Yöntem makalesi

İpekböceği Bombyx mori'de Chitosan/dsRNA Nanopartikül Dağıtımı ile Larva RNA Girişimi

DOI:

10.3791/67360

⸱

4 Ekim 2024

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Guangzhou University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan, ipekböceği Bombyx mori larvalarında yutma yoluyla gen susturmayı indüklemek için kitosan/dsRNA nanopartikül dağıtımı için bir protokoldür.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İpekböceği, Bombyx mori, Çin'de binlerce yıllık geçmişi olan önemli bir ekonomik böcektir. Bu arada, ipekböceği, iyi bir temel araştırma birikimi ile Lepidoptera'nın model böceği. Aynı zamanda, Lepidoptera'daki ilk böcek, tam genomu dizilenmiş ve bir araya getirilmiştir, bu da gen fonksiyonel çalışması için sağlam bir temel sağlar. RNA interferansı (RNAi), ters gen fonksiyonel çalışmasında yaygın olarak kullanılmasına rağmen, ipekböcekleri ve diğer Lepidopteran türlerinde refrakterdir. Çift sarmallı RNA (dsRNA) sağlamak için önceki başarılı RNAi ile ilgili araştırmalar yalnızca enjeksiyon yoluyla gerçekleştirildi. dsRNA'nın beslenme yoluyla iletilmesi hiçbir zaman rapor edilmez. Bu yazıda, ipekböceği larvalarına yutularak beslenen kitosan/dsRNA nanopartiküllerini hazırlamak için adım adım prosedürleri açıklıyoruz. Protokol, (i) ipekböceği larvalarının uygun aşamasının seçilmesini, (ii) dsRNA'nın sentezini, (iii) kitosan/dsRNA nanopartiküllerinin hazırlanmasını ve (iv) ipekböceği larvalarının kitosan/dsRNA nanopartikülleri ile beslenmesini içerir. Gen transkripti doğrulaması ve fenotip gözlemi dahil olmak üzere temsili sonuçlar sunulmuştur. dsRNA besleme, ipekböceği larvalarında RNAi için basit bir tekniktir. İpekböceği larvalarının yetiştirilmesi kolay ve çalıştırılabilecek kadar büyük olduğundan, böceklerde larva RNAi'sini göstermek için iyi bir model sağlar. Ek olarak, bu tekniğin basitliği, araştırmaya daha fazla öğrenci katılımını teşvik ederek ipekböceği larvalarını sınıf ortamında kullanım için ideal bir genetik sistem haline getirir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İpekböceği, Bombyx mori, 5000 yıldan daha uzun bir süre önce Çin'de evcilleştirilmiş bir böcek. İpekböceği, ipek üretme kabiliyeti nedeniyle Çin tarımında ve ipekböcekçiliğinde önemli bir ekonomik böcektir. İpekböceği, model böcek olarak meyve sineğinden sonra ikinci sıradadır. Lepidoptera'da model bir böcek olan ipekböceğinin yetiştirilmesi kolaydır, büyük bir vücut büyüklüğü ve bol miktarda mutant vardır. Bu arada, ipekböceği, tam genomu dizilenmiş ilk Lepidopteran böceğidir1. Genom2, transkriptom3, eksprese edilmiş dizi etiketi (EST)4, kodlamayan RNA5 ve mikrosatellit6 için bilgi sağlayan birçok veri tabanı da halka açıktır. Yukarıdaki gerçekler ipekböceğini genetik araştırmalar için mükemmel bir model haline getirmektedir.

RNA interferansı (RNAi), çift sarmallı RNA (dsRNA) moleküllerinin tamamlayıcı haberci RNA'yı (mRNA) bağlayıp dilimlediği, böylece hedef genin susturma etkisini elde ettiği hücresel bir süreçtir. Bu mekanizma, virüslerin istilasına karşı savunmak için bakterilerde doğal olarak bulunur7. Daha sonra RNAi'nin hayvanlarda, bitkilerde ve mikroplarda korunduğu bulundu. Güçlü diziye özgü susturma etkisi nedeniyle, RNAi, gen ekspresyonunu manipüle etmek ve gen fonksiyonunu incelemek için temel araştırmalarda kullanılır. RNAi, dsRNA'nın hücrelere verilmesi yoluyla elde edilir.

Böceklerde, dsRNA'yı iletmenin mikroenjeksiyon, besleme ve ıslatma olmak üzere üç yaygın yolu vardır8. Şu anda, ipekböceklerinde çıplak dsRNA iletimi yoluyla başarılı RNAi raporları, dsRNA enjeksiyonu9 ile gerçekleştirilmektedir. Mikroenjeksiyonun avantajları, dsRNA'nın hemolenf içine anında verilmesi ve dsRNA miktarının hassas bir şekilde kontrol edilmesidir. Bununla birlikte, mikroenjeksiyonun bazı dezavantajları da mevcuttur. Örneğin, zaman alıcıdır ve hassas cihazlar gerektirir. Enjeksiyon iğnelerini, enjeksiyon hacmini ve dsRNA miktarını optimize etmek de önemlidir. Bu nedenle, dsRNA'yı ipekböceklerine iletmenin alternatif bir yolu gerekli hale gelir. Bir böceğin dış iskeleti, kitinden yapılmış su geçirmez bir bariyer olduğundan, RNAi'yi elde etmek için böcek larvalarının ıslatılması nadiren rapor edilir, bu da böceklerde RNAi için iyi bir seçenek değildir. dsRNA'nın beslenmesi emek tasarrufu sağlar, uygun maliyetlidir ve gerçekleştirilmesi kolaydır10. Bu yöntem aynı zamanda yüksek verimli gen taraması için de geçerlidir11. Bununla birlikte, ipekböceği larvalarının12 orta bağırsak ve orta bağırsak suyunda DNA/RNA spesifik olmayan bir nükleazın, yani BmdsRNaz'ın bulunduğu bulunmuştur. Bu nükleazın dsRNA'yı, tercihen13'ü sindirdiği gösterilmiştir. Bu nedenle, gen ifadesini susturmak için ipekböceğine çıplak dsRNA beslemek zor gibi görünüyor.

Son zamanlarda, nanopartikül korumalı dsRNA'nın,14'ü besleyerek RNAi verimliliğini artırmak için iyi bir alternatif olduğu kanıtlanmıştır. Kitosan, selüloz15'ten sonra doğal olarak oluşan ve en bol bulunan ikinci biyopolimer olan kitinin deasetilasyonu ile hazırlanabilen ucuz, toksik olmayan ve biyolojik olarak parçalanabilen bir polimerdir. Kitosan içindeki amino grubu pozitif yüklü olduğundan ve dsRNA'nın omurgasındaki fosfat grubu negatif yüklü olduğundan, kitosan / dsRNA nanopartikülleri, polikatyonların16 kendi kendine bir araya gelmesiyle oluşturulabilir. Kitosan / dsRNA nanopartikülleri, sivrisinekler Aedes aegypti ve Anopheles gambiae17, pamuk benekli koza kurdu Earias vittella18 ve karmin örümcek akarı Tetranychus cinnabarinus19'da larva besleme yoluyla RNAi elde etmede etkilidir.

Başarılı RNAi verimliliği elde etmek için ipekböceklerinde beslenerek dsRNA iletimi için bir metodoloji geliştirmek amacıyla, bu rapor, kitosan/dsRNA nanopartiküllerinin nasıl hazırlanacağına ve nanopartiküllerin ipekböceği larvalarına nasıl besleneceğine ilişkin adım adım prosedürleri açıklamaya odaklanmaktadır. Bu metodoloji nispeten ucuzdur, emek tasarrufu sağlar ve takip edilmesi kolaydır, bu da diğer böceklerde gen susturma çalışmaları için uyarlanabilir. Daha yüksek RNAi verimliliği ile Lepidopteran dsRNA dağıtım yöntemi için daha kolay bir protokol sağlamayı amaçlıyoruz.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. İpekböceği türleri ve yetiştiriciliği

  1. Taze dut yaprakları ile 25 ± 1 °C'de, fotoperiyot 12 saat Aydınlık: 12 saat Karanlık ve% 75 ±% 5 bağıl nemde, taze dut yaprakları ile B. mori P50 suşunun en az 120yumurtadan yeni çıkmış 1. instar ipekböceği larvalarını arkaya koyun.

2. İpekböceği larvalarının seçimi

  1. RNAi deneyi için 5. instar larvalarının 1. gününü seçin; İpekböceği larvaları, larva görünümündeki farklılıkları karşılaştırmak için ideal olan 5.instarın 3. gününden sonra hızlı bir şekilde büyür.
    NOT: Alternatif olarak, RNAi deneyi için 3. veya 4. instar gibi daha genç aşamalar kullanılabilir. Bununla birlikte, nispeten pahalı ve malzeme maliyeti olan 5.instar'a kadar sürekli dsRNA tedavisi gerektirir.

3. dsRNA'nın sentezi

  1. dsRNA hedef fragmanının tanımlanması: Bir hedef genin kodlama dizisini seçin ve korunan bölgeyi belirlemek için onu diğer homojen genlerle hizalayın. Sonraki dsRNA hedef fragman amplifikasyonu için korunmamış bölgede gene özgü primerler tasarlayın. Böceklerde yapılan RNAi deneyleri için, tipik dsRNA hedef fragmanı genellikle 400-600 bp'dir. Minimum boyut 200 bp olabilir.
    NOT: RNAi deneylerinin verimliliğini ve başarılı oranını artırmak için, dsRNA hedefini tasarlamak için dsRNA Mühendisi (https://dsrna-engineer.cn/) gibi bazı web tabanlı araçlar kullanılabilir.
  2. PCR ürün şablonu üretme: Yukarıda tasarlanan her iki primerin 5' ucuna bir T7 RNA polimeraz promotörü (3'-TAATACGACTCACTATAGG-5') ekleyin. dsRNA hedef fragmanını yükseltmek için standart PCR gerçekleştirin. Beklenen boyutta tek bir PCR ürününü doğrulamak için 1x TAE'de %1'lik bir agaroz jeli çalıştırın. Bundan sonra, PCR ürününü bir saflaştırma kiti (Malzeme Tablosu) ile saflaştırın ve sonraki transkripsiyon için kullanın.
    NOT: Hedef PCR ürününü uzun süre saklamak ve yüksek verim elde etmek için PCR ürününün bir plazmide bağlanması önerilir. Plazmit, PCR reaksiyonundan önce doğrusallaştırılmalıdır.
  3. dsRNA'nın Üretilmesi: dsRNA'yı oluşturmak için bir T7 RNAi Sistemi (Malzeme Tablosu) kullanın. Bileşenleri üreticinin talimatlarına göre oda sıcaklığında ekleyerek reaksiyonu ayarlayın. Reaksiyonu nazikçe pipetleyerek karıştırın ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
    NOT: Verimi en üst düzeye çıkarmak için, 37 ° C'de inkübasyon 2-6 saate kadar uzatılabilir. İkincil bir yapı veya GC açısından zengin şablonlar için, dsRNA verimini artırmak yerine 42 °C'de inkübasyon gerçekleştirilebilir.
  4. dsRNA oluşturmak için tavlama: Reaksiyonu 70 °C'de 10 dakika inkübe edin, ardından yavaşça oda sıcaklığına (~ 20 dakika) soğutun. Bu, dsRNA'yı tavlayacaktır.
  5. DNaz ve RNaz tedavisi: Taze seyreltilmiş bir RNaz çözeltisi yapmak için verilen RNase çözeltisinin 1 μL'sini 199 μL nükleaz içermeyen suya pipetleyin. 20 μL reaksiyon hacmi başına 1 μL taze seyreltilmiş RNaz çözeltisi ve 1 μL sağlanan RQ1 RNaz içermeyen DNaz ekleyin, hafifçe karıştırın ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Tek sarmallı RNA (ssRNA) ve reaksiyondaki şablon DNA bu işlemden sonra çıkarılacaktır.
  6. Alkol çökeltme: Reaksiyona 1 hacim izopropanol veya 2.5 hacim %95 etanol ile birlikte 0.1 hacim 3 M Sodyum Asetat (pH 5.2) ekleyin. Reaksiyonu girdap yaparak karıştırın ve bulutlu bir kütle oluşturmak için 5 dakika buz üzerinde inkübe edin. Tüpün dibinde beyaz bir pelet toplamak için bir santrifüjde 10 dakika boyunca maksimum hızda döndürün. Süpernatanı atın ve kalan tuzu çıkarmak için peleti 0,5 mL soğuk %70 etanol ile yıkayın. Yıkamadan sonra etanolü çıkarın. Peletin oda sıcaklığında 15 dakika kurumaya bırakın. Pelet, ilk reaksiyon hacminin 2-5 katı kadar nükleaz içermeyen su ile yeniden süspanse edin. -20 °C veya -70 °C'de saklayın.
    NOT: dsRNA peleti aşırı kurutulmamalıdır, çünkü bu, tamamen yeniden süspanse edilmesini zorlaştırabilir. Yeterli yeniden süspansiyonu sağlamak için en az 2 hacme ihtiyaç vardır.
  7. DsRNA'nın miktar ve kalite kontrolü: dsRNA'yı nükleaz içermeyen suda 1:100 ila 1:300 oranında seyreltin. Üreticinin talimatlarına göre bir mikro hacim spektrofotometresi (Malzeme Tablosu) kullanarak dsRNA konsantrasyonunu belirleyin. dsRNA'yı ölçmek için konsantrasyonu hacimle çarpın. DsRNA'nın kalitesini değerlendirmek için agaroz jel elektroforezi kullanın. 1x TAE'de %1'lik bir agaroz jeli hazırlayın ve dsRNA'yı 1:50'de nükleaz içermeyen suyla seyreltin. Şerit başına 5 μL seyreltilmiş dsRNA kullanın ve görselleştirme için jeli en az 15 dakika boyunca 0,5 mg/mL etidyum bromür içinde boyayın.
    NOT: dsRNA, dsDNA'dan daha yavaş göç eder.

4. Kitosan / dsRNA nanopartiküllerinin hazırlanması

  1. Oda sıcaklığında 100 mM sodyum asetat (0.1 M NaC2H3O2 ve 0.1 M asetik asit, deiyonize suda pH 4.5) ve 100 mM sodyum sülfat (deiyonize suda 100 mM Na2S4) tamponu yapın.
  2. Ticarileştirilmiş kitosanı çözün (karides kabuklarından,% ≥75 deasetillenmiş; Malzeme Tablosu) % 0.02 (a / h) kitosan çözeltisi yapmak için 100 mM sodyum asetat tamponu içinde.
  3. 20 μg dsRNA'yı 50 μL nükleaz içermeyen suda çözün ve 100 μL'lik bir dsRNA çözeltisi yapmak için 50 μL 100 mM sodyum sülfat tamponuna ekleyin.
  4. 100 μL dsRNA çözeltisine 100 μL kitosan çözeltisi ekleyin. Eşzamanlı olarak, 100 μL 50 mM sodyum sülfata 100 μL kitosan çözeltisi ekleyerek bir kontrol hazırlayın. Karışımları karıştırın ve 55 °C'de 1 dakika ısıtın.
  5. Nanopartiküllerin oluşumuna izin vermek için karışımı hemen 30 saniye boyunca yüksek hızlı bir girdapla girdaplayın.
  6. Beyaz bir pelet elde etmek için karışımı oda sıcaklığında 13.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı 1.5 mL'lik yeni bir tüpe aktarın. Peletin oda sıcaklığında 10 dakika kurumaya bırakın.
  7. Bir mikrohacim spektrofotometresi (Malzeme Tablosu) kullanarak süpernatanttaki dsRNA konsantrasyonunu belirleyin. Kontroldeki süpernatanı boş olarak kullanın. Süpernatantta kalan toplam dsRNA miktarını hesaplamak için konsantrasyonu hacimle çarpın. Nanopartiküllerde kapsüllenen dsRNA yüzdesini, süpernatantta kalan miktarın dsRNA'nın başlangıç miktarına bölünmesiyle hesaplayın.
    NOT: Nanopartiküller kullanımdan önce en az 15 gün boyunca 4-37 ° C'de tutulabilse de14, nanopartiküllerin mümkün olan en kısa sürede kullanılması önerilir.

5. İpekböceği larvalarının kitosan/dsRNA nanopartikülleri ile beslenmesi

  1. Besleme deneyi için aynı büyüklükte taze tüy dökmüş 5. instar ipekböceği larvalarını (yani, 5. instarın 1. günü) seçin. Kapağı kapatmadan önce larvaları 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna ayrı ayrı yerleştirin ve 24 saat aç bırakın.
  2. Taze dut yapraklarını deiyonize su ile durulayın ve temiz mutfak kağıdı ile kurulayın. Dut yaprakları su damlası olmadan kuru olmalıdır. 1 cm x 1 cm dut yaprağı diskleri halinde kesin.
  3. Kullanmadan önce kitosan / dsRNA nanopartiküllerini 500 ng / μL'de nükleaz içermeyen suda çözün. Kontrol kitosan nanopartiküllerini (4.4'te hazırlanmış) aynı hacimde nükleaz içermeyen su ile seyreltin. Nükleaz içermeyen suda 500 ng/μL'ye kadar çıplak dsRNA hazırlayın.
  4. RNAi knockdown deneyi için kitosan / dsRNA nanopartiküllerini, kontrol kitosan nanopartiküllerini boş / negatif kontrol olarak kullanın. Kitosan/dsRNA nanopartikülleri ile farklılıkları karşılaştırmak için çıplak dsRNA'yı kullanın.
  5. Her bir yaprak diskinin yüzeyine sırasıyla 10 μL kitosan/dsRNA nanopartikülleri, kitosan ve çıplak dsRNA kaplayın. Yaprak diskler üzerindeki nanopartikül çözeltisini ve dsRNA çözeltisini oda sıcaklığında 5 dakika havayla kurutun.
  6. Her larvayı günde bir nanopartikül kaplı veya dsRNA kaplı yaprak diski ile besleyin. Larvalara 5 gün boyunca sürekli olarak nanopartikül kaplı veya dsRNA kaplı yaprak diskleri sağlayın. Kaplanmış yaprak diski her gün larvalar tarafından tamamen yendikten sonra taze dut yaprağı sağlanabilir.
  7. 6. günde, larvaları hareket etmeyene kadar buz üzerinde uyuşturun ve larvaları örnekleme için inceleyin. Göğüs kafesi temiz bir Petri kabında makasla kesin. Bir cımbız ile orta bağırsağı dışarı çekin. Orta bağırsaktaki içeriği çıkarın ve orta bağırsağı nükleaz içermeyen suyla dolu başka bir Petri kabında yıkayın. Orta bağırsağı 1,5 mL'lik bir tüpte saklayın ve -70 °C'de tutun.

6. Gen susturmanın doğrulanması

  1. Bağıl transkript nicelemesini hesaplamak için kantitatif Gerçek Zamanlı PCR (qRT-PCR) gerçekleştirin. En az üç biyolojik kopya ve her biyolojik kopya için üç teknik kopya gereklidir. Göreceli transkripti normalleştirmek için en az iki referans gen önerilir. Bir Bombyx Toll9-2 (BmToll9-2) geni test edildi. Bağıl transkriptin ortalama değerini kontrol grubuyla karşılaştırarak gen susturma verimliliğini değerlendirin ve bunu yüzdeye dönüştürün.
    NOT: qRT-PCR amplifikasyon koşulu, primer bilgileri ve bağıl transkript hesaplaması son yayınımız20'de bulunabilir.
  2. Gen susturma etkisini değerlendirmek için RNAi fenotipini analiz edin. Larva ve kozaların boyutunu gözlemleyin. Görünümleri kaydetmek için her gün fotoğraf çekin.
    NOT: RNAi morfolojiyi, metamorfozu, fizyolojiyi ve davranışı etkileyebilir. RNAi ile ilişkili fenotiplerin gözlemlenmesi, hedeflenen genlere bağlıdır.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNAi verimliliğini değerlendirmek için, analiz için BmToll9-2'yi hedefleyen bir bağışıklık geni seçildi. BmToll9-2 geni laboratuvarda iyi karakterize edilmiştir ve dsRNA enjeksiyonu ile gen susturma, son yayınımız20'de daha hafif ve daha küçük larvalarla sonuçlanır. Kitosan / dsRNA nanopartikülleri yoluyla yutularak RNAi etkinliğini doğrulamak için, kitosan nanopartikülleri kontrol olarak kullanıldı ve aynı anda çıplak dsRNA karşılaştırıldı.

Kontrol ile karşılaştırıldığında, dsRNA'sı olmayan kitosan nanopartikülleri, BmToll9-2 genini hedefleyen çıplak dsRNA, susturma etkisi göstermez. İpekböceğindeki kitosan/dsRNA nanopartiküllerinin beslenmesi, y'luk bir yıkım ile transkripti önemli ölçüde engeller (Şekil 1). Göreceli transkriptin inhibisyonu, BmToll9-2 geninin kitosan/dsRNA yutulması yoluyla başarılı bir şekilde susturulduğunu gösterir.

BmToll9-2 geninin yıkılması, ipekböceğinin büyümesini önemli ölçüde etkiler. Larvaları gözlemlerken, BmToll9-2 susturuculu larvalar kontrol larvalarından daha küçüktür (Şekil 2A). Kozalar karşılaştırıldığında, BmToll9-2 susturuculu kozalar da daha küçüktür (Şekil 2B). Kitosan/dsRNA nanopartikülleri, ipekböceğinde hem transkript hem de fenotip olarak başarılı RNAi etkileri göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1: B. mori 5. instar larvalarında kitosan / dsBmToll9-2 nanopartiküllerinin yutulmasından sonra BmToll9-2'nin nispi transkripti.Kontrol olarak kitosan nanopartikülleri, çıplak dsRNA ve kitosan/dsRNA nanopartikülleri ile beslenen larvalarda BmToll9-2'nin nispi mRNA seviyeleri. Veriler, üç biyolojik replikasyonun ortalama ± standart sapması olarak temsil edildi. Her biyolojik replikasyon için üç teknik replikasyon vardı. Çubuklardaki farklı harfler, tek yönlü ANOVA analizine dayalı olarak önemli farklılıklar gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Kitosan / dsBmToll9-2 nanopartikülleri ile beslendikten sonra fenotip gözlemi. Kitosan nanopartikülleri kontrol olarak kullanılır. (A) Nanopartiküllerin yutulmasından sonra ipekböceği larvalarının ortaya çıkması. (B) Nanopartiküllerin yutulmasından sonra ipekböceği kozalarının ortaya çıkması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hedeflenen genlere bağlı olarak RNAi fenotip gözlemi için uygun bir aşama önemlidir. Ön sonuçlarımız, Toll9-2'nin ipekböceğinin büyümesinde rol oynadığını gösterdi. İpekböceği larvalarının büyüklüğü ve ağırlığı 5. instar 21'de hızla artar. Bu nedenle, 5. instar larvaları, kitosan/dsRNA nanopartikül besleme deneyi için aşama olarak seçilir. Besleme deneyleri için 3. veya 4. instar larvalarının seçilmesi ve 5. instardaki gelişimsel farklılıkların gözlemlenmesi de mümkündür. Bununla birlikte, nanopartikül besleme deneyleri günlük olarak sürekli besleme gerektirir14. Larvaları daha genç bir aşamada beslemek, nispeten daha pahalı olan daha fazla dsRNA hazırlığı gerektirir. Yukarıdaki nedenlerden dolayı, nanopartikül besleme deneyinin başlangıç noktası olarak 5. instarın taze tüy döken ipekböceği larvalarının seçilmesini öneriyoruz.

Nanopartikül besleme parametrelerinin optimizasyonu da önemlidir. Verimli RNAi elde etmek için 5-7 gün boyunca sabit bir nanopartikül beslemesi mevcut çalışmalarda yaygındır 14,18,22,23. dsRNA, RNAi deneylerinde en pahalı bileşen olduğundan, nanopartiküller her gün larvalara beslenebilir ve bu da dsRNA hazırlama maliyetinin yarısını azaltmaya yardımcı olabilir. Maliyeti düşürmenin bir başka yolu da beslemede kullanılan dsRNA miktarını optimize etmektir. Bu protokolde, laboratuvarda dsRNA enjeksiyonu için evrensel doz olan her larva için 5 μg kitosan/dsRNA nanopartikülleri kullanılır. 5 μg dsRNA'nın yüksek bir doz olduğu ve nanopartikül besleme ile inhibisyonun önemli olduğu düşünüldüğünde. Deneyde dsRNA miktarının azaltılması önerilmektedir. Bununla birlikte, yukarıdaki iki parametrenin RNAi verimliliği üzerindeki etkisinin gelecekteki deneylerde değerlendirilmesi gerekmektedir.

Kitosan ve dsRNA oranı optimize edilebilir. Bu protokolde 100 μL sodyum asetat içinde 20 μg kitosan 100 μL sodyum sülfat içinde 20 μg dsRNA ile karıştırılır. İlk kitosan/dsRNA nanopartikülleri raporunda, 100 μL sodyum asetat içinde 20 μg kitosan 100 μL sodyum sülfat16 içinde 32 μg dsRNA ile karıştırılmıştır. Diğer bazı raporlarda, 100 μL sodyum asetat içinde 1 μg kitosan 100 μL sodyum sülfat18,23 içinde 1 μg dsRNA ile karıştırılmıştır. Bu nedenle, kitosan ve dsRNA miktarı, nanopartiküllerin en iyi yükleme verimliliğini ve optimum RNAi susturma etkisini elde etmek için optimize edilebilir.

Kitosan / dsRNA nanopartiküllerinin depolanması dikkate alınmalıdır. Kitosan / dsRNA nanopartikülleri besleme deneyinden önce hazırlanır ve hemen kullanılmaları önerilir. Yakın tarihli bir rapor, kitosan / dsRNA nanopartiküllerinin 15 gün boyunca 4 ° C, 24 ° C ve 37 ° C'de saklandığını ve hala stabil olduğunu gösterdi19. Bu nedenle, kitosan/dsRNA nanopartikülleri önceden hazırlanabilir ve dsRNA düşük sıcaklıklarda daha kararlı olduğu için buzdolabında 4 ° C'de saklanabilir.

DsRNA'nın yanı sıra, küçük enterferans yapan RNA (siRNA) ve kısa firkete RNA (shRNA) gibi bazı küçük RNA, RNAi deneyleri için nanopartikül hazırlamada kullanılabilir. Örneğin, siRNA nanopartikülleri, Pseudomonas syringae24'e karşı bitki direncini artırır. ShRNA nanopartiküllerinin verilmesi, neotropik kahverengi kokuşmuş böcek Euschistus heros25'te başarılı RNAi etkisine neden oldu. Bu nedenle, nanopartiküller RNAi deneyinde kullanılan herhangi bir RNA molekülüne uygulanabilir.

İpekböcekleri de dahil olmak üzere Lepidoptera'daki RNAi etkinliğinin refrakter26 olduğu bildirilmektedir. dsRNA'nın iletimi sadece ipekböceklerine enjeksiyon yoluyla yapılır, bu da zaman alıcı ve emek maliyetlidir. Bu kitosan/dsRNA nanopartikül verme yöntemiyle, ipekböceği larvalarında ve kozalarında transkript veya fenotipte önemli bir susturma etkisi gözlenir, bu da kitosan19'un korunmasıyla dsRNA'nın daha az bozunması nedeniyle mümkündür. Bu yöntem emek tasarrufu sağlar ve diğer böceklere uyarlanabilen gerçekleştirilmesi kolaydır. Bu protokolün kolaylığı sadece bilimsel araştırmalarda değil, aynı zamanda sınıf içi öğretim, gösteri ve uygulamada da uygulanabilir. Nanopartikül dağıtım yöntemi, gelecekteki biyokontrol ve haşere yönetimi için yeni bir yöndür27.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31501898), Guangzhou Bilim ve Teknoloji Programı (202102010465), Guangzhou Yüksek Öğrenim Öğretim Kalitesi ve Öğretim Reformu Projesi (2022JXGG057) ve Guangdong Eyalet Üniversiteleri Açık Çevrimiçi Ders Yönlendirme Komitesi Araştırma projesi (2022ZXKC381) tarafından finanse edilmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
dsRNA veya nanopartikül reaksiyonumu1.5 mL santrifüj tüpüSangon
F601620; l sıvımu'yuaspire etmek veya yeniden süspanse etmek içinEppendorf
pipeti; l pipetEppendorfQ12115Gmu'yu aspire etmek veya yeniden süspanse etmek için
; l sıvımu'yuaspire etmek veya yeniden süspanse etmek içinEppendorf
; l sıvımu'yuaspire etmek veya yeniden süspanse etmek için
; l sıvıyıaspire etmek veya yeniden süspanse etmek içinEppendorfH20588E
6 oyuklu Clear TC ile muamele edilmiş Çoklu Kuyulu PlakalarBireysel olarak ipekböceği yetiştiriciliği içinCostar3516
TAE Agarose yapmak içinAsetik asitAladdinA116165
MBBI Yaşam Bilimleriagarozjel elektrofozu için A610013
Analitik teraziSartoriusBSA224Sağırlık malzemelerine
Santrifüj SartoriusCentrisart A-14C,dsRNA veya nanopartiküller oluşturmak üzere santrifüjlemek için
KitosanSigma-AldrichC3646nanopartiküllerin hazırlanması için dsRNA ile birleştirmek için
EDTASangonA500895TAE yapmak için
EtanolAladdinE130059veya dsRNA çökeltme
için DondurucuSiemensiQ300dsRNA'yı depolamak için veya nanopartiküller
PCR reaksiyonu içinGoTaq Green Master MixPromegaM712
qRT-PCRGoTaq qPCR Master MixPromegaA6002
İzopropanol dsRNA çökeltme içinAladdinI112011
NanoDrop Microvolume UV-Vis SpektrofotometresiThermoFisherOnedsRNA ph metre Sartorius konsantrasyonunu belirlemek için
  Tamponları hazırlamak için PB-10
SanPrep Sütunu PCR Ürün Saflaştırma KitiPCR ürün saflaştırması içinSangonB518141
100 mM sodyum asetat tamponu yapmak içinSodyum asetatSigma-AldrichS2889
Sodyum sülfat ve nbsp;100 mM sodyum sülfat tamponu yapmak içinSigma-Aldrich239313
dsRNA sentezi içinT7 RiboMAX Express RNAi SistemiPromegaP1700
ThermoMixerEppendorfCveya nanopartikülleri ısıtmak Tris
SangonA501492TAE
Vortex yapmak için Kitosan/dsRNA nanopartiküllerini hazırlamak içinIKAVortex 3
10 & için 100 & P13473G sıvı 2.5 & 20 & P20777G pipeti 200 & Eppendorf H19229E pipetipipet , , , , reaksiyonu için, dsRNA üretimi için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xia, Q., et al. A draft sequence for the genome of the domesticated silkworm (bombyx mori). Science. 306 (5703), 1937-1940 (2004).
  2. Kawamoto, M., Kiuchi, T., Katsuma, S. Silkbase: An integrated transcriptomic and genomic database for bombyx mori and related species. Database (Oxford). 2022, (2022).
  3. Yokoi, K., Tsubota, T., Jouraku, A., Sezutsu, H., Bono, H. Reference transcriptome data in silkworm bombyx mori. Insects. 12 (6), (2021).
  4. Mita, K., et al. The construction of an est database for bombyx mori and its application. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14121-14126 (2003).
  5. Zhou, Q. Z., Zhang, B., Yu, Q. Y., Zhang, Z. Bmncrnadb: A comprehensive database of non-coding rnas in the silkworm, bombyx mori. BMC Bioinformatics. 17 (1), 370(2016).
  6. Prasad, M. D., et al. Silksatdb: A microsatellite database of the silkworm, bombyx mori. Nucleic Acids Res. 33 (Database issue), D403-D406 (2005).
  7. Ding, S. W. Rna-based antiviral immunity. Nat Rev Immunol. 10 (9), 632-644 (2010).
  8. Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: An overview and future directions. Insect Sci. 20 (1), 4-14 (2013).
  9. Liang, Y., et al. Silencing of the immune gene bmpgrp-l4 in the midgut affects the growth of silkworm (bombyx mori) larvae. Insect Mol Biol. 32 (4), 340-351 (2023).
  10. Tian, H., et al. Developmental control of a lepidopteran pest Spodoptera exigua by ingestion of bacteria expressing dsrna of a non-midgut gene. PLoS One. 4 (7), e6225(2009).
  11. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific rna-mediated interference through ingested double-stranded rna in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002(2001).
  12. Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. Molecular characterization of a cdna encoding extracellular dsrnase and its expression in the silkworm Bombyx Mori. Insect Biochem Mol Biol. 37 (2), 176-183 (2007).
  13. Liu, J., Swevers, L., Iatrou, K., Huvenne, H., Smagghe, G. Bombyx mori DNA/rna non-specific nuclease: Expression of isoforms in insect culture cells, subcellular localization and functional assays. J Insect Physiol. 58 (8), 1166-1176 (2012).
  14. Christiaens, O., et al. Increased rnai efficacy in Spodoptera exigua via the formulation of dsrna with guanylated polymers. Front Physiol. 9, 316(2018).
  15. Dass, C. R., Choong, P. F. The use of chitosan formulations in cancer therapy. J Microencapsul. 25 (4), 275-279 (2008).
  16. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect Mol Biol. 19 (5), 683-693 (2010).
  17. Zhang, X., et al. Chitosan/interfering rna nanoparticle mediated gene silencing in disease vector mosquito larvae. J Vis Exp. (97), e52523(2015).
  18. Sandal, S., et al. Nanoparticle-shielded dsrna delivery for enhancing rnai efficiency in cotton spotted bollworm Earias vittella (lepidoptera: Nolidae). Int J Mol Sci. 24 (11), 9161(2023).
  19. Zhou, H., et al. Chitosan/dsrna polyplex nanoparticles advance environmental rna interference efficiency through activating clathrin-dependent endocytosis. Int J Biol Macromol. 253 (Pt 4), 127021(2023).
  20. Liu, J., et al. Immunological function of bombyx toll9-2 in the silkworm (Bombyx mori) larval midgut: Activation by escherichia coli/lipopolysaccharide and regulation of growth. Arch Insect Biochem Physiol. 116 (4), e22130(2024).
  21. Cheng, L., et al. Characterization of silkworm larvae growth and properties of silk fibres after direct feeding of copper or silver nanoparticles. Mater Design. 129, 125-134 (2017).
  22. Wang, K., et al. Comparison of efficacy of rnai mediated by various nanoparticles in the rice striped stem borer (Chilo suppressalis). Pestic Biochem Physiol. 165, 104467(2020).
  23. Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Chitosan nanoparticles help double-stranded rna escape from endosomes and improve rna interference in the fall armyworm, Spodoptera frugiperda. Arch Insect Biochem Physiol. 104 (4), e21677(2020).
  24. Qi, J., et al. Rational design of ros scavenging and fluorescent gold nanoparticles to deliver sirna to improve plant resistance to Pseudomonas syringae. J Nanobiotechnol. 22 (1), 446(2024).
  25. Laisney, J., Loczenski Rose, V., Watters, K., Donohue, K. V., Unrine, J. M. Delivery of short hairpin rna in the neotropical brown stink bug, Euschistus heros, using a composite nanomaterial. Pestic Biochem Physiol. 177, 104906(2021).
  26. Terenius, O., et al. Rna interference in Lepidoptera: An overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. J Insect Physiol. 57 (2), 231-245 (2011).
  27. Kolge, H., Kadam, K., Ghormade, V. Chitosan nanocarriers mediated dsrna delivery in gene silencing for Helicoverpa armigera biocontrol. Pestic Biochem Physiol. 189, 105292(2023).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kitosan Nanopartik lleridsRNA letimiGen SusturmaRNAi Beslemeift Zincirli RNANanopartik l Olu umuGen Fonksiyonel al masLepidoptera Modeli

İlgili makaleler