Yöntem makalesi

Yüzer Laboratuvar: Çevresel DNA Analizi için İşletme Feribotlarından Deniz Suyu Örneklerinin Toplanması ve Filtrelenmesi için Standart Operasyonel Prosedür

DOI:

10.3791/67366

⸱

1 Ağustos 2025

 , 
1Department of Earth and Environmental Sciences, University of Milano-Bicocca, 2Marine Research and Higher Education Center (MaRHE Center), 3National Biodiversity Future Centre (NBFC)

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, faal feribotlardan ve diğer ticari gemilerden deniz suyu örneklerinin toplanması ve filtrelenmesi yoluyla deniz eDNA'sını almak için yeni bir protokol sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çevresel DNA izlerinden bilgi almak için genetik araçlar, hem hedefli hem de taksonomik olarak geniş biyoçeşitlilik karakterizasyonu için iyi bilinmektedir. Yine de, deniz bağlamında, abisal veya açık deniz suları gibi erişilemeyen alanlardan eDNA örneklerinin toplanması hala bir sınırlama olabilir. Tarifeli feribotların veya geniş açık deniz alanlarını geçen ticari gemilerin kullanılması, çevresel örneklerin toplanması için değerli fırsatçı platformlar oluşturabilir. Her türlü hava koşulunda ve günün herhangi bir saatinde veri toplama olasılığından, zaman içinde tekrarlanabilirliğe, rotaların sabit olmasına ve maliyetlerde ve yakıt emisyonlarında toplam azalmaya kadar sayısız avantaj vardır. Önceki çalışmalar, yaklaşımın mümkün ve başarılı olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, bu büyük deniz araçlarının karınlarından numune alma süreci hemen gerçekleşmeyebilir. Bu çalışma, büyük gemilerden deniz suyunun toplanması ve filtrelenmesinin nasıl hazırlanabileceğini, düzenlenebileceğini ve gerçekleştirilebileceğini her ayrıntıyla göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son yıllarda, çevresel DNA (eDNA) analizi, yani çevredeki organizmalar tarafından bırakılan genetik materyalin tespiti, tatlı su ve deniz hayvanları toplulukları için umut verici bir izleme aracı olarak hızla büyümüştür. Bu moleküler teknik, tek bir numune içinde birden fazla taksonu aynı anda tanımlama imkanı sunar (metabarkodlama yaklaşımı), örneklenen alanda yaşayan veya bu alanıgeçen biyolojik toplulukların tespit edilmesine olanak tanır 1,2,3,4,5.

Şu anda, asıl zorluk, örnekleme noktalarına ulaşmaktır, çünkü büyük coğrafi ölçeklerde örnek toplamak genellikle ekonomik ve/veya lojistik olarak mümkün değildir, bu da pelajik alanların daha erişilebilir kıyı bölgelerine kıyasla genellikle yetersiz örneklenmesine neden olur6. Feribotların veya diğer ticari gemilerin kullanılması, tipik olarak sezon boyunca sabit olan ve geniş alanları kapsayan belirli nakliye rotalarını takip ettiklerinden, yüksek oranda tekrarlanabilir örnekleme geçişlerine izin verir 7,8. Ayrıca, feribot rotalarının numune alma aracı olarak kullanılması, hava ve deniz koşullarından bağımsız olarak günün her saatinde ve her mevsimde numune toplamaya olanak tanır ve çok sayıda başka avantaj sunar (Ek Şekil 1). Ön çalışmalar, biyolojik çeşitlilik indekslerini değerlendirmek için hem fizibilitesini hem de doğruluğunu kanıtlamıştır 9,10. Su numuneleri, motorların yukarısındaki deniz soğutma suyunu yakalayan bir derivasyon borusu aracılığıyla feribot makine dairesinden toplanabilir. LIFE-CONCEPTU MARIS (Conservation of CEtaceans and Pelagic sea TUrtles in Med: Managing Actions for their Recovery in Sustainability), bu kavram kanıtının büyük ölçekte uygulamaya konulduğu ilk projedir: 500 numunenin (iki yıl boyunca) toplanmasını hedefler ve bir değil birkaç feribot şirketinin ve birkaç taşıyıcının katılımını içerir, gemide karşılaşılabilecek en çeşitli bağlamlara daha iyi uyum sağlamak için kritik sorunların vurgulanmasına ve örnekleme stratejilerinin iyileştirilmesine olanak tanır. Aşağıda, deniz çevresel DNA örneklerinin büyük ölçekli toplanması ile ilgili bileşeni için projenin özelliklerini açıklıyoruz (projenin açıklaması için https://webgate.ec.europa.eu/life/publicWebsite/project/details/5707 ziyaret edin).

Planlanmış bir feribot kullanarak bir örnekleme kampanyası gerçekleştirme kararı, bu çalışmada doğrudan ele alınan husus olan gerçek örneklemeden önce alınması gereken bazı eylemleri ima eder. Burada, herhangi bir ticari gemiden gemide numune alımından önce yapılması gereken eylemlerden kısaca bahsediyoruz.

Bu da göz ardı edilmemesi gereken ve tahsilat kampanyasının başarısını belirleyen bir husustur. Denizcilik şirketleri ticaridir ve araştırma kuruluşları değildir ve bu nedenle, gemide yürütülmesi amaçlanan bilimsel araştırmanın amaç ve hedeflerine aşina değildir ve olmaları gerekmez. Bu, multidisipliner olabilen önerilen bilimsel projenin amaçlarının, denizcilik şirketinin üst yönetimi tarafından iletilmesi ve motive edilmesi gereken önemli ve hassas bir başlangıç aşamasını ifade eder. CONCEPTU MARIS projesinin özel durumunda, bu, denizcilik şirketlerinin halihazırda görsel izleme projelerinde (örneğin, Sabit Hat Transektleri [FLT]7) yer aldığı ve bu çalışmanın kapsadığı numune alma yaklaşımı için vazgeçilmez olan makine dairelerine erişim için yeşil ışık yakabilmek için gerekli olan karşılıklı saygı ilişkisini belirleyen onlarca yıllık bir ilişki sayesinde mümkün olmuştur.

CONCEPTU MARIS projesinde benimsenen numune alma rejimi türü iki yönlüdür: numuneler hem sabit numune alma istasyonlarında (FSS, aşağıya bakınız) hem de "nadir" deniz memelilerinin görülmesi vesilesiyle alınır. Bunlar, FTL transektleri11 sırasında en az görülen türleri temsil eder: ortak yunus (Delphinus delphis), Cuvier'in gagalı balinası (Ziphius cavirostris), pilot balina (Globicephala melas), Risso'nun yunusu (Grampus griseus), ispermeçet balinası (Physeter macrocephalus) ve yüzgeçli balina (Balaenoptera physalus). Ek bir su örneği, yalnızca görsel nüfus sayımı ekibi (FLT ekibi) tarafından bildirilen nadir türlerin görülmesi, FSS'lerden birinden yarım saatten daha uzun bir süre önce veya sonra meydana geldiğinde toplanır. Gözlemlerle bağlantılı olarak gerçekleştirilen örneklemelerin tümü mutlaka günlük olacaktır.

Gemi yolculukları boyunca coğrafi konumu sabit kalan sabit numune alma istasyonları (FSS'ler) önceden belirlenir ve tüm çalışma ekibi ile üzerinde anlaşmaya varılır. FSS'lerin coğrafi konumları, 1) önceki gözlemsel / literatür verilerine dayalı olarak biyolojik bir ilgi alanının varlığına göre seçilir; 2) Batimetrik haritalarda habitat değişikliklerini gösteren noktalara öncelik verilmesi (örneğin, kıta sahanlığının kenarı); 3) Belirlenen nakliye şeritlerinin homojen bir şekilde kapsanması, böylece hem tüm rotayı kapsamak hem de gece numunelerinin toplanmasını öngörmek için kabaca eşit uzaklıkta örnekleme alanlarının (yaklaşık 35-45 deniz mili aralıkla) seçilmesi.

Bitişik numunelerin günün farklı saatlerinde alındığından ve numune işlemeyi tamamlamak için iki ardışık numune arasında yeterli zaman olduğundan emin olmak için, biri dışa doğru yolculukta ve diğeri dönüş yolculuğunda olmak üzere bitişik FSS'lerden numune alınması tavsiye edilir. Bu, FSS'lerin örneklendikleri kronolojik sıraya göre numaralandırılması durumunda, haritada ardışık bir sırada görünmeyecekleri anlamına gelir. Örneğin, 6 FSS seçilirse, 3'ü gidiş yolculuğunda ve 3'ü dönüş yolculuğunda örneklenecektir. "Haritadaki rota boyunca sıraları PortAFSS1-FSS6-FSS2-FSS5-FSS3-FSS4-PortB olacak ve İtalik olarak üç örnekleme istasyonu (FSS4, FSS5 ve FSS6) dönüş yolculuğunda incelenecektir (bkz. Şekil 1).

Her bir FSS'nin benzersiz bir kimlik numarası vardır (yani, farklı rotalarda tanımlanan FSS'lerin hiçbiri aynı kimlik numarasını paylaşmaz). Numaralandırma, bir FSS ilk kez örneklendiğinde atanır ve ardışık numaralandırma takip eder. Bu nedenle, projenin sonunda, düşük numaralı FSS'ler, birkaç yıl boyunca test edilmiş veya en eski verilerin mevcut olduğu FSS'ler olacaktır.

Her numune, her numune alma istasyonunda toplanan yaklaşık 13 L deniz suyundan oluşur. Deniz suyu, numune işlenene kadar doğrudan feribotun derivasyon borusundan "Kutuda Torba" (BiB) kaplara, yani steril folyo lamine plastik torbalara boşaltılır (aşağıya bakınız). Kutuda Torba Numune Alma Sisteminin (BiBSS) özellikleri ve avantajları Valsecchi ve ark. (2021)9 ve ayrıca kolaylık sağlamak için burada Şekil 2'de rapor edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Laboratuvarda hazırlanma

  1. Dişli kontrol listesi
    1. Hem numune alımı hem de numune filtrasyonu için uçağa alınacak öğeler için kontrol listesine bakın. Ek Dosya 1'de gösterilmiştir. Her bir öğe ve kullanımı aşağıdaki bölümlerde açıklanacaktır.
    2. Ek Dosya 1'in bir kopyasını yazdırın ve örnekleme kampanyası için yola çıkmadan önce doldurun.
  2. Bag-in-Box numune alma sisteminin hazırlanması
    1. Uçağa binmeden önce Kutu İçi Torbaları laboratuvarda, mümkünse çeker ocak altında hazırlayın. Üç açıklığı (torbanın üzerindeki, torbayı kapatan kapağın bir kısmı ve musluktan çıkan çıkış) sızdırmazlık filmi ile kapatın (Şekil 3, Malzeme Tablosu).
    2. Torbaları, kapağı çıkarılmış ve içi kapalı olacak şekilde sıkıca sarın ve nakliye sırasında yeniden açılmasını önlemek için yapışkan bir bantla kapatın (Şekil 3).
    3. Bu işlemi, hem (i) torbaya giren hava ile taşınan olası kontaminasyonu önlemek hem de (ii) katlanmış torbanın daha hacimli hale gelmesini önlemek için (hava içeriyorsa) yukarıda belirtilen kapatma manevrası sırasında torbanın içine hava girmemesine dikkat ederek gerçekleştirin.

2. Uçağa hazırlanma

  1. Mürettebat üyeleriyle koordinasyon
    1. Gemiye biner binmez, seçilen numune alma noktalarını kaptan ve mürettebatı ile paylaşın, böylece feribotun "Sabit Numune Alma İstasyonu" (FSS) olarak seçilen her bir noktaya en yakın olacağı saatler gösterilecektir.
    2. Her FSS için örnekleme süresini ve o rota için feribotun mevcut (veya varsa ortalama) seyir hızını not edin: bu, örneklenen deniz şeridinin uzantısının (km) tahmin edilmesini sağlar.
    3. Feribot hiçbir zaman tam olarak aynı noktadan geçmediğinden, gerçek örneklemeden sonra her deniz suyu örneği toplamasının koordinatlarını düzeltin.
      NOT: Kesin numune alma aralığı, fiilen numune alınan deniz alanının aslına uygun bir şekilde tanımlanması için en önemli veridir; bu nedenle, gerçek örnekleme koordinatlarını bildirirken pürüzlü noktaların bir haritasını yazdırmak yararlıdır (örneğin, Ek Dosya 2'de).
    4. Şirket makine dairesine erişim izni verirse, odaya kadar eşlik edilmesini isteyin.
    5. Makine dairesine girmeden önce kişisel koruyucu ekipmanı (KKD) giyin. Burada, ortam elverişsiz (sağır edici gürültü ve yüksek sıcaklıklar) ve potansiyel olarak sinsi noktalarla (dik merdivenler, zeminlerde büyük boşluklar) doludur. Makine dairesine giriş izni alındıktan sonra, güvenlik ayakkabıları, kask ve işitme koruma kulaklıkları gibi tüm temel güvenlik ekipmanlarıyla donatın.
    6. Filtreleme yüzeyi nakliye şirketi tarafından sağlanıyorsa (genellikle kendi katlanır masasına sahip olmanız tavsiye edilir), bu alanın% 10'luk bir ağartma çözeltisi kullanılarak numuneler arasında sterilize edilip edilmediğini kontrol edin.
  2. Makine dairesine yerleşme
    1. Gemilerde çeşitli deniz suyu girişleri olduğundan, su örneğinin borularda bulunabilecek maddeler ve organizmalarla kirlenmesini en aza indirmek için geminin borularından alınan su için minimum bir yol sağlayan makine dairesi yöneticisi ile görüşün.
    2. Gelen deniz suyunun toplanması için en uygun nokta/giriş belirlendikten sonra, numune toplama için kullanılan boruyu "yerel" su ile sürekli olarak durulamak için personele numune toplama musluğunun tüm seyir boyunca hafifçe açık tutulup tutulamayacağını sorun. Musluktan aralıksız akan deniz suyunu sintineye atın.

3. Su numunesi alımı (makine dairesinde)

NOT: Şekil 4 , deniz suyu numunesi toplamanın aşamalarını göstermektedir.

  1. Su toplama için hazırlık
    1. Gerekli tüm teçhizatı (ilk kısım Ek Dosya 1 kontrol listesi) makine dairesine getirin. BiB'lerin işlendiği alanı %10'luk bir çamaşır suyu solüsyonu kullanarak sterilize etmek için planlanan numune alma zamanından en az 15 dakika önce makine dairesine gidin.
    2. Özel musluk tüm seyir boyunca açık bırakılmadıysa, deniz suyu örneklerinin toplanması için açın ve fiili çekilmeden önce suyun en az 5 dakika akmasına izin verin (su sintineye atılır) (Şekil 4A).
    3. Filtreleme istasyonunu hazırlayın.
      NOT: Filtreleme istasyonunun kurulumunda, filtrelemenin verimliliğini önemli ölçüde artırabilecek birkaç önlem vardır (bkz. adım 4.3): 1) yüksek kapasiteli termos kullanın (çekilecek hacme bağlı olarak 2 L, 4 L veya 5 L şişe). Bu, şişeyi 1 L ile bir sonraki L arasında boşaltmak için gereken zamandan tasarruf etmenin yanı sıra, filtrasyon silindirinin işlenmesini ve dolayısıyla herhangi bir kontaminasyonu en aza indirir; 2) Birden fazla numunenin (torbaların) aynı anda filtrelenmesine izin veren bir ölçü olan seri olarak düzenlenmiş birden fazla filtre şişesi kullanılabilir. Bu önlem, aksi takdirde yanaşma limanına ulaşmadan önce torbaları işlemek için gerekli zamana sahip olmama riskinin olduğu sıkı numune alma rejimlerinde önerilir.
    4. BiB'yi hazırlamak ve etiketlemek için üzerine şunları yazarak kalıcı bir işaretleyici kullanın: 1) BiB'nin her iki tarafındaki numunenin benzersiz alfanümerik tanımlama kodu (özellikle BiB gemide hemen işlenmediyse ve karada filtreleniyorsa önemlidir) 2) tarih; 3) BiB'yi doldurmaya başlamanın tam zamanı.
  2. Su toplama
    1. Sızdırmazlık filmini BiB'nin açıklığından çıkarın ve tamamen dolana kadar (yaklaşık 13 L) doldurmaya başlayın (Şekil 4B).
    2. Torba neredeyse dolduğunda, sızdırmazlık filmini kapaktan çıkarın, ancak musluk açıklığından çıkarmayın: sızdırmazlık filmini filtrasyona kadar musluk güvenlik emniyetinin (kırmızı plastik tırnak) etrafında tutun (Şekil 4C). Önlüğü kapakla kapatın ve tamamen kapanana kadar sıkıca bastırın.
    3. Numune alımının tam olarak ne zaman tamamlandığına dikkat edin: numune alımının toplam süresinin (dakika) hesaplanmasına izin verir.
  3. Su toplandıktan sonra
    1. BiB üzerindeki kalıcı işaretleyici ile numune alımının tam olarak ne zaman tamamlandığını yazın ve tüm verileri numune toplama/filtreleme formuna raporlayın (Ek Dosya 2).
    2. Doldurulmuş BiB'yi depolama odasına veya filtreleme alanına (makine dairesinde veya kabinde özel bir alan) aktarın.
    3. Numune toplama/filtreleme formundaki tüm verileri aktarın (Ek Dosya 2).
      NOT: Ek Dosya 2 , tüm parçalarıyla gemide doldurulacak numune toplama/filtreleme sayfasını gösterir.
      1. Numunenin toplanması ile ilgili kısım (yeşil) için, makine dairesinden deniz suyu numunesi alımının başlangıç ve bitiş zamanlarını girin.
      2. İkincil olarak, mürettebat üyeleriyle veya GPS kayıtlarıyla görüştükten sonra, örnekleme ve seyir hızının başlangıcına ve sonuna göre coğrafi koordinatları girin. Bu, daha sonra örneklenen deniz segmentinin uzunluğunu hesaplamanıza olanak tanır.
        NOT: Filtreleme ile ilgili kısım (mavi) ile ilgili olarak, filtrelemenin gemide mi yoksa daha sonra karada mı gerçekleştiği belirtilecektir: 3 filtrenin her biri için filtreleme süreleri belirtilecektir.

4. Deniz suyu numunesi filtrasyonu

  1. Filtreleme için hazırlanın
    NOT: Bu noktadan itibaren, filtreleme işlemi, araştırma projesinin özel hedeflerine dayalı olarak farklı protokollere göre yönetilebilir. Burada açıklanan protokol, büyük miktarda deniz suyunun (10 litreden fazla) doğrudan gemide verimli bir şekilde filtrelenmesine izin vererek, yaygın olarak kullanılan diğer ticari kitlerin veya protokollerin doğasında bulunan hacim kısıtlamalarından kaçınır. Mümkün olduğunda, su numunelerini gemide filtreleyin: filtreleme, makine dairesinin kendisinde veya tercihen makine dairesinin yakınında bulunan bir kabinde gerçekleştirilebilir. Hem eDNA bozulmasını sınırlamak hem de kolaylık sağlamak için deniz suyu numunelerinin toplandıktan hemen sonra filtrelenmesi her zaman arzu edilir, böylece işlenecek büyük hacimlerde deniz suyu ile karaya çıkmaktan kaçınılır. Mümkün değilse, numuneler Bag-in-Box kaplarında saklanabilir ve daha sonra filtrelenmek üzere taşınabilir.
    1. Gemide filtrelemeye ayrılmış sağlanan alanda (makine dairesinde veya özel bir kabinde), Ek Dosya 1'deki kontrol listesinin ikinci bölümünde listelenen her şeyle hazırlanın ve filtreleme sistemini Şekil 5'te gösterildiği gibi monte edin.
    2. Filtrasyon silindirini (Malzeme Tablosu) Şekil 6 ve Şekil 7'de gösterildiği gibi hazırlayın. Her istasyon için yeni bir silindir, yeni bir çift tek kullanımlık cımbız veya bir çift sterilize edilmiş cımbız kullanın.
      NOT: Aynı konumdan numuneleri filtrelemek için tek bir silindir birden çok kez kullanılabilir. Bununla birlikte, laboratuvarda kurumaya bırakılmadan önce %10 çamaşır suyu ile sterilize edilmesi, ardından tatlı suyla durulanması ve ardından bir sonraki kampanyaya kadar saklanmak üzere tek tek paketlenmesi gerekir.
    3. Filtrasyona başlamadan önce, numune toplama/filtrasyon veri günlüğünü doldurun (Ek Dosya 2). Bu, hem işlenen litre sayısını takip etmek hem de filtreleme süresini ölçmek için gereklidir (numunedeki partikül miktarının göstergesi). Vakum pompası devreye girer girmez, filtreleme süresini ölçmek için zamanlayıcıyı başlatın.
  2. Gemide filtreleme
    1. Kontaminasyon riskini en aza indirmek için (özellikle birkaç torba aynı anda işlendiğinde, aşağıya bakın), musluk ile filtreleme silindiri arasına bir yalıtım manşonu - plastik torba - yerleştirerek filtrelenecek su akışını çevredeki ortamdan izole edin (bkz. Şekil 7).
      NOT: Çevresel DNA analizi için kullanılan teknolojilerin hassasiyeti, yaklaşımı çevresel kontaminasyona (operatörden veya numuneler arasındaki çapraz kontaminasyondan) karşı özellikle hassas hale getirdiğinden, bu önemli bir önlemdir.
    2. Vakum pompasını etkinleştirin ve her filtre için 4 L'ye kadar suyu filtreleyin. Sisteme hava girmesini önlemek ve filtreleme işlemini yavaşlatmak için filtreleme sırasında silindiri daima dolu tutun.
      NOT: Membranın gözenekliliğinin seçimine gelince, bu araştırmanın amacına, hedef taksonomik gruplara ve işlenmesi amaçlanan su miktarına bağlıdır. Bu konu daha önceki çalışmalardaele alınmıştır 9,12.  Farklı gözenekliliğe sahip filtrelerin karşılaştırıldığı. Omurgalıların incelenmesi ve filtre başına 4 litre su işleme seçimi için, 0.45 μm'lik bir gözenekliliğe sahip bir membran, gözeneklerin doygunluğu nedeniyle filtrenin dağınıklığına neden olmadan büyük miktarlarda suyun işlenmesine izin veren en iyi çözümü kanıtladı.
    3. Şişenin içindeki filtrelenmiş suyun seviyesi 4 L seviye işaretine ulaştığında, vakum pompasını kapatın ve zamanlayıcıyı durdurun, filtreleme süresi değerini veri günlüğüne bildirin.
      NOT: 12/13 L'lik her bir Önlükten, her biri 4 L'lik (A, B ve C olarak adlandırılan) 3 teknik kopya elde edilecektir.
    4. Bu noktada, cımbızı (ve gerekirse filtre kenarını kaldırmaya yardımcı olması için steril bir kürdan) kullanarak, filtrede olası herhangi bir hasarı önleyerek ilk filtreyi (filtre A) Şekil 8'de gösterildiği gibi silindirden kurtarın.
    5. Filtreyi ikiye katlayın (biyolojik materyali tutan taraf kendi üzerine katlanmış olarak) ve alüminyum folyoya sarın, hemen numune numarasını ve filtre kopyasının kimliğini (örneğin, 15A) ambalajın üzerine yazın. Karaya çıkana kadar yerleşik dondurucuda saklayın.
    6. Başka bir 4 L numuneyi işlemek için filtrasyon silindirinin içine yeni bir filtre (filtre B) monte edin (Şekil 9). Şişeyi boşaltın ve 4 L tamamen filtrelenene kadar ikinci kopyayı filtrelemeye yeniden başlayın. B filtresini açıklandığı gibi kurtarın ve C filtresi için aynı adımları tekrarlayın.
  3. İyi uygulamalar
    1. Filtreleme sürelerini kısaltmak için, tek bir filtreden işlenen tüm filtrelenmiş suyu barındırabilen büyük bir termos kullanın (bu nedenle, bu durumda en az 4 L kapasite).
    2. Filtreleme aparatını paralel olarak düzenleyerek (yani, tek bir pompa tarafından servis edilen birden fazla vakum şişesi) birden fazla torbayı aynı anda filtreleyerek filtreleme sürelerini önemli ölçüde azaltın.
      NOT: CONCEPTU MARIS kampanyasında her iki strateji de benimsenmiştir (Şekil 10). Bir rota boyunca toplanan örneklerin sayısı büyük olabileceğinden, filtreleme verimliliğini en üst düzeye çıkarmanın çok önemli olduğunu unutmayın. Bu nedenle, gemide işlemek için yeterli zaman olmaması durumunda torbaları boşaltmak zorunda kalma riskiyle birlikte numunelerin birikmesini önlemek için torbaların kısa sürede işlenmesi gerekir.
    3. Yanlış pozitiflerin (kontaminasyon) insidansını izlemek için, filtreleme prosedürüne, seyir başına en az bir kez, kapalı şişelerden alınan içme suyu ile doldurulmuş bir torbayı numunelere paralel olarak filtreleyen bir "boş torba" dahil edin. Bu kontrol numunesi, çoğaltma gerektirmez ve bunu numunelerin geri kalanı gibi ele alır ve NGS çalışmasına dahil eder.
  4. Filtrelerin depolanması ve taşınması
    1. Filtrasyondan sonra, tüm filtreleri daha sonraki laboratuvar işlemlerine kadar -4 °C ile -20 °C arasında saklayın.
    2. Numuneleri karaya çıkmadan hemen önce yerleşik dondurucudan toplayın ve Şekil 11'de gösterildiği gibi taşınabilir soğutucular kullanarak düşük sıcaklıklarda taşımaya hazırlayın.
      NOT: Numuneler gemide filtrelenmezse, deniz suyu torbaları, taşımayı kolaylaştırmak için plastik kasalar içindeki alışveriş torbalarının içinde çiftler halinde desteklenerek, kapak üst tarafta tutularak dikey olarak tutulursa daha güvenli bir şekilde taşınır (Şekil 12).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol açıklandığı gibi yürütüldüğünde, 3 kopya için çarpılan FSS sayısına eşit sayıda filtre operatör tarafından toplanacaktır. Her filtre, iki taraftan birinde biyolojik izleri (çevresel DNA) tutar. eDNA ekstraksiyonunu takip eden analitik adımlar, araştırma sorusuna, hedefine ve hedefine büyük ölçüde bağlıdır. Örneğin, Valsecchi ve ark.9 tarafından yapılan pilot çalışmada, açıklanan eDNA toplama protokolü, tekrarlanabilir ve sistematik bir deniz megafauna araştırmasının tasarımına izin verdi....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol adımları basit ve anlaşılır olduğundan, ticari feribotlar üzerinde çalışırken göz önünde bulundurulması gereken bazı ilgili hususlar vardır. Soğutma suyu elde etme borusu genellikle erişimin kısıtlı olabileceği veya önceden izne tabi olabileceği makine dairesi alanında bulunur. Bu nedenle, uygun kişisel koruyucu ekipmanla birlikte bu tür bir yetkiye sahip olduğunuzdan emin olmak çok önemlidir (Şekil 4). Ayrıca, herhangi bir kontaminasyonu önlemek iç...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan yöntemin test edilmesine ve geliştirilmesine izin veren kişilere, yani Akdenizli (ve Akdenizli olmayan) deniz memelilerinin yoğun bir feribot ağına dayanarak sürekli olarak görsel olarak izlendiği ve feribotların geçtiği rotalarda DNA aramak gibi iddialı bir öneriye inanan FLT projesini onlarca yıldır yöneten Antonella Arcangeli'ye (ISPRA) derinden teşekkür ederiz; Meydan okumayı coşkuyla kabul eden Korsika ve Sardunya Feribotları'ndan Cristina Pizzutti, metodolojiyi ilk kez filolarından bir taşıyıcıda test etmemiz için bize lojistik destek verdi (çekimi yapan video yapımcılarından oluşan ekibi de memnuniyetle karşıladı); Fulvio Maffucci, gemide numune toplama izni vermek için farklı denizcilik şirketleriyle iş yaptığı için. Yüksek lisans tezi projesi eDNA ve feribotların keşfini başlatan Roberto Lombardo'ya teşekkür ederiz. Son olarak, LIFE-CONCEPTU MARIS projesi ile ilgili olarak eDNA'ya binmemize ve numune almamıza izin veren denizcilik şirketlerine teşekkür ederiz, çünkü bu bize yöntemimizi Akdeniz'deki birkaç farklı gemide test etme fırsatı verdi: Grimaldi Lines, Minoan Lines, Tirrenia, Balearia, Corsica ve Sardinia Ferries, Grandi Navi Veloci (GNV). Devam etmekte olan AB tarafından finanse edilen LIFE-CONCEPTU MARIS projesi, Standartlaştırılmış Operasyonel Protokol'ün (SOP) daha geniş bir bilimsel topluluğa ve halka yayılmasını sağlayacak bu video yayınının üretimini finanse etmenin yanı sıra, yaklaşımın büyük ölçekte tekrarlanabilirliği kavramının kanıtını sunmaktadır. Mattia Nocciola ve Francesco Tommasinelli'ye (Triton Research) protokolün bazı görüntülerini sağladıkları için teşekkür ederiz. Son olarak, son 5 yılda bizimle etkileşime giren ve örneklememize yardımcı olan tüm ekiplere teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
4,7 cm çapında filtre membranlarıBiosigma S.p.A.https://www.biosigma.com/0.45 & filtre membranları; m gözeneklilik, ayrı ayrı paketlenmiş 
4/5 L vakumlu şişelerDuranhttps://www.duran-bottle-system.com/5 L tıpalı cam şişe
Emici kağıt pedlerAdvantec MFS, Inc.https://www.advantecmfs.com/category/absorbent-pads-1Filtre kağıdı emici pedler, boyut 47 mm.
Kutuda Torba (BiB)G.M.V. Agricenter Srlhttps://www.gmvagricenter.it/10 litre musluklu kutu içi
torba Filtreleme silindirleri ve nbsp;Sartorius AGhttps://shop.sartorius.com/in/industrial-microbiology-filtration-devices/biosart-100-monitors/p/M_Biosart_100_Monitors#Biostart 100 Monitör silindirleri, 0,45 & ile; M membran dahil 
Sızdırmazlık filmiMerckhttps://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/sigma/hs234526a?utm_source=bing&utm_medium = < / > cpc & utm_campaign=Tümü+product_
dsa_WW_%28bing+ebizpfs%29&
utm_id=626946489& utm_content=
1166583023365595& msclkid=
d2b55b82440b1aef56fc3ca803c
6486f& utm_term=%2FÜrün%2F		4 inç x 125 fit laboratuvar sızdırmazlık filmi rulosu
Vakum pompasıKNF Grouphttps://knf.com/en/usLaboport taşınabilir vakum pompası N. 96 

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Andruszkiewicz, E. A., et al. Biomonitoring of marine vertebrates in Monterey Bay using eDNA metabarcoding. PLoS One. 12 (4), e0176343(2017).
  2. Djurhuus, A., et al. Environmental DNA reveals seasonal shifts and potential interactions in a marine community. Nat Commun. 11 (1), 254(2020).
  3. DiBattista, J. D., et al. Environmental DNA can act as a biodiversity barometer of anthropogenic pressures in coastal ecosystems. Sci Rep. 10 (1), 8365(2018).
  4. Beng, K. C., Corlett, R. T. Applications of environmental DNA (eDNA) in ecology and conservation: Opportunities, challenges, and prospects. Biodivers Conserv. 29 (7), 2089-2121 (2020).
  5. He, X., et al. eDNA metabarcoding enriches traditional trawl survey data for monitoring biodiversity in the marine environment. ICES J Mar Sci. 80 (5), 1529-1538 (2023).
  6. Pawlowski, J., et al. The future of biotic indices in the ecogenomic era: Integrating (e)DNA metabarcoding in biological assessment of aquatic ecosystems. Sci Total Environ. 637 - 638, 1295-1310 (2018).
  7. Arcangeli, A., Marini, L., Crosti, R. Changes in cetacean presence, relative abundance and distribution over 20 years along a trans-regional fixed line transect in the central Tyrrhenian sea. Mar Ecol. 34 (1), 112-121 (2013).
  8. Matear, L., Robbins, J. R., Hale, M., Potts, J. Cetacean Biodiversity in the Bay of Biscay: Suggestions for environmental protection derived from citizen science data. Mar Policy. 103672, 109(2019).
  9. Valsecchi, E., et al. Ferries and environmental DNA: Underway sampling from commercial vessels provides new opportunities for systematic genetic surveys of marine biodiversity. Front Mar Sci. 8, 704786(2021).
  10. Boyse, E., Beger, M., Valsecchi, E., Goodman, S. J. Sampling from commercial vessel routes can capture marine biodiversity distributions effectively. Ecol Evol. 13 (2), e9810(2023).
  11. Arcangeli, A., et al. Testing indicators for trend assessment of range and habitat of low-density cetacean species in the Mediterranean Sea. Front Mar Sci. 10, 1116829(2023).
  12. Valsecchi, E., et al. Novel universal primers for metabarcoding environmental DNA surveys of marine mammals and other marine vertebrates. Environ DNA. 2 (4), 460-476 (2020).
  13. Hunter, M. E., et al. Improving eDNA yield and inhibitor reduction through increased water volumes and multi-filter isolation techniques. Sci Rep. 9 (1), 5259(2019).
  14. Capo, E., et al. Effects of filtration methods and water volume on the quantification of brown trout (Salmo trutta) and Arctic char (Salvelinus alpinus) eDNA concentrations via droplet digital PCR. Environ DNA. 2 (2), 152-160 (2020).
  15. Li, J., et al. The effect of filtration method on the efficiency of environmental DNA capture and quantification via metabarcoding. Mol Ecol Resour. 18 (5), 1102-1114 (2018).
  16. Collins, R. A., Wangensteen, O. S., O'Gorman, E. J., Mariani, S., Sims, D. W., Genner, M. J. Persistence of environmental DNA in marine systems. Commun Biol. 1, 185(2018).
  17. Kelly, R. P., Gallego, R., Jacobs-Palmer, E. The effect of tides on nearshore environmental DNA. PeerJ. 6, e4521(2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Deniz Suyu rneklemesiFeribot Tabanl zlemeDeniz MemelileriK y A klar Sularrnek FiltrasyonuVakum FiltrasyonuBiyo e itlilik De erlendirmesiFiltre SaklamaSetase Surveyi

İlgili makaleler