri görselleştirmek için optimize edilmiş bir Taramalı Elektron Mikroskobu protokolü öneriyoruz. Bu protokol, mikrobiyota organizasyonunun mekansal boyutlarının tanımlanmasına izin verir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yağmur ormanları veya mercan resifleri gibi makro ölçekli ekosistemlerde, organizmaların mekansal lokalizasyonu, topluluk ekolojisi anlayışımızın temelidir. Mikrobiyal dünyada, aynı şekilde, mikro ölçekli ekosistemler, organizmaların ve habitatların rastgele ve homojen bir karışımından uzaktır. Mikropların mekansal dağılımına erişmek, mikrobiyotanın işleyişini ve ekolojisini anlamak için esastır, çünkü birlikte yaşayan türlerin etkileşime girme ve birbirlerinin fizyolojisini etkileme olasılığı daha yüksektir.

Krallıklar arası bir mikrobiyal ekosistem, basidiomycete mantarlarını bir besin kaynağı olarak yetiştiren mantar yetiştiren karınca kolonilerinin merkezinde yer alır. Attin karıncaları, süngerimsi bir yapı oluştururken, ekili mantar tarafından metabolize edilen çeşitli substratlar (çoğunlukla bitki bazlı) için yem ararlar, bu da harici bir bağırsak görevi gören bir "mikrobiyal bahçe"dir. Bahçe, substratı metabolize ederek, karakteristik ve uyarlanmış bir mikrobiyotanın kurulması için nişler açarak büyüyen iç içe geçmiş bir mantar hifleri ağıdır. Mikrobiyotanın substrat bozulmasına ve mantar büyümesine katkıda bulunduğu düşünülmektedir, ancak mekansal organizasyonu henüz belirlenmemiştir.

Burada, mantar yetiştiren karıncaların farklı mantar kültürü sistemlerindeki mikrobiyota ve biyofilm mekansal organizasyonunu benzeri görülmemiş ayrıntılarla araştırmak için Taramalı Elektron Mikroskobunu (SEM) nasıl kullandığımızı açıklıyoruz. SEM görüntüleme, mikrobiyotanın mekansal yapısı ve organizasyonunun bir tanımını sağlamıştır. SEM, mikrobiyotanın yaygın olarak mantar yetiştiriciliğindeki mikrobiyal manzaraların yaygın bir yapısı olan biyofilmlerde bir araya geldiğini ortaya koydu. Böylesine karmaşık bir topluluğu düzeltmek, kurutmak, kurutmak, püskürtmek ve görüntülemek için kullanılan protokolleri sunuyoruz. Bu protokoller, bitki ve mantar biyokütlesinin yanı sıra mikrobiyota ve biyofilmi içeren hassas ve heterojen numunelerle başa çıkmak için optimize edilmiştir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekosistemler, belirli bir coğrafi konumdaki (yani çevre) süreçlerle birbirine bağlanan organizmalardan oluşur. Organizmalar zamanla çevreleriyle etkileşime girer ve bu da karmaşık ve heterojen mekansal kalıpların ortaya çıktığı anlamına gelir. Mekansal modelleme, ekolojik çeşitliliği ve istikrarı ve nihayetinde ekosistem işleyişini belirler 1,2,3,4. Sulak alanlar, savanlar, mercan resifleri ve kurak ekosistemler gibi makro ölçekli ekosistemlerde, mekansal modeller kaynak akışı ve konsantrasyonu ile ilişkilidir. Kaynak optimizasyonuna, mekansal heterojenliğe ve modellemeye izin vermek, homojen olanlardan daha esnek ekosistemlerle sonuçlanır2. Topluluk ekolojisinin temelinde yer alan organizmaların mekansal lokalizasyonu, mikrobiyal dünyaya da tercüme edilir.

Mikrobiyal ekosistemler, mikroorganizmalar boyunca rastgele ve homojen bir şekilde karışmış organizmalardan uzakta, işlevlerinin çoğunu tanımlayan mekansal modeller sergiler 5,6,7. Winogradsky sütunlarından çevre ve konakçı ile ilişkili mikrobiyotaya kadar, bu ekosistemler uzayda heterojen bir şekilde düzenlenmiştir ve mekansal düzenlemeler farklı fenotipik tepkileri ortaya çıkarır. Birlikte yaşayan türlerin etkileşime girme ve birbirlerinin fizyolojisini etkileme olasılığı daha yüksektir. Bu nedenle, topluluk mekansal organizasyonu, kendi başına bileşiminden daha fazla, ekosistem özelliklerini ve ekolojik nişleri sınırlar 5,7,8. Bu kavramları açıklamak için, uzamsal desenlemedeki değişiklikler diş plaklarının, çürüklerin, diş eti hastalıklarının 9,10, inflamatuar bağırsak hastalığının11, kistik fibrozun akciğer enfeksiyonlarının, kronik yara enfeksiyonlarının12,13, kolorektal kanserin ve adenomların14 patolojik ilerlemesi ile ilişkili görünmektedir.

Mikrobiyal biyocoğrafya (mikro ölçekte uzay ve zaman boyunca biyolojik çeşitlilik dağılımı ve modelleme çalışması) kapsamında, mikrobiyal ekosistemlerin bilgisi, mekansal kalıplarını kavrayarak büyük ölçüde yararlanılır 6,13,15,16,17. Karizmatik mantar yetiştiren attine karınca (Hymenoptera: Formicidae: Myrmicinae: Attini: Attina) kolonilerinin merkezinde bulunan, böcek yapılı bir mikrobiyal ekosistemin mekansal modellerini inceledik. Leucocoprinae (Basidiomycota: Agaricaceae) kabilesinde veya Pterulaceae (Basidiomycota: Agaricales) familyasında bir basidiomycete mantarı etrafında merkezlenmiş bir "mikrobiyal bahçe" bulunur.18,19,20,21,22. Bahçe, karıncalar tarafından dahil edilen çoğunlukla bitki bazlı substratı metabolize ederek büyüyen iç içe geçmiş bir hif ağından çıkan süngerimsi bir yapıdır (Şekil 1). Bunlar, attine cinslerine göre şunları içerebilir: kuru bitki kısımları, böcek parçaları ve leşleri, taze kesilmiş yapraklar, tohumlar ve çiçek kısımları23,24. Dış otçul bir bağırsağa benzer şekilde, bahçe enzimatik ve kimyasal olarak inatçı polimerleri kararsız besin kaynaklarına dönüştürür ve karıncalara esansiyel amino asitler, lipitler ve çözünür şekerler sağlar 21,25,26,27,28.

Yaprak kesme cinsleri Atta ve Acromyrmex'in bahçeleri için gerçekleştirilen ultrayapısal, enzimatik ve transkriptomik analizler, bu ortamların substrat bozulması ve beslenme yamalarının sürekliliğini yapılandırdığını göstermektedir 26,29,30,31,32. Bahçenin genç kısımları, parçalandıktan sonra yeni eklenen alt tabaka nedeniyle daha koyu olma eğilimindedir. Yakın zamanda eklenen bu substratlar genellikle karınca işçileri tarafından kesilen ve misel kümeleri ile aşılanan kenarlardan kolonize edilir. Kesilmiş kenarlardan yayılan mantar hifleri substrat üzerine yayılır 29,32,33. Substrat bozunması ilerledikçe hif bolluğu artar, bu da beyazımsı ve metabolik olarak aktif bölgelerle sonuçlanır 30,31,32. Daha fazla bozulmuş substrat ve bol miktarda mikrobiyota29,32 içeren daha eski bölgeler, kahverengimsi tonlar ve daha yüksek nem sunma eğilimindedir. İşçiler bu bölgenin parçalarını çıkarır, onları atık yığınlarına ayırırlar ve burada mantar simbiyotuna zarar veren substratları da alırlar 34,35,36. Atık yığınları, bahçeden fiziksel olarak ayrılmış olmasına rağmen, bol miktarda yaşayan mikrobiyota 29,32,37,38,39 tarafından sürekli substrat bozulması ve besin döngüsünün bir noktasıdır.

Esas olarak Enterobacter, Klebsiella, Pantoea, Pseudomonas ve Serratia'dan oluşan bir mikrobiyota da bahçede yaşar ve görünüşe göre çeşitli attine mantar kültür sistemleri tarafından paylaşılır. Mantar metabolizmasını tamamlayabilecek metabolik yolları kodlayan mikrobiyota, bahçenin fizyolojik tepkilerine potansiyel olarak katılır 40,41,42,43,44. Metagenomik veriler sadece mikrobiyotanın orada olduğunu göstermeklekalmadı 41,42, aynı zamanda yaprak kesen karıncaların mantar kültürünün Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) analizi, bitki substratı üzerinde çoğunlukla çubuk şeklindeki bakterileri gösterdi32. Bakteriler (selülolitik suşlar dahil) tüm bahçeden izole edilmiş olsa da, yalnızca bahçenin eski kısımlarında ve atık yığınlarında ve ayrıca kurucu kraliçeler tarafından taşınan ilk peletlerdegörüntülendi 29,32. Mikrobiyotanın metabolik kapasitelerinin42 önerdiği ve in vitro44'te gözlemlendiği gibi in vivo (yani bahçede ve atıkta) biyofilm oluşturup oluşturamayacağı da belirsizdi.

Burada, mikrobiyota-substrat ve mikrobiyota-hiflerin fiziksel etkileşimlerini detaylandırarak, bahçe bölgelerindeki mikrobiyota mekansal organizasyonunu daha iyi anlamak için SEM'i kullandık. SEM, daha büyük odak derinliğine sahip görüntüler sağlayarak, üç boyutlu mikroskobik yapıların yüksek çözünürlükte gözlemlenmesine izin vererek, bahçe mikrobiyotası mekansal modellerinin kapsamlı bir analizini sağlar. Bu tür heterojen ve hassas mantar bazlı örnekleri düzeltmek, kurutmak, kurutmak, püskürtmek ve görüntülemek için adımları detaylandırıyoruz. Osmiyum tetroksit (OsO4) kullanarak postfiksasyon adımını kaldırarak ve dehidrasyon süresini azaltarak, SEM analizi için bahçe ve atık numunelerinin hazırlanması için 32,33,45 protokollerini basitleştirdik. Bu uyarlanmış protokol, hifal yapısal modellerin yanı sıra mikrobiyota ve biyofilm mekansal organizasyonunu korur ve diğer hassas mikrobiyal ekosistemlere ve biyofilmlere uygulanabilir.

figure-introduction-1
Şekil 1: Attine mikrobiyal bahçeleri. Bahçe, karıncalar tarafından dahil edilen çoğunlukla bitki bazlı substratı metabolize ederek büyüyen iç içe geçmiş bir hif ağından kaynaklanan sünger benzeri bir yapıdır. Ayrıca bahçede yaşayan, mantar metabolizmasını tamamlayabilecek metabolik yolları kodlayan mikrobiyota da bulunur. Metagenomik veriler ve önceki Taramalı Elektron Mikroskobu analizi, mekansal organizasyonu ve substrat ve mantar hifleri ile fiziksel etkileşimleri hakkında çok az bilgimiz olmasına rağmen, varlığını gösterdi. Mikrobiyota ve biyofilm mekansal organizasyonunu ve modellemesini ortaya çıkarmak için SEM'i kullandık. Mariana Barcoto'nun çizimleri (Barcoto ve Rodrigues 94'ten uyarlanmış bahçe ve mikrobiyota) ve Mariana Barcoto ve Enzo Sorrentino'nun fotoğrafları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Örnekleme alanı kolonileri

NOT: Karınca kolonilerini toplarken, toplamadan önce yerel mevzuatın gerektirdiği tüm izinlerin alındığını onaylayın. Bizim durumumuzda, #74585 toplama izni Instituto Chico Mendes de Conservação e Biodiversidade (ICMBio) tarafından verilmiştir. Numuneler bir laboratuvar kolonisinden geldiğinde, bölüm 2'ye gidin.

  1. Koloniyi bulun ve işaretleyin. Bahçe odası açığa çıkana kadar yuva alanını çevreleyen bir hendek kazın (Şekil 2A).
    NOT: Bazı attine türleri kolonilerini yaprak çöpünün altına veya çürümüş kütüklerin içine inşa edebilir. Bu gibi durumlarda, çöpü dikkatlice döndürün veya numuneleri toplamak için kütükleri dikkatlice kırın. Çeşitli attine karınca türlerinin canlı kolonilerinin bulunması, toplanması ve bakımı hakkında ayrıntılı bilgi için Sosa-Calvo ve ark.46'ya bakınız.
  2. Toprağın bahçe yüzeyine düşmesini önlemek için bahçe odasını yanlamasına açın. Bahçe büyüklüğüne bağlı olarak entomolojik forseps, kaşık veya mutfak kepçesi kullanarak bahçe örneklerini dikkatlice toplayın.
    NOT: Toplamadan önce aletleri sterilize ettiğinizden emin olun. Yaprak kesen karıncaların bahçelerini toplarken, işçi ısırıklarını önlemek (veya en azından azaltmak) için kalın kumaş eldivenler giyin. Diğer attin türleri için kumaş eldivenler isteğe bağlıdır.
  3. Bahçe numunelerini, bahçenin nemini dengelemek için bir sıva tabakası içeren temiz bir plastik alıcıya aktarın. Bahçe ve karınca işçilerini aktardıktan sonra, numunenin kurumasını önlemek için alıcıyı hava geçirmez şekilde kapatın. Bahçe numunelerini işlenene kadar 23-25 °C'de saklayın.
  4. Açmayı daha önce çıkarılmış toprakla kapatın.

figure-protocol-1
Şekil 2: Numune hazırlama protokolü. (A) Tarla kolonilerinden numune alınması. (B) Numune işleme. (C) Numune hazırlama için kısa temeller ve iş akışı: 1. Sabitleme: numune yapısını güçlendirmek ve korumak için. 2. Dehidrasyon: numunelerin su içeriği etanol ile değiştirilir. 3. Kritik nokta kurutma: sıvı CO2 etanolün yerini alır ve buharlaştırılır. 4. Montaj: analiz için görüntülenen örnek. 5. Altın ile püskürtme kaplama: numune şarjını önleyin. 6. Görüntüleme. İllüstrasyonlar ve fotoğraflar Mariana Barcoto'ya aittir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Reaktifler

NOT: Aşağıdaki çözümlerin önceden hazırlanması gerektiğini unutmayın.

  1. 0.2 M sodyum kakodilat tamponu hazırlayın. Bunun için 42.8 g sodyum kakodilatı 800 mL damıtılmış su içinde çözün, çözünene ve 7.2'de pH stabilizasyonuna kadar karıştırın (gerekirse pH'ı hidroklorik asit kullanarak ayarlayın). Damıtılmış su ekleyerek çözeltinin hacmini 1 L'ye yükseltin. Solüsyonu 4 °C'de saklayın (~ 1 ay).
    DİKKAT: Gluteraldehit ve paraformaldehit toksiktir ve çeker ocak içinde ele alınmalıdır. Bu tür reaktifleri kullanırken her zaman nitril eldiven ve koruyucu gözlük kullanın.
  2. Karnovsky'nin fiksatifini hazırlayın (Karnovsky'den değiştirilmiş)47. Bunun için 25 mL 0.2 M sodyum kakodilat tamponuna 10 mL % glutaraldehit sulu çözeltisi ve 10 mL paraformaldehit sulu çözeltisi ekleyin ve karıştırın. 1 mL 0.1 M kalsiyum klorür (CaCl2) ekleyin ve damıtılmış su ekleyerek hacmi 100 mL'ye yükseltin. Solüsyonu 4 °C'de saklayın (1 aya kadar).
    DİKKAT: Karnovsky fiksatifi solunduğunda zararlıdır ve cilt ve göz tahrişine neden olabilir. Bu nedenle, yalnızca açık havada veya iyi havalandırılan bir alanda kullanarak buharları solumaktan kaçının. Solüsyonu tutarken her zaman nitril eldiven ve koruyucu gözlük kullanın.














Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, mantar hifleri, substrat, mikrobiyota ve biyofilmler gibi attine bahçesi ve atık örneklerinin bileşenlerini görselleştirmek için basitleştirilmiş bir protokol sunduk. SEM, bahçenin ve atığın mikrobiyotanın yapısal modellerini nasıl iskele kurduğuna dair anlayışımızı geliştirmiştir (Şekil 3). Attine bahçelerinde, mantar hifleri, substrat yüzeyinin bazı kısımlarını kaplayan dal benzeri yapılardır. Mantar hifleri dehidrasyona ve yırtılmaya karşı çok hassas olma eğiliminde olduğundan, kullanıcı, numune hazırlamanın sonuçlarını değerlendirmek için hif yönü tarafından yönlendirilebilir. Daha önceki eserlerdede görüldüğü gibi 32,33,45, hifler boru şeklinde bir görünüm sergiler; Sağlam, tüp şeklindeki hifler, etkili bir numune hazırlığını gösterir (Şekil 3A ve Şekil 4C). Hifler şerit şeklinde olduğunda, bu tür bir düzleştirme muhtemelen tekniğin bir eseridir (Şekil 4C).

Bitki substrat yüzeyleri, kütikül ve epidermal tabakaların yanı sıra stomalar ve trikomlar tarafından tanınabilir. Bu tür yapılar, substratlar henüz mantar hifleri ve mikrobiyota tarafından kolonize edilmediğinde daha tanınırdır (Şekil 3A ve Şekil 4C). Substrat kolonize olduğunda, mikrobiyota ve/veya mantar hifleri, belirli bitki yapılarının kolayca fark edilemeyeceği şekilde yüzeyini kaplar (Şekil 3A). Mikrobiyota, mantar hiflerini veya substratı, bunların her biri görünüşte farklı mekansal organizasyonda kolonize edebilir. Şekil 3'te, bu tür uzamsal desenler şematik olarak gösterilmiş ve tanımlandıkları ilgili SEM görüntülerinde kutulanmıştır; bu, SEM sonuçları ile yorumlanması arasındaki bağlantıyı kolaylaştırabilir.

Hifal kolonize edici mikrobiyota daha az sıklıkta görülür ve bulunduğunda izole edilmiş veya hifal yüzeye yapışık küçük gruplar halinde meydana gelen çubuk veya kokoid hücrelerden oluşur. "Dantel kumaş" yapısına benzeyen biyofilm ekzopolisakkaridik matriks (EPS), küçük kümeler halinde hifleri çevreleyebilir (Şekil 3A). Oldukça yaygın olanı, farklı attine karınca türlerinin bahçelerinde bulunan substrat kolonize eden mikrobiyotadır. Kolonizasyon modelleri, bir dereceye kadar substrat bozulma aşamaları tarafından tanımlanmış gibi görünmektedir. Bu nedenle, henüz bozulmamış substratları kolonize ederken, mikrobiyota ya tek tek hücreler halinde ortaya çıkabilir ya da küçük gruplar halinde toplanabilir. Mikrobiyota, mikroskobik bozulma belirtileri gösterdiğinde (yani, bitki kütiküler/epidermal tabakaları ve diğer bitki yapıları fark edilemediğinde ve oluklar ve girintiler bol olduğunda) substratı katmanlayabilir.

Bu "mikrobiyal matlarda", EPS matrisi olmadığında hücrelerin morfolojisi daha tanınır. Mikrobiyal hücrelerin EPS matrisine gömülü olduğu durumlarda, morfolojileri kolayca ayırt edilemez. Mekansal organizasyonlarına göre, biyofilmleri "yayılmış" veya "3 boyutlu" olarak nitelendirdik. Biyofilm yayıldığında, mikrobiyal hücreler ve EPS matrisi aralıklı olarak substrat yüzeyini kaplar ve 1-3 hücre kalınlığında düz bir tabaka oluşturur (Şekil 3B). Biyofilm 3 boyutlu olduğunda, mikrobiyal hücreler ve EPS matrisi birikerek birkaç hücre kalınlığına sahip kümeler oluşturur. Bozulmuş substratların oluşturduğu bahçe bölgeleri (eski bahçe ve atıklar gibi) mikrobiyotayı kalın topluluklar oluşturdukları oluk ve girintilerde barındırır (Şekil 3C). Özellikle, atık örneklerindeki yoğun şekilde bozulmuş substratlar, tüm bölgeler arasında morfolojik olarak en çeşitli olan bol miktarda mikrobiyota barındırır. Mayalar, biyofilm yoluyla prokaryotlarla fiziksel olarak etkileşime girerek bu topluluğa daha fazla karmaşıklık katar. Atta sexdens ve Acromyrmex sp. atık örneklerinde, EPS matrislerinin, çubuk şekilli ve kokoid prokaryotların yanı sıra fusiform ve küresel mayaları çevreleyen göze çarpan bir fibriller ağ örgüsü oluşturduğu gözlenmiştir (Şekil 3C).

İç içe geçmiş bir hif ağından kaynaklanan bahçenin süngerimsi yapısı, numuneyi daha eşit bir şekilde kaplamak için ek püskürtme gerektirir. Bu tür adımlar, görüntüyü bozan ve çözünürlüğünü engelleyen elektron saçılmasını önler (Şekil 4A). Numune hazırlama adımları, mikrobiyotanın mekansal dağılımını ve organizasyonunu ortaya çıkararak bahçe yapısının çoğunu korumuştur. Bununla birlikte, mantar hifleri ve EPS matrisi gibi yapıların dehidrasyona karşı çok hassas olduğunu ve özellikle SEM için korunmasının çok zor olduğunu tekrarlamakta fayda var. Hif yapısı nispeten iyi korunmuştur, ancak bazı bahçe örneklerinde görselleştirilen biyofilmin EPS matrisinin bazı yapısal bileşenlerinden yoksun olabileceğini düşünmek mantıklıdır. Bazı örneklerde mikrobiyotayı saran polisakkaritlerin en dış düzgün tabakası korunmuş olsa da (Şekil 3A, B), bazılarının mikrobiyota morfolojik özellikleri korunmuş ancak EPS matrisi yoktu. Bununla birlikte, EPS matrisinin gerçekten eksik olup olmadığı veya numune hazırlama sırasında çıkarılıp çıkarılmadığı açık değildir.

Bir yandan, biyofilm pürüzsüz tabakasının çıkarılması, kesin biyofilm yapısının anlaşılmasını bozar. Öte yandan, ana araştırma odak noktamız olan katmanın altında bulunan hücrelerin morfolojisini, mekansal organizasyonunu ve fiziksel etkileşimlerini ortaya koymaktadır. Önceki çalışmalar, birincil fiksatif olarak osmiyum tetroksit (OsO4) buharı kullanılarak hem mantar hiflerinin hem de biyofilm matrisinin korunduğunu bildirmiştir 44,50,51,52,53,54. Daha sonra, biyofilmlerin pürüzsüz yönünü görünüşte koruyan OsO4 buharı ile taze bahçe örneklerini sabitleyen karşılaştırmalı bir deney yaptık (Şekil 4B). Bununla birlikte, bu yöntem, hiflerin ve mikrobiyotanın geniş ölçüde düzleşmesine neden oldu. Bu düzleşme, daha önce 29,33,32,45 olarak tanımlanan bahçenin genel mekansal yönlerinin kaybolmasına neden olmuş ve böylece bahçe yapısal desenleri üzerine daha fazla çalışmayı sınırlamıştır. OsO4 ile sabitleme, hem mikrobiyal morfolojiyi ve dağılımı ayırt etmeyi hem de hücre yapılarını teknik eserlerden ayırt etmeyi zorlaştırdı, böylece veri yorumlamayı zorlaştırdı.

figure-results-1
Şekil 3: Mikrobiyota mimari desenleri. Mikrobiyota, mantar hiflerini ve substratı farklı mekansal organizasyonda kolonize eder. Bu tür uzamsal desenler şematik olarak gösterildi ve tanımlandıkları ilgili SEM görüntülerinde kutulandı (şekilde beyaz karelerle sınırlandırılmıştır): (A) Hifal kolonize edici mikrobiyota, bazı örneklerde tespit edilebilen biyofilm ekzopolisakkaridik matris ile izole edilmiş veya küçük hücre gruplarından oluşur. (B) Substrat kolonize eden mikrobiyota substrat boyunca yayılır ve EPS matrisi, morfolojileri kolayca ayırt edilemeyecek şekilde hücreleri kaplar. (C) Mono veya çok morfolojik biyofilmler oluşturan, bazı durumlarda EPS matrisini kanıtlayan, 3 boyutlu gruplar oluşturan substrat kolonize mikrobiyota. İllüstrasyonlar Mariana Barcoto'ya aittir. Kısaltma: EPS = ekzopolisakkaridik matris. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 4: Sonuçsuz görüntüleme. Etkisiz sonuçlar veren ve/veya mimari desenlerin yorumlanmasını engelleyen düşük kaliteli görüntüler. (A) Elektron saçılması görüntüyü bozar, çözünürlüğünü ve sonuç olarak morfoloji tanımlamasını engeller. Bu, yalnızca bir kez püskürtülerek kaplanmış numunelerde sıklıkla gözlendi ve ek kaplama ile azaltıldı. (B) Taze bahçe numunelerinin birincil fiksatif olarak osmiyum tetroksit (OsO4) buharı ile sabitlenmesi 44,50,51,52,53,54 görünüşe göre biyofilmlerin pürüzsüz yönünü korumuştur. Bununla birlikte, geniş hif ve mikrobiyota düzleşmesine neden olarak bahçe mimari desenlerine zarar verdi. (C) Karnovsky'nin fiksatifi kullanılarak yapılan numune hazırlama, OsO4 kullanan preparatlarla karşılaştırıldığında, hif yapısının, mikrobiyota dağılımının ve bahçelerin mekansal modellerinin çoğunu koruyarak daha yüksek kaliteli görüntüler verdi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SEM, numuneyi taramak için bir elektron ışını kullanır ve üç boyutlu mikro yapıları yüksek çözünürlükte görselleştirebilecek şekilde büyütülmüş bir görüntüsünü oluşturur. SEM yüksek vakum altında çalıştığından, numunelerden %99'a kadar/daha fazla suyun uzaklaştırılması gerekir. SEM vakum odasının içinde, kısmen hidratlanmış numuneler, saçılan elektronların yanı sıra dehidre olabilir ve çökebilir. SEM'de yüksek çözünürlüklü görüntüleme için, numune hazırlama, hacim ve morfolojideki değişiklikleri minimumda tutarken suyun uzaklaştırılmasına yönelik prosedürlerin yanı sıra görüntüleme sırasında şarjı önlemek için kaplamayı içermelidir 55,56,57.

İlk olarak, numune, çeşitli tekniklerle elde edilen proteinlerini ve nükleik asitlerini çapraz bağlayarak kimyasal olarak sabitlenir. Yaygın olarak kullanılan bir yöntem, gluteraldehit ve formaldehitin (veya paraformaldehitin) piperazin-1,4-bis [2-etansülfonik asit] (PIPES) gibi bir tamponda birleştirilmesini içerir; N-[2-hidroksietil]-piperazin-N'-2-etansülfonik asit (HEPES); fosfat tamponlu tuzlu su (PBS); veya sodyum kakodilat. Kimyasal fiksasyon, kurutma için yapısını koruyarak numuneyi güçlendirir. Doğalarına bağlı olarak, numuneler ikincil bir fiksasyona (osmiyum tetroksitte) ve hatta üçüncül bir fiksasyona (uranil asetatta) ihtiyaç duyabilir. İkincisi, numuneler susuz bırakılmalıdır. Havayla kurutma, ince yapıların kapsamlı bir şekilde çökmesine neden olduğundan, yaygın bir alternatif teknik kritik nokta kurutmadır (CPD). CPD'de, numune yüzey gerilimine tabi tutulmaz, bu da artefaktların oluşmasını önler. Bir yandan su, 228,5 bar ve 374 °C'deki kritik noktaya ulaşır ve bu da numuneyi kolayca tahrip eder. Öte yandan, CO2 kritik noktası 73,8 bar ve 31 °C'dir ve bu da geçiş sıvısı olarak kullanımını haklı çıkarır. Sıcaklık arttırılırken, CO2 gaz formuna dönüştürülür venumune 58,59,60,61,62,63'ten uzaklaştırılır. Üçüncüsü, iletken olmayan numuneler, yüklenmelerini önlemek ve ikincil elektron verimini artırmak için kaplanmalıdır, bu da sonuç olarak keskin görüntü sinyallerinin elde edilmesine katkıda bulunur64.

Burada sunulan protokol, mantar bazlı numunelerin 32,33,45,65,66,67,68 ve biyofilmlerin 69,70 korunmasına yönelik prosedürleri birleştirir, ancak postfiksasyon adımlarını kaldırarak ve dehidrasyon süresini azaltarak süreci basitleştirir. Yine de, hassas bahçe yapısını korudu, mikrobiyotanın fiziksel etkileşimlerini daha da detaylandırdı ve biyofilm mekansal yapısını ortaya çıkardı. Mikrobiyota mekansal montajı, hem etkileşimlerin kurulması hem de düzenleyici kalıplarının belirlenmesi için gereklidir. Mekansal dağılım, içsel özelliklerin ortaya çıkabileceği mikrobiyal sosyal dinamikleri şekillendirir. Bunlar, mikrobiyal ekosistemlerde karşılaşılan değişkenlik ve karmaşıklıkla başa çıkmak için gereklidir 71,72,73. Bulgularımız, mikrobiyotayı bahçe yapısal modellerini entegre ederek fizyolojik tepkilere varsayılan katılımlarını destekleyerekgüçlendirmektedir 32,42,43,44. Biyofilmlerin attin mantar kültüründeki mikrobiyal etkileşimlerle ilgili olduğuna dair yerinde kanıt sağladık42,44. Biyofilmler, kendi kendine salgılanan bir EPS matrisine gömülü mikroorganizmaların sosyal ağlar oluşturduğu karmaşık ve heterojen çok hücreli sistemlerdir. İşbirlikçi ve/veya antagonistik olarak, biyofilm içindeki etkileşimler nişlerin açılmasını, işgalini ve modifikasyonunu belirler 71,72,73,74. SEM, mikrobiyota-substrat ve mikrobiyota-hiflerin fiziksel etkileşimlerini detaylandırarak, bahçe bölgeleri boyunca mikrobiyota mekansal organizasyonunun daha fazla anlaşılmasına izin verirken, bu alanda yapılacak araştırmalar için yöntemleri basitleştirdi.

Bahçe mikrobiyotası üzerine yapılan araştırmalar, özellikle bu eşsiz toplulukların 75,76 bileşimini şekillendirebilecek süreçlere, işlevlerine ve etkileşimlerine42,43,44 odaklanarak artan bir ilgi görmektedir. Bakteriyel-fungal ürün etkileşimleri, mantarın fosfatı çözündürmesine, sideroforlar üretmesine ve selüloz ve kitini parçalamasına yardımcı olabilir. Bir karşılıklılık-antagonizma sürekliliği olarak ortaya çıkabilecek bu tür etkileşimler, bahçenin işleyişini düzenleyebilir44. Burada sunduğumuz metodolojik yaklaşım, etkileşimlerin gerçekleşebileceği yapısal boyuta yerinde bakmayı sağlar. Halihazırda incelenmiş mikrobiyal ekosistemlerin çoğunda olduğu gibi, attine bahçelerinin desenli, uzayda heterojen olarak organize edilmiş olduğunu vurgulamaktadır 5,7,8. SEM, siyanosüngerler77, kambur balina derisi78, mantarlar66, cnidarians79, insan bağırsağı80, likenler81 gibi çeşitli konakçı ile ilişkili topluluklarda mikrobiyota dinamikleri hakkında yerinde mekansal perspektif sağladı ve ayrıca plastisferi (yeni bir antropojenik olarak türetilmiş ekosistem) tanımlamaya katkıda bulundu82. Bununla birlikte, bu çalışmaların her biri, numune hazırlama için biraz farklı bir aşamalı yöntem kullanmıştır.

Bahçe örnekleri oldukça hassas ve heterojendir, mantar hiflerininsu 26 kaybetmemek için uyarlandığı düşünülür, ayrıca çeşitli birleşik substratlar24, mikrobiyota ve biyofilmi. Yine de, uyarladığımız numune hazırlama protokolü bu tür yapıların çoğunu korudu ve mikrobiyota mekansal yapısının karakterizasyonunu genişletmemize izin verdi. Karnovsky'nin çözümüyle fiksasyonun protokoldeki kritik adım olduğunu düşünüyoruz, çünkü bu kadar hassas bir numunenin 3 boyutlu yönü bu noktada çökebilir ve/veya düzleşebilir. Karmaşık mantar bazlı numuneler genellikle glutaraldehit ile fikse edilerek ve OsO4 65,66,67,68 ile son fikse edilerek SEM için hazırlanır. Bununla birlikte, aldehitlerin (paraformaldehit ve glutaraldehit) birleştirilmesinin SEM69,70 için biyofilm korumasını iyileştirdiği bildirilmiştir. Biyofilmleri koruma yöntemleri ayrıca ilk Karnovsky fiksatifine %0.15 Alcian Blue veya %0.15 Rutenyum Kırmızısı ve ayrıca postfiksasyon için %1 tanik asit ila %1 osmiyum içerebilir. Attine bahçelerinin ve atıkların Karnovsky'ninkiyle sabitlenmesi ve OsO4 ile son sabitleme, eski bahçe ve atık örneklerinde korunmuş bakteriler, ancak biyofilm32'yi kanıtlamaz. Örneklerimizde, önceki protokoller 32,33,69,70'de kullanılan osmiyum postfiksasyon basamağı olmadan bahçe yapısı, mikrobiyota ve biyofilmler korunduğundan, bu basamağı kaldırarak protokolü basitleştirmeyi tercih ettik. OsO4, (özellikle) lipidik hücre bileşenlerini83 sabitlemek için kullanılan bir oksitleyici ajandır. Oldukça aşındırıcı olduğu için OsO4, solunduğunda veya yutulduğunda solunum veya gastrointestinal sisteme zarar vermenin yanı sıra cilt ve mukoza ile temas ettiğinde ciddi yanıklara neden olabilir84,85. Protokol, OsO4 sonrası fiksasyonu kaldırarak, manipüle edilecek toksik vekillerin sayısını sonuç olarak azaltır.

Ayrıca, hassas numuneler için çok sert olabilecek aseton kullanmak yerine etanol yıkama serisini öneriyoruz86. 10 dakikalık adımlarla etanol yıkama serisi, görüntü çözünürlüğünü bozmadan eski SEM protokollerini45 de basitleştirir. Ayrıca, ek püskürtme adımlarının, test ettiğimiz tüm türlerin bahçe örnekleri için tutarlı olan daha yüksek kaliteli görüntüler oluşturduğunu ampirik olarak doğruladık. Bu tür ek adımlar muhtemelen numuneleri daha eşit bir şekilde kapladı, çünkü elektron saçılımı yalnızca bir kez kaplanmış numunelerde çok daha sık görüldü (Şekil 4A). Bu nedenle, bahçe örneklerinde biyofilm görselleştirme için gelişmiş bir protokol oluşturabilecek katkı maddelerini ve koşulları test eden gelecekteki çalışmaları teşvik ediyoruz.

SEM, yüzeylerdeki mikrobiyota hücresel morfolojisini ve EPS mekansal düzenlemesini detaylandırmak için güçlü bir araçtır, bahçe örneklerinin topografyasını ve dokusunu yüksek çözünürlük ve büyütmedeortaya çıkarır 70,87. Yine de, topluluk üyeleri için taksonomik ayrımcılık sağlamaz ve sonuç olarak kimin nerede olduğuna dair bir ayrımımız yoktur. Ayrıca, SEM'in geniş odak derinliğine rağmen, numunenin 3 boyutlu özellikleri hakkında bilgi vermez. Taksonomik biyocoğrafya ve 3 boyutlu uzamsal çözünürlük dahil olmak üzere attine mikrobiyal bahçesinin tam bir tanımı için, SEM analizi, bahçe örnekleri için aşamalı görüntüleme tekniklerinde ilk prosedür olarak düşünülebilir. Taksonomik çözünürlük için SEM, floresan in situ hibridizasyon (FISH)88,89 ve yüksek filogenetik çözünürlüklü FISH (HiPR-FISH)90, kombinatoryal etiketleme ve spektral görüntüleme FISH (CLASI-FISH)9,91 ve 3 boyutlu projeksiyonlar92 gibi varyantları ile birleştirilebilir. Üç boyutlu mikroyapı analizi, X-ışını mikrotomografisi (X-ışını μCT)93 ile daha da detaylandırılabilir. Şimdiye kadar SEM, hifleri çevreleyen ve substrat yüzeyinde, oluklarda ve girintilerde mikrobiyota mekansal organizasyonunu ayrıntılı olarak gözlemlememizi sağladı. Bu tür mikrobiyal modelleme, attine bahçelerindeki varsayılan mikrobiyal etkileşimler hakkındaki bilgimizi oluşturuyor. Sunduğumuz hazırlık adımlarının, diğer hassas mikrobiyal ekosistemlerdeki mikrobiyal mekansal organizasyon üzerine yapılan çalışmaları iyileştirmek için yaygın olarak uygulanabileceğine inanıyoruz.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, mali destek sağladığı için Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo'ya (FAPESP) teşekkür eder (Hibe #2019/03746-0). MOB, FAPESP (süreç 2021/08013-0) ve Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brezilya (CAPES) - Finans Kodu 001'den alınan doktora bursu için teşekkür eder. AR ayrıca Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico'ya (CNPq) bir araştırma bursu için teşekkür eder (#305269/2018). Yazarlar, numune hazırlama için pilot testlere yardımcı oldukları için Marcia Regina de Moura Aouada ve Antonio Teruyoshi Yabuki'ye, teknik yardım için Renato Barbosa Salaroli'ye ve fotoğraf çekiminde yardımcı olduğu için Enzo Sorrentino'ya teşekkür eder. Bu çalışma, erişim genetik miras yetkilendirmesi # SISGen AA39A6D kapsamında gerçekleştirilmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2 mL tüpAxygenMCT-200-C-BRANumuneleri sabitlemek ve kurutmak için
Kalsiyum klorür susuzMerckC4901CaCl2 Karnovsky'yi hazırlamak için susuz s sabitleyici
Kritik nokta kurutucuLeicaEM CPD 300Kritik nokta kurutma için
Çift Taraflı Karbon İletken Bant, 12 mm (G) X 5 M (U)Elektron Mikroskobu Bilimleri77819-12Numuneleri monte etmek için
Entomolojik forsepsBelirli bir tedarikçiBahçe örneklerini manipüle etmek için
Etil alkol (=etanol), saf (≥ %99,5)Sigma-Aldrich459836Dehidrasyon
forsepsBelirli bir tedarikçiBahçe örneklerini manipüle etmek için
Cam beherBelirli bir tedarikçiDehidrasyon için
Cam Petri kabıBelirli bir tedarikçiBahçe örneklerini manipüle etmek için
Cam pipetBelirli bir tedarikçiNumuneleri sabitlemek ve kurutmak için
Glutaraldehit (Sulu Glutaraldehit EM Sınıfı% 25)Elektron Mikroskobu Bilimleri16220Karnovsky'yi hazırlamak için s sabitleyici
Altın hedefi Ted Pella, Inc.8071Altın Hidroklorik asit ile kaplamayı püskürtmek için
Sigma-Aldrich320331Çözeltileri ayarlamak için pH
Görüntü düzenleyiciPhotoshopherhangi bir sürümGörüntüleri ayarlamak için
Paraformaldehit (Paraformaldehit% 20 Sulu Çözelti EM Sınıfı)Elektron Mikroskobu Bilimleri15713Karnovsky'yi hazırlamak için s fiksatif
Propilene alıcısıBelirli bir tedarikçiCanlı karınca kolonilerini korumak için
Taramalı Elektron MikroskobuJEOL IT300 SEMÖrnek görüntüleme için 
Sodyum kakodilat trihidratSigma-AldrichC0250Sodyum kakodilat tamponu hazırlamak için
SpatulaBelirli bir tedarikçiBahçe örneklerini manipüle etmek için
15 mm çapında numune kapları x 10 mm yüksekliğindeTed Pella, Inc.4591Kritik nokta kurutma için
Püskürtmeli kaplayıcıBaltec SCD 050Altın Saplama ile kaplamak için
(Alüminyum montaj, düz uç pimi) 12,7 mm x 8 mm Elektron Mikroskobu Bilimleri75520Numunelerin montajı için
yok için yok yok yok yok yok yok

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Turner, M. G. Landscape ecology: the effect of pattern on process. Annu Rev Ecol Evol Syst. 20 (1), 171-197 (1989).
  2. Rietkerk, M., Van de Koppel, J. Regular pattern formation in real ecosystems. Trends Ecol Evol. 23 (3), 169-175 (2008).
  3. Schmitz, O. J. Spatial dynamics and ecosystem functioning. PLOS Biol. 8 (5), e1000378(2010).
  4. Pringle, R. M., Doak, D. F., Brody, A. K., Jocqué, R., Palmer, T. M. Spatial pattern enhances ecosystem functioning in an African savanna. PLOS Biol. 8 (5), e1000377(2010).
  5. Wimpenny, J. W. Spatial order in microbial ecosystems. Biol Rev. 56 (3), 295-342 (1981).
  6. Martiny, J. B. H., et al. Microbial biogeography: putting microorganisms on the map. Nat Rev. Microbiol. 4 (2), 102-112 (2006).
  7. McCallum, G., Tropini, C. The gut microbiota and its biogeography. Nat Rev Microbiol. 22 (2), 105-118 (2024).
  8. Lamont, R. J., Hajishengallis, G., Koo, H. Social networking at the microbiome-host interface. Infec Immun. 91 (9), e00124-e00223 (2023).
  9. Welch, J. L. M., Rossetti, B. J., Rieken, C. W., Dewhirst, F. E., Borisy, G. G. Biogeography of a human oral microbiome at the micron scale. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (6), E791-E800 (2016).
  10. Kim, D., et al. Spatial mapping of polymicrobial communities reveals a precise biogeography associated with human dental caries. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (22), 12375-12386 (2020).
  11. Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. Spatial organization and composition of the mucosal flora in patients with inflammatory bowel disease. J Clin Microbiol. 43 (7), 3380-3389 (2005).
  12. Ibberson, C. B., Barraza, J. P., Holmes, A. L., Cao, P., Whiteley, M. Precise spatial structure impacts antimicrobial susceptibility of S. aureus in polymicrobial wound infections. Proc Natl Acad Sci USA. 119 (51), e2212340119(2022).
  13. Azimi, S., Lewin, G. R., Whiteley, M. The biogeography of infection revisited. Nat Rev Microbiol. 20 (10), 579-592 (2022).
  14. Dejea, C. M., et al. Microbiota organization is a distinct feature of proximal colorectal cancers. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (51), 18321-18326 (2014).
  15. Hanson, C. A., Fuhrman, J. A., Horner-Devine, M. C., Martiny, J. B. Beyond biogeographic patterns: processes shaping the microbial landscape. Nat Rev Microbiol. 10 (7), 497-506 (2012).
  16. Adade, E. E., Al Lakhen, K., Lemus, A. A., Valm, A. M. Recent progress in analyzing the spatial structure of the human microbiome: Distinguishing biogeography and architecture in the oral and gut communities. Curr Opin Endocr. 18, 275-283 (2021).
  17. Mony, C., Bohannan, B. J., Leibold, M. A., Peay, K., Vandenkoornhuyse, P. Microbial landscape ecology: Highlights on the invisible corridors. Front Ecol Evol. 9, 753213(2021).
  18. Hölldobler, B., Wilson, E. O. The Ants. , Harvard University Press. (1990).
  19. Chapela, I. H., Rehner, S. A., Schultz, T. R., Mueller, U. G. Evolutionary history of the symbiosis between fungus-growing ants and their fungi. Science. 266 (5191), 1691-1694 (1994).
  20. Mueller, U. G., Rehner, S. A., Schultz, T. R. The evolution of agriculture in ants. Science. 281 (5385), 2034-2038 (1998).
  21. Mueller, U. G., Gerardo, N. M., Aanen, D. K., Six, D. L., Schultz, T. R. The evolution of agriculture in insects. Annu Rev Ecol Evol Syst. 36, 563-595 (2005).
  22. Dentinger, B. T., Lodge, D. J., Munkacsi, A. B., Desjardin, D. E., McLaughlin, D. J. Phylogenetic placement of an unusual coral mushroom challenges the classic hypothesis of strict coevolution in the Apterostigma pilosum group ant-fungus mutualism. Evolution. 63 (8), 2172-2178 (2009).
  23. Schultz, T. R., Brady, S. G. Major evolutionary transitions in ant agriculture. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 5435-5440 (2008).
  24. de Fine Licht, H. H., Boomsma, J. J. Forage collection, substrate preparation, and diet composition in fungus-growing ants. Ecol Entomol. 35 (3), 259-269 (2010).
  25. Martin, M. M. The biochemical basis of the fungus-attine ant symbiosis: A complex symbiosis is based upon integration of the carbon and nitrogen metabolisms of the two organisms. Science. 169 (3940), 16-20 (1970).
  26. Grell, M. N., et al. The fungal symbiont of Acromyrmex leaf-cutting ants expresses the full spectrum of genes to degrade cellulose and other plant cell wall polysaccharides. BMC Genomics. 14, 928(2013).
  27. Lange, L., Grell, M. N. The prominent role of fungi and fungal enzymes in the ant-fungus biomass conversion symbiosis. Appl Microbiol Biotechnol. 98, 4839-4851 (2014).
  28. Huang, E. L., et al. The fungus gardens of leaf-cutter ants undergo a distinct physiological transition during biomass degradation. Environ Microbiol Rep. 6 (4), 389-395 (2014).
  29. Craven, S. E., Dix, M. W., Michaels, G. E. Attine fungus gardens contain yeasts. Science. 169 (3941), 184-186 (1970).
  30. De Fine Licht, H. H., Boomsma, J. J., Tunlid, A. Symbiotic adaptations in the fungal cultivar of leaf-cutting ants. Nat Commun. 5 (1), 5675(2014).
  31. Aylward, F. O., et al. Enrichment and broad representation of plant biomass-degrading enzymes in the specialized hyphal swellings of Leucoagaricus gongylophorus, the fungal symbiont of leaf-cutter ants. PLoS One. 10 (8), e0134752(2015).
  32. Moreira-Soto, R. D., Sanchez, E., Currie, C. R., Pinto-Tomás, A. A. Ultrastructural and microbial analyses of cellulose degradation in leaf-cutter ant colonies. Microbiology. 163 (11), 1578-1589 (2017).
  33. Erthal Jr, M., Silva, C. P., Cooper, R. M., Samuels, R. I. Hydrolytic enzymes of leaf-cutting ant fungi. Comp Biochem. 152 (1), 54-59 (2009).
  34. North, R. D., Jackson, C. W., Howse, P. E. Communication between the fungus garden and workers of the leaf-cutting ant, Atta sexdens rubropilosa, regarding choice of substrate for the fungus. Physiol Entomol. 24 (2), 127-133 (1999).
  35. Herz, H., Hölldobler, B., Roces, F. Delayed rejection in a leaf-cutting ant after foraging on plants unsuitable for the symbiotic fungus. Behav Ecol. 19 (3), 575-582 (2008).
  36. Schiøtt, M., De Fine Licht, H. H., Lange, L., Boomsma, J. J. Towards a molecular understanding of symbiont function: identification of a fungal gene for the degradation of xylan in the fungus gardens of leaf-cutting ants. BMC Microbiol. 8, 40(2008).
  37. Bot, A. N., Currie, C. R., Hart, A. G., Boomsma, J. J. Waste management in leaf-cutting ants. Ethol Ecol Evol. 13 (3), 225-237 (2001).
  38. Scott, J. J., et al. Microbial community structure of leaf-cutter ant fungus gardens and refuse dumps. PLOS One. 5 (3), e9922(2010).
  39. Lewin, G. R., et al. Cellulose-enriched microbial communities from leaf-cutter ant (Atta colombica) refuse dumps vary in taxonomic composition and degradation ability. PLOS One. 11 (3), e0151840(2016).
  40. Suen, G., et al. An insect herbivore microbiome with high plant biomass-degrading capacity. PLOS Genet. 6 (9), e1001129(2010).
  41. Aylward, F. O., et al. Convergent bacterial microbiotas in the fungal agricultural systems of insects. MBio. 5 (6), e02077(2014).
  42. Barcoto, M. O., et al. Fungus-growing insects host a distinctive microbiota apparently adapted to the fungiculture environment. Sci Rep. 10 (1), 12384(2020).
  43. Francoeur, C. B., et al. Bacteria contribute to plant secondary compound degradation in a generalist herbivore system. mBio. 11, e02146-e02220 (2020).
  44. Martiarena, M. J. S., Deveau, A., Montoya, Q. V., Flórez, L. V., Rodrigues, A. The hyphosphere of leaf-cutting ant cultivars is enriched with helper bacteria. Microb Ecol. 86 (3), 1773-1788 (2023).
  45. Leal-Dutra, C. A., et al. Evidence that the domesticated fungus Leucoagaricus gongylophorus recycles its cytoplasmic contents as nutritional rewards to feed its leafcutter ant farmers. IMA Fungus. 14 (1), 19(2023).
  46. Sosa-Calvo, J., Jesovnik, A., Okonski, E., Schultz, T. R. Locating, collecting, and maintaining colonies of fungus-farming ants (Hymenoptera: Myrmicinae: Attini). Sociobiology. 62 (2), 300-320 (2015).
  47. Karnovsky, M. J. A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. J Cell Biol. 27, 137-138 (1965).
  48. Eltoum, I., Fredenburgh, J., Myers, R. B., Grizzle, W. E. Introduction to the theory and practice of fixation of tissues. J Histotechnol. 24 (3), 173-190 (2001).
  49. Gusnard, D., Kirschner, R. H. Cell and organelle shrinkage during preparation for scanning electron microscopy: effects of fixation, dehydration and critical point drying. J Microsc. 110 (1), 51-57 (1977).
  50. Surman, S. B., et al. Comparison of microscope techniques for the examination of biofilms. J Microbiol Methods. 25 (1), 57-70 (1996).
  51. Augustin, J. O., et al. Yet more "weeds" in the garden: fungal novelties from nests of leaf-cutting ants. PLOS One. 8 (12), e82265(2013).
  52. Montoya, Q. V., Martiarena, M. J. S., Polezel, D. A., Rodrigues, A. More pieces to a huge puzzle: Two new Escovopsis species from fungus gardens of attine ants. MycoKeys. 46, 97(2019).
  53. Varanda-Haifig, S. S., et al. Nature of the interactions between hypocrealean fungi and the mutualistic fungus of leaf-cutter ants. Antonie van Leeuwenhoek. 110, 593-605 (2017).
  54. Custodio, B. C., Rodrigues, A. Escovopsis kreiselii specialization to its native hosts in the fungiculture of the lower attine ant Mycetophylax morschi. Antonie van Leeuwenhoek. 112, 305-317 (2019).
  55. Schröttner, H., Schmied, M., Scherer, S. Comparison of 3D surface reconstruction data from certified depth standards obtained by SEM and an Infinite Focus Measurement Machine (IFM). Microchim Acta. 155, 279-284 (2006).
  56. Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z. L., Joy, D. Fundamentals of scanning electron microscopy (SEM). Scanning microscopy for nanotechnology: Techniques and applications. Zhou, W., Wang, Z. L. , Springer. New York, NY. 1-40 (2007).
  57. Kannan, M. Scanning electron microscopy: Principle, components and applications. A Textbook on Fundamentals and Applications of Nanotechnology. Raja, K., Subramanian, K. S., Kannan, M. , Daya Publishing House. 81-92 (2018).
  58. Ruffolo, J. J. Jr Critical point drying of protozoan cells and other biological specimens for scanning electron microscopy: apparatus and methods of specimen preparation. Trans Am Microsc. 93 (1), 124-131 (1974).
  59. Echlin, P. Recent advances in specimen coating techniques for electron microscopy. Scanning Electron Microscopy 1981/1. , IITRI. Chicago. 79-90 (1981).
  60. Ris, H. The cytoplasmic filament system in critical point-dried whole mounts and plastic-embedded sections. J Cell Biol. 100 (5), 1474-1487 (1985).
  61. Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical-point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microsc Res Tech. 26 (6), 489-495 (1993).
  62. Bergmans, L., Moisiadis, P., Van Meerbeek, B., Quirynen, M., Lambrechts, P. Microscopic observation of bacteria: review highlighting the use of environmental SEM. Int Endod J. 38 (11), 775-788 (2005).
  63. Kirk, S. E., Skepper, J. N., Donald, A. M. Application of environmental scanning electron microscopy to determine biological surface structure. J Microsc. 233 (2), 205-224 (2009).
  64. Kemmenoe, B. H., Bullock, G. R. Structure analysis of sputter-coated and ion-beam sputter-coated films: a comparative study. J Microsc. 132 (2), 153-163 (1983).
  65. Kinden, D. A., Brown, M. F. Technique for scanning electron microscopy of fungal structures within plant cells. Phytopathology. 65, 74-76 (1975).
  66. Masaphy, S., Levanon, D., Tchelet, R., Henis, Y. Scanning electron microscope studies of interactions between Agaricus bisporus (Lang) Sing hyphae and bacteria in casing soil. Appl Environ Microbiol. 53 (5), 1132-1137 (1987).
  67. Massicotte, H. B., Melville, L. H., Peterson, R. L. Scanning electron microscopy of ectomycorrhizae potential and limitations. Scanning Microsc. 1 (3), 58(1987).
  68. Visen, A., Singh, P. N., Chakraborty, B., Singh, A., Bisht, T. S. Scanning electron microscopy indicates Pseudomonad strains facilitate AMF mycorrhization in litchi (Litchi chinensis Sonn.) air-layers and improving survivability, growth and leaf nutrient status. Curr Res Microb Sci. 2, 100063(2021).
  69. Fleeman, R. M., Mikesh, M., Davies, B. W. Investigating Klebsiella pneumoniae biofilm preservation for scanning electron microscopy. Access Microbiol. 5 (2), 000470-000473 (2023).
  70. Wells, M., Mikesh, M., Gordon, V. Structure-preserving fixation allows scanning electron microscopy to reveal biofilm microstructure and interactions with immune cells. J Microsc. 293 (1), 59-68 (2024).
  71. Nadell, C. D., Drescher, K., Foster, K. R. Spatial structure, cooperation and competition in biofilms. Nat Rev Microbiol. 14 (9), 589-600 (2016).
  72. Madsen, J. S., et al. Coexistence facilitates interspecific biofilm formation in complex microbial communities. Environ Microbiol. 18 (8), 2565-2574 (2016).
  73. Madsen, J. S., Sørensen, S. J., Burmølle, M. Bacterial social interactions and the emergence of community-intrinsic properties. Curr Opin Microbiol. 42, 104-109 (2018).
  74. Flemming, H. C., Wuertz, S. Bacteria and archaea on Earth and their abundance in biofilms. Nat Rev Microbiol. 17 (4), 247-260 (2019).
  75. Bringhurst, B., Allert, M., Greenwold, M., Kellner, K., Seal, J. N. Environments and hosts structure the bacterial microbiomes of fungus-gardening ants and their symbiotic fungus gardens. Microb Ecol. 86 (2), 1374-1392 (2023).
  76. Bringhurst, B., Greenwold, M., Kellner, K., Seal, J. N. Symbiosis, dysbiosis and the impact of horizontal exchange on bacterial microbiomes in higher fungus-gardening ants. Sci Rep. 14 (1), 3231(2024).
  77. Vargas, S., et al. Body-plan reorganization in a sponge correlates with microbiome change. Mol Biol Evol. 40 (6), msad138(2023).
  78. Apprill, A., et al. Humpback whale populations share a core skin bacterial community: towards a health index for marine mammals. PLOS One. 9 (3), e90785(2014).
  79. Fraune, S., et al. Bacteria-bacteria interactions within the microbiota of the ancestral metazoan Hydra contribute to fungal resistance. ISME J. 9 (7), 1543-1556 (2015).
  80. Gowen, R., Gamal, A., Di Martino, L., McCormick, T. S., Ghannoum, M. A. Modulating the microbiome for Crohn's disease treatment. Gastroenterology. 164 (5), 828-840 (2023).
  81. Moya, P., et al. Molecular phylogeny and ultrastructure of the lichen microalga Asterochloris mediterranea sp. nov. from Mediterranean and Canary Islands ecosystems. Int J Syst Evol Microbiol. 65 (6), 1838-1854 (2015).
  82. Zettler, E. R., Mincer, T. J., Amaral-Zettler, L. A. Life in the "plastisphere": microbial communities on plastic marine debris. Environ Sci Technol. 47 (13), 7137-7146 (2013).
  83. Porter, K. R., Kallman, F. The properties and effects of osmium tetroxide as a tissue fixative with special reference to its use for electron microscopy. Exp Cell Res. 4 (1), 127-141 (1953).
  84. Ligon, J. J., Abraham, J. L., Boyd, A. S. Traumatic osmium tetroxide inoculation. J Am Acad Dermatol. 45 (6), 949-952 (2001).
  85. Friedova, N., et al. Osmium absorption after osmium tetroxide skin and eye exposure. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 127 (5), 429-433 (2020).
  86. Fratesi, S. E., Lynch, F. L., Kirkland, B. L., Brown, L. R. Effects of SEM preparation techniques on the appearance of bacteria and biofilms in the Carter Sandstone. J Sediment. 74 (6), 858-867 (2004).
  87. Dassanayake, R. P., et al. Identification of a reliable fixative solution to preserve the complex architecture of bacterial biofilms for scanning electron microscopy evaluation. PLOS One. 15 (5), e0233973(2020).
  88. Desiro, A., et al. Detection of a novel intracellular microbiome hosted in arbuscular mycorrhizal fungi. ISME J. 8 (2), 257-270 (2014).
  89. Morales, D. P., et al. Advances and challenges in fluorescence in situ hybridization for visualizing fungal endobacteria. Front Microbiol. 13, 892227(2022).
  90. Shi, H., et al. Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities. Nature. 588 (7839), 676-681 (2020).
  91. Valm, A. M., Welch, J. L. M., Borisy, G. G. CLASI-FISH: principles of combinatorial labeling and spectral imaging. Syst Appl Microbiol. 35 (8), 496-502 (2012).
  92. Fernandez-Brime, S., Muggia, L., Maier, S., Grube, M., Wedin, M. Bacterial communities in an optional lichen symbiosis are determined by substrate, not algal photobionts. FEMS Microbiol Ecol. 95 (3), fiz012(2019).
  93. Schluter, S., Eickhorst, T., Mueller, C. W. Correlative imaging reveals holistic view of soil microenvironments. Environ Sci Technol. 53 (2), 829-837 (2018).
  94. Barcoto, M. O., Rodrigues, A. Lessons from insect fungiculture: from microbial ecology to plastics degradation. Front Microbiol. 13, 812143(2022).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mantar Bah eleriMikrobiyal BiyofilmlerMikrobiyota Uzaysal OrganizasyonuFungal HiflerBiyofilm Yap sNumune Haz rlamaKritik Nokta KurutmaSputter Kaplama

İlgili makaleler