İnsan Trombositlerinde Doku Faktörü İfadesinin Akış Sitometrisi Analizi

Özet

Bu makale, tüm kan akışı sitometrisi kullanılarak Doku Faktörü (TF) pozitif trombositlerin yüzdesinin nicelendirilmesi protokolünü özetlemekte ve proteinin değerlendirilmesini sunmaktadır: (1) dinlenme koşullarında hücre içi ve (2) hücre yüzeyinde, hem dinlenme hem de aktif koşullarda. Trombosit açısından zengin plazmada TF-pozitif trombositlerin değerlendirilmesi için de rehberlik sağlanmaktadır.

Özet

Dolaşımdaki insan trombositlerinin bir alt kümesi, kan pıhtılaşma kaskadı ve trombus oluşumunun ana aktivatörü olan Doku Faktörünü (TF) hücre içi olarak depolar. Trombosit aktivasyonu sırasında TF hücre zarına maruz kalır ve burada FVII'ye bağlanır ve nihayetinde trombin oluşumuna yol açar. (1) TF-pozitif trombosit seviyelerinin çeşitli klinik ortamlarda arttığı, hastanın protrombotik fenotipine katkıda bulunduğu ve (2) farklı ilaçların trombosit ilişkili TF ifadesini modüle edebildiği göz önüne alındığında, TF-pozitif trombositleri değerlendirmek için standartlaştırılmış bir yöntem değerlidir; çünkü bu değerlendirme geçmişte tartışmalı olmuştur. Burada, tam kan ve trombosit zengin plazma (PRP)/yıkanmış trombositlerde akış sitometrisi kullanılarak TF-pozitif trombositlerin yüzdesini ölçmek için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, proteinin (1) dinlenme koşullarında hücre içi ve (2) hem dinlenme hem de aktive koşullarda hücre yüzeyinde değerlendirilmesiyle TF-pozitif trombosit yüzdesinin ölçülmesi için ayrıntılı talimatlar sunmayı amaçlamaktadır. İlk bölüm, kan çekilmesinin doğru şekilde yapılması için temel bilgileri sunar ve ön analitik prosedürlerin sonuçları etkilememesini sağlar. Sonrasında protokol, akış sitometrisi analizi için örnek hazırlama ve etiketleme prosedürlerine odaklanır. Hücre uyarımı, etiketleme, fiksasyon ve permeabilizasyon için ayrıntılı adımlar — gerekirse — özetlenir. Son olarak, trombosit popülasyonunu doğru şekilde tanımlamak ve TF-pozitif olayları analiz etmek için akış sitometrisi ayarları talimatları açıklanır. Son olarak, yöntem, TF-pozitif trombositlerin izole trombositlerde ölçülmesi için PRP hazırlanma prosedürünü içerir. Trombositlerin yalnızca bir alt kümesi TF içerdiğinden, PRP elde etmek için gereken santrifüj adımlarında bu trombositlerin kaybedilmemesi önemlidir.

Giriş

Doku Faktörü (TF), kan pıhtılaşma kaskadının ana aktivatörü ve transmembran glikoprotein olarak, özellikle daha büyük^boyutlu olanlar olan insan^{trombositlerinin} ~%20-%30'u olan bir alt küme (%20-%30) tarafından ifade edilir. Adenozin difosfat (ADP) ve trombin gibi klasik trombosit agonistleri tarafından aktive edildiğinde, trombositler yüzeylerinde konsantrasyona bağlı olarak fonksiyonel olarak aktif TF'yi açığa çıkarır; bu da faktör VII/VIIa'ya bağlanır ve nihayetinde^{trombin oluşumu} 1,3,4,5,6'ya yol açar. Özellikle, koroner arter hastalığı (CAD)⁷, şiddetli akut respirator solunum sendrom-koronavirüs-2 (SARS-CoV-2)^{enfeksiyonu 8}, patent foramen ovale (MHA-PFO)⁹ ile ilişkili aura içeren migren, kanser¹⁰ ve sepsis¹¹ gibi patolojik durumlarda, TF-pozitif trombositlerin sayısı önemli ölçüde artar ve bu klinik ortamlarda gözlemlenen trombotik riskin artmasına katkıda bulunur.

Bu ikna edici kanıta rağmen, TF-pozitif trombositlerin tespiti bilim camiasında tartışma konusu^{olmaya devam etmektedir 6,12,13}. Analitik öncesi değişkenler, örnek hazırlığı ve antikor özgüllüğü gibi metodolojik zorluklar, ^2,4,12,14 literaturasında bildirilen çelişkili sonuçların olası nedenleri olarak öne sürülmüştür. Bu nedenle, insan trombositlerinde TF ölçümü için iyi tanımlanmış bir protokole dayalı standart bir test oluşturmak çok önemlidir.

Bu bağlamda, tüm kan akışı sitometrisi, TF-pozitif trombositlerin minimal örnek işleme ile analizini sağlayan tek teknolojidir ve bu trombosit alt kümesinin kaybını önlemek için çok önemlidir.

Bu makalede, tüm kan akışı sitometrisi kullanılarak trombosit ilişkili TF ölçümü için bir protokol öneriyoruz; proteini (1) dinlenme koşullarında hücre içi olarak ve (2) hem dinlenme hem de aktif koşullarda hücre yüzeyinde değerlendiriyoruz. Trombosit zengin plazmada (PRP) TF-pozitif trombositlerin değerlendirilmesi gerektiği için talimatlar da verilir.

Protokol

Protokol, kurumun Etik Komitesi tarafından onaylandı (no.70/24, CE 18.06.24) ve tüm kan bağışçılarından yazılı bilgilendirilmiş onay alındı. Protokol, kullanıcıyı yedi ana adımda yönlendirecektir (Şekil 1). İlk adım, kan örnekleme prosedürünü ele alır. 2. ve 3. adımlar, fikoeritrin (PE) etiketli αCD142/HTF1 monoklonal antikor (mAb) kullanılarak hücre içi TF ekspresyonunun analizi için antikor titrasyon protokolü ve örnek hazırlamayı özetler. 4. adım, trombosit yüzeyine maruz kalan proteinin αCD142/HTF1 mAb ile dolaylı boyama yöntemiyle değerlendirilmesi protokolünü açıklar. Florokromun sterik engellemesi nedeniyle, hücre içi boyama için kullanılan PE etiketli mAb yüzeye maruz kalan proteinin katalitik alanına bağlanmaz. Bu nedenle, Alexa Fluor 633 etiketli ikincil mAb ile dolaylı boyama protokolü önerilmektedir. 5. ve 6. adımlar akış sitometrisi analizinin aşamalarını detaylandırır. Son adım, büyük trombosit alt popülasyonunun kaybını önlemek için trombosit açısından zengin plazmanın (PRP) hazırlanması prosedürünü özetlemektedir. Kullanılan reaktifler ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Kan yoksunluğu

NOT: İnsan kanı alımı yalnızca Etik Komite onayı alındıktan sonra yapılmalıdır.

1. Periferik venöz infüzyonlardan etkilenmeyen bir koldan, tercihen antekübital venden periferik venöz veya iğne kanülü ile kan örnekleri alın.
   1. Periferik venöz örnekleme için turnike uygulanır ve damara G19 kelebek iğnesi soktuğunuz, trombosit aktivasyonunu önlemek için çıkarın (Şekil 2).
      NOT: Trombosit aktivasyonunu önlemek için G21'den küçük kelebek iğnesi kullanmayın.
   2. İğne-kanül ile venöz numune almakta, örnekleme sırasında turnike uygulanmaz. Gerekirse, numuneyi almadan önce %0,9 tuzlu su çözeltisiyle yıkayın. Tüpleri doldurmaya başlamadan önce her zaman ilk 5 mL kanı at.
2. 2 mL kan EDTA vakutainerine alın (kan hücresi sayısı için kullanılacak). Kan ve antikoagülantı tam karıştırmak için tüpü üç kez nazikçe karıştırın.
3. Trombosit ilişkili TF ekspresyonunun analizi için 0.129 M sodyum sitrat vakutainerine kan alın. Doğru kan/antikoagülan oranını korumak için vakutaneri dikkatlice belirtilen seviyeye kadar doldurun. Tüpleri beş kez nazikçe ters çevirerek kanın antikoagülanla tam karışmasını sağlayarak pıhtı oluşumunu ve örneklerde hemolizi önlenir.
   NOT: αCD142 mAb'ın HTF1 klonu ile trombosit ilişkili TF tespit edilmesini optimize etmek için 0.129 M sitrat antikoagülansının kullanılması önerilir. Trombositlerin tam kandan izole edilmesi gerekirse, trombosit açısından zengin plazma (PRP) hazırlamak için ikinci bir 0,129 M sodyum sitrat vakutaineri alın.
4. Elektrikli süpürgeleri tüp tutucuda dik tutun. Dönen veya eğinen plakalarda onları sallamayın ve pnömatik taşıma sistemlerinden kaçının. Trombosit aktivasyonunu önlemek için kan örneklerini buzdolabında saklamayın.
   NOT: Kan örnekleri, TF ile birlikte başka bir granül ilişkili trombosit aktivasyon belirteci ölçülecekse, çekilmeden sonra 15 dakika içinde işlenmelidir. Aksi takdirde, örnekler toplanmadan en geç 3 saat içinde işlenmelidir (Şekil 3).

2. Anti-TF antikorunun titrasyonu (hücre içi TF değerlendirmesi için)

NOT: Hücre içi depolanan TF belirlenmesi PE-αCD142/HTF1 mAb kullanılarak gerçekleştirilir.

1. Boncuklarla antikor titrasyonu
   NOT: Boncukların kullanımı, kullanılacak doğru antikor miktarının tanımlanmasına olanak tanır (yani, pozitif ve negatif örnekler arasında floresan zirvelerinin en büyük ayrımını sağlayan antikor konsantrasyonu). Bu analiz, biri gerçekten pozitif diğeri gerçekten negatif olmak üzere iki örnek kullanılarak yapılır. Antikor konsantrasyonu üretici tarafından bildirilmez ( bkz. Materyal Tablosu), bu nedenle antikor titrasyonu beş seyreltme noktası kullanılarak yapılır.
   1. Antikoru 17.000 x g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın. Beş antikor seyreltme noktasını hazırlamak için, 40 μL antikoru tüp 1'e ve 20 μL PBS tüpleri 2'den 5'e kadar pipetleyin. Dört ardışık seri 1:2 seyreltme yapın; 20 μL tüpten 2-ye ve ardından 2. tüpten sonra aktarın.
   2. Test için her antikor hacmi için bir test tüpü hazırlayın. Her test tüpüne bir damla negatif boncuk ve bir damla pozitif boncuk ekleyin. Her antikor seyreltmesinden 20 μL test tüpüne ve girdaba hemen ekleyin. Oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika kuluçka yapın.
   3. Her tüp ve girdava 1 mL 1x PBS (Ca⁺⁺ ve Mg⁺+) içermeyen pH 7.4 ekleyin.
   4. Numuneleri üreticinin talimatlarına göre akış sitometresindeki örnekleri alın ve "boncuk" kapısında 10.000 olaydan oluşan bir veri dosyası kaydedin. Optimal antikor konsantrasyonu, pozitif ve negatif zirveler arasında en büyük ayrımı sağlayan olanıdır.
2. Trombositlerde antikor titrasyonu
   NOT: Kural olarak, boncuklarla belirlenen optimal antikor konsantrasyonu boyanacak hücrelerde doğrulanmalıdır - bu durumda tam kandaki trombositler.
   1. Takıntı
      1. Sodyum sitrat vakutainerini beş kez nazikçe ters çevirerek kan ve antikoagülantı iyice karıştırın. 50 μL kan 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın, 950 μL %1 paraformaldehit (PFA) ekleyin, numuneyi nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 90 dakika kuluçka yapın.
      2. Numuneyi 1.500 x g sıcaklıkta, 5 dakika boyunca frenle oda sıcaklığında santrifüjlen.
      3. Üst sıvıyı çıkarın ve pelleti 1 mL 1x PBS'ye nazikçe pipetleyerek Ca⁺⁺ ve Mg^{++ olmadan tekrar süzülün,} pH 7.4.
   2. Permeabilizasyon
      1. Test edilecek her antikor hacmi için bir tüp hazırlayın (boncuk titrasyonu ile tanımlanan hacmi daha yüksek ve daha düşük seyreltme ile birlikte test edin; örneğin, tanımlanan hacim 5 μL ise 10 μL, 5 μL, 2,5 μL) ve Floresans Eksi Bir (FMO) kontrolü için bir tüp.
      2. Her tüpte 100 μL sabit kan dağıtın ve 1.500 x g sıcaklığında, oda sıcaklığında frenle birlikte 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
      3. Üst yüzeyi çıkarın, pelleti 100 μL %0,1 Triton-PBS ile tekrar süslü bırakarak örnekleri geçirebilir hale getirin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın.
   3. Boyama
      1. Antikoru 17.000 x g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın. 2.2.2.1'de belirlendiği şekilde her test tüpüne gerekli antikor hacimlerini ekleyin ve karıştırın.
      2. Örnekleri oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika kuluçkaya geçirin.
      3. Her tüpte 300 μL 1x PBS Ca⁺⁺ ve Mg⁺+ içermeden, pH 7.4 ekleyin ve karıştırın. Akış sitometresinde örnekleri alın (bkz. adım 5).
      4. Leke indeksini aşağıdaki^{formüle göre hesaplayın: 15}:
                                
         burada MFI_pos pozitif olayların Ortalama Flüoresans Yoğunluğu, MFI_neg negatif olayların yoğunluğu ve SD negatif popülasyonun Standart Sapmasıdır.
      5. En yüksek leke indeksini sağlayan en düşük antikor konsantrasyonunu seçin.
         NOT: Mevcut deneysel koşullarda, PE-αCD142/HTF1 mAb için en yüksek leke indeksi 5 μL antikor kullanılarak elde edilir.

3. Hücre içi TF ekspresyonunun akış sitometrisi analizi için örnek hazırlığı

1. Tam kan fiksasyonu ve permeabilizasyonu
   1. Hücre içi TF analizi için, 2. adımda belirtilen prosedüre göre tam kanı sabitleyip geçirimlileştirin.
2. Boyama prosedürü
   NOT: Aşağıdaki protokolde, trombosit popülasyonu αCD61-PerCP boyama kullanılarak tanımlanır. Operatörün takdirine bağlı olarak diğer nüfus göstergeleri de kullanılabilir.
   1. Floresans Minus One (FMO) kontrolü için bir tüp, TF boyama için bir tüp hazırlayın. Her tüpte 100 μL sabit ve permeabilize tam kan ile birlikte Tablo 1'de listelenen antikorlar eklenin.
   2. Örnekleri oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika kuluçkaya geçirin.
   3. Her tüpte 300 μL 1x PBS Ca⁺⁺ ve Mg⁺+ içermeden, pH 7.4 ekleyin ve karıştırın. Boyalı örnekleri akış sitometrisi analizine kadar karanlıkta saklayın (bkz. adım 5).
      NOT: Tazminat matrisini hesaplamak için, örnekleri Tablo 2'de açıklandığı şekilde hazırlayın.

4. Dinlenme ve aktive trombositlerde hücre yüzeyiyle ilişkili TF ekspresyonunun akış sitometrisi analizi için örnek hazırlama

NOT: Hücre yüzeyiyle ilişkili TF tespit için, sinyal algısı için ikincil antikor olarak etiketlenmemiş αCD142/HTF1 mAb (1 mg/mL) ve Alexa Fluor 633 keçi anti-fare IgG (2 mg/ml) kullanın. Adenozin 5'-difosfat (ADP), hücre yüzeyinde TF maruziyetini sağlamak için trombosit agonisti olarak kullanılır. PE etiketli bir antikor, yayılmayı en aza indirmek için trombosit popülasyon belirtisi olarak kullanılır ve bu sinyal telafisi ile kontrol edilir.

1. TF boyama
   1. αCD142/HTF1 mAb 1:100 hassasiyetinde 1x PBS ile Ca⁺⁺ ve Mg⁺+ olmadan seyreltirin, pH 7.4, böylece 10 μg/mL çalışma konsantrasyonu elde edilir. Alexa Fluor 633 keçi fare karşıtı IgG 1:10 oranında Ca⁺⁺ ve Mg⁺+ olmadan 1x PBS, pH 7.4 olarak seyreltirin; böylece çalışma konsantrasyonu 200 μg/mL elde edilir.
   2. Üç örnek tüpünü hazırlayın ve Tablo 3'te belirtildiği gibi Ca⁺⁺ ve Mg⁺⁺ olmadan 1x PBS, pH 7.4 dağıtın.
   3. 7,5 μL seyreltilmiş αCD142/HTF1 mAb dağıtın ve 5 μL ADP (200 μM) ekleyin, böylece nihai konsantrasyon 10 μM ADP elde edilir. Sitrat vakutainer'i nazikçe 5 kez ters çevirerek kan ve antikoagülanı iyice karıştırın, ardından her tüpte 5 μL tam kan dağılın. Örnekleri nazikçe karıştır.
   4. Örnekleri oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka altına alın.
2. Örnek fiksasyonu
   1. Her örneği 300 μL %1 paraformaldehit (PFA) ekleyerek sabitleyin ve örnekleri oda sıcaklığında 1 saat kuluçka edin.
      NOT: %1 PFA ile sabitlenmiş ve 4 °C'de saklanan etiketlenmiş örnekler 4 güne kadar stabil kalır.
   2. Her tüpe 300 μL 1x PBS (Ca⁺⁺ ve Mg⁺+) olmadan pH 7.4 ekleyin ve 1500 x g sıcaklıkta 5 dakika boyunca oda sıcaklığında frenle santrifüj yapın.
   3. Üst maddeyi çıkarın ve peleti 95 μL 1x PBS ile Ca⁺⁺ ve Mg++ (pH 7.4) olmadan nazikçe pipetle tekrar askıya alın.
3. İkincil antikorla boyama
   1. 5 μL seyreltilmiş Alexa Fluor 633 IgG dağıtın ve örnekleri oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika kuluçka edin.
   2. Her tüpe 300 μL 1x PBS (Ca⁺⁺ ve Mg⁺+) olmadan pH 7.4 ekleyin ve 1500 x g sıcaklıkta 5 dakika boyunca oda sıcaklığında frenle santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve pelleti Ca⁺⁺ ve Mg⁺⁺ olmadan 95 μL 1x PBS'ye, pH 7.4 olmadan yeniden askıya alın.
   3. Her tüpte 5 μL αCD41-PE dağıtın ( bkz. Tablo 4). Örnekleri oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika kuluçkaya geçirin.
   4. Her tüpte 300 μL 1x PBS Ca⁺⁺ ve Mg⁺+ içermeden, pH 7.4 ekleyin ve karıştırın.
   5. Lekeli örnekleri akış sitometrisi analizine kadar karanlıkta saklayın (bkz. adım 6).
      NOT: Tazminat matrisini hesaplamak için, örnekleri Adım 4.1-4.3'e göre ve Tablo 5 ile Tablo 6'da belirtildiği şekilde hazırlayın.

5. Hücre içi TF ekspresyonunun akış sitometrisi analizi

NOT: Aşağıdaki prosedür, referans akış sitometresindeki alımlara atıfta bulunur; Bu nedenle, bildirilen ortamlar ve grafikler temsil edici olarak kabul edilmelidir. Protokol, herhangi bir yüksek duyarlı, yeni nesil akış sitometresine uygulanabilir. Lazer stabilitesini sağlamak için numune alımından çok önce akış sitometresini açın. Sıvı ve akış hücresini iyice yıkayın, çünkü trombositler küçüktür ve herhangi bir hücre kalıntısı, ön saçılım alanı/yan saçılma alanı (FSC-A/SSC-A) nokta grafikinde trombosit popülasyonunun görselleştirilmesini engelleyebilir. Üreticinin talimatlarına göre kalite kontrolünü QC boncuklarıyla yapın ve sıvıları tekrar yıkarak kalan boncukları çıkarın.

1. Satın alma kurulumu
   1. Tüm Olayları gösteren bir log ölçeğinde bir FSC-A/SSC-A nokta grafiki oluşturun (Şekil 4A). Tüm Olayları gösteren bir log ölçeğinde CD61-A/SSC-A nokta grafiki oluşturun (Şekil 4B).
   2. PE (Y-585) ve PerCP (B690) kazancını günlük kalite kontrolüne göre ayarlayın. Trombosit popülasyonunu görselleştirmek için eşik değerini yaklaşık SSC-H için 2000, PerCP (B690-H) için ise 1000 olarak ayarlayın. Akış hızını DÜŞÜK olarak ayarlayın.
   3. Trombosit popülasyonunu belirlemek için 10³ ile 10⁵ arasında "CD61⁺" adlı bir bölge çizin.
   4. Telafi matrisini hesaplamak ve ardından örnekleri toplamak için tek boyalı kontroller edinin. "CD61⁺" kapısında 10.000 olaydan oluşan bir veri dosyasını kaydedin (Şekil 4D,E). Örnek edinmeye başladıktan 5-10 saniye sonra kaydetmeye başlayın.

6. Yüzey TF ifadesinin akış sitometrisi analizi

1. Tüm Olayları gösteren bir log ölçeğinde FSC-A/SSC-A nokta grafiki oluşturun (Şekil 5A), ve Tüm Olayları gösteren log ölçeğinde CD41-A/SSC-A nokta grafiki oluşturun (Şekil 5B).
2. Alexa Fluor 633 kazancı ve PE (Y-585) kazancını günlük kalite kontrolüne göre ayarlayın, trombosit popülasyonunu Şekil 5B'de görselleştirmek için eşiği SSC-H için yaklaşık 1000, PE (Y585-H) için ise 2500 olarak ayarlayın. Akış hızını DÜŞÜK olarak ayarlayın.
3. Trombosit popülasyonunu belirlemek için 10⁴ ile 10 5 arasında "CD41⁺" adlı bir bölge çizin.
4. Telafi matrisini hesaplamak ve ardından örnekleri toplamak için tek boyalı kontroller edinin. "CD41⁺" kapısı içinde 10.000 olaydan oluşan bir veri dosyasını kaydedin (Şekil 5D,E). Örnek edinmeye başladıktan 5-10 saniye sonra kaydetmeye başlayın.

7. Trombosit açısından zengin plazmada TF-pozitif trombositlerin analizi

1. Trombosit açısından zengin plazma (PRP) hazırlama
   NOT: Hücre aktivasyonunu önlemek için trombosit izolasyonu oda sıcaklığında yapılmalıdır. Reaktiflerin ve aletlerin sıcaklığının 18 °C ile 22 °C arasında olduğundan emin olun. İşlem boyunca hızlı pipetleme ve yoğun sarsıntılardan kaçının.
   1. 0.129 M sodyum sitrat vakutainer'i nazikçe 5 kez karıştırın ve trombosit sayısını kan hücresi sayacı üzerinde iki kez ölçün, böylece geri kazanılan trombosit yüzdesini hesaplayın.
      NOT: İki belirlemenin ortalama değerini trombosit konsantrasyonu olarak kullanın.
   2. 0,129 M sodyum sitrat vakutaneri 100 x g boyunca, frensiz, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca santrifüj yapın (Şekil 6). Elde edilen PRP'yi toplayın, 10 mL'lik bir polipropilen tüpüne aktarın ve toplanan hacmi kaydedin.
      NOT: Trombosit aktivasyonunu önlemek için polistiren tüpleri kullanmayın.
   3. Kan hücresi sayacı kullanarak PRP'de trombositleri iki kez sayın ve trombositlerin iyileşme yüzdesini aşağıdaki şekilde hesaplayın:
      
      NOT: Eğer iyileşme %65'in altındaysa, trombosit popülasyonu tam kanda bunu tam olarak temsil etmez. Hazırlıkları atmayı düşünün.
2. PRP'de hücre içi ve yüzeyle ilişkili TF ekspresyonunun akış sitometrisi analizi için örnek hazırlığı
   1. PRP'de hücre içi ve yüzeye bağlı TF ekspresyonunu analiz etmek için, tam kan analizi için tanımlanan aynı protokolü kullanın (bkz. 3-6. adımlar).

Sonuçlar

Trombosit ilişkili TF ifade analizinin özeti, Şekil 1'de gösterilen akış diyagramında açıklanmıştır. Adımlar şunları içerir: (1) Kan Toplama: İnsan periferik damarından, tercihen antekubital damardan, turnike olmadan G19 kelebek iğnesi veya iğne-kanül ile ve antikoagülant içeren vakutanerlerle kan toplamak. (2) Numune İşleme: Örnekleri yapılacak TF değerlendirme türüne göre işleyin. (3) Örnek Etiketleme: Örnekleri spesifik antikorlarla etiketleyin. (4) Akış Sitometrisi Analizi: Yüzey ve hücre içi TF tespit etmek için örnekleri analiz edin.

Kan yoksunluğu sırasında, trombosit aktivasyonunu önlemek için özel dikkat gösterilmelidir. Bu amaçla iki önlem uygulanır: iğneyi damara soktuktan kısa süre sonra turnike çıkarılması ve ilk çekilen vakutainerdeki kanı atmak. Turniket kullanılmadan, FSC-A/SSC-A nokta grafikinde gösterilen trombosit popülasyonu, Şekil 2A'da gösterildiği gibi tipik bir şekle sahiptir. Buna karşılık, turnike kullanımıyla trombosit popülasyonunun fiziksel özellikleri, ADP gibi klasik trombosit agonisti ile uyarıldıktan sonra gözlemlenen morfolojiye benzeyen uzun bir şekil elde eder (Şekil 2B,C).

Trombosit ilişkili TF ekspresyonunun zaman içinde stabilitesini değerlendirmek için yapılan deneyler, kan alımından sonra 3 saat boyunca stabil olduğunu göstermiştir (Şekil 3). TF ekspresyonunun ölçümü, P-selektin gibi trombosit aktivasyonunun bir belirteçiyle birleştirildiğinde, trombosit degranülasyonunu önlemek için kan örneğinin mümkün olan en kısa sürede işlenilmesi tavsiye edilir.

Hücre içi depolanan TF analizi için, tam kan %1 PFA ile sabitlenir, PBS-Triton ile permeabilize edilir ve ardından PE etiketli bir antikor ile boyanır. Trombosit popülasyonu, logaritmik FSC-A/SSC-A grafikinde (Şekil 4 A,D) ve αCD61 mAb boyama ile (Şekil 4 B,E) tanımlanmıştır. Sağlıklı bireylerde hücre içi TF analizinden elde edilen sonuçlar (n = 377), TF'nin dolaşımdaki trombositlerin %26,8 ± %4,8'i içinde bulunduğunu göstermiştir (Şekil 4F).

Yüzeyle ilişkili TF ekspresyonunun akış sitometrisi analizi, dinlenme koşullarında ve ADP 10 μM ile hücre uyarısı sonrası yapılmıştır. αCD41 mAb ile işaretlenmiş tüm kan trombosit popülasyonu, logaritmik FSC-A/SSC-A grafikinde tanımlanmıştır (Şekil 5A,B). Sonuçlar, sağlıklı bireylerde (n = 377) TF'nin dinlenme trombositlerinin %2,8 ± %1,4'ü ile ifade edildiğini (Şekil 5D-F) ve aktivasyonda %24,5 ± %5,8'e kadar arttığını göstermiştir (Şekil 5G-I). TF, en büyük boyuta sahip trombosit alt kümesiyle ifade edilir (Şekil 5D,G, yeşil noktalar). Ayrıca, görüntüleme akışı sitometrisiyle yapılan analiz, TF sinyalinin yalnızca αCD61 pozitif olaylarla ilişkili olduğunu, αCD45 pozitif olaylarla ilişkili olmadığını ortaya koymaktadır (Şekil 7).

Daha önce belirtildiği gibi, TF, tüm popülasyon içinde en büyük büyüklüğüyle karakterize edilen trombosit alt kümesinde depolanır. Bu nedenle, PRP hazırlığı sırasında bu trombosit fraksiyonunu kaybetmemek önemlidir. Yöntem bölümünde (adım 7) verilen endikasyonlara göre, PRP içinde tam kanda olan trombosit popülasyonunu temsil eden bir popülasyonun izole edilmesi mümkündür. Şekil 6'da gösterildiği gibi, 100 x g tam kan santrifüjiyle elde edilen trombosit popülasyonunun akış sitometrisi nokta grafiği, FSC dağılımı açısından tam kan popülasyonuna çok benzerdir (Şekil 6 A,B). Buna karşılık,^{literatürde sıkça bildirildiği gibi} daha yüksek kuvvet ve daha uzun santrifüj süresi kullanılarak, 12,14,16 literatüründe sıkça bildirildiği gibi, kurtarılan trombosit popülasyonunda tam kan ile karşılaştırıldığında daha düşük FSC bulunur (Şekil 6C), bu da yüksek TF-pozitif olan büyük büyüklükteki trombositlerin kaybını gösterir.

Şekil 1: Trombosit ilişkili TF ifade analizi ve trombosit izolasyonu için şematik diyagram. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Tüm kan akışı sitometrisiyle analiz edilen trombosit popülasyonunun temsil yoğunluk grafikleri. (A) Turnikesiz alınan kan örneğinde trombosit popülasyonu veya (B) turniketle analiz edilmiş. (C) ADP ile uyarılmış trombosit popülasyonu karşılaştırma için rapor edilmiştir. Beyaz Kan Hücreleri; RBC: Kırmızı kan hücreleri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Hücre yüzeyiyle ilişkili TF ifadesinin zaman içinde kararlılığı. Dinlenme trombositlerinin trombositle ilişkili TF ekspresyonu x ekseninde kan çekilmesinden sonra 4 farklı zaman noktasında analiz edildi ve x-ekseninde şu şekilde bildirildi: T0 = kan aldıktan hemen sonra; T1 = kan aldıktan sonra 1 saat; T2 = kan aldıktan sonra 2 saat sonra; T3 = kan aldıktan sonra 3 saat. Veriler ortalama SD ± n = 3 olarak rapor edilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Hücre içi depolanan TF'nin temsil akış sitometrisi analizi. Tam kandaki trombosit popülasyonu (kırmızı) FSC/SSC-A nokta grafikinde (A,D) ve αCD61 mAb boyama (B,E) ile tanımlanmıştır. TF ifadesi PE- αCD142/HTF1 mAb (yeşil noktalar) kullanılarak analiz edilir. Histogram grafikleri, negatif (C) ve pozitif (F) olayları tanımlamak için kullanılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Yüzeye bağlı TF-pozitif trombositlerin temsil akış sitometrisi analizi. Taze tam kan αCD142/HTF1 mAb ile etiketlenir, ardından %1 PFA ile sabitlenir ve ikincil mAb ile αCD41 mAb ile etiketlenir. Tam kandaki trombosit popülasyonu (kırmızı) FSC/SSC-A nokta grafikinde (A,D,G) ve αCD41 mAb boyama (B,E,H) ile tanımlanmıştır. Dinlenme durumunda (D-F) ve ADP uyarısından (G-I) sonra TF ekspresyonu αCD142/HTF1 mAb (yeşil noktalar) ile etiketlenerek nicelendirilir. Negatif (C) ve pozitif (F,I) örneklerin temsilci histogram grafikleri rapor edilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Farklı santrifüj kuvvetlerinin PRP hazırlığı üzerindeki etkisi. (A-C) Tüm kandaki trombosit popülasyonunun akış sitometrisi analizi, PRP 100 x g ve 350 x g ile hazırlanmıştır. FSC-H/SSC-H üzerindeki trombosit popülasyonunun referans aralığı noktalı çizgilerle gösterilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Trombositlerde ve lökositlerde TF ekspresyonunun görüntüleme akış sitometrisi ile değerlendirilmesi. 60x büyütmede elde edilen parlak alan (BF, gri), Doku Faktörü (TF, yeşil), αCD61 (kırmızı), αCD45 (gri), Hoechst ile çekirdek boyama (magenta) ve bileşik görüntünün (birleşme) temsil kanal görüntüleri gösterilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Örnek tüp kimliği	Tam kan (μL) düzeltme/kalıcı	αCD142-PE (μL)	αCD61-PerCP (μL)
FMO	100	-	15
TF	100	5	15

Tablo 1: Hücre içi TF ekspresyonunun akış sitometrisi analizi için boyama protokolü.

Örnek tüp kimliği	Tam kan (μL) düzeltme/kalıcı	αCD142-PE (μL)	αCD61-PerCP (μL)
Lekelenmemiş	100	-	-
αCD142-PE	95	5	-
αCD61-PerCP	85	-	15

Tablo 2: Hücre içi TF ekspresyonunun telafi matrisi için tek boya kontrolü.

Örnek tüp kimliği	PBS 1x (μL)	αCD142 (μL)	ADP (μL)	Taze tam kan (μL)	PFA %1 (μL)
FMO	95	-	-	5	300
Dinlenme	87.5	7.5	-	5	300
ADP Aktif Oldu	82.5	7.5	5	5	300

Tablo 3: Yüzey TF ifadesinin akış sitometrisi analizi için boyama protokolü.

Örnek tüp kimliği	PBS 1x (μL)	Alexa Fluor 633 IgG (μL)	αCD41-PE (μL)
FMO	90	5	5
Dinlenme	90	5	5
ADP Aktif Oldu	90	5	5

Tablo 4: Yüzeyle ilişkili TF analizi için ikincil antikor boyama protokolü.

Örnek tüp kimliği	PBS 1x (μL)	αCD142 (μL)	ADP (μL)	Taze tam kan (μL)	PFA %1 (μL)
Lekelenmemiş	90	-	5	5	300
TF + Alexa Fluor 633 IgG	82.5	7.5	5	5	300
αCD41-PE	90	-	5	5	300

Tablo 5: Hücre içi TF analizi için telafi matris hazırlığı.

Örnek tüp kimliği	PBS 1x (μL)	Alexa Fluor 633 IgG (μL)	αCD41-PE (μL)
Lekelenmemiş	100	-	-
TF + Alexa Fluor 633 IgG	95	5	-
αCD41-PE	95	-	5

Tablo 6: Yüzeyle ilişkili TF analizi için telafi matrisi hazırlanması.

Tartışma

Bu makale, trombosit yüzeyinde ve üzerinde ifade edilen proteinin analizini dikkate alarak, tüm kan akışı sitometrisiyle TF-pozitif trombositlerin değerlendirilmesi için ayrıntılı protokolleri rapor etmektedir.

Son 20 yılda, insan trombositlerinde TF varlığı iyi şekilde^{belirlenmiştir} 1,2,3,4,5,17,18. Toplam dolaşımdaki trombosit^{popülasyonunun} %20-30'unu oluşturan trombositlerin bir alt kümesi, proteini ifade eder ve bu da alanda giderek daha önemli hale gelen trombosit heterojenliği^{kavramını pekiştirmektedir 19,20}. TF-pozitif trombositlerin ortalama trombosit hacminin yüksek olduğunu belirtmekte fayda var; bu, daha önce çok hassas görüntüleme akışı^{sitometrisi 2} ile gösterilmiştir. Bu özelliğin dikkate alınması çok önemlidir, özellikle TF ifadesinin diğer kan hücresi bileşenlerinden izole edilen trombositlerde analiz edilmesi gerektiğinde. Gerçekten de, trombosit izolasyonu için kullanılan santrifüj adımının büyük boy trombositlerin kaybına yol^{açması mümkündür 2}. Bu analiz öncesi sorun, birkaç yıl öncesine kadar süren tartışmanın ana itici kaynaklarından biri olabilir -^trombositler 7,12,13'te TF varlığı konusunda. Tam kan akışı sitometrisi bu konuda son derece faydalı bir yaklaşımdır ve tüm trombosit alt kümelerinin izole edilmesine gerek kalmadan analiz edilmesini sağlar.

Trombositlerde TF varlığının tartışmasını teşvik eden ikinci bir sebep, analiz için kullanılan insan karşıtı TF antikorunun seçilmesiydi. Trombositlerle ilişkili TF değerlendirmesi için kullanılan ve proteinin farklı epitoplarını tanıyan birçok ticari antikor bulunmaktadır. TF9-10H10 ^3,21,22 ve VIC7 ^1,3 klonları gibi bazı antikorlar, TF'nin işlevsel olmayan bir bölgesine bağlanır ve FVII/FVIIa bağlanmasını etkiler. VD8 ^1,2,3 ve HTF1¹⁸ klonları gibi diğer antikorlar da - sonuncusu mevcut protokollerde kullanılıyor - proteinin katalitik yerini tanır ve TF ile bağlanma için FVII/FVIIa ile rekabet eder ve böylece prokoagülant fonksiyonunu engeller. Hücre dışı domainin glikozilasyon durumuna ve TF^23'ün katalitik sitesinin konformasyonuna bağlı olarak, bu durum belirli koşullarda (örneğin hücre aktivasyonu veya hastalık) değiştirilebildiğinde, bu antikorların bazıları, akış sitometrisiyle trombosit ilişkili TF'nin yüzey ekspresyonunu farklı şekilde tanıyabilmektedir. Ayrıca, analiz edilecek numunenin taze, sabit ve/veya permeabilize olup olmaması gibi boyama koşulları da epitop konformasyonunu ve dolayısıyla antijen-antikor^{bağlanmasını etkileyebilir.}

Dikkate değer bir diğer husus, antikora bağlı florokrom seçimidir. TF, trombosit popülasyonunun yalnızca %20-30'u tarafından ifade edildiğinden, düşük emisyonlu florokromlar ve düşük duyarlılıklı akış sitometrelerinin kullanımı düşük pozitif sinyalleri ayırt etmek için uygun olmayabilir. Bu nedenle, PE veya APC gibi parlak florokromlarla etiketlenmiş antikorlar tercih edilmelidir. Ancak, PE gibi bir florokromun büyük boyutunun, etiketlenmiş antikorun protein^24'e bağlanmasını engelleyebileceğini belirtmek önemlidir. Bu sorunu aşmak için, mevcut protokolde, yüzey TF boyama dolaylı olarak konjuge edilmemiş αCD142/HTF1 mAb ile yapılmış, ardından ikincil bir antikor kullanılarak ortaya çıkarılmıştır. PE-sterik engel, katalizör bölgenin antikor bağlanmasına daha erişilebilir olduğu hücre içi depolanan TF'ye αCD142/HTF1 mAb bağlanmasını etkilemez. Trombosit ilişkili TF'nin yüzey ifadesinin doğrudan etiketlemeyle değerlendirilmesinin, dolaylı ile karşılaştırıldığında, örneğin işlem süresini kısaltmak için mümkünse tercih edileceği açıktır. Ancak bu yaklaşım, yukarıda bahsedilen kritik sorunları ve proteinin kendisinin konformasyonu nedeniyle trombosit TF'ye ticari olarak bulunan çeşitli antikorların bağlanma kapasitesiyle ilgili ve kullanılan farklı florokromların sterik engellemesi ile ilgili kritik konuları göz önünde bulundurmalıdır. Bu nedenle, yanlış negatif sonuçların önlenmesi için, yüzeyle ifade edilen trombosit ilişkili TF'nin doğrudan etiketlenmesi zorunlu ve dikkatli bir optimizasyon süreci gerektirir. Bu yönler, her kullanımda kullanılan florokromlarla etiketlenmiş ticari olarak mevcut farklı antikor klonlarıyla doğrudan boyamanın verimliliğini değerlendirmeye yönelik devam eden bir çalışmanın konusudur.

Birçok çalışma, TF ifadesinin yüksek trombotik riskle karakterize edilen çeşitli patolojik^{durumlarda yüksek olduğunu göstermiştir} 8,9,10,11,17. Son zamanlarda, akış sitometrisi analiziyle doğru şekilde ölçülen TF-pozitif trombosit seviyelerinin, aspirin ve P2Y₁₂ antagonistleriyle ilaç tedavisine optimal yanıt vermesine rağmen yüksek trombotik risk taşıyan kardiyovasküler hastaları tespit^{edebileceğine dair kanıtlar sunulmuştur 25}. Gerçekten de, trombositle ilişkili TF işlevsel olarak aktiftir ve bu nedenle trombin^üretimi 1,3,4'ü destekleyebilmektedir. Bu bağlamda, birkaç mikrolitre kan üzerinde akış sitometrisi analizi yapılabilme yeteneği, trombosit ilişkili TF analizinin klinik ortama genişletilmesini sağlayan önemli bir avantajdır. Bu amaçla, trombosit ilişkili TF ölçümünün akış sitometrisiyle doğrulanmasının, yakın zamanda koordine ettiğimiz, Uluslararası Hemostaz ve Tromboz Derneği'nin desteğiyle koordine ettiğimiz uluslararası bir projenin amacı olduğunu belirtmekte fayda var; bu projenin değerlendirmesi için metodolojik rehberlik sağlamaktadır.

P-selektin ve trombosit-lökosit agregaları gibi diğer klasik trombosit aktivasyon belirteçlerinin aksine, kan örneklemesinden hemen sonra artefaktlardan kaçınmak için analiz edilmesi gerekirken, TF ekspresyonu çok daha stabildir. Aslında, kan örneği kan çekilmesinden birkaç saat içinde trombosit-TF ekspresyonu üzerinde önemli bir değişiklik olmadan işlenebilir; Ayrıca, numunenin sabitlenmesi ve sonrasında etiketlenme/işleme olasılığı bu analizi birçok hastane/laboratuvar için uygun kılar. Bu makalede tanımlanan protokolün uygulanması nispeten basit olmasına rağmen, akış sitometrisi tekniğinin hâlâ özel teknik eğitim gerektirdiği dikkat çekicidir. Bu nedenle, teknoloji bakım noktası testleri için giderek daha basit sitometrelerin geliştirilmesine doğru ilerliyor.

Sonuç olarak, önerilen protokol, trombosit ilişkili TF'nin doğru analizi için yöntemler sunar ve akış sitometrisi analizine dayalı bir tekniğin bu yöntemin belirlenmesi için avantajlarını vurgular. Ayrıca, bu proteinin analizini etkileyebilecek ön analitik değişkenleri vurgular ve bunlardan kaçınmak için alınacak önlemleri vurgular.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Adenosin 5'-difosfat (ADP)	Sigma-Aldrich	A-2754	Trombosit agonisti
Alexa Fluor 633 keçi α-fare IgG	Invitrogen	A21052	İkincil antikor
Biotube 10 mL	Biosigma	BSP048	PRP koleksiyonu için
Kelebek İğnesi G19	PIC çözümü	02044019030010	Kan çekiminde
CytExpert Yazılımı	Beckman Coulter		Akış sitometrisi veri analizi
Cytoflex S	Beckman Coulter		Akış sitometresi
Eppendorf tüpleri 1.5 mL	Eppendorf	1,20,086	Kan fiksasyonu
ImageStreamX Mk II	Cytek Biosciences		Görüntüleme akışı sitometresi
Kaluza Software	Beckman Coulter		Akış sitometrisi veri analizi
Paraformaldehit	Antibiyotikler – Divisione Carlo Erba Reagenti	387507	Kan ve trombositleri düzeltmek için
PerCP-α CD45	BD	345809	Lökosit popülasyon belirtecisi
PerCP-α CD61	BD	347408	Trombosit poulasyon işaretleyicisi
PE-α CD142	BD	550312	Anti-İnsan Doku Faktörü antikor
PE-α CD41	Beckman Coulter	A07781	Trombosit poulasyon işaretleyicisi
Kalsiyum ve Magnezyum olmadan 1 kez Fosfat Tampon Salini (PBS)	Gibco	10010-015	Antikorlar ve örnek seyreltme için
Pipet uçları 10 & mikro; L	Gilson	F161630	Örnekler hazırlamak için
Pipet uçları 1000 & mikro; L	Gilson	F161670	Örnekler hazırlamak için
Pipet uçları 200 & mikro; L	Gilson	F161930	Örnekler hazırlamak için
Yuvarlak Tabanlı Boru 5 mL	Corning	352052	Akış sitometresi alımı için
Sodyum klorür %0,9	BD	306575	Kan çekildikten sonra iğne-kanülü yıkamak için
Sysmex XN-450	Dasit		Kan hücresi analizörü
Triton X-100	Carlo Erba Reagenti	9002-93-1	Kan hücrelerinin membranını permeabilize etmek için
Vakum sitratı 0.129M tüpler	BD	363079	Kan toplama için
Vacutainer K2 EDTA tüpleri	BD	368857	Kan toplama için
Vacutainer çoklu örnek luer adapteri	BD	367300	Kan çekiminde
Vacutainer one use holder	BD	364815	Kan çekiminde
Versacomp Antibody Capture boncuk kiti	Beckman Coulter	B22804	Antikor titrasyonu
α CD142 (HTF-1 klonu)	Invitrogen	16-1429-82	Anti-İnsan Doku Faktörü antikor