Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

C-Glikozit-Parçalayan Bağırsak Bakterilerinin Taranması ve İzolasyonu

945 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67346

⸱

28 Şubat 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, C-glikozitleri parçalayabilen bağırsak bakterilerini verimli bir şekilde taramak ve izole etmek için bir dizi standart işletim prosedürü (SOP) oluşturur.

Özet

C-glikozitler tıbbi bitkilerde yaygın olarak bulunur ve antibakteriyel, antienflamatuar, antiviral, antioksidan ve antineoplastik aktiviteler dahil olmak üzere çeşitli biyoaktivitelerle birlikte geniş yapısal çeşitlilik sergiler. C-glikozitlerde, şeker parçasının anomerik karbonu, karbon-karbon bağı yoluyla doğrudan bir aglikona bağlanır. O-glikozitlerle karşılaştırıldığında, C-glikozitler yapısal olarak kararlıdır ve asitlere ve enzimlere karşı dirençlidir. Sonuç olarak, tipik olarak kırılamazlar, bu da zayıf emilebilirlik ve düşük biyoyararlanım ile sonuçlanır. İlginç bir şekilde, bazı bağırsak bakterileri C-C glikozidik bağlarını parçalayabilir ve C-glikozitleri parçalamak için spesifik ve çevre dostu bir biyolojik yaklaşım sağlar. Bu çalışmada, doğal bileşiklerin biyotransformasyon modeline dayalı olarak C-C glikozidik bağlarını parçalayabilen bağırsak bakterilerini taramak için bir dizi standart işletim prosedürü (SOP) geliştirilmiştir. SÇP'ler, bağırsak bakterilerinin hazırlanmasını ve zenginleştirilmesini, aktivite odaklı taramayı ve düşük karbonlu bir kaynak ortamında aktivite doğrulamasını içerir. Bu metodoloji, bu özel fonksiyonel bakterileri izole etmeyi ve incelemeyi amaçlayan araştırmacılar için temel bir referans sağlar.

Giriş

C-glikozitler, glikosil gruplarının CC bağları1 yoluyla aglikonlara doğrudan bağlanması ile karakterize edilen bir bileşik grubudur. Doğada, orientin, vitexin, puerin ve türevleri yaygın olarak C-glikozitler2 olarak tanımlanır. Bu bileşikler sıklıkla Trollius chinensis3 gibi tıbbi bitkilerde ve Styela plicata4 gibi hayvanlarda bulunur. Çalışmalar, bu bileşiklerin sağlık yararları sağladığını ve antibakteriyel 5,6,7, anti-inflamatuar 8,9,10,11,12, antiviral 3,12,13, antioksidan 14,15,16 ve Antineoplastik aktiviteler17.

Glikosil gruplarının CC bağları yoluyla iskelete bağlanması nedeniyle, bu bileşikler asidik ve enzimatik hidrolize18 karşı yüksek stabilite ve direnç sergiler, bu da zayıf emilebilirliğe ve düşük biyoyararlanıma19 yol açar. Bu sınırlama, C-glikozitlerin gelişimini ve kullanımını etkiler. Bununla birlikte, genellikle oral yoldan uygulanan C-glikozitler içeren ilaçlar, spesifik enzimler tarafından deglikosile edilir ve daha güçlü biyoaktif aglikonlar üretir 20,21,22,23. Konağın kendi enzimleri C-glikozitleri deglikosile edemezken, bağırsak bakterilerinin belirli türleri metabolize ettiği bildirilmiştir. Örneğin, bazı bağırsak bakterileri mangiferini antidiyabetik veya antineoplastik bir ajan olarak daha fazla etki gösteren noratiriole dönüştürür24. Bu bulgulara rağmen, C-glikozitleri parçalayabilen sadece sınırlı sayıda bakteri karakterize edilmiştir ve altta yatan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu bakterilerin verimli ve standartlaştırılmış taraması, işlevlerinin anlaşılmasını artıracak ve C-glikozitlerin gelişimini hızlandıracaktır.

Tarama yöntemi zaman içinde geliştirilmiş ve rafine edilerek olgun bir sisteme dönüştürülmüştür. Temel yaklaşımlar, düşük karbonlu kaynak ortamlarında zenginleştirme, aktivite odaklı tarama ve aktivite doğrulamasını içerir. Bu yöntem, saf hedef suşların izolasyonunun yanı sıra türlerin, genomik verilerin ve hedef mikroorganizmaların özelliklerinin tanımlanmasını kolaylaştırır. Bu sistemi kullanarak, C-glikozitleri parçalayabilen bağırsak bakterileri etkili bir şekilde taranabilir ve izole edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Yürütülen deneyler, her bir suşla ilişkili spesifik biyogüvenlik tehlikelerine uygun yerel, ulusal ve uluslararası biyogüvenlik muhafaza düzenlemelerine bağlı kalmıştır. En az bir hafta boyunca herhangi bir ilaç kullanmayan sağlıklı gönüllülerden dışkı örnekleri toplandı. Kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. İnsan bağırsağı bakteriyel dönüşüm modelinin in vitro olarak oluşturulması

  1. Genel Anaerobik Ortamın (GAM) Hazırlanması25
    1. Çözelti A'nın Hazırlanması
      1. 10.0 g tripton, 10.0 g proteoz pepton, 3.0 g soya peptonu, 13.5 g sindirim serumu tozu, 1.2 g karaciğer özü tozu, 2.2 g sığır özü ve 5.0 g maya özütünü 500 mL'lik bir Erlenmeyer şişesinde birleştirin.
      2. 500 mL damıtılmış su ekleyin ve maddeler tamamen eriyene kadar ısıtma altında karıştırın.
    2. Çözelti B'nin Hazırlanması
      1. 3.0 g glikoz, 5.0 g çözünür nişasta, 2.5 g dipotasyum hidrojen fosfat ve 3.0 g sodyum klorürü 250 mL'lik bir Erlenmeyer şişesinde birleştirmek dışında, Çözelti A ile aynı prosedürü izleyerek Çözelti B'yi hazırlayın.
    3. Çözelti C'nin Hazırlanması
      1. 0.3 g L-sistein hidroklorür ve 0.3 g sodyum tiyoglikolatı 100 mL'lik bir Erlenmeyer şişesinde birleştirmek dışında, Çözelti A ve B ile aynı prosedürü izleyerek Çözelti C'yi hazırlayın.
      2. Üç çözeltiyi de 1000 mL'lik bir Erlenmeyer şişesinde karıştırın, %10'luk bir sodyum hidroksit çözeltisi kullanarak pH'ı 7.2'ye ayarlayın ve 1000 mL'lik bir nihai hacim oluşturmak için damıtılmış su ekleyin.
      3. Ortamı 250 mL Erlenmeyer şişelerine dağıtın ve 121 ° C'de 30 dakika boyunca otoklavlayın. Oda sıcaklığına soğutun ve 4 °C'de saklayın.
    4. Katı genel anaerobik ortamın hazırlanması
      1. GAM sıvı ortamına %1-%2 agar ekleyin ve tamamen eriyene kadar ısıtın. 250 mL Erlenmeyer şişelerine dağıtın ve 121 ° C'de 30 dakika boyunca otoklava koyun.
    5. Düşük karbonlu kaynak ortamının hazırlanması
      1. Düşük karbonlu kaynak ortamını GAM ile aynı prosedürü kullanarak hazırlayın, ancak maya özütü, glikoz ve çözünür nişastayı atlayın.
  2. Karışık İnsan Bağırsak Florasının Hazırlanması
    1. Azot gazı ile doldurulmuş tek kullanımlık steril dışkı toplama tüpünde 1-2 g taze insan dışkısı toplayın. Tüpü derhal kapatın. Steril bir anaerobik inkübatörde 24 saat boyunca 37 ° C'de 5 mL GAM ortamı, mühür ve kültür ekleyin.
      NOT: Anaerobik inkübatörün oksijen seviyelerini izlemek için bir oksijen ölçer kullanın ve anaerobik koşulları korumak için gerektiği gibi nitrojen gazını değiştirin.
  3. Karışık insan bağırsak florasının aktivasyonu
    1. 24 saat sonra, 0.5 mL insan bağırsağı bakteri süspansiyonunu 4.5 mL taze GAM ortamı içeren yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    2. Aktif karışık insan bağırsak florası elde etmek için anaerobik koşullar altında 37 ° C'de 24 saat boyunca kapatın ve inkübe edin.
  4. Referans çözeltilerin hazırlanması
    1. Her biri 5 mg oryantin ve luteolin tartın ve 5 mg / mL konsantrasyonda oryantin ve luteolin referans çözeltileri hazırlamak için bunları 1 mL DMSO içinde ayrı ayrı çözün.
  5. C-glikozitleri parçalayabilen aktif bağırsak florasının taranması
    1. 260 μL aktif bağırsak florasını, 40 μL oryantin referans çözeltisi içeren 6 mL taze düşük karbonlu kaynak ortamla karıştırın ve 37 °C'de inkübe edin.
    2. Bir kontrol grubu (6 mL düşük karbonlu kaynak ortamı, 40 μL oryantin referans çözeltisi ve 260 μL normal salin) ve boş bir grup (6 mL düşük karbonlu kaynak ortamı, 40 μL normal salin ve 260 μL aktif bağırsak florası) içerir.
      NOT: Tüm testleri anaerobik bir inkübatörde üç kopya halinde gerçekleştirin.
  6. Dönüşüm çözümlerinin ön arıtımı
    1. 24 saat ve 48 saat sonra, 1 mL reaksiyon çözeltisini 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine pipetleyin ve bakterileri uzaklaştırmak için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 13.400 x g'da santrifüjleyin.
    2. 600 μL metanole 200 μL süpernatan ekleyin, karıştırın ve proteinleri çıkarmak için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 13.400 x g'da santrifüjleyin.
  7. Dönüşüm ürünlerinin tespiti
    1. Süpernatanı 0,22 μm mikro gözenekli bir membran kullanarak filtreleyin ve süzüntüyü yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile analiz edin. C18 sütunu (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) ile donatılmış bir cihazda HPLC analizi yapın.
    2. Kolon fırın sıcaklığını 40 mL/dk akış hızıyla 1 °C'de tutun. Mobil faz A olarak asetonitril ve arıtılmış suda mobil faz B olarak %0.1 formik asit kullanın.
      NOT: Aşağıdaki gibi doğrusal bir gradyan sistemi kullanın: 0-20 dakikada %5 - %55 A, 20-25 dakikada %55 - %95 A, 25-30 dakikada %95 - %5 A ve 30-32 dakikada %5 A.

2. İnsan bağırsak bakteri florasından tek suşların izolasyonu

  1. Karışık insan bağırsak bakteri florasının aktivasyonu
    1. Aktive edilmiş insan bağırsağı bakteri florası çözeltisini elde etmek için, adım 1.3'te açıklandığı gibi oryantasyonini parçalayabilen karışık insan bağırsağı bakteri florasını aktive edin.
  2. Katı GAM plakalarının hazırlanması
    1. Hazırlanan katı GAM ortamını ısıtarak çözün ve anaerobik bir inkübatörde tek kullanımlık steril petri kaplarına dökün. Katı GAM plakaları hazırlamak için ortamın katılaşmasına izin verin.
  3. İnsan bağırsak bakteri florasından tek suşların ön taraması
    1. 100 μL aktif bakteri solüsyonunu 1 mL normal salin içeren 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin.
    2. Tek kullanımlık bir aşılama halkası kullanarak uygun miktarda bakteri solüsyonunu bir petri kabına aşılayın. Çanağı kapatın ve anaerobik bir inkübatörde inkübe edin.
  4. Koloni morfolojisinin gözlemlenmesi
    1. 37 ° C'de 48 saatlik inkübasyondan sonra, plaka üzerindeki kolonilerin boyutunu, morfolojisini ve rengini gözlemleyin.
  5. Tek suşlar elde etmek için bireysel kolonilerin seçimi
    1. Farklı tek bakteri kolonilerini seçin ve bunları 4.5 mL taze GAM ortamı içeren 10 mL mikrosantrifüj tüplerinde kültürleyin. Tek suşlar elde etmek için anaerobik koşullar altında 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
  6. Tek suş aktivitesinin doğrulanması
    1. Adım 1.5, 1.6 ve 1.7'de açıklandığı gibi tek suşların aktivitesini doğrulayın. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ve plaka işaretleme25 kullanarak aktivite doğrulaması yapın.
  7. İnsan bağırsak bakteri florasından tek suşların saflaştırılması
    1. Aktif tek suşu adım 2.1'de açıklandığı gibi saflaştırın. Adım 1.5, 1.6 ve 1.7'de belirtilen prosedürleri izleyerek orientin ile dönüşüm deneyleri yoluyla aktivitesini doğrulayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

On sağlıklı gönüllüden alınan dışkı örnekleri, dönüşüm deneyleri kullanılarak tarandı ve bu, oryantini deglikosile etmede aktivite gösteren bir örnekle sonuçlandı. Bu bulgu, aktif numuneler için taramanın fizibilitesini doğruladı. Aktif numune, plaka işaretleme yöntemi kullanılarak izole edildi. Kolonilerin morfolojisine ve özelliklerine dayanarak, daha fazla analiz için sarı veya beyaz renkli, çeşitli şekillere ve düzensiz kenarlara sahip yaklaşık 18 tek bakteri kolonisi seçildi. Bunlar arasında, sadece bir koloni, orie...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

C-glikozitleri parçalayabilen insan bağırsak bakterilerini taramak için standart işletim prosedürü (SOP) oluşturulmuştur. Bu prosedürler kullanılarak, saf bir aktif suş başarılı bir şekilde elde edildi ve deglikosilasyon özelliği, dönüşüm testleri ile doğrulandı. SOP, bağırsak bakterilerinin hazırlanması ve zenginleştirilmesi, aktivite odaklı tarama ve düşük karbonlu kaynak ortamında aktivite doğrulamasından oluşur.

Tarama işleminin en önemli yönü, bakteri akt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı 82374134 tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AsetonitrilTermo Fisher BilimselF2408R205HPLC
Anaerobik İnkübatörŞangay CIMO Tıbbi Alet İmalat A.Ş., LTDYQX-II
Sığır ÖzüPekin Abxing Biyoteknoloji A.Ş., LTD01-009BR
Sindirim Serumu TozuPekin Abxing Biyoteknoloji A.Ş., LTD01-087BR
Dipotasyum Hidrojen FosfatPekin Kimyasal İşlerM26298AR
Tek Kullanımlık Steril Dışkı Toplama TüpüLang Fu Co., LTD5 mL
Damıtılmış SuBiyofarmasötik Bölümü, Pekin Geleneksel Çin Tıbbı
DMSOSigma-Aldrich CorporationWXBD2861VAR
EP TüpüPekin Biodee Biyoteknoloji A.Ş., LTD10 mL / 1.5 mL
Eppendorf SantrifüjEppendorf AG5418
GlikozPekin Kimyasal İşlerGC205003
AR Yüksek Performanslı Sıvı KromatografıShimadzu CorporationLC-20
Yüksek Basınçlı Buhar SterilizatörüSanyo Denki Shanghai Co., LTDMLS-3780
Innoval C18 Kromatografik KolonAgela Technologies Co., LTD4.6 mm ve kez; 250 mm, 5 ve mikro; m
L-sistein HidroklorürPekin Abxing Biyoteknoloji A.Ş., LTDBGASY01BR
Karaciğer Özü TozuPekin Abxing Biyoteknoloji A.Ş., LTD01-085BR
LuteolinUlusal Gıda ve İlaç Kontrol>% 98
Manyetik KarıştırıcıIka Werke Co., LTDRCT temel
MetanolThermo Fisher Bilimsel20240901312AR
Millipor Filtre MembranıSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.0.22 ve mikro; L ve kez; 50 mm
OrientinYishiming (Pekin) Biyoteknoloji A.Ş., LTD19120601>98
PeptonBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD1685787BR
Petri KabıBeijing Biodee Biotechnology Co., LTD150 mm
Sodyum KlorürBeijing Abxing Biotechnology Co., LTDBN20008AR
Sodyum TiyoglikolatŞangay Jianglai Biyoteknoloji A.Ş., LTDJ031S219019AR
Çözünür NişastaPekin Abxing Biyoteknoloji A.Ş., LTDS9765BR
Soya PeptonPekin Abxing Biyoteknoloji A.Ş., LTD2147955BR
TriptonAgela Technologies Co., LTD1685787BR
Ultrasonik TemizleyiciKun Shan Ultrasonik Aletler A.Ş., LTDKQ-500DE
Maya ÖzüPekin Abxing Biyoteknoloji A.Ş., LTD01-014BR
Üniversitesi Enstitüleri%

Kaynaklar

  1. Zhang, Y. Q., Zhang, M., Wang, Z. L., Qiao, X., Ye, M. Advances in plant-derived C-glycosides: phytochemistry, bioactivities, and biotechnological production. Biotechnol Adv. 60, 108030(2022).
  2. Franz, G., Grun, M. Chemistry, occurrence and biosynthesis of C-glycosyl compounds in plants. Planta Med. 47 (3), 131-140 (1983).
  3. Cai, S., et al. Antiviral flavonoid-type C-glycosides from the flowers of Trollius chinensis. Chem Biodivers. 3 (3), 343-348 (2006).
  4. Shi, X., et al. A flavone C-glycoside from Styela plicata. Biochem Syst Ecol. 86, 103924(2019).
  5. Xiao, J., Capanoglu, E., Jassbi, A. R., Miron, A. Advance on the flavonoid C-glycosides and health benefits. Crit Rev Food Sci Nutr. 56 (Suppl 1), S29-S45 (2016).
  6. Ma, R., Cheng, S., Sun, J., Zhu, W., Fu, P. Antibacterial gilvocarcin-type aryl-C-glycosides from a soil-derived Streptomyces species. J Nat Prod. 85 (10), 2282-2289 (2022).
  7. Le Dang, Q., et al. Desmodinosides A-E: New flavonoid C-glycosides from Desmodium heterocarpon var. stigosum with hepatoprotective and antifungal activity. Fitoterapia. 169, 105609(2023).
  8. Choi, J. S., et al. Effects of C-glycosylation on antidiabetic, anti-Alzheimers disease and anti-inflammatory potential of apigenin. Food Chem Toxicol. 64, 27-33 (2014).
  9. Courts, F. L., Williamson, G. The occurrence, fate and biological activities of C-glycosyl flavonoids in the human diet. Crit Rev Food Sci Nutr. 55 (10), 1352-1367 (2015).
  10. Thao, N. P., et al. Anti-inflammatory flavonoid C-glycosides from Piper aduncum leaves. Planta Med. 82 (17), 1475-1481 (2016).
  11. Kim, M. K., Yun, K. J., Lim, D. H., Kim, J., Jang, Y. P. Anti-inflammatory properties of flavone di-C-glycosides as active principles of camellia mistletoe, Korthalsella japonica. Biomol Ther (Seoul). 24 (6), 630-637 (2016).
  12. Chen, Y. L., Chen, C. Y., Lai, K. H., Chang, Y. C., Hwang, T. L. Anti-inflammatory and antiviral activities of flavone C-glycosides of Lophatherum gracile for COVID-19. J Funct Foods. 101, 105407(2023).
  13. Wang, Y., et al. Flavone C-glycosides from the leaves of Lophatherum gracile and their in vitro antiviral activity. Planta Med. 78 (1), 46-51 (2012).
  14. Devkota, H. P., Fukusako, K., Ishiguro, K., Yahara, S. Flavone C-glycosides from Lychnis senno and their antioxidative activity. Nat Prod Commun. 8 (10), 1413-1414 (2013).
  15. Stark, T. D., et al. Isolation and structure elucidation of highly antioxidative 3,8-linked biflavanones and flavanone-C-glycosides from Garcinia buchananii bark. J Agric Food Chem. 60 (8), 2053-2062 (2012).
  16. Stark, T. D., Germann, D., Balemba, O. B., Wakamatsu, J., Hofmann, T. New highly in vitro antioxidative 3,8-linked biflav(an)ones and flavanone-C-glycosides from Garcinia buchananii stem bark. J Agric Food Chem. 61 (51), 12572-12581 (2013).
  17. Xiao, J., Capanoglu, E., Jassbi, A. R., Miron, A. Advance on the flavonoid C-glycosides and health benefits. Crit Rev Food Sci Nutr. 56 (Suppl 1), 29-45 (2016).
  18. Xie, K., Zhang, X., Sui, S., Ye, F., Dai, J. Exploring and applying the substrate promiscuity of a C-glycosyltransferase in the chemo-enzymatic synthesis of bioactive C-glycosides. Nat Commun. 11 (1), 5162(2020).
  19. Liu, L., et al. Characterization of the intestinal absorption of seven flavonoids from the flowers of Trollius chinensis using the Caco-2 cell monolayer model. PLoS One. 10 (3), e0119263(2015).
  20. Xu, M., et al. Mechanism and application of microbial transformation of glycosides in traditional Chinese medicine. World Sci Technol. 2, 24-27 (2006).
  21. Xie, L., et al. Comparison of flavonoid O-glycoside, C-glycoside and their aglycones on antioxidant capacity and metabolism during in vitro digestion and in vivo. Foods. 11 (6), 882(2022).
  22. Hostetler, G. L., Ralston, R. A., Schwartz, S. J. Flavones: Food sources, bioavailability, metabolism, and bioactivity. Adv Nutr. 8 (3), 423-435 (2017).
  23. Xiao, J. Dietary flavonoid aglycones and their glycosides: which show better biological significance. Crit Rev Food Sci Nutr. 57 (9), 1874-1905 (2017).
  24. Hasanah, U., Miki, K., Nitoda, T., Kanzaki, H. Aerobic bioconversion of C-glycoside mangiferin into its aglycone norathyriol by an isolated mouse intestinal bacterium. Biosci Biotechnol Biochem. 85 (4), 989-997 (2021).
  25. Yang, X., Xu, W. Establishment of model and standard operation procedure for biotransformation of chemical constituents of traditional Chinese medicine by human intestinal bacteria. China J Chin Mater Med. 36 (1), 19-26 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

C-Glikozit YıkımıBakteriyel TaramaBakteriyel İzolasyonDüşük Karbonlu BesiyeriAnaerobik İnkübasyonYüksek Performanslı Sıvı Kromatografisiİnsan Bağırsak FlorasıKoloni MorfolojisiDeglikozilasyon Aktivitesi
C-Glikozit-Parçalayan Bağırsak Bakterilerinin Taranması ve İzolasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.