İpekböceği Bombyx mori'de Chitosan/dsRNA Nanopartikül Dağıtımı ile Larva RNA Girişimi

İpekböceği, Bombyx mori, 5000 yıldan daha uzun bir süre önce Çin'de evcilleştirilmiş bir böcek. İpekböceği, ipek üretme kabiliyeti nedeniyle Çin tarımında ve ipekböcekçiliğinde önemli bir ekonomik böcektir. İpekböceği, model böcek olarak meyve sineğinden sonra ikinci sıradadır. Lepidoptera'da model bir böcek olan ipekböceğinin yetiştirilmesi kolaydır, büyük bir vücut büyüklüğü ve bol miktarda mutant vardır. Bu arada, ipekböceği, tam genomu dizilenmiş ilk Lepidopteran böceğidir¹. Genom², transkriptom³, eksprese edilmiş dizi etiketi (EST)⁴, kodlamayan RNA⁵ ve mikrosatellit⁶ için bilgi sağlayan birçok veri tabanı da halka açıktır. Yukarıdaki gerçekler ipekböceğini genetik araştırmalar için mükemmel bir model haline getirmektedir.

RNA interferansı (RNAi), çift sarmallı RNA (dsRNA) moleküllerinin tamamlayıcı haberci RNA'yı (mRNA) bağlayıp dilimlediği, böylece hedef genin susturma etkisini elde ettiği hücresel bir süreçtir. Bu mekanizma, virüslerin istilasına karşı savunmak için bakterilerde doğal olarak bulunur⁷. Daha sonra RNAi'nin hayvanlarda, bitkilerde ve mikroplarda korunduğu bulundu. Güçlü diziye özgü susturma etkisi nedeniyle, RNAi, gen ekspresyonunu manipüle etmek ve gen fonksiyonunu incelemek için temel araştırmalarda kullanılır. RNAi, dsRNA'nın hücrelere verilmesi yoluyla elde edilir.

Böceklerde, dsRNA'yı iletmenin mikroenjeksiyon, besleme ve ıslatma olmak üzere üç yaygın yolu vardır⁸. Şu anda, ipekböceklerinde çıplak dsRNA iletimi yoluyla başarılı RNAi raporları, dsRNA enjeksiyonu⁹ ile gerçekleştirilmektedir. Mikroenjeksiyonun avantajları, dsRNA'nın hemolenf içine anında verilmesi ve dsRNA miktarının hassas bir şekilde kontrol edilmesidir. Bununla birlikte, mikroenjeksiyonun bazı dezavantajları da mevcuttur. Örneğin, zaman alıcıdır ve hassas cihazlar gerektirir. Enjeksiyon iğnelerini, enjeksiyon hacmini ve dsRNA miktarını optimize etmek de önemlidir. Bu nedenle, dsRNA'yı ipekböceklerine iletmenin alternatif bir yolu gerekli hale gelir. Bir böceğin dış iskeleti, kitinden yapılmış su geçirmez bir bariyer olduğundan, RNAi'yi elde etmek için böcek larvalarının ıslatılması nadiren rapor edilir, bu da böceklerde RNAi için iyi bir seçenek değildir. dsRNA'nın beslenmesi emek tasarrufu sağlar, uygun maliyetlidir ve gerçekleştirilmesi kolaydır¹⁰. Bu yöntem aynı zamanda yüksek verimli gen taraması için de geçerlidir¹¹. Bununla birlikte, ipekböceği larvalarının¹² orta bağırsak ve orta bağırsak suyunda DNA/RNA spesifik olmayan bir nükleazın, yani BmdsRNaz'ın bulunduğu bulunmuştur. Bu nükleazın dsRNA'yı, tercihen^13'ü sindirdiği gösterilmiştir. Bu nedenle, gen ifadesini susturmak için ipekböceğine çıplak dsRNA beslemek zor gibi görünüyor.

Son zamanlarda, nanopartikül korumalı dsRNA'nın,^14'ü besleyerek RNAi verimliliğini artırmak için iyi bir alternatif olduğu kanıtlanmıştır. Kitosan, selüloz^15'ten sonra doğal olarak oluşan ve en bol bulunan ikinci biyopolimer olan kitinin deasetilasyonu ile hazırlanabilen ucuz, toksik olmayan ve biyolojik olarak parçalanabilen bir polimerdir. Kitosan içindeki amino grubu pozitif yüklü olduğundan ve dsRNA'nın omurgasındaki fosfat grubu negatif yüklü olduğundan, kitosan / dsRNA nanopartikülleri, polikatyonların¹⁶ kendi kendine bir araya gelmesiyle oluşturulabilir. Kitosan / dsRNA nanopartikülleri, sivrisinekler Aedes aegypti ve Anopheles gambiae¹⁷, pamuk benekli koza kurdu Earias vittella¹⁸ ve karmin örümcek akarı Tetranychus cinnabarinus^19'da larva besleme yoluyla RNAi elde etmede etkilidir.

Başarılı RNAi verimliliği elde etmek için ipekböceklerinde beslenerek dsRNA iletimi için bir metodoloji geliştirmek amacıyla, bu rapor, kitosan/dsRNA nanopartiküllerinin nasıl hazırlanacağına ve nanopartiküllerin ipekböceği larvalarına nasıl besleneceğine ilişkin adım adım prosedürleri açıklamaya odaklanmaktadır. Bu metodoloji nispeten ucuzdur, emek tasarrufu sağlar ve takip edilmesi kolaydır, bu da diğer böceklerde gen susturma çalışmaları için uyarlanabilir. Daha yüksek RNAi verimliliği ile Lepidopteran dsRNA dağıtım yöntemi için daha kolay bir protokol sağlamayı amaçlıyoruz.

1. İpekböceği türleri ve yetiştiriciliği

1. Taze dut yaprakları ile 25 ± 1 °C'de, fotoperiyot 12 saat Aydınlık: 12 saat Karanlık ve% 75 ±% 5 bağıl nemde, taze dut yaprakları ile B. mori P50 suşunun en az 120^yumurtadan yeni çıkmış 1. instar ipekböceği larvalarını arkaya koyun.

2. İpekböceği larvalarının seçimi

1. RNAi deneyi için 5^{. instar} larvalarının 1. gününü seçin; İpekböceği larvaları, larva görünümündeki farklılıkları karşılaştırmak için ideal olan 5.^instarın 3. gününden sonra hızlı bir şekilde büyür.
   NOT: Alternatif olarak, RNAi deneyi için 3^{. veya 4. instar} gibi daha genç aşamalar kullanılabilir. Bununla birlikte, nispeten pahalı ve malzeme maliyeti olan 5.^instar'a kadar sürekli dsRNA tedavisi gerektirir.

3. dsRNA'nın sentezi

1. dsRNA hedef fragmanının tanımlanması: Bir hedef genin kodlama dizisini seçin ve korunan bölgeyi belirlemek için onu diğer homojen genlerle hizalayın. Sonraki dsRNA hedef fragman amplifikasyonu için korunmamış bölgede gene özgü primerler tasarlayın. Böceklerde yapılan RNAi deneyleri için, tipik dsRNA hedef fragmanı genellikle 400-600 bp'dir. Minimum boyut 200 bp olabilir.
   NOT: RNAi deneylerinin verimliliğini ve başarılı oranını artırmak için, dsRNA hedefini tasarlamak için dsRNA Mühendisi (https://dsrna-engineer.cn/) gibi bazı web tabanlı araçlar kullanılabilir.
2. PCR ürün şablonu üretme: Yukarıda tasarlanan her iki primerin 5' ucuna bir T7 RNA polimeraz promotörü (3'-TAATACGACTCACTATAGG-5') ekleyin. dsRNA hedef fragmanını yükseltmek için standart PCR gerçekleştirin. Beklenen boyutta tek bir PCR ürününü doğrulamak için 1x TAE'de %1'lik bir agaroz jeli çalıştırın. Bundan sonra, PCR ürününü bir saflaştırma kiti (Malzeme Tablosu) ile saflaştırın ve sonraki transkripsiyon için kullanın.
   NOT: Hedef PCR ürününü uzun süre saklamak ve yüksek verim elde etmek için PCR ürününün bir plazmide bağlanması önerilir. Plazmit, PCR reaksiyonundan önce doğrusallaştırılmalıdır.
3. dsRNA'nın Üretilmesi: dsRNA'yı oluşturmak için bir T7 RNAi Sistemi (Malzeme Tablosu) kullanın. Bileşenleri üreticinin talimatlarına göre oda sıcaklığında ekleyerek reaksiyonu ayarlayın. Reaksiyonu nazikçe pipetleyerek karıştırın ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
   NOT: Verimi en üst düzeye çıkarmak için, 37 ° C'de inkübasyon 2-6 saate kadar uzatılabilir. İkincil bir yapı veya GC açısından zengin şablonlar için, dsRNA verimini artırmak yerine 42 °C'de inkübasyon gerçekleştirilebilir.
4. dsRNA oluşturmak için tavlama: Reaksiyonu 70 °C'de 10 dakika inkübe edin, ardından yavaşça oda sıcaklığına (~ 20 dakika) soğutun. Bu, dsRNA'yı tavlayacaktır.
5. DNaz ve RNaz tedavisi: Taze seyreltilmiş bir RNaz çözeltisi yapmak için verilen RNase çözeltisinin 1 μL'sini 199 μL nükleaz içermeyen suya pipetleyin. 20 μL reaksiyon hacmi başına 1 μL taze seyreltilmiş RNaz çözeltisi ve 1 μL sağlanan RQ1 RNaz içermeyen DNaz ekleyin, hafifçe karıştırın ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Tek sarmallı RNA (ssRNA) ve reaksiyondaki şablon DNA bu işlemden sonra çıkarılacaktır.
6. Alkol çökeltme: Reaksiyona 1 hacim izopropanol veya 2.5 hacim %95 etanol ile birlikte 0.1 hacim 3 M Sodyum Asetat (pH 5.2) ekleyin. Reaksiyonu girdap yaparak karıştırın ve bulutlu bir kütle oluşturmak için 5 dakika buz üzerinde inkübe edin. Tüpün dibinde beyaz bir pelet toplamak için bir santrifüjde 10 dakika boyunca maksimum hızda döndürün. Süpernatanı atın ve kalan tuzu çıkarmak için peleti 0,5 mL soğuk %70 etanol ile yıkayın. Yıkamadan sonra etanolü çıkarın. Peletin oda sıcaklığında 15 dakika kurumaya bırakın. Pelet, ilk reaksiyon hacminin 2-5 katı kadar nükleaz içermeyen su ile yeniden süspanse edin. -20 °C veya -70 °C'de saklayın.
   NOT: dsRNA peleti aşırı kurutulmamalıdır, çünkü bu, tamamen yeniden süspanse edilmesini zorlaştırabilir. Yeterli yeniden süspansiyonu sağlamak için en az 2 hacme ihtiyaç vardır.
7. DsRNA'nın miktar ve kalite kontrolü: dsRNA'yı nükleaz içermeyen suda 1:100 ila 1:300 oranında seyreltin. Üreticinin talimatlarına göre bir mikro hacim spektrofotometresi (Malzeme Tablosu) kullanarak dsRNA konsantrasyonunu belirleyin. dsRNA'yı ölçmek için konsantrasyonu hacimle çarpın. DsRNA'nın kalitesini değerlendirmek için agaroz jel elektroforezi kullanın. 1x TAE'de %1'lik bir agaroz jeli hazırlayın ve dsRNA'yı 1:50'de nükleaz içermeyen suyla seyreltin. Şerit başına 5 μL seyreltilmiş dsRNA kullanın ve görselleştirme için jeli en az 15 dakika boyunca 0,5 mg/mL etidyum bromür içinde boyayın.
   NOT: dsRNA, dsDNA'dan daha yavaş göç eder.

4. Kitosan / dsRNA nanopartiküllerinin hazırlanması

1. Oda sıcaklığında 100 mM sodyum asetat (0.1 M NaC₂H_3O2 ve 0.1 M asetik asit, deiyonize suda pH 4.5) ve 100 mM sodyum sülfat (deiyonize suda 100 mM Na₂S₄) tamponu yapın.
2. Ticarileştirilmiş kitosanı çözün (karides kabuklarından,% ≥75 deasetillenmiş; Malzeme Tablosu) % 0.02 (a / h) kitosan çözeltisi yapmak için 100 mM sodyum asetat tamponu içinde.
3. 20 μg dsRNA'yı 50 μL nükleaz içermeyen suda çözün ve 100 μL'lik bir dsRNA çözeltisi yapmak için 50 μL 100 mM sodyum sülfat tamponuna ekleyin.
4. 100 μL dsRNA çözeltisine 100 μL kitosan çözeltisi ekleyin. Eşzamanlı olarak, 100 μL 50 mM sodyum sülfata 100 μL kitosan çözeltisi ekleyerek bir kontrol hazırlayın. Karışımları karıştırın ve 55 °C'de 1 dakika ısıtın.
5. Nanopartiküllerin oluşumuna izin vermek için karışımı hemen 30 saniye boyunca yüksek hızlı bir girdapla girdaplayın.
6. Beyaz bir pelet elde etmek için karışımı oda sıcaklığında 13.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı 1.5 mL'lik yeni bir tüpe aktarın. Peletin oda sıcaklığında 10 dakika kurumaya bırakın.
7. Bir mikrohacim spektrofotometresi (Malzeme Tablosu) kullanarak süpernatanttaki dsRNA konsantrasyonunu belirleyin. Kontroldeki süpernatanı boş olarak kullanın. Süpernatantta kalan toplam dsRNA miktarını hesaplamak için konsantrasyonu hacimle çarpın. Nanopartiküllerde kapsüllenen dsRNA yüzdesini, süpernatantta kalan miktarın dsRNA'nın başlangıç miktarına bölünmesiyle hesaplayın.
   NOT: Nanopartiküller kullanımdan önce en az 15 gün boyunca 4-37 ° C'de tutulabilse de¹⁴, nanopartiküllerin mümkün olan en kısa sürede kullanılması önerilir.

5. İpekböceği larvalarının kitosan/dsRNA nanopartikülleri ile beslenmesi

1. Besleme deneyi için aynı büyüklükte taze tüy dökmüş 5^{. instar} ipekböceği larvalarını (yani, 5^{. instarın} 1. günü) seçin. Kapağı kapatmadan önce larvaları 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna ayrı ayrı yerleştirin ve 24 saat aç bırakın.
2. Taze dut yapraklarını deiyonize su ile durulayın ve temiz mutfak kağıdı ile kurulayın. Dut yaprakları su damlası olmadan kuru olmalıdır. 1 cm x 1 cm dut yaprağı diskleri halinde kesin.
3. Kullanmadan önce kitosan / dsRNA nanopartiküllerini 500 ng / μL'de nükleaz içermeyen suda çözün. Kontrol kitosan nanopartiküllerini (4.4'te hazırlanmış) aynı hacimde nükleaz içermeyen su ile seyreltin. Nükleaz içermeyen suda 500 ng/μL'ye kadar çıplak dsRNA hazırlayın.
4. RNAi knockdown deneyi için kitosan / dsRNA nanopartiküllerini, kontrol kitosan nanopartiküllerini boş / negatif kontrol olarak kullanın. Kitosan/dsRNA nanopartikülleri ile farklılıkları karşılaştırmak için çıplak dsRNA'yı kullanın.
5. Her bir yaprak diskinin yüzeyine sırasıyla 10 μL kitosan/dsRNA nanopartikülleri, kitosan ve çıplak dsRNA kaplayın. Yaprak diskler üzerindeki nanopartikül çözeltisini ve dsRNA çözeltisini oda sıcaklığında 5 dakika havayla kurutun.
6. Her larvayı günde bir nanopartikül kaplı veya dsRNA kaplı yaprak diski ile besleyin. Larvalara 5 gün boyunca sürekli olarak nanopartikül kaplı veya dsRNA kaplı yaprak diskleri sağlayın. Kaplanmış yaprak diski her gün larvalar tarafından tamamen yendikten sonra taze dut yaprağı sağlanabilir.
7. 6. günde, larvaları hareket etmeyene kadar buz üzerinde uyuşturun ve larvaları örnekleme için inceleyin. Göğüs kafesi temiz bir Petri kabında makasla kesin. Bir cımbız ile orta bağırsağı dışarı çekin. Orta bağırsaktaki içeriği çıkarın ve orta bağırsağı nükleaz içermeyen suyla dolu başka bir Petri kabında yıkayın. Orta bağırsağı 1,5 mL'lik bir tüpte saklayın ve -70 °C'de tutun.

6. Gen susturmanın doğrulanması

1. Bağıl transkript nicelemesini hesaplamak için kantitatif Gerçek Zamanlı PCR (qRT-PCR) gerçekleştirin. En az üç biyolojik kopya ve her biyolojik kopya için üç teknik kopya gereklidir. Göreceli transkripti normalleştirmek için en az iki referans gen önerilir. Bir Bombyx Toll9-2 (BmToll9-2) geni test edildi. Bağıl transkriptin ortalama değerini kontrol grubuyla karşılaştırarak gen susturma verimliliğini değerlendirin ve bunu yüzdeye dönüştürün.
   NOT: qRT-PCR amplifikasyon koşulu, primer bilgileri ve bağıl transkript hesaplaması son yayınımız^20'de bulunabilir.
2. Gen susturma etkisini değerlendirmek için RNAi fenotipini analiz edin. Larva ve kozaların boyutunu gözlemleyin. Görünümleri kaydetmek için her gün fotoğraf çekin.
   NOT: RNAi morfolojiyi, metamorfozu, fizyolojiyi ve davranışı etkileyebilir. RNAi ile ilişkili fenotiplerin gözlemlenmesi, hedeflenen genlere bağlıdır.

RNAi verimliliğini değerlendirmek için, analiz için BmToll9-2'yi hedefleyen bir bağışıklık geni seçildi. BmToll9-2 geni laboratuvarda iyi karakterize edilmiştir ve dsRNA enjeksiyonu ile gen susturma, son yayınımız20'de daha hafif ve daha küçük larvalarla sonuçlanır. Kitosan / dsRNA nanopartikülleri yoluyla yutularak RNAi etkinliğini doğrulamak için, kitosan nanopartikülleri kontrol olarak kullanıldı ve aynı anda çıplak dsRNA karşılaştırıldı.

Kontrol ile karşılaştırıldığında, dsRNA'sı olmayan kitosan nanopartikülleri, BmToll9-2 genini hedefleyen çıplak dsRNA, susturma etkisi göstermez. İpekböceğindeki kitosan/dsRNA nanopartiküllerinin beslenmesi, y'luk bir yıkım ile transkripti önemli ölçüde engeller (Şekil 1). Göreceli transkriptin inhibisyonu, BmToll9-2 geninin kitosan/dsRNA yutulması yoluyla başarılı bir şekilde susturulduğunu gösterir.

BmToll9-2 geninin yıkılması, ipekböceğinin büyümesini önemli ölçüde etkiler. Larvaları gözlemlerken, BmToll9-2 susturuculu larvalar kontrol larvalarından daha küçüktür (Şekil 2A). Kozalar karşılaştırıldığında, BmToll9-2 susturuculu kozalar da daha küçüktür (Şekil 2B). Kitosan/dsRNA nanopartikülleri, ipekböceğinde hem transkript hem de fenotip olarak başarılı RNAi etkileri göstermektedir.

Şekil 1: B. mori 5. instar larvalarında kitosan / dsBmToll9-2 nanopartiküllerinin yutulmasından sonra BmToll9-2'nin nispi transkripti.Kontrol olarak kitosan nanopartikülleri, çıplak dsRNA ve kitosan/dsRNA nanopartikülleri ile beslenen larvalarda BmToll9-2'nin nispi mRNA seviyeleri. Veriler, üç biyolojik replikasyonun ortalama ± standart sapması olarak temsil edildi. Her biyolojik replikasyon için üç teknik replikasyon vardı. Çubuklardaki farklı harfler, tek yönlü ANOVA analizine dayalı olarak önemli farklılıklar gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Kitosan / dsBmToll9-2 nanopartikülleri ile beslendikten sonra fenotip gözlemi. Kitosan nanopartikülleri kontrol olarak kullanılır. (A) Nanopartiküllerin yutulmasından sonra ipekböceği larvalarının ortaya çıkması. (B) Nanopartiküllerin yutulmasından sonra ipekböceği kozalarının ortaya çıkması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.