Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Geçici Fokal İskemi ile Kombine Akut Hipergliseminin Neden Olduğu Hemorajik Dönüşümün Bir Fare Modeli

1.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67371

⸱

15 Kasım 2024

 ,  ,  , 
1Hubei Key Laboratory of Cognitive and Affective Disorder, Institute of Biomedical Sciences, School of Medicine, Jianghan University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

Bu çalışma, akut hiperglisemisi olan C57BL/6 farelerinde orta serebral arter oklüzyonu/reperfüzyonu (MCAO/R) kullanılarak hemorajik dönüşümün (HT) yüksek oranda tekrarlanabilir bir hayvan modelinin oluşturulması için bir protokol sunmaktadır.

Özet

Hemorajik transformasyon (HT), iskemik inme (İS) sonrası trombolitik tedavi sonucu ortaya çıkabilen ciddi bir komplikasyondur ve rekombinant doku plazminojen aktivatörünün (rt-PA) klinik uygulamasında önemli sınırlamalar oluşturur. Ne yazık ki, şu anda klinik uygulamada HT için etkili bir girişim mevcut değildir. Bu nedenle, HT patogenezini aydınlatmak ve etkili müdahale stratejileri geliştirmek için stabil ve güvenilir deney hayvanı modellerine acil ihtiyaç vardır. Bu çalışma, geçici fokal iskemi (tMCAO) ile kombine akut hipergliseminin neden olduğu bir fare HT modeli oluşturmak için bir protokol sunmuştur. Erkek C57BL / 6J farelerine hiperglisemiyi indüklemek için% 30 glikoz enjekte edildi ve daha sonra reperfüzyon ile 60 dakika tMCAO'ya tabi tutuldu. Enfarktüs hacmi, kan-beyin bariyerinin (BBB) bütünlüğü ve intrakraniyal kanama derecesi MCAO'dan 24 saat sonra değerlendirildi. Sonuçlar, glukoz enjeksiyonunun geçici hiperglisemiye (14.3-20.3 mmol/L) yol açtığını ve bunun hem enfarktüs hacmini hem de HT insidansını önemli ölçüde artırdığını gösterdi. Hematoksilen-eozin (H&E) boyaması, hiperglisemik farelerde enfarktüs zonu içinde önemli hemorajik lezyonları gösterdi. Ek olarak, hiperglisemik fareler, Evans mavisi (EB) ve FITC-Dekstran'in daha şiddetli sızıntısı ile gösterildiği gibi, ağırlaştırılmış BBB bozulması sergiledi. Sonuç olarak, akut hiperglisemi, tMCAO'nun bir fare modelinde güvenilir ve tutarlı bir şekilde makroskopik HT ile sonuçlandı. Bu tekrarlanabilir model, HT'nin patolojik mekanizmalarını araştırmak ve karşılık gelen terapötik müdahaleleri geliştirmek için değerli bir araç sunmaktadır.

Giriş

Serebral enfarktüs, dünya çapında yetişkinlerde engelliliğin birincil nedeni ve ikinci önde gelen ölüm nedenidir1. Akut faz, serebral enfarktüsün ilerlemesinde çok önemli bir rol oynar ve hastalık tedavisi için çok önemli bir zaman noktası olarak hizmet eder. Akut serebral enfarktüs (ACI) tedavisinin temel dayanaklarını temsil eden tromboliz ve girişimsel tedavi ile daha fazla beyin hücresi ölümünü önlemek için penumbra bölgesindeki kan akışının erken ve zamanında restorasyonu esastır. Bununla birlikte, hemorajik transformasyon (HT), iskemik inmeli hastaların %15-30'unda tromboliz ve girişimsel tedaviyi takiben önemli bir komplikasyon oluşturur ve bu nedenle uygulamalarını bir dereceye kadar sınırlar 2,3. HT oluşumu, ACI'nin prognozunu etkileyerek mortalite ve sakatlık riskini önemli ölçüde artırır. Bu nedenle, HT'nin patolojik mekanizmalarının araştırılması ve etkili terapötik hedeflerin belirlenmesi klinik açıdan büyük önem taşımaktadır.

Günümüzde, iplik embolisine bağlı orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO), kemirgenlerde HT'nin bir modeli olarak sıklıkla kullanılmaktadır4. Uzun süreli tıkanıklık, korteks ve striatumu içeren büyük serebral enfarktüse neden olabilir ve potansiyel olarak ikincil HT'ye yol açabilir. İplik MCAO kraniotomi gerektirmez, yüksek oranda tekrarlanabilir ve insan felcine benzer fokal beyin hasarı ve HT üretir. Bununla birlikte, bu mekanik modelin, yüksek erken ölüm oranları ve düşük uzun süreli sağkalım oranları dahil olmak üzere bazı belirgin dezavantajları vardır5. Sıklıkla kullanılan bir diğer HT modeli, ilk olarak hedef damarda kan pıhtısı oluşumunun indüklendiği, ardından pıhtıyı çözmek için trombolitik ilaçların (örneğin, rt-PA, warfarin) kullanıldığı tromboliz modelidir ve iskemik inmede HT'nin klinik sürecini taklit eder 6,7. Klinik trombolitik tedavinin patolojik sürecini büyük ölçüde tekrarlamasına rağmen, rt-PA veya warfarin tarafından indüklenen HT hayvan modellerinin uygulanması karmaşıktır ve yüksek hayvan mortalitesinin yanı sıra değişken insidans ve kanama yeri ile ilişkilidir. Serebral enfarktüs sonrası HT ile ilgili temel ve klinik translasyonel araştırmaları ilerletmek için, HT'nin kullanımı kolay ve yüksek stabilite sunan tekrarlanabilir bir hayvan modeli oluşturmak esastır.

Hiperglisemi, serebral iskemi / reperfüzyonu (I / R) takiben HT'ye önemli bir katkıda bulunur ( I/R )8. Birkaç retrospektif çalışma, mekanik trombektomi geçiren hastaların klinik verilerini analiz etmiş ve başvuru sırasında yüksek kan şekeri seviyelerinin daha yüksek spontan HT3 insidansı ile bağlantılı olduğunu ortaya koymuştur. Diyabetik inme hastalarında hiperglisemi, HT riskini önemli ölçüde artırır ve daha ciddi nörolojik defisitlere yol açar 9,10. Araştırmacılar, MCAO aracılığıyla diyabetik hayvan modellerinde serebral I/R'yi indükleyerek HT modelleri geliştirdiler. Bununla birlikte, diyabet-MCAO modeli uzun bir deney süresine, karmaşık bir prosedüre ve yüksek maliyetlere sahiptir11,12. İntraperitoneal glukoz enjeksiyonu yoluyla akut hiperglisemiyi indükleyerek ve bunu sütür tekniği ile oluşturulan bir serebral I/R modeli ile entegre ederek güvenilir bir HT modeli oluşturulabilir. Bu yöntem, tutarlı kanama pozisyonu ile kolayca gerçekleştirilir ve inme sonrası hipergliseminin klinik özelliklerini etkili bir şekilde taklit eder. Bununla birlikte, iskemik zaman ve glikoz konsantrasyonu gibi önemli durumlarda önemli farklılıklar vardır; ek olarak, modelin kararlılığı ve HT insidansı farklı literatürde tutarsızdır.

Araştırma grubumuz, bir HT modeli oluşturmak için akut hiperglisemi-MCAO yöntemini yaygın olarak kullandı. Ayrıca, iskemik zaman, kan şekeri konsantrasyonu, HT insidans oranı ve hayvan ölümleri arasındaki ilişkiyi araştırmak için kapsamlı bir dizi deney gerçekleştirdik. Bu deneyler nihayetinde serebral enfarktüs sonrası HT modeli oluşturmak için en uygun koşulların belirlenmesine yol açtı. Bu çalışma, embolik MCAO ile birlikte intraperitoneal %30 glukoz enjeksiyonu kullanılarak akut hiperglisemiye bağlı HT modeli oluşturmak için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Deney protokolü, Jianghan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (JHDXLL2024-080) tarafından onaylandı ve Çin Hastalık Kontrol Merkezi tarafından yayınlanan Deney Hayvanları Etik Yönergelerine uygun olarak yürütüldü. Bu çalışmada 21-26 g ağırlığındaki yetişkin erkek C57BL/6J fareler kullanıldı. Kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Hayvan gruplaması ve akut hiperglisemiye neden olan

  1. Fareleri, Jianghan Üniversitesi'nin laboratuvar hayvanları merkezinde, 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsü kontrollü bir ortamda (20-22 ° C,% 50 -% 55 nem) yiyecek ve su ad libitum ile barındırın.
  2. Fareleri rastgele dört gruba ayırın: Sham + salin (n = 12), Sham + glikoz (n = 12), MCAO + salin (n = 12) ve MCAO + glikoz (n = 20).

2. Ameliyat öncesi hazırlık

NOT: Tüm deney fareleri ameliyattan önce 12 saat aç kaldı.

  1. Perioperatif olarak sistemik analjezi (meloksikam, 5 mg / kg subkütan) ve insizyon bölgesine (bupivakain, 2 mg / kg subkütan) lokal anestezi uygulayın.
  2. Tüm cerrahi aletleri, pamuklu çubukları ve cerrahi dikişleri 121 °C ve 15 psi koşullarında 30 dakika boyunca otoklavlayarak sterilize edin.
  3. Cerrahi platformu ve çevresindeki çalışma alanını %75 etanol ile silin ve sıcaklık 37 °C'ye ayarlıyken ısıtma anahtarını açın.
  4. Anestezi indüksiyon odasında fareyi %3 izofluran-%20 oksijen gazı karışımı ile uyuşturun. Ardından, anestezi derinliğini test etmek için ayak parmağını sıkıştırma refleksini değerlendirin.
  5. Fareyi cerrahi platform üzerinde yüzüstü pozisyonda hareket ettirin ve farenin burnunu hızlı bir şekilde burun konisine yerleştirin. Anestezi indüksiyon odasına giden akışı kapatarak burun konisine giden gaz akışını açın. İzofluran oranını% 2'ye ayarlayın ve anestezi bakımı için gaz karışımının akışını 0.4 mL / dk'ya ayarlayın.
  6. Ameliyat sırasında nemi korumak için farenin gözlerine göz jeli uygulayın.
  7. Hayvan kesme makinesini kullanarak boyun bölgesindeki kılları tıraş edin. Dezenfektan bir pamuklu çubuk kullanarak iyot ve% 70 etanol ile dönüşümlü olarak uygulayarak cildi temizleyin ve dezenfekte edin.
  8. Boyunda steril bir gazlı bez örtün ve ameliyat bölgesini ortaya çıkarmak için bir açıklık açın.

3. Temel serebral kan akışı ölçümü

  1. Hayvan kesme makinesini kullanarak kafa derisi bölgesindeki kılları tıraş edin. Dezenfektan bir pamuklu çubuk kullanarak iyot ve% 70 etanol ile dönüşümlü olarak uygulayarak kafa derisini temizleyin ve dezenfekte edin.
  2. Kraniyal bıngıldak oluşumunu ortaya çıkarmak için frontal bölge üzerinden ciltte 1.0 cm uzunluğunda bir orta hat kesisi yapın. Kafatasını normal tuzlu su ile nemli tutun.
  3. Lazer Doppler Akış Ölçümü (LDF) aletini hazırlayın ve LDF prob ucunu sol parietal kafatasının yüzeyine dik tutun (1 mm arka ve bregmaya 5 mm yanal); FLUX kararlı olduğunda ve temel değeri kaydettiğinizde.
    NOT: AKI için ölçü birimi, 0-1000 PU ölçüm aralığına sahip Perfüzyon Birimleridir (PU). Lazer Doppler Akış Ölçerde ideal başlangıç CBF'si >600 PU'dur. %10'dan daha az bir dalgalanma aralığına sahip 5 saniyelik sürekli bir süre, geçerli AKI okuması olarak kabul edilir.
  4. 5.0 PGA emilebilir sütür kullanarak kas ve cildi ayrı ayrı dikin. Yaraya diklofenak sodyum jeli ve mupirosin merhem sürün.

4. MCAO cerrahi prosedürü

NOT: MCAO, daha önce Chiang ve ark.13 tarafından tarif edildiği gibi, modifiye edilmiş bir iplik oklüzyon yöntemi kullanılarak gerçekleştirilir.

  1. Fareyi nazikçe sırtüstü pozisyona getirin ve cerrahi işlemden 15 dakika önce farelere intraperitoneal olarak %30 glikoz (7.2 mL/kg) veya normal salin uygulayın.
    NOT: Sham + glikoz ve MCAO + glikoz gruplarından farelere intraperitoneal glikoz enjeksiyonları yapıldı. Sham + salin ve MCAO + salin gruplarından farelere intraperitoneal normal salin enjeksiyonları yapıldı.
  2. Hayvan kesme makinesini kullanarak boyun bölgesindeki kılları tıraş edin. Dezenfektan bir pamuklu çubuk kullanarak iyot ve% 70 etanol ile dönüşümlü olarak uygulayarak cildi temizleyin ve dezenfekte edin. Boyunda steril bir gazlı bez örtün ve ameliyat bölgesini ortaya çıkarmak için bir açıklık açın.
    NOT: Karotis arterin en iyi şekilde görüntülenmesini sağlamak için insizyonun düz tutulduğundan emin olun.
  3. Bir neşter kullanarak boynun ventral yönünde 1,5 cm'lik bir orta hat kesisi yapın. Cerrahi cımbız kullanarak deri altı dokusunu ve yüzeysel fasyayı ayırın.
    NOT: Karotis arterin en iyi şekilde görüntülenmesini sağlamak için insizyonun düz tutulduğundan emin olun.
  4. Yüzeysel fasyanın altında, submandibular bezi ve üç kasın oluşturduğu ters çevrilmiş bir üçgeni bulun: trakea üzerinde orta hatta yerleştirilmiş sternohyoid; parlak beyaz tendinöz kısmı ile tanınan digastrik kasın arka göbeği; Ve son olarak, sternomastoid kas.
  5. Sol ortak karotis arteri (CCA) tanımlamak ve ayırmak için ters üçgen içinde künt diseksiyon yapın.
  6. Oftalmik forseps kullanarak CCA'ya ve kan damarlarını çevreleyen mukozal dokuya bitişik vagus sinirini diseke edin. 5.0 poliglikolik asit (PGA) emilebilir sütür kullanarak CCA'da bir zil sesi açın, ancak sütürü gergin tutun.
  7. CCA boyunca yukarı doğru ayrıldığında, CCA'yı dış karotis arter (ECA) ve iç karotis arter (ICA) olarak bölmek için bir "Y" çatallanması gözlenebilir.
  8. ECA ve ICA'yı tam olarak ortaya çıkarmak için çatallanmayı ayırın. 5.0 PGA emilebilir bir sütürü ECA'nın etrafına çatallanmadan distal olarak geçirin ve sıkıca bağlayın.
    NOT: ECA'nın dönüşü sırasında ipliğin yerinden çıkmasını önlemek için kalıcı ligasyon bölgesi ile vasküler çatallanma arasında yeterli mesafe olduğundan emin olun.
  9. CCA'dan ICA'ya kan akışını engellemek için iki adet 8 mm x 2 mm hafif mikro serrafine arteriyel arter kelepçesi kullanarak hem CCA'yı hem de ICA'yı geçici olarak kelepçeleyin.
  10. ECA segmentini düzeltmek için ECA distal ve CCA'daki dikiş bağını gerin.
  11. ECA üzerindeki iki dikiş bağı arasında küçük bir kesi yapmak için mikromakas kullanın.
  12. ECA'ya silikon kaplı bir monofilament sütür (30 mm uzunluğunda, 3-4 mm kaplı silikon) yerleştirin. Monofilament sütürün geri çekilmesini önlemek için ikinci bir 5.0 PGA emilebilir sütürü bifurkasyonun yakınındaki ECA'ya geçirin ve hafifçe bağlayın.
  13. ECA'nın distalini kalıcı ligasyona tamamen kesin ve arter forseps kelepçesini ICA'dan çıkarın.
  14. Sütürü CCA'nın çatallanmasına kadar geri çekin, ardından ECA kütüğünü dikkatlice geri çekin ve döndürün. Sütürün yerleştirme yönünü ayarlayın ve MCA'yı tıkamak için CCA çatallanmasından yaklaşık 9.0-10.0 mm uzakta ICA'ya yavaşça yerleştirin.
  15. ECA'nın etrafındaki ikinci PGA emilebilir sütürü sıkın ve arter kelepçesini CCA'dan çıkarın.
  16. 5.0 PGA emilebilir sütür kullanarak kas ve cildi ayrı ayrı dikin. Yaraya diklofenak sodyum jeli ve mupirosin merhem sürün.
  17. Fareyi yavaşça yüzüstü konuma getirin ve 3.4 adımını tekrarlayın. MCA oklüzyonunu takiben kan akışını kaydetmek için.
    NOT: MCAO'yu takiben başlangıç değerinin% 40'ından daha az kan akışı azalması sergileyen fareler çalışmadançıkarıldı 14.
  18. Sıcaklık 37°C'ye ayarlanmış durumda kurtarma kafesinin ısıtma anahtarını açın. Oklüzyon sonrası dönemde (60 dakika) fareyi kurtarma kafesine yerleştirin.

5. Monofilament çıkarma ve reperfüzyon

  1. Oklüzyon süresi sona ermeden hemen önce fareyi daha önce tarif edildiği gibi yeniden uyuşturun.
  2. CCA'yı bir mikroklips arter kelepçesi kullanarak kelepçeleyin.
  3. Silikon kaplı uç ICA'dan görünür hale gelene kadar monofilamenti ICA'dan kısmen geri çekin.
  4. Silikon kaplı ucun üzerine ICA'ya başka bir mikroklip arter kelepçesi yerleştirin.
  5. Monofilamenti tamamen geri çekin ve ECA kütüğünü sıkıca bağlayın.
  6. Microclip arter klempini sırasıyla ICA ve CCA'dan çıkarın.
  7. 5.0 PGA emilebilir sütür kullanarak kası ve cildi katman katman dikin.
  8. Fareyi kurtarma odasına yerleştirin ve tüm fareleri tamamen uyanana kadar izleyin. Ağrı kesici için her 12 saatte bir 24 saate kadar meloksikam (deri altından 5 mg / kg) uygulayın.

6. Kan şekeri ölçümü

NOT: Kan şekeri seviyeleri aşağıdaki zaman noktalarında ölçülmüştür: (1) MCAO ameliyatından hemen önce (başlangıç), (2) monofilamentin yerleştirilmesinden hemen sonra (glikoz enjeksiyonundan 15 dakika sonra), (3) monofilamentin yerleştirilmesinden hemen sonra monofilamentin çekilmesinden hemen sonra (glikoz enjeksiyonundan 75 dakika sonra).

  1. Kuyruk damarını tamamen hiperemik hale getirmek için farenin kuyruğunu alkollü bir pamuk topuyla silin.
  2. Cerrahi makas kullanarak kuyruk ucunu 1-2 mm kesin.
  3. Kuyruğun kökü boyunca kuyruğun ucuna kadar hafifçe sıkın ve kanın kesiden dışarı akmasını kolaylaştırın.
  4. Test kağıdının numune emme tankını kan damlasının kenarına yerleştirin.
    NOT: Sifonlama etkisinden dolayı kan test kağıdına çekilecektir.
  5. Kan şekeri ölçüm cihazı okumasını okuyun ve sonucu kaydedin.
    NOT: 15 dakikalık glikoz enjeksiyonundan sonra kan şekeri seviyeleri 10 mmol / L'nin üzerine çıkmayan fareleri hariç tutun.
  6. Bir pamuk kullanarak fazla kanı alın ve kanamayı durdurmak için baskı uygulayın.

7. 2,3,5-Trifeniltetrazolyum Klorür (TTC) boyama

  1. Aşırı dozda pentobarbital (300 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyonu ile fareyi ötenazi yapın.
  2. Fare nefes almayı bıraktığında, derhal sırtüstü pozisyonda hareketsiz hale getirin.
  3. Makas kullanarak göğüs kafesini açın ve kalbi ortaya çıkarmak için diyaframı kesin.
  4. Farenin sol ventrikülüne 23 G'lik bir enjeksiyon iğnesi yerleştirin ve kulak apendiksini makasla kesin.
  5. Kulak apendiksinden akan sıvı berrak ve şeffaf görünene kadar 15 mL normal salin perfüze edin.
  6. Farenin kafasını kesin ve makas kullanarak kafatasını tamamen ortaya çıkarmak için kafa derisini kesin. Makas ucunu kafatasının koronal dikişinin 2 mm hafifçe önüne sokarak açın.
  7. Farenin beyin dokusunu sağlam bir şekilde çıkarmak için cımbız kullanın.
  8. Beyin dokusunu bir kemirgen beyin matrisine yerleştirin ve 2 mm'lik koronal dilimler halinde kesin.
  9. Dilimleri 24 oyuklu bir tabağa aktarın ve 37 ° C'de% 2 TTC çözeltisi ile 15 dakika inkübe edin.
  10. Tarama yazılımını başlatın ve parametre ayarlarını görüntü analizi için 1200 dpi çözünürlüğe ve JPG formatına ayarlayın.
  11. Doku bölümlerini 24 oyuklu plakadan kavisli forseps ile kırpın ve bölümleri cam tarama plakası üzerine yerleştirin.
  12. Doku kesitlerini tarayın ve ardından görüntüleri ölçüm analizi için dışa aktarın.
  13. Doku şişmesini düzelterek enfarktüs alanını ölçün. ImageJ yazılımını15 kullanarak ipsilateral tarafın enfarktüs olmayan alanını karşı tarafın alanından çıkarın. Enfarktüs boyutunu kontralateral hemisferin yüzdesi olarak değerlendirin. Enfarktüs alanı analizi hakkında daha fazla ayrıntı için Friedländer ve ark.16'ya bakın.

8. Gross gözlemi

  1. 7.1–7.8 arasındaki adımları tekrarlayın.
  2. Doku bölümlerini kavisli forseps ile beyin matrisinden kırpın ve bölümleri cam tarama plakası üzerinde düzenleyin.
  3. Beyin koronal bölümlerini adım 7.10 ve 7.12'de açıklandığı gibi tarayın.

9. Hematoksilen ve eozin (H & E) boyama

  1. 7.1–7.4 arasındaki adımları tekrarlayın. 15 mL normal salini yavaşça perfüze edin, ardından yaklaşık 15 mL paraformaldehit (PFA) perfüzyonu yapın.
  2. 7.6–7.7 arasındaki adımları tekrarlayın. Beyin dokusunu oda sıcaklığında 24 saat boyunca% 4 PFA ile sabitleyin.
  3. Sabit beyin dokusunu dehidrasyon, vitrifikasyon ve balmumu daldırma için otomatik doku kurutucusuna yerleştirin.
  4. Dokuyu parafin mumuna gömün ve beyin dokusunu mikrotom ile 5 μm kalınlığında koronal dilimler halinde kesin.
  5. Dilimi üç kez ksilene batırarak mumdan arındırın, her daldırma 8 dakika sürer. Daha sonra, dilimi yavaş yavaş azalan konsantrasyonlarda (%100, %95, %90, %80, %70) etanol çözeltilerine daldırın, ardından her adım 5 dakika sürecek şekilde damıtılmış suya batırın.
  6. Dilimi hematoksilen çözeltisi ile 3 dakika boyayın. Ardından, 5 saniye boyunca% 5 hidroklorik asit alkole batırarak ayırt edin.
  7. Dilimi eozin çözeltisi ile 1 dakika inkübe edin, ardından gradyan etanol çözeltisi (% 90,% 95,% 100) ve ksilen ile dehidre edin ve hyalinize edin.
  8. Bölümü nötr reçinelerle monte edin.
  9. Floresan mikroskobu kullanarak parlak bir alan altında H&E lekeli beyin dilimlerinin görüntülerini yakalayın.

10. Evans Blue (EB) lekage'nin belirlenmesi

NOT: Bu prosedürle ilgili ayrıntılar için lütfen Wang ve ark.17'ye bakın.

  1. MCAO'dan 23 saat sonra kuyruk damarı yoluyla % 2 (a / h) Evans Blue (EB) çözeltisi (2 mL / kg) enjekte edin.
  2. EB enjeksiyonundan bir saat sonra 7.1-7.7 arasındaki adımları tekrarlayın ve tüm beynin bir fotoğrafını çekin.
  3. Beyni bir kemirgen beyin matrisine yerleştirin ve koronal olarak 2 mm'lik dilimler halinde kesin. EB sızıntısını gözlemlemek için beyin koronal bölümlerini adım 7.10–7.12'de açıklandığı gibi tarayın.
  4. Dilimleri sağ ve sol kısımlara bölün ve her birini bir santrifüj tüpüne koyun.
  5. Beyin dokusunun her dilimini 100 mg beyin dokusuna 0,4 mL trikloroasetik asit oranıyla %50 trikloroasetik asit içinde homojenize edin.
  6. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edildikten sonra, homojenatı 10.000 x g'da (4 °C'de) 30 dakika santrifüjleyin.
  7. Süpernatan sıvıyı başka bir santrifüj tüpüne aktarın ve etanol ile dört kat seyreltin.
  8. Bir spektrofotometre kullanarak süpernatan sıvının emilimini 620 nm'de ölçün.
  9. Etanolde standart bir EB eğrisi kullanarak absorbans değerlerini EB konsantrasyonuna dönüştürün (ör., 31.25, 62.5, 125 ve 250 ug / mL'de).
    NOT: Sonuç, beyin dokusunun gramı başına bir mikrogram EB olarak sunulur.

11. FITC-Dekstran sızıntısının belirlenmesi

  1. FITC-Dekstran'i (10 KDa, 6 mg / mL, 0.01M PBS'de seyreltilmiş; 4 mL / kg) MCAO'dan 24 saat sonra kuyruk damarına enjekte edin ve 10 dakika boyunca kanda dolaşmasına izin verin.
  2. Perfüzyon gerçekleştirmek ve sağlam beyin dokusunu çıkarmak için 7.1–7.7 adımlarını tekrarlayın.
  3. Beyin dokusunu karanlıkta oda sıcaklığında 24 saat boyunca% 4 PFA'da sabitleyin.
  4. Sabit beyin dokusunu, dehidrasyon için% 10,% 20 ve% 30 (0.01M PBS'de seyreltilmiş) gradyan konsantrasyonlarına sahip sükroz çözeltisine aktarın.
  5. Beyin dokusunu optimum kesme sıcaklığı bileşiğini (OCT) kullanarak gömün ve 30 μm kalınlığında beyin dokusu bölümlerine kesin. Bölümleri bir aşılama halkası kullanarak bir mikroskop lamına aktarın ve lamın yüzeyine yapıştıklarından emin olun.
  6. Beyin dokusu bölümlerini 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren bir montaj ortamı kullanarak monte edin.
  7. Lazer konfokal mikroskobu ve kontrol yazılımını başlatın.
  8. Mikroskop slaytını nesne tablasına sabitleyin ve 200x göz merceğinin altındaki enfarktüs alanını bulun.
  9. Çözünürlüğü 1024 x 1024 olarak ayarlayın ve mümkün olan en net görüntüyü elde etmek için kazanç değerini ve pozlama süresini ayarlayın.
  10. 488 nm'lik bir uyarma dalga boyu altında FITC-Dextran boyalı serebral enfarktüs bölgesinin görüntülerini elde edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu çalışmanın deneysel prosedürü Şekil 1'de gösterilmiştir. Kısaca, farelere 60 dakika boyunca iplik oklüzyonunun neden olduğu MCAO uygulandı ve ardından reperfüzyon uygulandı. Glukoz (normal serum fizyolojik içinde 0, vücut ağırlığında 7.2 mL/kg) MCAO'dan 15 dakika önce intraperitoneal olarak uygulandı. Kan glukoz seviyeleri başlangıçta (glukoz enjeksiyonundan önce), MCAO'dan hemen sonra ve reperfüzyon sırasında ölçüldü. 24 saatlik reperfüzyondan sonra, farelere ötenazi ya...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Mevcut protokol, hiperglisemik koşullar altında damar revaskülarizasyonunun zararlı etkilerini çoğaltabilen, iskemik inme sonrası hemorajik transformasyonun güvenilir bir hayvan modelini oluşturmak için tasarlanmıştır. İskemik inme için çeşitli risk faktörleri arasında, inme başlangıcından sonraki 24 saat içindeki kan şekeri seviyesi, serebral hasarın alevlenmesi ve mortalitenin artması ile pozitif korelasyon gösterir 3,18. Çok s...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek çatışan çıkarları yoktur.

Teşekkürler

Şekil 1, BioRender yazılımı (https://www.biorender.com/) ile oluşturulmuştur. Bu çalışma, Hubei Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı'nın (No. 2022CFC057) rehberlik projesinden alınan hibelerle desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2,3,5-Trifeniltetrazolyum Klorür (TTC)Sigma-Aldrich108380TTC boyama için boya
24 oyuklu kültür plakasıCorning IncorporatedCLS3527TTC boyama için kap
%30 glikoz enjeksiyonuKelun PharmaceuticalH42021188Akut hiperglisemi indüksiyonu
%4 paraformaldehitWuhan Servicebio Technology
Co., Ltd. 		G1101Doku fiksasyonu
5.0 Poliglikolik asit emilebilir sütürJinhuan Medical Co., LtdKCR531Ameliyat ekipmanı
96 oyuklu kültür plakasıCorning IncorporatedCLS3596EB içerik ölçümü
Anestezi makinesiMidmark CorporationDAPI
Beyotime Biotechile hayvan Antifade Montaj OrtamıP0131Doku kesitleri için montaj
Otomasyon-doku dehidrasyonu 
makinesi		Leica BiosystemsTP1020Dehidrat dokusu
Konfokal mikroskopiLeica BiosystemsSTELLARIS 5Görüntü edinme
Diklofenak sodyum jeliMaYinglong Hayvan için İlaçH10950214Analjezi
Eozin boyama çözeltisiServicebio TechnologyG1001H & için boya E boyama
Evans BlueAladdinE104208EB boyama
Göz jeliGuangzhou İlaçH44023098Ameliyat malzemesi
Fitc-dextranSigma-Aldrich60842-46-8BBB geçirgenlik değerlendirmesi
Floresan mikroskobuOlympusBX51Görüntü elde
etme Donmuş mikrotomLeica BiosystemsCM1900Donmuş bölümler için kullanın
GlukometreYuWell580Kan şekeri ölçümü
Hematoksilen boyama SolüsyonuServicebioG1004H & için boya E boyama
İyotLircon20020059Ameliyat malzemesi
IsofluranRwd Life ScienceR510-22-10Hayvan için anestezi
Lazer doppler kan akış ölçerMoor InstrumentsmoorVMSKan akışı izleme
MCAO SütürlerRwd Life Science907-00023-01Ameliyat için malzeme
MeloksikamBoehringer-IngelheimJ20160020Hayvanlar için Analjezi
Mikrocerrahi alet kitiRwd Life ScienceSP0003-MAmeliyat ekipmanı
MicrotomeThermo Fisher ScientificHM325Doku kesiti üretimi
Mikrotom bıçağıLeica Biosystems819Doku kesiti üretimi
Mupirosin merhemGlaxoSmithKlineH10930064Hayvan için anti-enfeksiyon
Nötr balsamAbsin Bioscienceabs9177H & için Mühür E boyama
Parafin gömme merkeziThermo Fisher ScientificEC 350Parafin blokları üretin
Pentobarbital sodyumSigma-AldrichP3761Hayvan için ötenazi
Fosfat tamponlu salinBeyotime BiotechC0221ADoku kesiti için durulama
TarayıcıEPSONV330Doku taramalı
Tıraş MakinesiShenzhen Codos Elektrikli Ev Aletleri Co., Ltd.CP-9200Ameliyat ekipmanı
SpektrofotometreThermo Fisher Scientific1510-02362EB içerik ölçümü
Sükroz çözeltisiShanghai MacklinBiyokimyasal 57-50-1Doku için dehidrasyon
Doku-Tek OCT BileşikSakura4583Doku gömme ortamı
Trikloroasetik asitSigma-AldrichT6399EB İçerik ölçümü
için VMR Anestezi

Kaynaklar

  1. Patel, P., Yavagal, D., Khandelwal, P. Hyperacute management of ischemic strokes: JACC focus seminar. J Am Coll Cardiol. 75 (15), 1844-1856 (2020).
  2. Goncalves, A., et al. Thrombolytic tPA-induced hemorrhagic transformation of ischemic stroke is mediated by PKCβ phosphorylation of occludin. Blood. 140 (4), 388-400 (2022).
  3. Adebayo, O. D., Culpan, G. Diagnostic accuracy of computed tomography perfusion in the prediction of hemorrhagic transformation and patient outcome in acute ischaemic stroke: A systematic review and meta-analysis. Eur Stroke J. 5 (1), 4-16 (2020).
  4. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  5. Knight, R. A., et al. Prediction of impending hemorrhagic transformation in ischemic stroke using magnetic resonance imaging in rats. Stroke. 29 (1), 144-151 (1998).
  6. Orset, C., et al. Combination treatment with U0126 and rt-PA prevents adverse effects of the delayed rt-PA treatment after acute ischemic stroke. Sci Rep. 11 (1), 11993(2021).
  7. Kwon, I., et al. Hemorrhagic transformation after large cerebral infarction in rats pretreated with dabigatran or warfarin. Stroke. 48 (10), 2865-2871 (2017).
  8. Mi, D., et al. Correlation of hyperglycemia with mortality after acute ischemic stroke. Ther Adv Neurol Disord. 11, 1756285617731686(2018).
  9. Seners, P., Turc, G., Oppenheim, C., Baron, J. C. Incidence, causes and predictors of neurological deterioration occurring within 24 following acute ischaemic stroke: A systematic review with pathophysiological implications. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 86 (1), 87-94 (2015).
  10. Reshi, R., et al. Hyperglycemia in acute ischemic stroke: Is it time to re-evaluate our understanding. Med Hypotheses. 107, 78-80 (2017).
  11. Graham, M. L., Schuurman, H. J. Validity of animal models of type 1 diabetes, and strategies to enhance their utility in translational research. Eur J Pharmacol. 759, 221-230 (2015).
  12. Rehni, A. K., Liu, A., Perez-Pinzon, M. A., Dave, K. R. Diabetic aggravation of stroke and animal models. Exp Neurol. 292, 63-79 (2017).
  13. Chiang, T., Messing, R. O., Chou, W. H. Mouse model of middle cerebral artery occlusion. J Vis Exp. 48, e2761(2011).
  14. Ma, F., Sun, P., Zhang, X., Hamblin, M. H., Yin, K. J. Endothelium-targeted deletion of the miR-15a/16-1 cluster ameliorates blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke. Sci Signal. 13 (621), eaay5686(2020).
  15. Wanson, R. A., et al. A semiautomated method for measuring brain infarct volume. J Cereb Blood Flow Metab. 10 (2), 290-293 (1990).
  16. Friedländer, F., et al. Reliability of infarct volumetry: Its relevance and the improvement by a software-assisted approach. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (8), 3015-3026 (2017).
  17. Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, 6588(2014).
  18. Wang, C., et al. Association between red blood cell distribution width and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke patients. Cerebrovasc Dis. 48 (3-6), 193-199 (2019).
  19. Zhu, B., et al. Stress hyperglycemia and outcome of non-diabetic patients after acute ischemic stroke. Front Neurol. 10, 1003(2019).
  20. Won, S. J., Tang, X. N., Suh, S. W., Yenari, M. A., Swanson, R. A. Hyperglycemia promotes tissue plasminogen activator-induced hemorrhage by increasing superoxide production. Ann Neurol. 70 (4), 583-590 (2011).
  21. Zhang, F. H., et al. Rosiglitazone attenuates hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation after transient focal ischemia in rats. Neuroscience. 250, 651-657 (2013).
  22. Soejima, Y., et al. Hyperbaric oxygen preconditioning attenuates hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation after transient MCAO in rats. Med Gas Res. 2 (1), 9(2012).
  23. Chen, C., Ostrowski, R. P., Zhou, C., Tang, J., Zhang, J. H. Suppression of hypoxia-inducible factor-1alpha and its downstream genes reduces acute hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation in a rat model of cerebral ischemia. J Neurosci Res. 88 (9), 2046-2055 (2010).
  24. Lin, Y., et al. Docosahexaenoic acid attenuates hyperglycemia-enhanced hemorrhagic transformation after transient focal cerebral ischemia in rats. Neuroscience. 301, 471-479 (2015).
  25. MacDougal, E. L., Herman, W. H., Wing, J. J., Morgenstern, L. B., Lisabeth, L. D. Diabetes and ischaemic stroke outcome. Diabet Med. 35 (9), 1249-1257 (2018).
  26. Yang, C., Hawkins, K. E., Doré, S., Candelario-Jalil, E. Neuroinflammatory mechanisms of blood-brain barrier damage in ischemic stroke. Am J Physiol Cell Physiol. 316 (2), C135-C153 (2019).
  27. Natarajan, R., Northrop, N., Yamamoto, B. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation as a measure of blood-brain barrier permeability. Curr Protoc Neurosci. 79, 9.58.1-9.58.15 (2017).
  28. Ahishali, B., Kaya, M. Evaluation of blood-brain barrier integrity using vascular permeability markers: Evans Blue, Sodium Fluorescein, Albumin-Alexa Fluor conjugates, and Horseradish Peroxidase. Methods Mol Biol. 2367, 87-103 (2021).
  29. Kovács, K. B., Bencs, V., Hudák, L., Oláh, L., Csiba, L. Hemorrhagic transformation of ischemic strokes. Int J Mol Sci. 24 (18), 14067(2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Düzeltme


Formal Correction: Erratum: A Mouse Model of Hemorrhagic Transformation Induced by Acute Hyperglycemia Combined with Transient Focal Ischemia
Posted by JoVE Editors on 1/06/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/67371

Daha fazla makale keşfet

Hiperglisemi Fare ModeliOrta Serebral Arter OklüzyonuKan Beyin BariyeriSerebral Enfarkt HacmiEvans Blue GeçirgenliğiFITC-Dekstran SızıntısıHematoksilen Eozin BoyamaLazer Doppler Akımmetrisi
Geçici Fokal İskemi ile Kombine Akut Hipergliseminin Neden Olduğu Hemorajik Dönüşümün Bir Fare Modeli
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.