Yöntem makalesi

Lycoris aurea Bitki Popülasyonlarının Florokrom Bantlama ve 45S ve 5S rDNA-FISH Kullanılarak Karşılaştırmalı Karyotip Analizi

DOI:

10.3791/67363

⸱

29 Kasım 2024

 ,  , 
1Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province, Huaihua University, 2College of Biological and Food Engineering, Hunan University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, kombine PI ve DAPI kromozom boyama, 18S-5.8-26S rRNA gen bölgeleri (45S rDNA bölgeleri) ve 5S ribozomal DNA probları ile floresan in situ hibridizasyon (FISH) kullanarak sekiz Lycoris aurea (L'Her) Herb popülasyonundaki heterokromatin dağılımını araştırır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekiz popülasyondaki karyotip varyasyonunu anlamak için, kromozomal ölçümler, floresan bantları ve rDNA FISH sinyalleri kullanılarak ayrıntılı karyotipler titizlikle oluşturuldu. 45S rDNA bölgelerinin sayısı, popülasyon başına bir ila beş çift arasında değişir ve karyotip başına en yaygın sayı dört çifttir. 45S rDNA lokusu ağırlıklı olarak kromozomların kısa kollarında ve terminal bölgelerinde bulunurken, 5S rDNA lokusu esas olarak kısa kolda ve terminal veya proksimal bölgelerde bulunur. HBWF, HNXN, HBBD ve HNZX popülasyonları, GXTL, HBFC ve SCLS'de olduğu gibi 45S rDNA bölgelerinin benzer bir dağılımını gösterdi ve bu da benzer 45S rDNA site dağılımlarına sahip popülasyonlar arasında yakın bir ilişki olduğunu gösterdi. İncelenen tüm popülasyonların karyotipleri simetriktir, kararlı ve yarı kararlı sentromerler veya sadece kararlı sentromerler içerir. MCA ve CVCL'nin dağılım grafikleri, karyotipik yapılarını etkili bir şekilde ayırt eder. Analiz altı kantitatif parametre (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI) içerir. Ek olarak, sonuçlar, bu altı parametreye dayanan PCoA'nın sekiz popülasyon arasındaki biyolojik karyotip ilişkilerini belirlemek için sağlam bir yöntem olduğunu göstermektedir. Lycoris popülasyonlarındaki kromozom sayısı x = 6'dır.-8. Mevcut çalışma ve literatüre dayanarak, bu popülasyonların genomik farklılaşması, genom boyutu, heterokromatin, 45S ve 5S rDNA bölgeleri ve karyotip asimetrisi açısından tartışılmıştır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lycoris , birkaç önemli bahçe bitkisi içeren bir ailedir1. Lycoris aurea (L'Hér.) Ot. uzun bir geçmişe sahip geleneksel bir Çin şifalı bitkisidir. Fitokimyasal analizler, Lycoris aurea (L'Her.) Herb, asetilkolin duyarlılığını artırabilen ve Alzheimer hastalığını kolinesteraz inhibitörleri2 olarak tedavi etme potansiyeline sahip galantamin ve diğer alkaloidleri içerir.

Daha yüksek bitkilerde, karyotip analizi, bitki biyolojisi için önemli pratik çıkarımlarla genetik ve fiziksel haritaları entegre etmek için çok önemlidir. Bu analiz, kromozomal düzeyde genom karakterizasyonuna, popülasyonlar arasındaki hücresel taksonomik ilişkilerin açıklığa kavuşturulmasına, genetik sapmaların tanımlanmasına ve kromozomal evrim eğilimlerinin anlaşılmasınaolanak tanır 3,4,5. Tipik olarak, bir karyotip tanımı, kromozom sayısını, mutlak ve nispi kromozom uzunluklarını, birincil ve ikincil daralma konumlarını, heterokromatik fragman dağılımını, rDNA site numaralarını ve konumlarını ve diğer DNA dizi özelliklerini ve ayrıca karyotip asimetrisi 6,7,8'i içerir. Karyotip parametreleri arasında asimetri, kromozom uzunluğundaki (kromozomal asimetri) ve sentromer pozisyonundaki (kromozom içi asimetri) varyasyonlarla belirlenir. Karyotip asimetrisi, kromozom morfolojisini yansıtan önemli bir özelliktir ve bitki hücre taksonomisi 9,10,11,12'de yaygın olarak kullanılmaktadır.

Genellikle, kromozom belirteçlerinin yokluğu karyotip analizini sınırlar ve tek tek kromozomların tanımlanmasını engeller. Son yıllarda, Giemsa boyama, floresan bantlama ve floresan in situ hibridizasyon (FISH) bitki kromozomu analizinde popüler hale gelmiştir. CMA (kronomisin A3) / DAPI (4, 6-diamino-2-fenilindol) boyama ve PI (propil iyodür) / DAPI boyama (CPD boyama olarak bilinir) gibi ikili floresan boyama yöntemleri, kromozomlar üzerinde GC açısından zengin ve AT açısından zengin heterokromatik bölgeleri ortaya çıkarır 4,13. Bitki mitozunun metafazı veya pakiteni sırasında, tekrarlanan DNA dizileri veya uzun DNA segmentleri, FISH hibridizasyonu, 14,15,16 yoluyla bitki popülasyonlarında spesifik sinyaller üretebilir.

Floresan bantlar ve FISH sinyalleri, kromozom tanımlaması için yararlı belirteçler sağlar. Kromozom uzunluğunu ölçerek, floresan bantlama özelliklerini analiz ederek ve FISH sinyal farklılıklarını karşılaştırarak, farklı bitki germplazmlarının veya popülasyonlarının ayrıntılı moleküler sitogenetik karyotipleri oluşturulabilir. Bu karyotipler, çeşitli germplazmlarda veya popülasyonlarda kromozom morfolojisini etkili bir şekilde göstererek, heterokromatin dağılımının ve DNA dizisi lokalizasyonunun karşılaştırılmasını sağlar ve daha fazla araştırmayı teşvik eder 4,8,17. Moleküler sitogenetik karyotip karşılaştırmaları, ilgili popülasyonlarınfilogenetik ilişkileri ve kromozomal evrimi hakkında değerli bilgiler sunabilir 8,14,18,19.

Amaryllis ailesi içinde çeşitli ve ilgi çekici bir grup olan Lycoris cinsi, çok yıllık soğanları ile bilinir. 15'i Çin'e özgü olmak üzere yaklaşık 20 türden oluşan, zengin biyolojik çeşitliliği sergiliyor. Bu cins, yalnızca güneybatı Çin, güney Kore ve Japonya dahil olmak üzere Doğu Asya'nın sıcak ılıman ve subtropikal bölgelerinde bulunur ve birkaç popülasyon kuzey Hindistan ve Nepal'e kadar uzanır20. Erken sitogenetik çalışmalar, öncelikle cinsin temel kromozom numarasını belirlemek ve belirli popülasyonlarda kromozom morfolojisini tanımlamak için kromozom sayımını içeriyordu ve büyük ölçüde Lycoris radiata21'e odaklanıyordu. Bu cinste gözlenen toplam kromozom sayıları sırasıyla diploid, anormal diploid, triploid, tetraploid ve anöploid seviyelerini temsil eden 12 ila 33 veya 44 arasında değişir. Temel kromozom sayıları x, 6, 7, 8 ve 11'dir.

Lycoris aurea (L'Hér.) Lycoris cinsi içinde dikkate değer bir tür olan bitki, Çin'de yaygın olarak dağıtılmaktadır22. Rahat, nemli ortamlarda büyür ve küçük ampuller aracılığıyla çoğalır. İki önemli tıbbi bileşik olan likorin ve galantamin içeren bu ampuller, geleneksel Çin tıbbında yüzyıllardır kullanılmaktadır. Lycoris aurea ayrıca sonbaharda çarpıcı kırmızı çiçekleri ve kışın yaprak dökmeyen yaprakları ile bahçecileri büyülüyor. Bununla birlikte, incelenen tüm Lycoris aurea (L'Hér.) Bitki popülasyonları, geleneksel sitolojik yöntemler kullanılarak kromozomal tanımlama için önemli bir zorluk teşkil etmektedir.

FISH, fosmid veya BAC'ın (bakteriyel yapay kromozomlar) metafaz veya pakidermatoz kromozomlar üzerinde tekrarlayan DNA dizileri ve oligonükleotid probları ile klonlanması, karyotip analizi 23,24,25, karşılaştırmalı sitogenetik analiz26,27, sitogenetik harita yapımı28,29 ve kromozoma özgü testler30 için kullanılmıştır. Son zamanlarda, FISH tekniği Lycoris popülasyonlarının kromozom analizine uygulanmıştır31. Kromozom sayısı ve karyotip Lycoris popülasyonlarında değişse de, toplam kromozom sayısı sabit kalır ve üç temel tip gözlenir: merkezi sentromer kromozomu (M-), distal sentromer kromozomu (T-) ve proksimal sentromer kromozomu (A-). Ek olarak, doğal popülasyonlarda çeşitli kromozom şekilleri ve boyutları gözlenir32.

RNA floresan in situ hibridizasyonu, sentromer füzyonu, inversiyon, gen amplifikasyonu ve fragman delesyonu gibi kromozomal değişiklikleri tespit etmek için yararlıdır. Floresan In Situ Hibridizasyon (RNA-FISH) teknolojisi, kromozom merkezi bölgelerinin füzyonu, yeni kromozom yapılarının oluşumu, kromozomal bölgelerin tersine çevrilmesi, genlerin veya gen fragmanlarının amplifikasyonu ve belirli kromozom bölgelerinde gen dizisi kaybı dahil olmak üzere çok sayıda karmaşık değişikliği tespit etmek ve tanımlamak için kromozomların yüksek çözünürlüklü görsel analizini sağlar33. 500 klondan beşi, merkezi sentromer kromozomunun (M-) sentromer bölgesinde güçlü FISH sinyalleri gösterdi, ancak distal sentromer kromozomunda (T-)34 göstermedi. Her kromozomdaki benzersiz FISH sinyal dağılım modeli, daha önce geleneksel boyama yöntemlerini kullanan Lycoris popülasyonlarında zor olan bireysel kromozomların tanımlanmasını sağladı31. Şu anda, Lycoris aurea'nın (L'Hér.) moleküler sitogenetiği üzerine çok az çalışma bulunmaktadır. Herb, bu alanda daha fazla araştırmaya acil ihtiyaç olduğunu vurguluyor.

Bu çalışmada, Lycoris aurea (L'Hér.) Bitki popülasyonları, enzim daldırma ve alevle kurutma (EMF) yöntemleri kullanılarak hazırlanmıştır. FISH identifikasyonu için CPD boyama ve 45S ve 5S rDNA probları kullanıldı. Bu popülasyonların ayrıntılı moleküler sitogenetik karyotipleri, kromozomal ölçümlerden, floresan bantlardan ve 45S ve 5S rDNA FISH sinyallerinden elde edilen birleşik veriler kullanılarak oluşturuldu. Aralarındaki karyotipik ilişkileri belirlemek için her popülasyon için altı farklı karyotipik asimetri indeksi hesaplandı. Moleküler sitogenetik karyotip verilerinin değerlendirilmesi, sekiz popülasyonun genomik farklılaşması ve evrimsel ilişkileri hakkında önemli bilgiler sağladı ve potansiyel olarak Lycoris kromozomlarının anlaşılmasını yeniden şekillendirdi.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda ayrıntılı olarak açıklanırken, kullanılan problar Ek Dosya 1'de verilmiştir.

1. Apikal kromozomların hazırlanması

  1. Hidroponik ile kök salın. Ampulün toprak üstü kısmını çıkardıktan sonra, Song ve ark.35 tarafından açıklanan yöntemi izleyerek suyu her 3 günde bir değiştirerek suyla dolu konik bir şişeye koyun.
  2. Aktif olarak büyüyen kök uçlarını yaklaşık 1.0-2.0 cm uzunluğa ulaştıklarında kesin ve 28 ° C'de 1.0 saat boyunca doymuş α-bromonaftalin içinde muamele edin.
  3. Kök uçlarını yaklaşık 1 cm'ye kadar kesin ve 2-3 saat boyunca oda sıcaklığında (yaklaşık 20-25 ° C) 3: 1 hacim oranında taze hazırlanmış metanol ve buzlu asetik asit karışımına yerleştirin. Daha sonra, She ve ark.36 tarafından tarif edildiği gibi 4 °C'de bir buzdolabında saklayın.
  4. Sabit kök uçlarını (2-3 mm) çift distile suda iyice yıkayın.
  5. pH 4.5'te 0.01 mM sitrik asit-sodyum sitrat tamponunda, her biri% 1'de selülaz ve pektin hidrolaz ile selülaz ve pektin hidrolaz karışımı hazırlayın. Ön işlemden geçirilmiş kök uçlarını karışıma yerleştirin ve 28 °C'de 1,0-1,5 saat sindirin.
  6. Sindirilmiş kök uçlarını çift damıtılmış suyla yıkayın, bir cam slayta aktarın ve ince uçlu forseps kullanarak sabitleyici ile iyice ezin.
  7. Su sisi kaybolana kadar slaytları bir alkol lambasının alevi üzerinde kurutun. Faz kontrast mikroskobu altında, beşten fazla bölünmüş fazı olan ve üst üste binen kromozomları olmayan slaytları seçin. Slaytları ileride kullanmak üzere -20 °C'de saklayın.

2. CPD boyama

  1. PI konsantrasyonunun 0.6 μg·mL-1 ve DAPI konsantrasyonunun 3 μg·mL-1 olduğu %30 (h/h) bir anti-floresan zayıflatıcıya PI ve DAPI ekleyerek bir CPD çözeltisi hazırlayın.
  2. Kromozom slaytını 65 ° C'de 30 dakika kurutun.
  3. Kromozom lamı başına 100 μL RNase A seyreltici (RNase A depolama çözeltisi, 2x SSC (salin sodyum sitrat) ile 100 kez seyreltilir, bu da 100 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyon ile sonuçlanır) ekleyin. Slaytın üzerini örtün ve 37 °C nemli odada 30-60 dakika ısıtın.
  4. Kromozom slaytını 2x SSC ile oda sıcaklığında her biri 5 dakikalık üç aralıklarla yıkayın.
  5. Kromozom slaytını oda sıcaklığında 1-2 dakika yıkayın.
  6. Her kromozom lamı başına 200 μL pepsin seyreltici (pepsin depolama çözeltisi, 5 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 0.01 N HCl ile 100 kez seyreltilir) ekleyin. Slaytın üzerini örtün ve nemli bir odada 37 °C'de 5-20 dakika inkübe edin.
  7. Kromozom bölümlerini oda sıcaklığında 2 dakika ultra saf suyla yıkayın, ardından oda sıcaklığında 2 xSSC ile her biri 5 dakikalık iki aralıklarla yıkayın.
  8. Slaytları metanol ile sabitleyin: buzlu asetik asit (3: 1) çözeltisi 10 dakika.
  9. 2x SSC ile oda sıcaklığında her biri 5 dakikalık üç aralıklarla yıkayın.
  10. %70, %95 ve %100 etanol ile -20 °C'de her biri 5 dakika muamele edin, ardından oda sıcaklığında kurutun.
  11. İşlem görmüş ve kurutulmuş kromozom slaytlarını alın, her slayta 30 μL CPD boyama solüsyonu ekleyin, 24 mm x 50 mm'lik bir lamel ile örtün ve karanlıkta 30 dakikadan fazla boyayın. Geniş kromozom materyali gece boyunca boyanmalıdır.
  12. PI boyama için yeşil bir uyarma filtresi (WG) ve DAPI boyama için bir ultraviyole filtre (UV) kullanarak bir floresan mikroskobu altında kromozom slaytlarını gözlemleyin. Uyumlu yazılımla görüntü yakalayın.
    1. Görüntü yakalama sırasında benzer kırmızı ve mavi floresan yoğunlukları elde etmek için pozlama süresini iki filtre aracılığıyla ayarlayın. CPD görüntüsü, PI ve DAPI ile boyanmış gri tonlamalı görüntülerden elde edilir. Kromozom ölçümleri ve görüntü işleme Adobe Photoshop programı kullanılarak yapıldı.

3. Floresan in situ hibridizasyon

  1. Hibrit çözeltiyi hazırlayın: FAD (10 μL), ssDNA (2 μL), ×20 SSC (2 μL), 5S rDNA (1 μL), 45S rDNA (1 μL) ve %50 glukan sülfat (4 μL). Hazırlandıktan sonra, hibrit çözeltiyi (2500 x g, 5-10 dakika, oda sıcaklığında) santrifüjleyin ve buzun üzerine koyun.
  2. Taranan slaytları 65 °C'de 30-60 dakika fırına koyun.
  3. Pişmiş slaytları çıkarın, 100 μL %70 FAD denatürasyon solüsyonu ekleyin, bir kapak camı ile örtün ve 85 °C'lik bir moleküler hibridizasyon fırınında 2,5 dakika denatüre edin.
  4. Kapak camını çıkarın ve slaytları hemen %70, %90 ve %100 soğuk etanole batırın ve her biri 5 dakika boyunca art arda kurutun.
  5. Slaytları çıkarın ve oda sıcaklığında 30 dakikadan fazla kurumaya bırakın.
  6. Slayta 20 μL hibrit çözelti ekleyin, sıvı tamamen dağılana kadar kapak camını yavaşça üstüne yerleştirin ve sürgünün kapalı alanını nemlendirmek için oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.
  7. Slaytları 2× SSC ile ıslatılmış hibrit bir kaba yerleştirin (hibrit tabak, ışıktan uzakta çalışmayı kolaylaştırmak için kalay folyoya sarılmış bir kapağı olan büyük bir Petri kabı olmalıdır) ve gece boyunca 37 °C'de (en az 6 saat) inkübe edin.
  8. Kromozomları, %30 (h/h) Vectashield H-100 çözeltisi içinde 3 μg·mL-1 DAPI ile monte ederek karşı boyayın. Filtrenin mor ışığıyla uyarılan DAPI'nin mavi floresansı ve yeşil ışıkla uyarılan PI'nin kırmızı floresansı ile uyumlu yazılımı kullanarak görüntüyü yakalayın.
    NOT: FISH hibridizasyonu, She ve ark.36 tarafından tarif edilen yöntem izlenerek, daha önce CPD ile boyanmış slaytlar üzerinde 45S ve 5S rDNA probları kullanılarak gerçekleştirildi.

4. Karyotip analizi

  1. Kromozomların iyi dağıldığı (üst üste binmeyen) ve orta derecede yoğunlaştığı (kromozomlar maksimum düzeyde toplanmamalıdır, ancak uçlar bir araya toplanmamalıdır) her popülasyon için beş metafaz mitotik hücre seçin, She ve ark.4 tarafından açıklanan metodolojiyi izleyerek.
  2. Hücre bölünmesi sırasında en yüksek konsantrasyona sahip beş kromozom seçerek her kromozomun mutlak uzunluğunu belirleyin.
  3. Her bir kromozomun uzun kolunun (L) ve kısa kolunun (S) uzunluğunun yanı sıra kromozom üzerindeki her bir floresan pigment bandının boyutunu titizlikle ve hassas bir şekilde ölçün.
  4. Aşağıdaki parametreleri hesaplayın: (1) bağıl kromozom uzunluğu (RL, haploid yüzdesi); (2) kol oranı (AR = L/S, uzun kol/kısa kol); (3) toplam haploid kromozom uzunluğu (TCL; karyotip uzunluğu); (4) ortalama kromozom uzunluğu (C); (5) floresan bandının boyutu (kromozomun uzunluğuna göre floresan bandının yüzdesi); (6) sentromerden rDNA bölgesine olan mesafe; (7) ortalama sentromere indeksi (CI, her bir kromozomun kısa kol uzunluğunun o kromozomun toplam uzunluğuna bölünmesiyle hesaplanır, daha sonra bu değerlerin ortalaması alınır); (8) sentromer indeksi (CVCI), varyasyon katsayısı (CV), kromozom uzunluğu varyasyon katsayısı (CVCL), ortalama sentromer asimetri katsayısı (MCA) ve Stebbins asimetrisi kategorisi dahil olmak üzere dört farklı karyotip asimetrisi göstergesi.
    NOT: Asimetri indeksini hesaplamak için Paszko10 ve Peruzzi et al.11 yöntemlerine bakın. Farklı kol oranlarına sahip kromozomları Levan'ın beş sınıflandırma yöntemine göre sınıflandırır. Lycoris aurea (L'Hér.) kromozomlarını düzenleyin. Han ve ark. protokol37'de açıklandığı gibi azalan uzunluk sırasına göre bitki.
  5. Floresan bant bilgileri ve rDNA-FISH'in konumu ve boyutu ile birlikte kromozom ölçüm verilerine dayalı olarak kromozom karyotip desenleri çizerek metodolojinin kesinliğini ve doğruluğunu sağlayın.
  6. Sekiz popülasyonun karyotip asimetrik ilişkilerini görselleştirmek, net içgörüler sağlayan önemli bir adımdır. Bu, MCA ve CVCL'lerini elde etmek için kullanılan iki boyutlu dağılım grafikleri aracılığıyla elde edilir.
  7. She ve ark.38'in yöntemlerini izleyerek, çok önemli bir bileşen olan Gower benzerlik katsayısını kullanarak temel koordinat analizi (PCoA) gerçekleştirin.
  8. Sekiz popülasyonun sitogenetik karyotiplerini belirlemek için altı kantitatif parametreyi (x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI) hesaplayın.
  9. UPGMA tabanlı dendrogram ve PCoA dağılım grafiği oluşturmak için bir veri analizi ve görselleştirme programı kullanarak istatistiksel analizler yapın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Titiz enzim daldırma ve alevle kurutma (EMF) yöntemini kullanarak, Lycoris aurea'nın (L'Hér.) dağınık ve iyi farklılaşmış metafaz kromozomları Bitki elde edildi ve Lycoris aurea'nın sitogenetik kromozom karyotipi oluşturuldu (Şekil 1). En yüksek yoğuşma derecesine sahip metafaz kromozomları, azaltılmış morfolojik farklılıklar nedeniyle karyotip analizi için uygun değildir. Bununla birlikte, haploid kromozomların (TCL) toplam uzunluğu popülasyonlar arasında karşılaştırılabilir olduğundan, farklı Lycoris aurea popülasyonlarının karyotiplerini ayırt etmek, TCL değerlerindeki farklılıkları karşılaştırarak mümkündür. Sekiz Lycoris aurea popülasyonunun karyotip özellikleri ve nükleer DNA içeriği Tablo 1'de gösterilmiştir. Floresan bantlarının dağılımı ve 45S ve 5S rDNA bölgelerinin konumları Tablo 2'de sunulmuştur. Şekil 2 , floresan bantlama özellikleri ve 45S ve 5S rDNA FISH sinyallerinin konumu ve boyutu ile birlikte kromozomların ölçümlerini göstermektedir.

Diploid kromozom sayıları şu şekildedir: GXTL için 2n = 16 = 8m + 8t, HBFC için 2n = 14 = 8m + 6t, GZDS için 2n = 14 = 8m + 6t, HNZX için 2n = 16 = 6m + 10t, HBBD için 2n = 14 = 8m + 6t, HNXN için 2n = 14 = 8m + 6t, HBWF için 2n = 16 = 6m + 10t ve SCLS için 2n + 1 = 15 = 7m + 8t (Tablo 1). She ve ark.4 tarafından protokolde tanımlandığı gibi, sekiz L. aurea popülasyonunun metafaz kromozomları küçüktür, ortalama kromozom uzunlukları 1.01 μm (HNZX) ila 2.08 μm (GZDS) arasında değişir ve TCL 16.14 μm (HNZX) ila 29.13 μm (GZDS) arasında değişir. Sekiz popülasyonun TCL'leri, rapor edilen nükleer DNA içeriği ile ilişkilidir (Tablo 1). En küçük nispi uzunluk aralığı (RRL) HNXN'de (1.52-3.81), en büyüğü ise GZDS'de (2.73-5.86) görülür. Popülasyonlar HNXN ve GZDS, sırasıyla kromozom uzunluğunda en küçük ve en büyük varyasyonu sergiledi. Genomun ortalama sentromer indeksi (Kİ) 61.02 ± 5.63 (popülasyon HBFC) ile 70.70 ± 4.63 (popülasyon HBWF) arasında değişmektedir. Popülasyon HBFC, sentromer indeksinde en az değişikliği gösterirken, popülasyon HBWF en kapsamlı değişiklikleri sergiledi.

Karyotipler metasentrik (m) ve telosentrik (t) kromozomlardan oluşur (Tablo 1; Şekil 2), incelenen sekiz popülasyon arasında en yaygın kromozom formlarını temsil eder. Sekiz farklı karyotip asimetri indeksi Tablo 1'de verilmiştir. Bu indeksler arasında, sentromer indeksi (CVCI) ve ortalama sentromer asimetrisi (MCA) varyasyon katsayısı intrakromozomal asimetriyi karakterize ederken, kromozom uzunluğunun varyasyon katsayısı (CVCL) kromozomlar arası asimetriyi ölçer. CVCI ve MCA aralıkları aşağıdaki gibidir: CVCI = 10.97 (HBBD) ila 18.25 (HBWF) ve MCA = 28.85 (HNZX) ila 39.30 (HBWF). Bu değerler tutarlı bir şekilde HBBD'nin en düşük, HBWF'nin ise en yüksek kromozomal asimetriye sahip olduğunu göstermektedir. CVCL aralığı 14.98 (GZDS) ila 23.32 (HBWF) arasındadır, bu da GZDS'nin en az asimetrik karyotip sergilediğini, HBWF'nin ise sekiz popülasyon arasında en asimetrik karyotipi gösterdiğini düşündürmektedir. Stebbins9'un sınıflandırma ilkelerine göre, bu karyotipler sınıf 1B'ye aittir, bu da incelenen tüm popülasyonların nispeten simetrik karyotiplere sahip olduğunu gösterir.

Sekiz Lycoris aurea (L'Hérit.) arasındaki karyotip asimetri ilişkileri Bitki popülasyonları, CVCI'ye karşı CVCL ve MCA'ya karşı CVCL'nin iki boyutlu dağılım grafikleri kullanılarak gösterilmiştir (Şekil 3). Bu popülasyonların karyotip yapısı, üç parametre çifti (CVCI, CVCL ve MCA) tarafından ortaya konduğu gibi önemli etkilere sahiptir. Bu parametreler benzer karyotip asimetrileri göstermektedir. Dağılım grafiklerinden elde edilen bulgular, popülasyon HNXN'nin en simetrik karyotipe sahip olduğunu, HBFC ve HBWF popülasyonlarının ise sırasıyla en fazla kromozom içi ve kromozomal asimetriler sergilediğini göstererek araştırmanın potansiyel etkisini vurgulamaktadır (Şekil 3).

Bu çalışma , sekiz Lycoris aurea popülasyonunu, beş karyotip parametresi ile UPGMA ağaç diyagramına dayalı olarak titizlikle üç ana gruba ayırdı (Şekil 4). Popülasyon SCLS tarafından temsil edilen ilk küme, bağımsız bir sınıf oluşturur. İkinci grup HNXN ve HBWF'den oluşmaktadır. Üçüncü küme iki alt gruba ayrılır: biri sadece popülasyon HBFC'yi içerirken, diğeri popülasyon HBWF, GZDS ve GXTL'yi içerir, popülasyon HBBD ve GZDS daha küçük bir dalda kümelenir. Temel koordinat analizi (PCoA) ile ortaya çıktığı gibi, incelenen popülasyonlar arasındaki karyolojik ilişkiler Şekil 5'te gösterilmektedir. PCoA dağılım grafiği, sekiz popülasyonun h.36 güven düzeyi ile iki gruba ayrılabileceğini göstermektedir. İlk grup HBWF, HBBD ve GXTL'yi içerir ve önceki üç popülasyon birlikte yakından kümelenir. İkinci grup, HBFC'nin iki grup arasında orta pozisyonu işgal ettiği ve SCLS'nin en izole olarak konumlandırıldığı HBFC, HNXN, HNZX ve SCLS'den oluşur (Şekil 5).

CPD (propidyum iyodür ve DAPI kombinasyonu) ve DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) ters boyama, nükleer yapıyı ve kromatin dağılımını gözlemlemek için kullanılan standart tekniklerdir. Bu çalışmanın sonuçları, sekiz Lycoris aurea (L'Hérit) popülasyonu arasında belirgin heterokromatin fenomenlerini ortaya çıkardı. Bitki (Şekil 1 ve Şekil 2; Tablo 2). Her popülasyon için FISH hibridizasyon sonuçları, tüm kromozomal bölgelerin 45S ve 5S rDNA lokuslarına karşılık geldiğini gösterdi. CPD bantlarının özellikleri Şekil 1A, C, E, G, I, K, M, O'da gösterilmiştir.

HBFC ve HBBD popülasyonlarında, sentromerik ve perisentromerik bölgelerde CPD bantları gözlenmiştir (Şekil 1G,K; Şekil 2D,F). Bununla birlikte, bazı kromozomlar CPD bantlarını göstermedi: SCLS'de 3. ve 8. kromozomlar, HNXN'de 1. kromozom, HNZX'de 1. kromozom, HBWF'de 1. kromozom, GZDS'de 2. kromozom ve GXTL'de 2. kromozom (Şekil 1A,C,E,I,J,M,O; Şekil 2A-C,E,G,H). Özellikle, SCLS ve HNXN'de kromozom çiftleri 5, 6 ve 7'nin kısa kollarının terminallerinde, HNZX'de 4, 5, 6, 7 ve 8 numaralı çiftlerde ve HBFC'de 5, 6 ve 7 numaralı çiftlerde CPD bantları da bulundu. Ek olarak, HBWF'de kromozom 4, 5, 6, 7 ve 8'in kısa kol uçlarında, HBBD'de kromozom 5, 6 ve 7'nin kısa kol uçlarında ve GXTL'de kromozom 5, 6, 7 ve 8'in kısa kol uçlarında CPD bantları mevcuttu (Şekil 1A ve Şekil 2A).

FISH hibridizasyonundan sonra, DAPI ters boyama, GZDS'deki 5, 6 ve 7 numaralı kromozomların merkez parçacıkları etrafında parlak floresan bantlar oluşturdu. FISH sonrası DAPI+ bantları olarak adlandırılan bu bantlar, bu heterokromatin bölgelerinin yüksek sayıda A-T baz çifti içerdiğini gösterir (Şekil 2G). Sekiz popülasyonda gözlenen (peri)sentromerik CPD bantlarının aralığı %.00 ile W.14 arasında iken, terminal CPD bantlarının toplam miktarı @.00 ile q.43 arasında değişmektedir (Tablo 2). Popülasyon GZDS'de, FISH sonrası DAPI+ bantları karyotip uzunluğu ile korelasyon gösterdi ve toplamın B.86'sını oluşturdu. FISH'ten sonra rDNA CPD bantlarının, rDNA olmayan CPD bantlarının ve DAPI+ bantlarının boyutları, Lycoris aurea'nın (L'Hérit) çeşitli kromozom çiftleri arasında önemli ölçüde farklılık gösterdi. Bitki (Şekil 2; Tablo 2).

FISH tekniği, Şekil 1'de gösterildiği gibi, 45S ve 5S rDNA problarını CPD ile boyanmış kromozomlara yerleştirmek için kullanıldı. Lycoris aurea'nın (L'Hérit.) sekiz popülasyonundaki 45S ve 5S rDNA bölgelerinin sayısının ve konumunun özeti. Bitki Tablo 2'de sunulmuştur ve Şekil 2'de gösterilmiştir. Özellikle, sekiz popülasyon arasındaki rDNA lokuslarının sayısı, büyüklüğü ve konumundaki önemli farklılıklar bu bulguların önemini vurgulamaktadır. Toplamda, sekiz popülasyonda 30 45S rDNA lokusu vardı. Bunlardan 4'ü (.33) merkezi sentromere bölgesinde, 9'u (0.00) yakın merkezi sentromere bölgesinde ve 17'si (V.67) kendi kromozom kollarının terminal bölgelerinde yerleşmişti (Şekil 2; Tablo 2).

GXTL popülasyonunda, kromozom 4'ün kısa kolunun sentromer bölgesinde bir 45S rDNA lokus sinyali bulunurken, kromozom 5, 6, 7 ve 8'in uzun kollarının sentromer bölgesinde dört ek sinyal bulundu (Şekil 1P; Şekil 2G). HBFC popülasyonunda, kromozom 4'ün kısa kolundaki sentromer bölgesinde bir 45S rDNA lokusu konumlandırıldı ve kromozom 5, 6 ve 8'in kısa kollarındaki perisentromerik heterokromatin bölgelerinde üç lokus bulundu (Şekil 1H; Şekil 2D). GZDS popülasyonunda, metasentrik kromozom 4'ün kısa kolunun sentromere bölgesinde bir 45S lokusu yerleşmiştir (Şekil 1N; Şekil 2G). HNZX'de, kromozom çiftleri 4, 5, 6, 7 ve 8'in kısa kollarının terminal bölgelerinde beş adet 45S rDNA lokusu gözlenmiştir (Şekil 1H; Şekil 2D). HBBD'de 45S sitelerinin dağılımı (Şekil 1J; Şekil 2E) ve HNXN (Şekil 1L; Şekil 2F) kromozom 4'ün kısa kolunun sentromere bölgesinde bir lokus ve kromozom 5, 6 ve 7'nin kısa kollarının sentromer bölgesinde üç lokus ile benzerdi.

HBWF'de, kromozom çiftleri 4, 5, 6, 7 ve 8'in kısa kol sentromer bölgelerinde beş adet 45S rDNA lokus sinyali ortaya çıktı (Şekil 1N; Şekil 2G). SCLS'de, kromozom çiftleri 1 ve 2'nin kısa kol sentromer bölgelerinde ve ayrıca kromozom çiftleri 5 ve 6'nın kısa kollarının perisentromerik bölgelerinde bir 45S rDNA lokus sinyali bulundu (Şekil 1P; Şekil 2H). 5S rDNA lokusu için, 3'ü (3.33) proksimal bölgelerde, 3'ü (3.33) perisentromerik bölgelerde ve 3'ü (3.33) ilgili kromozom kollarının terminal bölgelerinde olmak üzere sekiz taksonda toplam dokuz tane tanımlanmıştır (Şekil 2; Tablo 2). GXTL'de, kromozom çifti 6'nın uzun kolunun terminal ucunun yakınında bir 5S rDNA lokus sinyali ortaya çıktı (Şekil 1P; Şekil 2G). 5S bölgelerinin dağılımı HBFC'de benzerdi (Şekil 1H; Şekil 2D) ve GZDS (Şekil 1N; Şekil 2G), her ikisi de kromozom 7'nin kısa kolunun proksimal bölgesinde bir 5S rDNA lokusu içerir. HNZX'de, kromozom 8'in uzun kolunun terminal ucunun yakınında bir 5S rDNA lokusu bulundu (Şekil 1H; Şekil 2D), HBBD'de ise kromozom 7'de bir 5S rDNA lokusu tanımlanmıştır (Şekil 1J; Şekil 2E). HBWF'de, kromozom 4 ve 8'in uzun kollarının terminal ucuna yakın iki 5S rDNA lokusu, kromozom 7'nin uzun kolunda iki tane daha, sentromer bölgesinde bir tane daha ve bir tanesi uca yakın olarak ortaya çıktı (Şekil 1N; Şekil 2G).

45S ve 5S rDNA FISH sinyallerinin kombinasyonu, terminal CPD segment özellikleri ile birlikte, tüm mitotik kromozomları farklı Lycoris aurea (L'Hérit) popülasyonlarından etkili bir şekilde ayırt etti. Ot. SCLS, HBFC, HBBD, GZDS ve GXTL popülasyonlarında, kromozom 1, sentromerik bölgede güçlü CPD sinyalleri sergiledi. Kromozom 2, GZDS ve GXTL hariç, sentromerik bölgede güçlü CPD sinyalleri sergiledi. Kromozom 3, SCLS dışında sentromerik bölgede güçlü bir CPD sinyali gösterdi. Kromozom 4, sentromerik bölgede sürekli olarak güçlü CPD sinyalleri sergiledi. Kromozom 5, 6 ve 7 için, kısa kolların uçlarında güçlü CPD sinyalleri gözlendi. Kromozom 4 ayrıca kısa kolun sonunda güçlü 45S rDNA sinyalleri gösterirken, kromozom 5 ve 6, GZDS hariç terminal bölgelerinde güçlü 45S sinyallerine sahipti. Özellikle, GZDS popülasyonunda güçlü bir DAPI sinyali mevcuttu. Ek olarak, HBFC, HBWF, HBBD ve GZDS popülasyonlarında kromozom 7'nin proksimal bölgesinde zayıf bir 5S rDNA sinyali ortaya çıktı.

figure-results-1
Resim 1: Sekiz adet Lycoris aurea (L' Hér.) kromozomunun mitotik kromozomları Bitki popülasyonları. Sekiz farklı Lycoris aurea (L' Herit.) familyasından alınan mitotik metafaz kromozomlarının incelenmesi Popülasyon SCLS (A,B), popülasyon HNXN (C,D), popülasyon HNZX (E,F), popülasyon HBFC (G,H), popülasyon HBWF (I,J) ve popülasyon HBBD (K,L) dahil olmak üzere bitki popülasyonları gösterilmiştir. GZDS (M,N) ve GXTL (O,P) hibridizasyonu, CPD boyamadan sonra biotin işaretli 45S ve digoksin işaretli 5S rDNA probları ile FISH kullanılarak gerçekleştirildi. CPD boyamadan sonra ortaya çıkan kromozom görüntüleri, 45S (yeşil) ve 5S (kırmızı) rDNA sinyallerini gösterir. Toplam DNA, DAPI boyası ile ters boyandı ve mavi bir renk elde edildi. Ölçek çubukları = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Sekiz Lycoris aurea (L' Hér.) kromozom karyotip diyagramları Bitki popülasyonları. Sekiz Lycoris aurea (L' Herit.) popülasyonu için kromozom model diyagramı Herb, 45S ve 5S rDNA FISH sinyallerinin konumu ve boyutu ile birlikte floresan bant özelliklerini ortaya çıkarır. Popülasyonlar SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS ve GXTL sırasıyla (AH) ile temsil edilir. Ordinat ölçeği, kromozomun nispi uzunluğunu (bu kromozomun haploid genomdaki yüzdesi) gösterir ve üstteki sayı, kromozomun seri numarasını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Sekiz Lycoris aurea (L' Hér.) için dağılım grafikleri Üç karyotip parametresine dayalı bitki popülasyonları. (A) CVCI endeksi, CVCL endeksine karşı çizilir. (B) MCA endeksi, CVCL endeksine karşı çizilir. Popülasyonlar SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS ve GXTL belirtilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Sekiz adet Lycoris aurea (L' Hér.) Bitki popülasyonları. UPGMA dendrogramı, sekiz Lycoris aurea (L' Hér.) için x, 2n, TCL, MCA, CVCL ve CVCI parametrelerine dayanmaktadır. Bitki popülasyonları: SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS ve GXTL. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Resim 5: Sekiz Lycoris aurea (L' Hér.) Altı karyotip parametresine dayalı bitki çeşitleri. PCoA, SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS ve GXTL'yi temsil eden x, 2n, TCL, MCA, CVCL ve CVCI parametrelerine dayanmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Sekiz Lycoris aurea (L' Hér.) Bitki popülasyonları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Sekiz Lycoris aurea (L' Hér.) Bitki popülasyonları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Bu çalışmada kullanılan problar. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lycoris aurea'nın (L'Hér.) hazırlanması Bitki kökü kromozomları birkaç kritik adım içerir: (1) hidroponik yoluyla kök yetiştirmek, (2) kök uçlarını doymuş α-bromonaftalin ile muamele etmek, (3) kökleri bir alkol-asetik asit çözeltisi kullanarak sabitlemek, (4) bir enzim çözeltisi ile kök uçları üzerinde enzimatik hidroliz yapmak ve (5) sindirilmiş kökleri iyice ezmek ve slaytları bir alkol lambası alevi üzerinde kurutmak.

Sitogenetik çalışmalarda karyotip analizi için doğru kromozom ölçümü şarttır. Kromozomlar, gözle görülür bir yoğunlaşma ve açıkça tanımlanmış sınırlar göstermelidir; Aksi takdirde kromozom parametrelerinin doğru hesaplanmasızorlaşır 5. Önceki sitogenetik araştırmalar, mitotik kromozomların morfolojik farklılaşmasının yoğunlaşma derecesine bağlı olduğunu göstermiştir 4,36. Yoğuşma yetersiz olduğunda, kromozom kollarının uçları hala desaglütine olabilir ve bu da belirsiz kromozom sınırlarına yol açabilir. Bununla birlikte, kromozomlar maksimum yoğunlaşmaya ulaştığında, kromozomlar arasındaki morfolojik farklılıklar azalır. Bu nedenle, orta derecede yoğunlaşmaya sahip kromozomların seçilmesi, özellikle daha az kromozoma sahip popülasyonlarda, kromozomun tanımlanması ve ölçülmesi için çok önemlidir.

Prob etiketlemesi, özellikle 5S rDNA prob çözümü için başarılı FISH in situ hibridizasyonuna ulaşmak için çok önemlidir. 5S rDNA'nın kısa dizisi nedeniyle, PCR ile etiketlenen hedef dizilerin konsantrasyonu tipik olarak düşüktür ve bu da zayıf hibridizasyon sinyallerine yol açar. Bununla birlikte, floresein etiketli probların doğrudan sentezlenmesi, daha güçlü hibridizasyon sinyalleri üretir ve işlemi basitleştirir. 45S rDNA prob çözeltisi için, Arabidopsis thaliana'nın 5.8S, 18S ve 25S rRNA kodlama bölgelerinden kısmi diziler, 5' ve 3' uçlarda 6-karboksil-tetrametil rodamin (TAMRA) ile etiketlendi ve daha sonra karıştırıldı. Floresein 5S rDNA prob çözeltisi, Arabidopsis 5S rRNA gen kodlama bölgesinden 1-59 ve 60-118 nükleotid dizileri kullanılarak elde edildi ve her dizi 5' ucunda 6-karboksil floresein (6-FAM) ile etiketlendi, daha sonra karıştırıldı.

Bu çalışmada, DNA bağlanmasında DAPI ve PI boyaları arasındaki farklardan yararlandık ve bunları berrak floresan bantlar elde etmek için birleştirdik. PI (propidyum iyodür) boyaları hücre zarlarına nüfuz edebilir ve hücreler içindeki DNA moleküllerine bağlanabilir. Buna karşılık, DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) tercihen AT açısından zengin DNA bölgelerine bağlanır ve berrak, yüksek kontrastlı boyama sağlar. Bu tamamlayıcı özelliklerden dolayı, DAPI ve PI, aynı anda hem çekirdek hem de sitoplazma hakkında bilgi toplamak için CPD boyaması olarak bilinen birlikte sıklıkla kullanılır. CPD ve DAPI+ bantlarının varlığı, yeri ve boyutundaki farklılıklar, Lycoris aurea'nın sekiz popülasyonunda önemli heterokromatin farklılaşması ortaya çıkardı. CPD boyama, hem sentromerik hem de perisentromerik bölgelerde ve telosentrik kromozomlar içinde GC içeriği açısından zengin heterokromatin bölgeleri gösterdi.

Karyotip asimetrisi çalışması, hem kalitatif hem de kantitatif ölçümler, Stebbins sınıflandırma parametreleri ve çeşitli kantitatif indeksler (örneğin, Paszko10; Peruzzi ve ark.11). Bunlar arasında, kromozom asimetrisini ölçmek için R oranı ve CVCL kullanılırken, CVCI ve MCA, kromozomal asimetrinin temel göstergelerini temsil eder. Özellikle, CVCL, kromozomal asimetri10'u tahmin etmek için sağlam bir istatistiksel parametre olarak kabul edilir ve Kromozomal Asimetri Metriği (MCA), kromozomal asimetri11'i değerlendirmek için etkili bir ölçü olarak kabul edilir. Popülasyonlar arasındaki karyotip asimetrilerini en iyi şekilde temsil etmek için, her bir numunenin bir nokta11,12 olarak temsil edildiği, sırasıyla x ve y eksenlerine yerleştirilmiş iki asimetri tahmincisi ile iki boyutlu bir dağılım grafiği önerilir. Sonuçlar, CVCL'nin iki boyutlu dağılım grafiklerinin vs. CVCI'nin yanı sıra MCA'ya karşı. CVCL, Lycoris aurea'nın (L'Herit) sekiz farklı popülasyonu arasındaki karyotip asimetri ilişkilerini etkili bir şekilde göstermektedir. Herb, kromozomal asimetrinin değerlendirilmesinde bu indekslerin güvenilirliğini desteklemektedir.

Karyotipleri karşılaştırmak ve sekiz popülasyon arasındaki karyolojik ilişkileri yeniden yapılandırmak için bu çalışma, x, 2n, TCL, MCA, CVCL ve CVCI parametrelerini kullanarak Peruzzi ve ark.11 tarafından önerilen metodolojiyi uyguladı. Bulgular, HBWF, GZDS, HBBD ve GXTL popülasyonlarının yakından ilişkili olduğunu ve HBFC'nin bu gruplar arasında konumlandığını ortaya koydu. Sonuç olarak, bu altı parametreye dayanan PCoA'nın, sekiz popülasyon arasındaki ilişkileri ayırt etmek için oldukça etkili bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, inşa edilen moleküler evrim ağacından bazı karmaşık modeller de ortaya çıktı. Örneğin, HNZX, moleküler filogenetik ağaçta HBWF ile yakından ilişkili görünürken, PCoA saçılma grafiğinde daha uzaktan ilişkiliydi. Bu karmaşıklık, moleküler sınıflandırma özelliklerini tamamlayarak, Lycoris içindeki karyotip evrimindeki eğilimleri tahmin etmek için çoklu nicel yaklaşımların kullanılmasının önemini vurgulamaktadır.

Bu çalışma için bitkiler, Tianlin İlçesi, Guangxi Eyaleti (GXTL), Fang İlçesi, Hubei Eyaleti (HBFC), Dushan İlçesi, Guizhou Eyaleti (GZDS), Zixing İlçesi, Hunan Eyaleti (HNZX), Badong İlçesi, Hubei Eyaleti (HBBD), Xinning İlçesi, Hunan Eyaleti (HNXN), Wufeng İlçesi, Hubei Eyaleti (HBWF) ve Lushan İlçesi, Sichuan Eyaleti (SCLS). Huaihua Üniversitesi Herbaryumu'nda bir kupon örneği korunmuştur. Bu çalışma, 45S ve 5S rDNA FISH sinyallerinin ve terminal CPD segment özelliklerinin kombinasyonunun, tüm mitotik kromozomları farklı Lycoris aurea (L'Herit) popülasyonlarından etkili bir şekilde ayırt ettiğini bulmuştur. Ot. Burada sunulan protokol, Lycoris aurea'nın (L'Herit.) farklı popülasyonları arasındaki heterokromatin dağılımını araştırmayı amaçlamaktadır. Ot. CPD (PI ve DAPI'nin bir kombinasyonu) ve DAPI (4 ", 6-diamidino-2-fenilindol) ters boyama, nükleer yapıyı ve kromatin dağılımını gözlemlemek için yerleşik tekniklerdir. Kromozom FISH hibridizasyonu için 18S-5.8-26S rRNA gen bölgelerinin (45S rDNA bölgeleri) ve 5S ribozomal DNA'nın doğrudan floresan etiketlemesi basittir ve sağlam hibridizasyon sinyalleri sağlar. Bu niteliksel ayrım, çeşitli popülasyonların analizinde giderek daha değerli hale gelecektir.

Bu yöntem, aktif mitoz sırasında kök ucu kültürüne ihtiyaç duyulduğundan, hızlı kök ucu yetiştiriciliği yapabilen bitki türleri için en uygun olanıdır. Kısa 5S dizisi nedeniyle, çalışmada 5S rDNA probu olarak Arabidopsis thaliana'nın 5S rRNA gen kodlama bölgesinin 1-118bp nükleotid dizisi kullanıldı. Kısa dizisi ve zayıf sinyali nedeniyle, bu yöntem yalnızca 5S rRNA geninin 1-118bp bölgesinde nispeten korunmuş bazlara sahip türlerin tanımlanması için etkilidir. Orta derecede yoğuşmalı metafaz kromozomlarının seçilmesi, yöntemin başarısı için çok önemlidir. Kromozom yoğunlaşması, kök toplama zamanlaması, ön işlem süresi ve alevle pişirme ile yakından ilgilidir. Bu nedenle, teknik, deneysel başarıyı sağlamak için her adım üzerinde hassas kontrol gerektirir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir çıkar bulunmadığını beyan etmişlerdir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Çin Doğa Bilimleri Vakfı (32070367) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AlkolSangon Biyoteknoloji (Şangay) Co., Ltd.A500737-0005(% 70,  %90,  % 100)
1 kez; TNTSangon Biyoteknoloji (Şangay) Co., Ltd.B5481081 kez;, 10 kez;
2 kez; SSCSangon Biyoteknoloji (Şangay) Co., Ltd.B5481092 kez;, 20 kez;
45S  rDNASangon Biyoteknoloji (Şangay) Co., Ltd.TAMRA her iki uca da eklenir (5 've 3' uçları)
4'6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E60730320ml
5S  rDNASangon Biyoteknoloji (Şangay) Co., Ltd.5 'end plus 6-FAM (FITC)
Adobe Photoshop yazılımıAdobe Systems IncorporatedCS6
Alpha bromo-naftalinSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A602718Doygunluk
Tükenmişlik önleyici ajanSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Vectashield H-100010 mL
Biyokimyasal inkübatörŞangay Yiheng Bilimsel Enstrüman A.Ş., LTDLRH-70
SelülazSangon Biotech (Şangay) Co., Ltd.A42606810 g
Sitrik asitSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A50170210 g
Deiyonize formamid (FAD)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600211-05000.7
Dekstran sülfatSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42822910 mL
Floresan yerinde hibridizasyon cihazıABD/Abbott ThermoBriteS500-24
Floresan mikroskobuOlympus  Çin  Co.ltdBX60
Buzlu asetik asitSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A501931500 mL
HClAladdin Reaktifi & nbsp; Co.   Ltd. (Şangay)H399657 500 mL
Buz makinesiDan Ding Shanghai International Trade Co., Ltd.ST-70
Leica biyolojik mikroskopAlmanya Leica Instrument Co., LTDDM6000B
Metil alkolSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A601617500 mL
MetMorph yazılımıMoleküler CihazlarSürüm 7.35
FırınThermo Scientific & Trade; Heratherm ve ticaret;THM # 51028152
PektinazSangon Biyoteknoloji (Şangay) Co, LtdA00429710 g
PepsinSangon Biotech (Şangay) Co., Ltd.1.07185100 g
Propidyum iyodür (PI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A4252591 g
RNaseASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.R464210 mg
Somon sperm DNA'sı (ssDNA)Aladdin Reaktifi & nbsp; Co.   Ltd. (Şangay)D1198711 g
Sodyum sitratAladdin Reaktifi & nbsp; Co.   Ltd. (Şangay) S189183Windows 10.0 için 10 g
Statistica;İstatistiksel analiz için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heywood, V., Casas, A., Ford-Lloyd, B., Kell, S., Maxted, N. Conservation and sustainable use of crop wild relatives. Agric Ecosyst Environ. 121 (3), 245-255 (2007).
  2. Rong, W., Sun, J., Zhang, H., Wang, H., Liu, H. Cloning and characterization of a tyrosine decarboxylase involved in the biosynthesis of galanthamine in Lycoris aurea. PeerJ. 7, e6729(2019).
  3. Guerra, M. Cytotaxonomy: The end of childhood. Plant Biosyst. 146 (3), 703-710 (2012).
  4. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Karyotype analysis of Lablab purpureus (L.) Sweet using fluorochrome banding and fluorescence in situ hybridization with rDNA probes. Czech J Genet Plant Breed. 51 (3), 110-116 (2015).
  5. Kadluczka, D., Grzebelus, E. Using carrot centromeric repeats to study karyotype relationships in the genus Daucus (Apiaceae). BMC Genomics. 22 (1), 508(2021).
  6. Levin, D. A. The role of chromosomal change in plant evolution. , Oxford Univ Press. 49-52 (2002).
  7. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Molecular cytogenetic characterization and comparison of the two cultivated Canavalia varieties (Fabaceae). Comp Cytogenet. 11 (4), 579-600 (2017).
  8. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Comparative molecular cytogenetic characterization of five wild Vigna varieties (Fabaceae). Comp Cytogenet. 14 (2), 243-264 (2020).
  9. Stebbins, G. L. Chromosomal evolution in higher plants. , Addison-Wesley. London. (1971).
  10. Paszko, B. A critical review and a new proposal of karyotype asymmetry indices. Plant Syst Evol. 258 (1-2), 39-48 (2006).
  11. Peruzzi, L., Eroglu, H. Karyotype asymmetry: Again, how to measure and what to measure. Comp Cytogenet. 7 (1), 1-9 (2013).
  12. Dehery, S. K., Tavakkoli, A., Jafari, M. Karyotype and chromosome pairing analysis in some Iranian upland cotton (Gossypium hirsutum). Nucleus. 64 (2), 167-179 (2021).
  13. Schweizer, D. Reverse fluorescent chromosome banding with chromomycin and DAPI. Chromosoma. 58 (4), 307-324 (1976).
  14. Moscone, E. A., Debat, H. J., Salguero, N. Quantitative karyotyping and dual color FISH mapping of 5S and 18S-25S rDNA probes in the cultivated Phaseolus varieties (Leguminosae). Genome. 42 (6), 1224-1233 (1999).
  15. Hasterok, R., Sliwinska, E., Kwasniewski, M. Ribosomal DNA is an effective marker of Brassica chromosomes. Theor Appl Genet. 103 (4), 486-490 (2001).
  16. Koo, D. H., Han, Y., Lee, H. Molecular cytogenetic mapping of GXTL and C. melo using highly repetitive DNA sequences. Chromosome Res. 18 (3), 325-336 (2010).
  17. De Moraes, A. P., Ferreira, J. P., Marques, R. Karyotype diversity and the origin of grapefruit. Chromosome Res. 15 (1), 115-121 (2007).
  18. Weiss-Schneeweiss, H., Kiefer, C., Schneider, H. Karyotype diversification and evolution in diploid and polyploid South American Hypochaeris (Asteraceae) inferred from rDNA localization and genetic fingerprint data. Ann Bot. 101 (7), 909-918 (2008).
  19. Siljak-Yakovlev, S., Peruzzi, L. Cytogenetic characterization of endemics: Past and future. Plant Biosyst. 146 (3), 694-702 (2012).
  20. Miaohua, Q., Wang, Y., Zheng, Y. Reciprocal natural hybridization between Lycoris aurea and Lycoris radiata (Amaryllidaceae) identified by morphological, karyotypic, and chloroplast genomic data. BMC Plant Biol. 24 (1), 14-27 (2024).
  21. Shi, S., Wang, Y., Yu, J. Phylogenetic relationships and possible hybrid origin of Lycoris varieties (Amaryllidaceae) revealed by its sequences. Biochem Genet. 44, 198-208 (2006).
  22. Yumai, J., Wang, Y., Zheng, H. Characterization, validation, and cross-species transferability of EST-SSR markers developed from Lycoris aurea and their application in genetic evaluation of Lycoris species. BMC Plant Biol. 20 (1), 522-528 (2020).
  23. Koo, D. H., Shin, D., Lee, J. Karyotype analysis of a Korean cucumber cultivar (Cucumis sativus L. cv. Winter Long) using C-banding and bicolor fluorescence in situ hybridization. Molecules Cells. 13 (3), 413-418 (2002).
  24. Waminal, N. E., Kim, H. H. Dual-color FISH karyotype and rDNA distribution analyses on four Cucurbitaceae species. Hortic Environ Biotechnol. 53 (1), 49-56 (2012).
  25. Xie, W. J., Yang, X., Wang, F. Localization of 45S and 5S rDNA sequences on chromosomes of 20 varieties of Cucurbitaceous plants. J South China Agric Univ. 40 (6), 74-81 (2019).
  26. Han, Y., Zhang, H., Zhu, C. Centromere repositioning in cucurbit varieties: Implication of the genomic impact from centromere activation and inactivation. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (35), 14938-14941 (2009).
  27. Li, K. P., Yao, S., Li, Y. Cytogenetic relationships among Citrullus varieties in comparison with some genera of the tribe Benincaseae (Lycoris aurea (L' Hér.) Herb) as inferred from rDNA distribution patterns. BMC Evol Biol. 16, 85(2016).
  28. Ren, Y., Huang, H., Zhang, Z. An integrated genetic and cytogenetic map of the cucumber genome. PLoS One. 4 (6), e5795(2009).
  29. Han, Y., Wang, H., Liu, B. An integrated molecular cytogenetic map of Cucumis sativus L. chromosome. BMC Genet. 12, 18(2011).
  30. Han, Y., Zhang, H., Yu, C. Chromosome-specific painting in Cucumis varieties using bulked oligonucleotides. Genetics. 200 (3), 771-779 (2015).
  31. Liu, M. S., Zhang, S., Liu, Q. Chromosomal variations of Lycoris varieties revealed by FISH with rDNAs and centromeric histone H3 variant associated DNAs. PLoS One. 16 (9), e0258028(2021).
  32. Hayashi, A., Murota, K., Murata, J. Genetic variations in Lycoris radiate var. radiate in Japan. Genes Genet Syst. 80, 199-221 (2005).
  33. Nima, R. Fluorescence in situ hybridization: Methods and application in cancer diagnosis. Cancer Immunol. 2, 711-728 (2020).
  34. Liu, K., Yang, X., Wang, J. Cytogeography and chromosomal variation of the endemic East Asian herb Lycoris radiate. Ecol Evol. 9, 6849-6859 (2019).
  35. Song, Y. C., Zhang, L., Yan, B. Comparisons of G-banding patterns in six species of the Poaceae. Hereditas. 121, 31-38 (1994).
  36. She, C. W., Zhou, M., Zhang, L. CPD staining: An effective technique for detection of NORs and other GC-rich chromosomal regions in plants. Biotechnic Histochem. 81 (1), 13-21 (2006).
  37. Han, Y. H., Kim, J., Yoon, M. Distribution of the tandem repeat sequences and karyotyping in cucumber (Cucumis sativus L.) by fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Genome Res. 122 (1), 90-98 (2008).
  38. Chao-Wen, S., Chen, Z., Wang, S. Comparative karyotype analysis of eight Cucurbitaceae crops using fluorochrome banding and 45S rDNA-FISH. Comp Cytogenet. 17, 31-58 (2023).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

45S rDNA b lgeleri5S rDNA b lgelerikromozom say skaryotip varyasyonugenom farkl la maskaryotip asimetrisi
Video yakında

İlgili makaleler