Yöntem makalesi

Bursaphelenchus xylophilus'un Üçüncü Aşama Dağılmış Yavrularının Ozmotik Regülasyon Yoluyla Kriptobiyoza Girişinin İndüklenmesi

858 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67350

⸱

27 Aralık 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
11State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Institute of Ecological Conservation and Restoration, Chinese Academy of Forestry, 2Comprehensive Experimental Center in Yellow River Delta of Chinese Academy of Forestry, 3Tianjin Institute of Forestry Science, Chinese Academy of Forestry, 4Ningbo Yongsen Biotechnology Co. Ltd, 5Xiangshan Natural Resources and Planning Bureau of Zhejiang

Bu makalede

Özet

Mevcut protokol, potasyum klorür (KCl) iyonlarının ozmotik regülasyonu yoluyla Bursaphelenchus xylophilus'un üçüncü aşama gençlerinin (pre-dauer juveniles, JIII.) kriptobiyoza dağılmasını indüklemek için bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yöntem, B. xylophilus'un stres direnç mekanizmaları üzerine yapılan araştırmalar için teknik destek sağlayabilir.

Özet

Kriptobiyoz, organizmaların neredeyse tüm iç sularını kaybettiği ve aşırı çevresel stres altında anhidrobiyoza girdiği bir durumdur. Bursaphelenchus xylophilus'un dağılmış üçüncü aşama yavruları (pre-dauer juveniles, figure-abstract-1) dehidrasyon yoluyla kriptobiyoza girebilir ve çevresel koşullar iyileştiğinde rehidrasyon üzerine canlanabilir. Ozmotik düzenleme, bu süreçte hayatta kalmaları için çok önemlidir. Bu çalışmada, Çin'in figure-abstract-2 Zhejiang Eyaleti, Ningbo'da çam solgunluğu hastalığı nedeniyle ölen Pinus massoniana'dan B. xylophilus örnekleri toplanmıştır. % 8 potasyum klorür (KCl) çözeltisine daldırıldıktan sonra, B. xylophilus, figure-abstract-3 doğal su buharlaşması ile artan dış ozmotik basınç nedeniyle kademeli dehidrasyondan sonra kriptobiyotik bir duruma girdi. figure-abstract-4 B. xylophilus, -20 ° C'de düşük sıcaklık stresine dayanabilir. B. xylophilus% 92.1'lik bir hayatta kalma oranı ile rehidrasyon üzerine canlanabilir. figure-abstract-5 Bu süreç, B. xylophilus'un figure-abstract-6 kriptobiyoza girişini düzenleyerek aşırı ortamlara direnmelerini sağlayabilir. Çalışmamızda açıklanan bu yöntem basit ve güvenilirdir ve B. xylophilus'un stres direnç mekanizmalarını incelemek için teknik destek sağlar.

Giriş

Çam solgunluğu hastalığı, Çin'deki en şiddetli orman hastalıklarından biridir1. Çam ormanı nematodu Bursaphelenchus xylophilus (B. xylophilus), Pinus massoniana (P. massoniana) gibi çam türleri için konukçu içinde üreyerek hızlı solmaya ve ölüme yol açarak önemli bir tehdit oluşturur. Konağın ölümünden sonraki elverişsiz çevresel koşullar altında, B. xylophilus'un üreme yavruları dauer öncesi yavrulara girebilir (figure-introduction-1). Bu yavrular, transferlerine ve yayılmalarına devam etmek için böcek vektörleri ararlar ve bu da geniş çam ormanı ölümlerine neden olur2.

Kriptobiyoz, organizmaların neredeyse tüm iç sularını kaybettiği ve aşırı çevresel stres altında anhidrobiyoza girdiği bir durumdur3. Bu süreçte, organizmalar yavaş yavaş susuz kalır, bu da hareketin durmasına, metabolizmanın azalmasına ve askıya alınmış bir yaşam döngüsüne neden olur4. Uygun koşullar altında, rehidrasyon ile iyileşebilirler. Kriptobiyoz, organizmaların düşük sıcaklıklar gibi aşırı ortamlara direnmelerini ve ömürlerini uzatmalarını sağlar5. Kriptobiyozda 30.000 yıl boyunca hayatta kalan nematodlar, Antarktika permafrost6'da bulundu.

Önceki çalışmalar, nematodların dehidrasyon sırasında yüzey geçirgenliklerini ayarlayarak düşük sıcaklık, kuraklık ve yüksek ozmotik basınç gibi çeşitli abiyotik stres faktörlerine uyum sağlayabildiğini göstermiştir7. Ek olarak, nematodlar yüzey alanını azaltmak ve su kayıp oranını en aza indirmek için vücutlarını kıvırabilir. Örneğin, Caenorhabditis elegans ozmotik dengeyi düzenleyerek iyonların ve küçük moleküllerin kütikülünden serbestçe geçmesine izin verirken, daha büyük moleküller8 yapamaz. figure-introduction-2 B. xylophilus ayrıca kriptobiyoz sergiler. Kriptobiyozun dehidrasyon ve rehidrasyon aşamaları sırasında, kütikül boyunca madde alışverişini kontrol etmek için ozmotik düzenleme gereklidir, bu da onu kriptobiyoza girmek veya kriptobiyozdan kurtulmak için çok önemli hale getirir9.

Bu çalışma, ozmotik regülasyon yoluyla B. xylophilus'ta figure-introduction-3 kriptobiyozu indüklemek için bir yöntem sunmaktadır. Bu yöntem basit, verimli ve son derece güvenilirdir ve B. xylophilus'unfigure-introduction-4 stres direnci mekanizmalarını araştırmak için teknik destek sağlar.

Protokol

1. B. xylophilus'un figure-protocol-1 Toplanması

  1. P. massoniana'nın enfekte disklerinin toplanması
    NOT: Tüm prosedürler Çam Solgunluğu Hastalığı Salgın Alanı ve Enfekte Ahşap için İdari Tedbirler ve diğer ilgili düzenlemelere uygundur. Zhejiang Eyaleti, Ningbo Şehri, Xiangshan İlçesinde B. xylophilus ile enfekte olmuş bir P. massoniana ormanı örnek bölge olarak seçildi. Çam solgunluğu hastalığından ölen P. massoniana, örnek alan içinde kesildi.
    1. Kesilen ağaçların ana gövdesinin üst, orta ve alt kısımlarından yuvarlak kütükleri (5 cm kalınlığında) toplayın.
    2. Toplanan yuvarlak P. massoniana kütüklerini 0,5-1 cm kalınlığında dilimler halinde kesin, ardından 2-3 cm uzunluğunda küçük şeritler halinde kesin.
    3. Küçük ahşap şeritleri kapalı torbalara koyun ve daha sonra kullanmak üzere bir laboratuvarda saklayın.
  2. B. xylophilus'un ekstraksiyonu figure-protocol-2
    1. Yaklaşık 15 cm çapında uzun boyunlu bir cam huninin dar ucuna lastik bir tüp takın. Lastik boruyu bir kıstırma musluğu ile sabitleyin. Monte edilmiş huniyi bir huni standına yerleştirin.
    2. Küçük ahşap şeritleri tamamen tek bir kağıt mendil tabakasına sarın ve ardından huniye yerleştirin. Tüm ahşap şeritler suya batırılana kadar huniye damıtılmış su ekleyin.
      NOT: 12-24 saat bekletildikten sonra, nematodlar ahşap şeritlerden dışarı çıktı ve huninin10 dibine yerleşti. Kağıt mendil, nematodların geçmesine izin verirken odun kalıntılarının çökmesini engelledi.
    3. Huninin altındaki kıstırma musluğunu yavaşça serbest bırakın ve mikroskobik inceleme ve morfolojik tanımlama için karışımın 2000-5000 μL'sinin bir Petri kabına (5 cm çapında) sızmasına izin verin.
    4. Stileler, medyan özofagus ampulleri, lipid damlacıkları ve "parmak benzeri" kuyruk şekilleri gibi özellikleri gözlemleyerek B. xylophilus'u tanımlayın figure-protocol-311.
    5. Mikroskop altında, her seferinde 10 μL'lik bir pipet kullanarak bir nematod ile birlikte 10 μL sıvıyı aspire ederek tek tek figure-protocol-4 B. xylophilus'u bir slayt üzerine aktarın. Nematod içeren karışımdan yaklaşık 300 μL toplamak için bu işlemi 30 kez tekrarlayın.
    6. B. xylophilus'un ekstraksiyonundan figure-protocol-5 sonra, daha fazla kontaminasyonu önlemek için kalan ahşap şeritleri ve enfekte ahşap malzemeleri sterilize edin.

2. Ozmotik düzenleme proses kontrolü

  1. Ozmotik regülasyon karışımının hazırlanması
    1. % 8 KCl sulu çözelti hazırlayın.
    2. Bir pipet kullanarak, B. xylophilus karışımını figure-protocol-6 içeren slayta 10 μL% 8 KCl sulu çözelti ekleyin, bu da yaklaşık 310 μL'lik bir nematod ve KCl çözeltisi karışımı elde eder.
  2. Artan ozmotik basıncın düzenlenmesi ve B. xylophilus'un figure-protocol-7 dehidrasyonu
    1. Slaytı, suyun doğal olarak buharlaşmasına izin verecek şekilde mikroskop tablasına yerleştirin. Çevredeki ortamın ozmotik basıncını kademeli olarak artıracak ve nematodların yaklaşık 30-60 dakika içinde kurumasına neden olacaktır.
      NOT: Operatörün yalnızca KCL kristalleri çökelene kadar suyun doğal olarak buharlaşmasını beklemesi ve nematodların durumunu mikroskop altında gözlemlemesi gerekir. Karışımın 310 μL'sinin KCL kristalleri çökelene kadar doğal olarak buharlaşması yaklaşık 30-60 dakika sürer.
    2. Mikroskop altında B. xylophilus'un figure-protocol-8 dehidrasyon sürecini (örneğin, vücut kıvrılması, agregasyon, vb.) gözlemleyin. Su tamamen buharlaştığında ve KCl kristalleri çökeldiğinde, figure-protocol-9 B. xylophilus hareket etmeyi durdurur ve kriptobiyoza girer.
  3. Kriptobiyotik figure-protocol-10 B. xylophilus'un düşük sıcaklıkta stres tedavisi
    1. Kriptobiyotik figure-protocol-11 B. xylophilus'u 24 saat boyunca -20 ° C'lik sabit bir sıcaklık ortamına yerleştirin.
  4. Azalan ozmotik basıncın düzenlenmesi ve B. xylophilus'un figure-protocol-12 rehidrasyonu
    1. Pipet ile düşük sıcaklıkta işlem görmüş yavruların etrafına yaklaşık 300 μL damıtılmış su ekleyin. Yaklaşık 30-60 dakika süren rehidrasyon işlemi, çevrelerindeki ortamın ozmotik basıncını kademeli olarak azaltır.
    2. Mikroskop altında B. xylophilus'un figure-protocol-13 rehidrasyon sürecini (örneğin, vücut gerilmesi, hareketin yeniden başlaması vb.) gözlemleyin. 24 saat sonra hayatta kalma oranını hesaplayın.

Sonuçlar

% 8'lik KCl çözeltisinde, su buharlaştıkça, figure-results-1 B. xylophilus başlangıçta hareketli kalırken gözle görülür bir "kıvrılma" sergiledi (Şekil 1A). Su tamamen buharlaştığında, nematodlar hareketi durdurdu ve kıvrıldı, bastırılmış yüzeyler ve birikmiş lipid damlacıkları (Şekil 1B), bu da kriptobiyotik duruma girişlerini gösterdi. Çevrelerine damıtılmış su eklendiğinde, nematodlar yeniden sulandırıldı ve yeniden canlandı (Şekil 1C). Su buharlaştıktan sonra KCL kristalleri görünecektir (Şekil 1D). Şekil 1E, B. xylophilus'unfigure-results-2 morfolojik özelliklerini göstermektedir.

Bir dehidrasyon deneyi, başlangıçtaki %8'lik KCl çözeltisinde su buharlaşmasının B. xylophilus'un su kaybetmesine neden olduğunu figure-results-3 gösterdi. Dehidrasyondan sonra, figure-results-4 B. xylophilus 24 saat boyunca -20 ° C'de düşük sıcaklık stresine maruz bırakıldı; ortalama sağkalım oranı% 92.1 idi11. Kriptobiyotik bir duruma girmemiş kontrol grubunda% 0'lık bir hayatta kalma oranı ile karşılaştırıldığında, yukarıdaki veriler, dehidrasyonun düşük sıcaklık koşulları altında B. xylophilus'un figure-results-5 hayatta kalma oranını önemli ölçüde artırabileceğini düşündürdü.

B. xylophilus'unfigure-results-6 kriptobiyozunu takip eden rehidrasyon fazı sırasında, nematodların 0'ünün @ KCl çözeltisinden damıtılmış suya aktarılırken in vivo "kabarcıklar" sergilediğini gözlemledik (Şekil 2).

figure-results-7
Şekil 1: B. xylophilus'unfigure-results-8 dehidrasyon-kriptobiyoz-rehidrasyon süreci. Bu görüntü, (A) dehidrasyon aşaması, (B) kriptobiyoz aşaması, (C) rehidrasyon aşaması, (D) KCL kristalleşme aşaması ve (E) figure-results-9 B. xylophilus dahil olmak üzere B. xylophilus'takifigure-results-10 kriptobiyoz sürecini göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-11
Şekil 2: Canlanmamış figure-results-12 B. xylophilus'ta yağ granüllerinin birikimi. Bu görüntü, in vivo kabarcık şeklindeki yağ granüllerinin varlığı ile karakterize edilen rehidrasyondan sonra B. xylophilus'un durumunu figure-results-13 göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu çalışmada, B. xylophilus, figure-discussion-1 Zhejiang Eyaleti, Ningbo'da ölü P. massoniana'dan toplanmıştır. B. xylophilus'un figure-discussion-2 farklı instarlara sahip karışık bir popülasyondan seçildiğine dikkat edilmelidir. Spesifik olarak, yüksek yoğunluklu B. xylophilus içeren yuvarlak kütükler seçildi, ardından B. xylophilus'unfigure-discussion-3 taranması izledi. Kış aylarında, Liaoning Eyaletindeki günlük minimum sıcaklık -20 °C civarındayken, bu deneydeseçim sürecini basitleştiren ölü Pinus tabuliformis'ten çok sayıda tek kişilik figure-discussion-4 B. xylophilus elde edilebilir.

Kriptobiyotik süreç sırasında, nematodların yavaş dehidrasyon hızı, hayatta kalmalarına fayda sağlar ve proteinlerinin yapısal olarak zarar görmesini önler13. Dehidrasyon süresi, B. xylophilus'unfigure-discussion-5 hayatta kalma oranını belirlemede kritik öneme sahiptir. Bu çalışmada, %8'lik bir başlangıç konsantrasyonunda bir KCl çözeltisi kullanılmış ve suyun doğal buharlaşması ile konsantrasyonu kademeli olarak arttırılarak B. xylophilus'un yavaşça dehidre olmasına ve kriptobiyoza girmesine izin verilmiştirfigure-discussion-6. Su çok hızlı buharlaşırsa veya nematodlar doğrudan yüksek konsantrasyonlu bir KCl çözeltisine yerleştirilirse, hayatta kalma oranları önemli ölçüde azalır.

Bu çalışmada açıklanan yöntemin çeşitli avantajları vardır. Deney materyallerine kolayca erişilebilir, B. xylophilus'unfigure-discussion-7 dehidrasyonunu ve rehidrasyonunu düzenlemek için sadece KCl çözeltisi ve damıtılmış su gerektirir. Prosedürler basittir: dehidrasyon doğal buharlaşma yoluyla meydana geldi ve damıtılmış su eklenerek rehidrasyon sağlandı. Tüm süreç 2 saat içinde tamamlanabilir. Bu yöntem, yüksek başarı ve sağkalım oranlarına sahiptir, çoğu figure-discussion-8 B. xylophilus dehidrasyondan sonra kriptobiyoza girer ve çoğunluğu rehidrasyondan sonra yeniden canlanır,sırasıyla 11.

Önerilen yöntem, hem B. xylophilus'un hem de figure-discussion-9 dördüncü aşama dispersal juvenillerin kriptobiyotik durumunu düzenlemek için uygulanabilir (figure-discussion-10)14. Bununla birlikte, yayıcı B. xylophilus için etkili olmayabilir.

Son yıllarda, B. xylophilus'un neden olduğu çam solgunluğu hastalığı, güney Çin'den kuzey bölgelerine yayılmıştır. figure-discussion-11 Bu soğuk kuzey bölgelerindeki çam ağaçlarında yaşayan B. xylophilus, soğuğa karşı daha fazla direnç gösterme eğilimindedir15. Önerilen yöntem, B. xylophilus'tafigure-discussion-12 kriptobiyozu indükleyerek soğuğa ve kuraklığa karşı dirençlerini artırabilir. Toplu olarak, bu yöntem B. xylophilus'un stres direnç mekanizmalarını ve çam solgunluğu hastalığının bulaşma mekanizmasını incelemek için teknik destek sağlayabilir.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu araştırma, Ağaç Genetiği ve Islahı Devlet Anahtar Laboratuvarı Merkezi Kamu Yararına Bilimsel Kurum Bazal Araştırma Fonu (hibe numarası CAFYBB2020ZY001-2), Kurumsal araştırma projeleri (202404016-4320) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NSFC 32271896) tarafından finanse edilmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Cam slaytBiyolojik AraziGS7101-7525 Serisi75 mm &zamanlar; 25 mm &zamanlar; 1 mm
Uzun boyunlu cam huniNanjing Kangluoda Deneysel TeknolojisiYOK150 mm
MikroskopPhenixXSP-35-1600XPH100-2B41L-IPL
Petri kabıNanjing Kangluoda Deneysel Teknolojisi  TB-624935792745 (İngilizce)50 mm &kez; 50 mm
Çimdik horozuNanjing Kangluoda Deneysel Teknolojisi  TB-62497331174336 mm &süre; 11 mm  &zamanlar; 55 mm
PipetEppendorf Belediyesi312300001210– 100 &mikro; L
Potasyum klorür (KCL)Solarbio Yaşam BilimleriP9921500 gr
Kauçuk boruNanjing Kangluoda Deneysel TeknolojisiTB-6249234570947 mm & zamanlar; 5 mm
SterilizatörBinJiang https://detail.1688.com/offer/644766597053.html?_t=1730892390541&spm=
a2615.7691456.co_0_0_wangpu
_score_0_0_0_0_1_0_0000_0.0		75 L
Doku kağıdı Kalpten kalbe baskıM322,5 cm &zaman; 21,5 cm

Kaynaklar

  1. Li, Y., Zhang, X. Analysis on the trend of invasion and expansion of Bursaphelenchus xylophilus. Forest Pest and Disease. 37 (5), 1-4 (2018).
  2. Futai, K. Pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Annu Rev Phytopathol. 51 (51), ?61(2013).
  3. Crowe, J. H., Cooper, A. F. Cryptobiosis. Sci Am. 225, 30-36 (1971).
  4. Wharton, D. A. Anhydrobiosis. Curr Biol. 25, 1107-1125 (2015).
  5. Browne, J., Tunnacliffe, A., Burnell, A. Anhydrobiosis: plant desiccation gene found in a nematode. Nature. 416 (6876), 38(2002).
  6. Shatilovich, A. V., et al. Viable nematodes from late Pleistocene permafrost of the Kolyma river lowland. Dokl Biol Sci. 480 (1), 100-102 (2018).
  7. Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. Osmotic regulation of seamless tube growth. Nat Cell Biol. 15 (2), 137-139 (2013).
  8. Erkut, C., et al. Trehalose renders the dauer larva of Caenorhabditis elegans resistant to extreme desiccation. Curr Biol. 21 (1), 1331-1336 (2012).
  9. Pan, L., et al. Third-stage dispersal juveniles of Bursaphelenchus xylophilus can resist low-temperature stress by entering cryptobiosis. Biology. 10 (8), 785(2021).
  10. Mao, X. F., Li, H. X., Chen, X. Y., Hu, F. Extraction efficiency of soil nematodes by different methods. Chinese J Ecol. 23 (3), 149-151 (2004).
  11. Pan, L., et al. Isolation and identification of pine wood nematode in Pinus koraiensis in Fengcheng, Liaoning province. Forest Pest and Disease. 38 (1), 4(2019).
  12. Pan, L., Cui, R., Li, Y., Feng, Y., Zhang, X. Investigation of pinewood nematodes in Pinus tabuliformis Carr. under low-temperature conditions in Fushun, China. Forests. 11 (9), 993(2020).
  13. Madin, K. A. C., Crowe, J. H. Anhydrobiosis in nematodes: Carbohydrate and lipid metabolism during dehydration. J Exp Zool. 3, 193(2010).
  14. Wharton, D. A. Anhydrobiosis: The model worm as a model. Curr Biol. 21 (15), 578-579 (2011).
  15. Li, Y., Zhang, X. High risk of invasion and expansion of pine wood nematode in the middle temperate zone of China. J Temperate Res. 1 (1), 4(2018).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kriptobiyoz nd ksiyonuam Orman Nematodunc Evre JuvenillerAnhidrobiyozDehidrasyon ProtokolD k S cakl k StresiPotasyum Klor r zeltisiRehidrasyon Sa kal m

İlgili makaleler