Yöntem makalesi

Dijital Isıtma Cihazına Dayalı Farelerin Satranç Tahtası Benzeri Yanık Yara İyileşme Modeli

2.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67375

⸱

27 Aralık 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral Diseases & National Center for Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2Department of Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

Bu makalede

Özet

Dijital bir ısıtma cihazı kullanan farelerde bir yanık yarası iyileşme modeli oluşturmak için aerodinamik bir protokol sunulmuştur. Deri üzerinde oluşturulan satranç tahtası benzeri deney bölgeleri, yara iyileşme testi için daha fazla fonksiyonel analizi kolaylaştırır.

Özet

Ciddi yanık yaralanmaları, hemen hemen her organ sistemini etkileyen ve önemli morbidite ve mortalite ile sonuçlanan en travmatik ve fiziksel olarak zayıflatıcı durumlar arasındadır. Karmaşıklıkları ve birden fazla organın katılımı göz önüne alındığında, yanık yaralanmasının farklı yönlerini çoğaltmak için çeşitli hayvan modelleri oluşturulmuştur. Yanmış yüzeyler üretmek için kullanılan yöntemler deney hayvanı modelleri arasında farklılık gösterir. Bu çalışma, bir dijital ısıtma cihazı kullanarak tutarlı tam kalınlıkta yanıklar oluşturmak için basit, uygun maliyetli ve kullanıcı dostu bir fare yanığı modelini açıklamaktadır. Bu cihazın ucu, satranç tahtası benzeri bir yanık oluşturmak ve deneysel bir pansuman tedavisi altında yara iyileşmesini incelemek için 97 ° C'de 10 saniye boyunca farelerin sırtına uygulandı. Hematoksilen ve Eozin (H & E) boyaması ve Masson boyaması dahil olmak üzere histolojik analiz için cilt örnekleri toplandı. Yara iyileşmesi, yara alanının analizi ve inflamatuar infiltrasyon, yeniden epitelizasyon ve granülasyon dokusu oluşumunun mikroskobik incelemesi ile değerlendirildi. Fare yanığı yaralanması modeli, termal yaralanmaların patofizyolojisini incelemede ve terapötik müdahaleleri değerlendirmede temel bir araç olarak hizmet edebilir.

Giriş

Yanıklar, ısıya maruz kalma, elektrik, kimyasal maddeler ve radyasyona maruz kalmanın neden olduğu ciltteki kritik yaralanmalardan biri olarak kabul edilir 1,2. Yaralanmanın derinliğine bağlı olarak, epidermisten cildin tam kalınlığına ve hatta kaslara ve kemiklere kadar dört dereceye kadar sınıflandırılabilir. Küçük yanıklar yara izi oluşumuna yol açabilir ve enfeksiyon riskini artırabilir. Geniş bir yanık yaralanması alanı sadece lokal hasara neden olmakla kalmaz, aynı zamanda ciddi ve uzun süreli iltihaplanma ve bağışıklık tepkileri yoluyla vücudun kalbi, böbrekleri ve diğer organ veya sistemlerindeki bozuklukları uyararak ciddi sistemik sonuçlara ve yüksek morbiditeye yol açar3. Yanık yaralanmasından kurtulanların çoğuna uzun süreli fiziksel engeller, duygusal sıkıntı ve düşük yaşam kalitesi eşlik eder 4,5. Bu nedenle, yanıkların patolojik sürecini ve yanmış dokunun yenilenme mekanizmalarını incelemek önemlidir.

İmmün yanıtlar, doku rejenerasyonu ve sistematik homeostaz ile ilgili olan in vitro çalışmalar, yanık yarası iyileşmesinin patolojik sürecini kapsamlı bir şekilde araştıramamıştır. Bu nedenle, son yirmi yılda, potansiyel terapötik müdahaleleri araştırmak için, yanık yaralanmasının çeşitli özelliklerini çoğaltmak için farklı yanık yarası iyileştirici hayvan modelleri geliştirilmiştir 6,7. Yanık yaraları genellikle epilasyondan sonra domuzların, sıçanların, farelerin, tavşanların ve diğer hayvanların sırt yüzeyinde üretilir. Yanma süresi, %5 ila %30 toplam vücut yüzey alanı (TBSA) aralığında kısmi ila tam kalınlıkta termal hasar oluşturmak için 3 s ila 30 s sürebilir8. Kullanılan tekniklerin yüksek değişkenliği nedeniyle şu anda yanık hayvan araştırmalarında bu yöntemlerin standart bir modeli bulunmamaktadır. Yanmış yüzeyler üretmek için kullanılan yöntemler, gaz alevi9, yanan etanol banyosu10, önceden ısıtılmış tek metal plaka/çubuk11,12, kaynar veya sıcak su13,14 dahil olmak üzere deney hayvanı modelleri arasında farklılık gösterir. Bununla birlikte, yanık oluşturma tekniği ve üretilen yanık derinliği genellikle tutarsızdır ve önceki çalışmalarda yetersiz tanımlanmıştır, bu da yanığın ciddiyetini ve yanık tedavisi yöntemini belirlemede çok önemlidir.

Bu çalışma, simüle edilmiş klinik senaryolarda tutarlı tam kalınlıkta yanıklar oluşturmak için basit, uygun maliyetli ve kullanıcı dostu bir fare yanığı hayvan modeli geliştirmeyi amaçlamaktadır. Bu protokolde, cilde uygulanan sıcaklığı ayarlayarak yanık derinliğini kontrol etmek için uygun bir dijital ısıtma cihazı kullandık. Bu cihazın ucu, farklı TBSA aralıkları ile termal yanıklara neden olmak için farklı boyutlara değiştirilebilir. Bu, farenin sırtında satranç tahtası benzeri bir yanık yarası oluşturulmasına izin vererek, aynı hayvan içindeki çeşitli deneysel ve kontrol tedavilerinin karşılaştırılmasını sağlar. Yara kapatma sürecini gözlemledik ve kayıt altına aldık. Yara iyileşmesinin farklı aşamalarında histolojik değerlendirme (Hematoksilen ve Eozin (H&E) boyaması ve Masson trikrom boyaması) için deri örnekleri alındı. Bu yaklaşım, deneyde kullanılan hayvan sayısını azaltır ve bu nedenle, hayvan etiği ile daha uyumlu olurken ekonomik maliyetleri düşürür. Bu çalışma, araştırmacılara yanık yaralanması için yeni tedavilerin geliştirilmesini kolaylaştırmak ve yanık yarası iyileşmesinin patofizyolojik mekanizmalarını ortaya çıkarmak için gerekli araçları sağlayacaktır.

Protokol

Bu çalışmadaki tüm hayvan prosedürleri, Sichuan Üniversitesi Batı Çin Stomatoloji Okulu Etik Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (WCHSIRB-D-2024-499). Bu çalışma için yirmi dört sekiz haftalık C57BL / 6 faresi (dişi, vücut ağırlığı 25-30 g) kullanıldı. Reaktiflerin ve kullanılan ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Yanık yaralanmasından önce ekipman ve farenin hazırlanması

  1. Hayvanları edinin ve çevreye alışmalarını sağlamak için varışta 7 gün boyunca kafeslerde barındırın.
  2. Çalışma alanını %70 etanol (h/h) püskürterek ve silerek sterilize edin. Ameliyat masasını steril cerrahi emici pedlerle örtün.
  3. Dijital ısıtma cihazının sıcaklığını 97 °C'ye ayarlayın. Isıtma cihazı üç parçadan oluşur (Şekil 1).
    NOT: 50-450 °C arasındaki sıcaklık, sıcaklık kontrolörü aracılığıyla ayarlanabilir (Şekil 1A). Stand tabanı, farklı alet boyutlarını değiştirmek için sökülebilen (Şekil 1C) ucu (Şekil 1B) yerleştirmek için kullanılır. Ucu iyodofor veya alkolle dezenfekte edin.
  4. Fareyi% 100 oksijen içinde% 5 izofluran ile bir indüksiyon odasında 3 dakika (akış hızı: 4 L / dak) solunum yavaşlayana kadar uyuşturun. Ayak parmağınızı sıkıştırma testi kullanarak anestezi derinliğini değerlendirin.
    NOT: İzofluranın solunması uyuşukluğa neden olabilir ve kardiyovasküler sisteme zarar verebilir. Koruyucu ekipman giymek ve iyi havalandırılan bir alanda çeker ocak içinde kullanmak çok önemlidir.
  5. Fare derin bir şekilde uyuşturulduktan sonra, anesteziden iyileşme sırasında sıcaklığı korumak ve hipotermiyi önlemek için yüzüstü pozisyonda ısıtılmış bir pede aktarın. İzofluranı 1'e düşürün. Burun konisi ile bakım için %5 oksijen.
  6. Korneanın kurumasını önlemek için farenin her iki gözüne pamuklu çubukla kayganlaştırıcı jel uygulayın.

2. Tam kalınlıkta yanık yaralanmasına neden olmak

NOT: Yanma indüksiyonu ve analizinin genel süreci Şekil 2'de gösterilmiştir.

  1. Farenin derisini elektrikli tıraş makinesi ile boyundan kuyruğa kadar yaklaşık 5 cm uzunluğunda ve 4 cm genişliğinde bir alanda tıraş edin. Tıraş sırasında cilde zarar vermemek için nazikçe çalışın (Şekil 3C).
  2. Tıraşlı cilt bölgesine 3 dakika boyunca tüy dökücü krem uygulamak için pamuk uçlu bir aplikatör kullanın (Şekil 3D).
    NOT: Tespit edilmesi zor olabilecek yanıkları önlemek için tüy dökücü kremi farenin diğer kısımlarına uygulamaktan kaçının. Krem 5 dakikadan fazla kullanıldığında deri döküntülerine neden oldu. Optimum etkinlik için kesin süre ürünler arasında değişir ve operatör tarafından belirlenmelidir.
  3. Krem ve saç algılanmayana kadar nemli gazlı bez kullanarak kremi silin. Cerrahi alanı klorheksidin ovma ve ardından her biri üç kez% 70 etanol (h / v) ile dezenfekte edin. Alanı steril gazlı bezle temizleyin ve kurulayın.
  4. İstenen yara bölgelerini doğru bir şekilde belirlemek için sterilize edilmiş mürekkebe batırılmış 1 mm çapında (Şekil 9A) sterilize edilmiş 3 mL'lik bir pipet ucu kullanın. Murin sırt derisi, düzensiz bir topografya ile karakterizedir. Farelerin omuriliğinden ayrı olarak yara bölgesini tanımlamak, tekrarlanabilirliği sağlamak için çok önemlidir.
  5. Cildi önceden kesilmiş steril bir örtü ile örtün ve cerrahi alanı serbest bırakın (Şekil 3). Isıya dayanıklı eldivenler giyin ve dijital ısıtma cihazının sıcaklığını kontrol edin. Yanma indüksiyonundan önce ve sonra, cihazın ucunu %70 etanol (h/h) ile sterilize edin.
  6. Isıtma cihazının ucunu bulunan yara bölgelerinin ortasına (10 saniye boyunca 97 °C) uygulayın ve 4 mm çapında altı yuvarlak yara oluşturun (Şekil 3B). Bitişik yanıklar arasındaki aralık 0,5-1 cm'dir. Deneysel tasarıma göre yanık sayısını belirleyin.
    NOT: Yanık esas olarak ısı iletiminden kaynaklanır; Bu nedenle, çubuğa baskı uygulamak, yani yanık indüksiyonu sırasında yerçekimi ile cilt ile temas halinde tutmak gereksizdir. Deney tasarımı için altı yanık vardı. Bu, kullandığımız cihaza ve fare sırtının bulunduğu bölgeye göre oluşturulabilecek maksimum yanık yarası sayısıdır. Bu temelde aynı deney grubunun birden fazla kopyası elde edilebilir.

3. Yanık sonrası bakım ve ölçüm

  1. Ağrı yönetimi için potansiyel ağrıyı azaltmak için yanık yarasına 5 dakika boyunca buz uygulayın (Şekil 3G).
  2. İzofluranı kapatın ve yanık yaralanmasından sonra burun konisini çıkarın. Fare normal şekilde hareket edene kadar (örn. çömelmiş veya titrememiş) fareyi bir ısıtma yastığına aktarın.
  3. Birbirlerini çizmelerini önlemek için her fareyi bir kurtarma kafesine yerleştirin. Her bir pelete 5-10 damla içme suyu ekleyerek bazı gıda peletlerini yumuşatın ve beslemeyi kolaylaştırmak için kafes tabanına yerleştirin.
    NOT: Kafeslerin püskürtülerek ve %70 etanol (hacim/hacim) ile silinerek sterilize edilmesi. Fareleri sıcak tutmak ve idrarı emmek için yatak takımları düzenli olarak değiştirilmelidir.
  4. Buprenorfini (0.1 mg / kg) toplam 3 gün boyunca günde iki kez kaudal bir yerde deri altından uygulayın ve enjeksiyonlar arasında en az 8 saat sağlayın.
  5. 24 saat yanık indüksiyonundan sonra tüm yaraları tuzlu su ile nemlendirilmiş steril gazlı bezle temizleyin. Cildi gazlı bezle kurulayın ve yanık yarasını kapatmak için bir şırınga kullanarak az miktarda antibakteriyel jel (TKH hidrojel) uygulayın12,14. Bu prosedürü daha sonra 3, 7 ve 10. günlerde tekrarlayın.
  6. Yaraları kapatmak için nefes alabilen, şeffaf bir pansuman kullanın. Pansumanın boyutu yaranın etrafını yaklaşık 1 cm kaplamalı ve epilasyon yapılmadan alanı kapatmamalıdır.
    NOT: Yara örtüsünü en az 2 günde bir değiştirin. Pansumanın değiştirilmeden uzun süre kullanılması, irin oluşumu ile yara enfeksiyonuna yol açarak yara iyileşmesinin gecikmesine neden olabilir.
  7. Takip süresi boyunca, ağırlığı her 2-3 günde bir ölçün. Genel olarak, başlangıçtaki vücut ağırlığının %15-20'sini kaybeden fareler kurban edilmeli ve deneyden çıkarılmalıdır.

4. Yara toplama

  1. 0, 3, 7, 10 ve 14. günlerde, yarayı steril 1 mL pipet ucunun ucuyla işaretleyin ve bir dijital kamera ile kaydedin.
  2. Fareleri aşırı dozda anestezi ve servikal çıkık ile ötenazi yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek).
    NOT: Sırt yaralarına zarar verebilecek aşırı çekmeyi önlemek için servikal çıkık sırasında dikkatli olun.
  3. Makasla, alttaki kas sistemi (1 cm x 1 cm) dahil olmak üzere yara bölgesini ve çevresindeki cildi izole edin. Her grup için en az üç numune hazırlayın.
  4. Deri örneklerini 24 saat boyunca %4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitleyin ve 4 °C'de saklayın. Fiksatif hacim, doku hacminin15,16 30 katı olmalıdır.
    NOT: PFA tehlikelidir. İyi havalandırılan bir alanda çalıştığınızdan emin olun ve uygun koruyucu ekipman kullanın.

5. Yara iyileşmesi değerlendirmesi

  1. Yara dokusunu PBS ile iki kez yıkayın ve uygun bir boyuta kesilmesi gereken filtre kağıdı ile yayın (Şekil 2H). Deri altı doku tabakası içinde bir miktar mukoza içeriğinin bulunması nedeniyle, filtre kağıdının yüzeyine hareket etmeden veya doku kıvrılmadan yapışır.
    1. Nispeten pürüzsüz doku örnekleri elde etmek için filtre kağıdını ve örneği parafin dehidrasyonu için bir doku kasetine koyun ve ardından dokuyugömün 15,16. Numuneleri 4 °C'de saklayın.
      NOT: Dokuyu mümkün olduğunca gerin ve herhangi bir katlanmadan kaçının, çünkü bu kıvrımlar fiksasyondan sonra kalıcı hale gelecektir.
  2. Parafine gömülü numuneleri 5 μm kalınlığında bölümlere kesin ve granülasyon dokusunun derecesini, anjiyogenez oluşumunu ve kollajen birikimini değerlendirmek için H&E ve Masson'un trikrom yoluyla slaytları boyayın, farklı aşamaları ve yara iyileşmesinin ilerlemesini değerlendirmek için kanıt sağlayın17,18.
  3. 40x objektifli bir mikroskop kullanarak tüm örneklerin görüntülerini yakalayın.
  4. Epidermis, dermis, deri altı dokusu ve kas durumu dahil olmak üzere lekeli cilt bölümünü analiz etmek için uyumlu yazılım kullanın.

Sonuçlar

Bu protokolde dijital ısıtma cihazı tarafından 97 °C'de 10 sn yanma süresi ile satranç tahtası benzeri yanık yaraları oluşturulmuştur (Şekil 1). Cihazın ucu, mükemmel ısı iletimi ve hızlı ısıtma özellikleri ile bilinen saf bakırdan yapılmıştır. Deneyci tarafından tutulan tutuş, ısı direnci ve yanmazlık sağlayan polikarbonat malzemeden yapılmıştır. Önceden ısıtılmış tek metal plaka/çubuk veya kaynar veya sıcak su yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bu cihaz üstün güvenlik performansı gösterir ve farelerde anestezi süresini azaltır, sonuç olarak genel deney süresini kısaltır.

Yanık indüksiyonu ve analizinin genel süreci Şekil 2'de gösterilmiştir. Her hayvanın sırtında, Şekil 2E'de gösterildiği gibi düzenlenmiş altı yanık yarası vardı. Bu hayvanlarda yara boyutu değerlendirildi ve yanık sonrası sırasıyla 1, 3, 7, 10 ve 14. günlerde H&E ve Masson trikrom boyama dahil olmak üzere histolojik analiz için deri örnekleri alındı.

Her yanık yarası, yanık indüksiyonundan sonra eşit alan ve eşit derinlikte dairesel bir şekle sahipti. Yanık yaralanmasının kenar rengi, yaralanmaya ani enflamatuar yanıt nedeniyle hiperemik bir bölge ile birlikte mumsu beyazdan kırmızıya kaymıştır. Ek olarak, yanık yarasının boyutu, yanığı takip eden 72 saat içinde biraz artmıştır (Şekil 4A).

Yaraların H&E ve Masson trikrom boyalı bölümlerinin mikroskobik analizi (Şekil 4B), epidermal tabakanın tamamen tahrip olduğunu ve hem deri altı yağını hem de kası etkileyen dermisin tam kalınlığında hasar olduğunu ortaya koydu. Histolojik inceleme, yara iyileşme sürecinin 3. günde enflamatuar aşamada olduğunu, vazodilatasyon ve enflamatuar hücrelerin önemli bir infiltrasyonu ile karakterize olduğunu gösterdi. Örneklerin mikroskobik görüntülerinde görüldüğü gibi, yanık sonrası 7. günde, 3. güne kıyasla yara alanında kayda değer bir azalma gözlendi. Granülasyon dokusu ve kardiyovasküler oluşur ve kollajen lifleri 14. günde yoğun bir şekilde biriktirilir, bu da yara iyileşmesinin yeniden şekillenme aşamasına girdiği anlamına gelir. Yaralar iyileşme süreci boyunca belirgin bir enfeksiyon olmadan iyileşti.

Ek olarak, yara iyileşme yetenekleri, yara iyileşme verilerinin ölçülmesi ve yara izlerinin analiz edilmesiyle değerlendirildi (Şekil 5). TKH peptit hidrojel12,14 ile tedavi edilen yaralarda yara iyileşmesinin arttığı gözlendi ve 7, 10 ve 14. günlerde önemli ölçüde daha küçük yara alanları ile kanıtlandı.

Enine veya boyuna bitişik yaralar (Şekil 6) arasındaki aralık, yanmamış cilde kıyasla hiçbir fark olmadığını doğruladı. Epidermis, dermis ve subkutan dokular sağlamdı ve lenfosit infiltrasyonu ve vazodilatasyon yoktu. İki yaranın iyileşme süreci birbiriyle çakışmaz. Bu nedenle, in vivo olarak etkiyi değerlendirmek için model bazında yara tedavisine farklı ilaçlar veya pansumanlar uygulanabilir.

figure-results-1
Şekil 1: Yanma indüksiyonu için dijital ısıtma cihazı. Yanık yaralanmalarını indüklemek için kullanılan dijital ısıtma cihazı. (a) Sıcaklık kontrol cihazı, 50-450 °C arasında değişen sıcaklık ayarlarına izin verir. (b) Stand tabanı, yanan ucu tutmak için kullanılır. (c) Cihazın ucu farklı boyutlara değiştirilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Satranç tahtası benzeri yara modelinin şeması. Makalede açıklanan satranç tahtası benzeri yara modelini yeniden üretmek için adım adım bir taslak. (A) Yara iyileşme deneyleri için model olarak 8 haftalık bir fare kullanılmıştır. (B) Saç, belirlenen yara bölgesinden çıkarılır. (C) Altı yaralama bölgesi 1 mL pipet ucu kullanılarak işaretlenir. (D) İşaretli her bölgenin (E) merkezinde altı yanık yarası oluşturmak için bir dijital ısıtma cihazı kullanılır. (F) Yanık indüksiyonundan sonra dorsumun yakın çekim görüntüsü. (G) Deri örnekleri (yaklaşık 1 cm × 1 cm) 3, 7, 10 ve 14. günlerde toplanır. (H) Deri örnekleri, fileto kağıdı kullanılarak düzleştirilir ve gömme kasetlerine aktarılır. (I) Parafin dehidrasyonu gerçekleştirilir ve (J) numuneler 5 μm kalınlığa kadar kesitlere ayrılır. (K) Kesitler hematoksilen ve eozin (H & E) ve Masson'un trikromu kullanılarak boyanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Tam kalınlıkta yanık yaralanması indüksiyon işlemi. (A) 1 mL'lik bir pipet ucunun çapı ve (B) dijital ısıtma cihazının ucu sırasıyla 9 mm ve 4 mm'dir. (C) Farenin sırt bölgesi elektrikli tıraş makinesi ile tıraş edilir. (D) Tüy dökücü krem 3 dakika boyunca uygulanır. (E) Tıraşlı alan temizlenir ve kurutulur ve yara noktaları sterilize edilmiş 1 mL pipet ucu ile işaretlenir. (F) Dijital ısıtma cihazı, altı yanık yarası oluşturmak için 10 saniye boyunca 97 °C'de uygulanır. (G) Ağrı yönetimi için yanık yaralarına buz uygulanır. (H) Farenin tüm sırtı altı tam kalınlıkta yanık yarasını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Yanık yaralarının temsili görüntüleri ve histolojik analiz. (A) 3, 7, 10 ve 14. günlerde iyileşmenin ilerlemesini gösteren yanık yaralarının görüntüleri. (B) H&E ve Masson'un trikrom ile boyanmış histolojik görüntüleri, yara iyileşmesini ve cilt yenilenmesini göstermektedir. Ölçek çubukları = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Zaman içindeki yara boyutu değişimi. (A) Kontrol ve TKH hidrojel ile tedavi edilen hayvanlarda zaman içinde yara boyutundaki değişim, ImageJ yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir. (B) Karşılık gelen yara izi verileri sunulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Komşu yanık yaraları ve histolojik analiz. (A) 1. günde bitişik yanık yaralarının temsili görüntüleri. (B) 3. günde histolojik analiz için toplanan bitişik yara örnekleri (kırmızı daire içine alınmış). (C) Parafin dehidrasyonundan önce doku örneklerini düzleştirmek için filtre kağıdı kullanılır. (D) H&E ve Masson'un bitişik yaraların trikrom analizi. Ölçek çubukları: 1 mm ve 200 μm (büyütülmüş). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Yanık çalışmaları için, in vitro modeller tipik olarak lokal antimikrobiyal ajanların veya antibiyotiklerin Staphylococcus aureus ve Pseudomonas aeruginosa19 gibi yanıklarla ilişkili bakteriler üzerindeki inhibitör etkilerine ve ayrıca çeşitli biyomalzemelerin (elastin, ipek ve hidrojel pansumanlar gibi) etkisine odaklanır14,20) yanık sonrası inflamatuar hücreler (nötrofiller, makrofajlar gibi) veya kök hücreler (mezenkimal kök hücreler gibi). Bu deneyler genellikle yapay olarak kontrol edilen ortamlarda gerçekleştirilir ve in vitro kültürlenen hücreler, hücreden hücreye etkileşimler ve hücre dışı matrisin etkisi gibi yanık yarası iyileşmesinin fizyolojik süreçlerini tam olarak kopyalayamayan in vivo olanlardan farklı büyüme özellikleri ve davranışları sergileyebilir. Bu nedenlerden dolayı, yanıkların hayvan modelleri, yanık sonrası patolojik mekanizmaların aydınlatılması ve yeni terapötik yaklaşımların değerlendirilmesi için gereklidir. Farelerde ve insanlarda yara iyileşme süreci, örtüşen ancak farklı dört aşamadan geçer: iltihaplanma, proliferasyon, yeniden epitelizasyon ve yeniden şekillenme21,22. Fareleri deneysel denekler olarak kullanmanın, fareye özgü çok sayıda reaktifin mevcudiyeti ve geri kazanım sürecinde yer alan moleküler sinyal yollarını araştırmak için transgenik modeller oluşturmanın fizibilitesi dahil olmak üzere çeşitli biyolojik avantajları vardır. Bu, fareleri yanıklar ve yara iyileşmesi üzerine araştırmalar için en yaygın kullanılan hayvan modellerinden biri yapar.

Bu çalışma, tam kalınlıkta yanık yaralanması için satranç tahtası benzeri bir yara modeli oluşturmuş ve bu modeli kullanarak bir hidrojel yara örtüsünün etkinliğini değerlendirmiştir. Sonuçlar, bu modelin deneysel pansumanların klinik performansını etkili bir şekilde izleyebildiğini göstermektedir. Her hayvanın içinde, omurga boyunca simetrik olarak altı yanık yarası dağıldı. Yanık yaraları benzer yerlerde ancak farklı farelerde oluşturulabilir. Dorsumun sınırlı cilt alanı ve yara sayısı nedeniyle, histolojik analiz, yaraların birbiriyle etkileşime girmediğini gösterdi ve her bir deneysel pansumanın aynı fare sırtı üzerinde farklı yerlerde bağımsız olarak değerlendirilmesini sağladı ve yara iyileşme süreciyle ilgili önyargıyı en aza indirdi. Ek olarak, bu model aynı zamanda her farenin kendi kontrolü olarak hizmet etmesini sağlamaktan da yararlanır, bu da aynı farenin sırtı üzerindeki deneysel ve kontrol tedavilerini karşılaştırmayı mümkün kılarak, hayvan sayısında ve deney maliyetinde önemli bir azalmaya yol açar. Farklı ilaçların farelerin genel sağlığı üzerindeki değişen etkileri nedeniyle, farklı yaraların tedavisi ve daha sonra karşılaştırma için aynı farenin cildine birden fazla ilaç uygulanacaksa, tek bir ilacın uygulanmasının veya farklı ilaçların birlikte uygulanmasının farenin genel sağlığını etkileyip etkilemeyeceğini gözlemlemek ve doğrulamak gerekebilir. Ek olarak, iyileşme sürecinde farenin çizilmesine bağlı ilaçların çapraz kontaminasyonunu veya yara enfeksiyonunu önlemek için farklı ilaçların cilt yüzeyine stabilitesine veya yapışmasına dikkat edilmelidir.

Deri örneği toplama, sonraki histolojik analiz için çok önemlidir. Doku kenarı herhangi bir tedavi olmaksızın fiksatif içinde küçülür ve katlanır16. Parafin dehidrasyonu ve kesitinden sonra, slayt üzerinde kavisli veya hatta kısmen üst üste binecek, bu da mikroskop altında çirkin görüntülere neden olacak ve potansiyel olarak yara uzunluğunun veya kalınlığının istatistiksel analizi gibi daha ileri histolojik analizleri etkileyecektir. Bu nedenle, dokuyu düzleştirmek için filtre kağıdı kullanmak, slayt üzerinde daha pürüzsüz bir bölüm elde edebilir, bu da histolojik görüntüyü düzgün hale getirir ve daha fazla istatistiksel analizi kolaylaştırır. Ayrıca, dehidrasyondan önce numuneyi sabitlemek için ataş kullanmayı denedik, bu da doku pürüzsüzlüğünü sağlamaya yardımcı oldu. Bununla birlikte, ataş uygulaması, klemplenen dokuya baskı uygulayarak doku sıkışmasına ve deformasyona neden olabilir. Bu nedenle, bu yöntemi kullanırken, gözlemi etkilememek için yanık yarası kısmı klemplenemez.

Ağrı, kaşıntı ve bakteriyel enfeksiyon dahil olmak üzere çok sayıda faktör iyileşme sürecini etkileyebilir23. Yanık ağrısının etkin yönetimi, yanık yaralanması olan hastaların iyileşmesi ve yeniden entegrasyonu için çok önemlidir. Yetersiz ağrı kontrolü iyileşme sürecini engelleyerek kalıcı fiziksel ve psikolojik zorluklara ve uzun süreli hastanede kalış sürelerine yol açabilir24. Genel olarak, ağrı farelerde beslenme davranışını etkiler. Bu nedenle, her yara yanıktan hemen sonra buzla tedavi edildi ve ağrı yönetimi için 3 gün boyunca günde iki kez deri altına buprenorfin (0.1 mg / kg) enjekte edildi. Ek olarak, yemlemeyi kolaylaştırmak için gıda peletleri yumuşatıldı ve kafes tabanına yerleştirildi. Ortak konut kurulumlarında, fareler birbirlerinin yaralarını kaşıyabilir ve yalayabilir, bu da potansiyel olarak yara iyileşmesini geciktirebilir veya enfeksiyonlara neden olabilir. Bu nedenle, önleyici bir önlem olarak farelerin bireysel olarak saklanması gerekli hale gelir. Yanık indüksiyonundan sonra sırtı örtmek için nefes alabilen pansuman kullanmak, farelerin yarayı çizmesini önleyebilir ve enfeksiyon riskini azaltabilir25. Bununla birlikte, farelerin normal hareketine izin vermek için pansumanları akıllıca seçmek ve uygun boyutta kesmek çok önemlidir. Pansumanlar düşerse derhal değiştirilmeli ve en az iki günde bir değiştirilmesi önerilmelidir. Pansumanların uzun süreli kullanımı, yara eksüdalarının yetersiz emilmesine neden olabilir.

Fare modelinin kendine özgü avantajları olmasına rağmen, insanlarda yara iyileşme sürecini hala tam olarak simüle edemez. İnsanlar öncelikle yeniden epitelizasyon ve granülasyon yoluyla iyileşir. Buna karşılık, fare derisi, insanlarda yalnızca boynun platizmasında bulunan ince bir iskelet kası tabakası olan benzersiz bir panniculus carnosus'asahiptir 7, bu nedenle yara iyileşmesi öncelikle yara kasılması yoluyla gerçekleşir. Ek olarak, fare derisi, hızlı cilt iyileşmesini ve keratinleşmeyi kolaylaştıran zenginleştirilmiş bir progenitör hücre havuzuna sahip olabilir 26,27. Bu faktörler toplu olarak iyileşme süresinin önemli ölçüde azalmasına katkıda bulunur. Hayvan modellerinde, yara kasılmasının iyileşme süreci üzerindeki etkisini azaltmak ve granülasyon dokusu ve yeniden epitelizasyon ile iyileşen insan benzeri fizyolojik yara iyileşmesini taklit etmek için yara kasılma önleyici halkalar kullanılmıştır 12,17,28.

Fare yanığı yaralanması modelinin başarılı bir şekilde kurulması, termal yaralanmaların patofizyolojisini incelemek ve potansiyel terapötik müdahaleleri değerlendirmek için değerli bir araç sağlar. Yanmış cilt dokusunda gözlenen histolojik değişiklikler, termal yaralanmanın karakteristik özellikleri ile uyumludur ve yanıkların klinik belirtilerini özetlemede modelin güvenilirliğini ve geçerliliğini vurgulamaktadır.

Genel olarak, fare yanığı yaralanması modeli, yanığın neden olduğu doku hasarı, iltihaplanma ve yara iyileşme süreçlerinin altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için sağlam bir platform sunar. Bu modeli kullanan gelecekteki çalışmalar, yanık hastaları için sonuçları iyileştirmeyi ve yanığa bağlı morbidite ve mortalite yükünü azaltmayı amaçlayan yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesine katkıda bulunabilir.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Sichuan Bilim ve Teknoloji Programı (23ZYZYTS0120), Batı Çin Stomatoloji Hastanesi Sichuan Üniversitesi hibeleri (RD-03-202011) ve Sichuan Bilim ve Teknoloji Programı (2022NSFSC0614) tarafından desteklenmiştir. Figürler BioRender ile oluşturuldu. Com.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 mL pipet ucuKIRGEN, ABDKG1333Yanık yara bölgelerini bulmak için kullanılır
3 M Tegaderm filmi3M, ABD1624WCN 6 cm x 7 cmYanık indüksiyonundan sonra yara örtüsü için
%4 paraformaldehit(PFA)Biosharp,ÇinBL539ADeri örneklerini sabitlemek için kullanılır
BuprenorfinSigma-Aldrich, ABDPHR8955-50MGFarelerin ağrı yönetimi için
C57BL / 6 farelerChengdu Dashuo deney hayvanları şirketi, Çinyok Yanıkmodelinin kurulması için
Tüy dökücü kremVeet, Çinve mdash;Farelerin dorsum epilasyonu için
Dijital Isıtma CihazıShenzhen Kapper Technology Company, ÇinNo.936DFarelerin yanma indüksiyonu için
Elektrikli tıraş makinesiAUX, ÇinAUX-A5Farelerin sırt epilasyonu için
Filtre kağıdıve mdash;—Deri örneklerini açmak için kullanılır
GraphPad yazılımıve mdash;GraphPad prizma 9.5.0Yanık yara alanının analizi için
Isıya dayanıklı eldivenlerve mdash;—Dijital ısıtma cihazı ucunu tutmak için kullanılır
Hematoksilen ve Eozin Leke kitiSolarbio, ÇinG1120Slaytların histolojik analizi için
ImageJ yazılımıve mdash;ImageJ 1.54fYanık yarası alanının analizi için
IsofluranRWD, ÇinR510-22-10Farelerin anestezisi için
Masson'un Trikrom Leke KitiSolarbio, ÇinG1340Slaytların histolojik analizi için
MikroskopOlympus, Japonya VS200 ASWH& taramak için kullanılır E ve Masson lekeli slaytlar
Doku kasetiCITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD, Çin31050102WDoku parafin dehidrasyonu ve parafin gömme için

Kaynaklar

  1. Mofazzal Jahromi, M. A., et al. Nanomedicine and advanced technologies for burns: Preventing infection and facilitating wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 123, 33-64 (2018).
  2. Burgess, M., Valdera, F., Varon, D., Kankuri, E., Nuutila, K. The immune and regenerative response to burn injury. Cells. 11 (19), 3073(2022).
  3. Arbuthnot, M. K., Garcia, A. V. Early resuscitation and management of severe pediatric burns. Sem Pediatr Surg. 28 (1), 73-78 (2019).
  4. Smolle, C., et al. Recent trends in burn epidemiology worldwide: A systematic review. Burns. 43 (2), 249-257 (2017).
  5. Jeschke, M. G., et al. Burn injury. Nat Rev Dis Primers. 6, 11(2020).
  6. Nomellini, V., Gomez, C. R., Gamelli, R. L., Kovacs, E. J. Aging and animal models of systemic insult: Trauma, burn, and sepsis. Shock. 31 (1), 11-20 (2009).
  7. Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. J Biomed Biotechnol. 2011, 969618(2011).
  8. Abdullahi, A., Amini-Nik, S., Jeschke, M. G. Animal models in burn research. Cell Mol Life Sci. 71 (17), 3241-3255 (2014).
  9. Katakura, T., Yoshida, T., Kobayashi, M., Herndon, D. N., Suzuki, F. Immunological control of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) infection in an immunodeficient murine model of thermal injuries. Clin Exp Immunol. 142 (3), 419-425 (2005).
  10. Dai, T., et al. Animal models of external traumatic wound infections. Virulence. 2 (4), 296-315 (2011).
  11. Tavares Pereira, D. D. S., Lima-Ribeiro, M. H. M., De Pontes-Filho, N. T., Carneiro-Leão, A. M. D. A., Correia, M. T. D. S. Development of animal model for studying deep second-degree thermal burns. J Biomed Biotechnol. 2012, 460841(2012).
  12. Gong, Y., et al. Exudate absorbing and antimicrobial hydrogel integrated with multifunctional curcumin-loaded magnesium polyphenol network for facilitating burn wound healing. ACS Nano. 17 (22), 22355-22370 (2023).
  13. Dahiya, P. Burns as a model of sirs. Front Biosci. 14 (13), 4962-4967 (2009).
  14. Yergoz, F., et al. Heparin mimetic peptide nanofiber gel promotes regeneration of full-thickness burn injury. Biomaterials. 134, 117-127 (2017).
  15. Rao, G., et al. Rat burn model to study full-thickness cutaneous thermal burn and infection. J Vis Exp. 186, e64345(2022).
  16. Yampolsky, M., Bachelet, I., Fuchs, Y. Reproducible strategy for excisional skin-wound-healing studies in mice. Nat Protoc. 19 (1), 184-206 (2024).
  17. Wang, C., et al. Engineering bioactive self-healing antibacterial exosomes hydrogel for promoting chronic diabetic wound healing and complete skin regeneration. Theranostics. 9 (1), 65-76 (2019).
  18. Papp, A., et al. The progression of burn depth in experimental burns: A histological and methodological study. Burns. 30 (7), 684-690 (2004).
  19. Barrett, J. P., et al. An in vitro study into the antimicrobial and cytotoxic effect of Acticoat dressings supplemented with chlorhexidine. Burns. 48 (4), 941-951 (2022).
  20. Lou, P., et al. Injectable self-assembling peptide nanofiber hydrogel as a bioactive 3D platform to promote chronic wound tissue regeneration. Acta Biomater. 135, 100-112 (2021).
  21. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
  22. Bielefeld, K. A., Amini-Nik, S., Alman, B. A. Cutaneous wound healing: Recruiting developmental pathways for regeneration. Cell Mol Life Sci. 70 (12), 2059-2081 (2013).
  23. Yildiz, S. C., Demir, C., Ayhanci, A. Examination of the effects of kefir on healing factors in a mice burn model infected with E. coli, S. aureus and P. aeruginosa using qRT-PCR. Burns. 49 (2), 425-431 (2023).
  24. Wang, Y., et al. Burn injury: Challenges and advances in burn wound healing, infection, pain and scarring. Adv Drug Deliv Rev. 123, 3-17 (2018).
  25. Chen, Y., et al. Research advances in smart responsive-hydrogel dressings with potential clinical diabetic wound healing properties. Mil Med Res. 10 (1), 37(2023).
  26. Ito, M., et al. Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis. Nat Med. 11 (12), 1351-1354 (2005).
  27. Ito, M., et al. Wnt-dependent de novo hair follicle regeneration in adult mouse skin after wounding. Nature. 447 (7142), 316-320 (2007).
  28. Chen, K., et al. Pullulan-collagen hydrogel wound dressing promotes dermal remodeling and wound healing compared to commercially available collagen dressings. Wound Repair Regen. 30 (3), 397-408 (2022).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fare Yan k ModeliTam Kat Yan klarYara Alan AnaliziHistolojik Analiznflamatuar nfiltrasyonGran lasyon DokusuRe epitelizasyonPeptit Hidrojeli

İlgili makaleler