Yöntem makalesi

CRISPR-Cas9 Ribonükleoprotein Kompleks Aracılı Gen Ablasyonu Kullanılarak Murin CD4 T Hücre Farklılaşmasının İncelenmesi

1.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67380

⸱

20 Haziran 2025

 ,  , 
1Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH

Bu makalede

Özet

CD4 T hücre farklılaşmasında gen fonksiyonunu araştırmak için murin naif CD4 T hücrelerinde CRISPR-Cas9 ribonükleoprotein kompleksi aracılı gen ablasyonunu kullanmak için oldukça uyarlanabilir bir yaklaşımın ana hatlarını çiziyoruz.

Özet

Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrar (CRISPR)-Cas9 teknolojisinin yaygın erişilebilirliği, birincil hücrelerde gen hedeflemeyi T hücrelerinde gen fonksiyonunu değerlendirmek için rutin bir yöntem haline getirmiştir. Nakavt (KO) fare suşlarının maliyeti ve sınırlı mevcudiyeti göz önüne alındığında, T hücrelerinde gen fonksiyonunu içeren ön hipotezlerin test edilmesi, gen hedefli hayvan modelleri kullanılarak engelleyici olabilir. Bununla birlikte, araştırmacılar, önceden tasarlanmış kılavuz RNA'lar (gRNA'lar) dahil olmak üzere ticari olarak mevcut kaynakları kullanarak, T hücresi aktivasyonu ve farklılaşma çalışmaları için kullanılabilecek gen hedefli saf T hücrelerini rahatlıkla üretebilirler.

Burada, in vitro olarak CD4 T hücre farklılaşmasında gen fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılabilecek gen KO murin naif CD4 T hücrelerini verimli bir şekilde üretmek için nükleofeksiyonla verilen CRISPR-Cas9 ribonükleoprotein komplekslerini (RNP'ler) kullanmak için bir protokolün ana hatlarını çiziyoruz. Naif CD4 T hücrelerinin fare ikincil lenfoid organlarından izole edilmesi, ardından Cas9-gRNA kompleksleri ile nükleofeksiyon, gen KO'nun aşağı akış T hücresi aktivasyonundan önce başlatılmasını sağlar ve tipik olarak T hücrelerinin ön aktivasyonunu gerektiren retroviral aracılı gRNA dağıtımına göre stratejik bir avantaj sunar. Ayrıca, bu nükleofeksiyon tabanlı yöntem, gen KO hayvanlarıyla ilişkili potansiyel gelişimsel sorunları atlar.

Cas9-gRNA dağıtımını takiben, in vitro polarizasyon kullanarak CD4 T hücresinin Th1, Th2, Th17 ve Treg soylarına farklılaşmasını incelemek için protokolleri açıklıyoruz. Ek olarak, bu protokol, in vitro olarak diğer T hücresi aktivasyon çalışmaları ve in vivo olarak evlat edinici transfer çalışmaları dahil olmak üzere çok sayıda alt uygulama için gen hedefli CD4 veya CD8 T hücrelerinin kullanılmasına uyarlanabilir. CRISPR-Cas9 yöntemlerinin kullanımı, T hücrelerinde gen fonksiyonunu değerlendirme yeteneğimizi kolaylaştırdı ve ilgilenilen birçok genin rutin KO'suna izin vererek, araştırmacıları gen KO hayvanlarını incelemekle ilgili sınırlamalardan kurtardı.

Giriş

Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrar (CRISPR) tabanlı teknolojilerin kullanımı, genomik DNA dizilerini manipüle etme yeteneğimizi dönüştürdü ve sayısız biyolojik sistemde gen fonksiyonunu inceleme yeteneğimizi büyük ölçüde artırdı. CD4 T hücreleri ile ilgili olarak, CRISPR-Cas9 ribonükleoprotein (RNP) komplekslerini kullanan yöntemler ortaya çıkmıştır ve in vitro ve in vivo çalışmalar için kullanılabilecek primer naif T hücrelerinde verimli gen naif çıkarmayı (KO) kolaylaştırmaktadır 1,2,3,4. CD4 T hücresi farklılaşmasını düzenleyen yeni varsayılan genlerin tanımlanması genellikle transkriptomik ve epigenomik analizler tarafından yönlendirilir ve özellikle gen birden fazla dokuyu etkiliyorsa ve koşullu gen hedefli fareler kullanılarak değerlendirme gerektirebilecekse, araştırılması gereken az veya elde edilmesi zor kaynakların olabileceği yeni hedefler oluşturur. gRNA'ların 5,6 retroviral transdüksiyonu yoluyla gen hedefleme, T hücrelerinde gen fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılmıştır, ancak retroviral enfeksiyon için T hücresi aktivasyonu gerektirir ve saf T hücrelerinde genleri hedeflemek için kullanılamaz. Saf T hücrelerinde nükleofeksiyonla verilen CRISPR-Cas9, zaman alıcı ve maliyetli fare modellerine yatırım yapmadan önce ilgilenilen yeni genleri doğrulamak ve sorgulamak için nispeten ucuz ve hızlı bir alternatif araç sunar.

Burada açıklanan protokolümüzde, CRISPR-Cas9 aracılı gen düzenlemesi, nükleofeksiyon yoluyla saf CD4 T hücrelerine iletilen kılavuz RNA (gRNA) molekülleri ile komplekslenmiş rekombinant Cas9 proteini kullanılarak gerçekleştirilir. gRNA, trans-aktive edici bir CRISPR RNA (tracrRNA) ve bir CRISPR RNA (crRNA) olmak üzere iki farklı bileşenden oluşur. İşlevsel olarak, tracrRNA'dan türetilen diziler, gRNA'nın Cas9 ile ilişkilendirilmesini kolaylaştırırken, crRNA dizileri, ilgilenilen hedef DNA bölgeleri için özgüllük içerir. Cas9-gRNA kompleksleri, hedeflenen çift sarmallı DNA (dsDNA) kırılmalarına aracılık eder ve gRNA'lar Cas9 endonükleaz aktivitesinin 7,8 dizi özgüllüğüne aracılık eder. DsDNA'nın Cas9 aracılı bölünmesi, hedef hücrelerde9 homolog olmayan uç birleşmesini takiben indel mutasyonlarının üretilmesi yoluyla gen inaktivasyonuna yol açar. Bu protokolde, naif CD4 T hücrelerinde sağlam KO sağlamak için ilgilenilen genleri hedefleyen çoklu gRNA'ların kullanılmasını öneriyoruz.

Yardımcı CD4 T hücreleri, bağışıklık sistemindeki kilit oyunculardır ve birçok bağışıklık hücresi tipinin işlevini modüle eden çeşitli sitokinlerin üretimi yoluyla bağışıklık tepkilerine rehberlik eder. Spesifik sitokinlerin varlığında T hücresi reseptörü (TCR) yoluyla stimülasyon üzerine, saf CD4 T hücreleri, Th1, Th2, Th17 ve düzenleyici T hücreleri (Treg) dahil olmak üzere T yardımcı (Th) CD4 T hücrelerinin farklı soylarına farklılaşabilir10,11,12. Bu farklı CD4 T hücre soylarını tanımlamak, spesifik soy tanımlayıcı transkripsiyon faktörlerinin (TF'ler) ve sitokinlerin ifadesidir (Şekil 1). CD4 T hücresi farklılaşması, in vitro polarizasyon 13,14,15 kullanılarak, soyu teşvik eden sitokinlerin varlığında TCR yoluyla aktive edilen naif CD4 T hücreleri ve uygun olmayan soy kabulünü önleyen bloke edici antikorlar kullanılarak modellenebilir.

Naif CD4 T hücrelerinde CRISPR-Cas9 gen hedeflemesinin in vitro CD4 T hücre polarizasyonu ile birleştirilmesi, bu hücrelerdeki gen fonksiyonunu değerlendirmek için sağlam bir sistem sunar (Şekil 2). Akış sitometrisi ile CD4 farklılaşmasını değerlendirmek için reaktiflerin yaygın mevcudiyeti göz önüne alındığında, TF ekspresyonu ve sitokin üretimi dahil olmak üzere CD4 T hücresi farklılaşmasının temel yönleri, burada açıklanan protokoller kullanılarak kolayca sorgulanabilir. CD4 T hücre fonksiyonunu düzenleyen yeni genlerin tanımlanması, bu hücreler hakkındaki anlayışımızı geliştirir ve in vitro polarizasyon ile eşleştirilmiş CRISPR-Cas9 yöntemleri, gen KO fare modellerine bağlanmadan önce gen fonksiyonunu değerlendirmek için sağlam bir modalite sunar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Burada açıklanan tüm prosedürler için vahşi tip (WT) C57/BL6J fareler kullandık. Fareler, NIAID (protokol LISB-22E) ve NIH'deki Hayvan Bakımı ve Kullanımı komitelerine (Hayvan Refahı Güvencesi #A-4149-01) uygun olarak spesifik patojen içermeyen (SPF) koşullar altında korundu ve tedavi edildi.

1. Başlamadan önce dikkat edilmesi gerekenler

  1. gRNA reaktiflerinin seçilmesi
    NOT: Bu protokolde kullanılan fare genomunu hedefleyen önceden tasarlanmış gRNA reaktiflerini elde etmek için Malzeme Tablosuna bakın.
    1. İlgilenilen geni arayın (Malzeme Tablosu, İstenen crRNA'lar) ve ilk üç sıradaki önceden tasarlanmış crRNA'ları (2 nmol formatı) seçin. Ek olarak, paralel olarak kullanmak için negatif kontrol crRNA'sı edinin (Malzeme Tablosu).
      NOT: Fonksiyonel gRNA'ların oluşumu, crRNA'nın tracrRNA ile duplekslenmesini gerektirir; bir tracrRNA reaktifi edinin ve bölüm 3'teki adımları izleyin.
    2. Özel hedefli gRNA dizileri tasarlayın.
      NOT: Özel hedefli gRNA dizilerinin tasarımı bu protokolün kapsamı dışındadır, ancak CRISPick (Malzeme Tablosu) gibi halka açık araçlar kullanılarak gerçekleştirilebilir.
  2. Tamponlar, ortam ve ekipman
    NOT: Aksi belirtilmedikçe, soğuk (4 °C) tamponlar ve reaktifler kullanın.
    1. Prosedüre başlamadan önce MACS tamponu, FACS tamponu, %0.5 Triton X-100 tamponu, 1x geçirgenlik tamponu, komple RPMI ortamı ve komple IMDM ortamı (Malzeme Tablosu) hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
    2. Bu işleme başlamadan önce saf CD4 T hücre izolasyonu ve anti-FITC mikroboncuk kitleri (Malzeme Tablosu) edinin.
    3. Nükleofeksiyona başlamadan önce (bölüm 4), 5 mL tam IMDM ortamını önceden ısıtın (37 °C) ve 37 °C'ye ısıtılmış 5 ng/μL'de IL-7 ile desteklenmiş en az 10 mL tam IMDM hazırlayın (Malzeme Tablosu). Nükleofeksiyondan sonra numune başına 125 μL eklemeyi hesaba katmak için önceden ısıtılmış ortamın hacmini gerektiği gibi ayarlayın. Çekirdeklenen hücre sayısına bağlı olarak, IL-7 içeren tam IMDM'nin hacmini gerektiği gibi ayarlayın (bölüm 4).
    4. Antijen sunan hücre (APC) izolasyonuna başlamadan önce, 2 mg mitomisin C şişesine (0.5 mg / mL stok konsantrasyonu) 4 mL steril H2O ekleyerek mitomisin C reaktifini hazırlayın.
      NOT: Tüm adımları bir doku kültürü başlığında gerçekleştirin ve steril aseptik teknikler kullanın.

2. Naif CD4 T hücre izolasyonu

NOT: Naif CD4 T hücreleri, manyetik izolasyon veya hücre sıralama yoluyla izole edilebilir. Manyetik izolasyondan elde edilen saflık tipik olarak %97'dir ve hücre canlılığı çok yüksektir, oysa elektronik sıralama, hücre canlılığı pahasına hücre saflığını artırabilir. Burada açıklanan protokol manyetik izolasyon kullanır ancak her iki senaryoya da uyarlanabilir. LS sütunlarının uygun şekilde hazırlandığından emin olun (Malzeme Tablosu).

  1. Dalak ve lenf düğümlerini (inguinal, brakiyal, eksenel ve servikal) farelerden izole edin (burada kullanılan WT C57BL / 6J fareler).
  2. İşlenen her doku için 5 mL tam RPMI (Malzeme Tablosu) ile 60 mm'lik bir tabağa 70 μm'lik bir elek yerleştirin. Verimi artırmak için lenf düğümlerini ve dalağı farklı tabaklarda işleyin. 3 mL'lik bir şırıngadan bir piston kullanarak dokuları filtreden nazikçe öğütün. Filtreyi 1-3 mL medya ile durulayın ve tek hücreli süspansiyonları 15 mL konik tüplere aktarın.
  3. Gerektiğinde ek lenf düğümleri ve dalak dokuları için adım 2.2'yi tekrarlayın.
  4. Tek hücreli süspansiyonları 500 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  5. Hücreleri aşağıdaki gibi saymaya hazırlanın.
    1. Dalak numuneleri için, süpernatanı aspire edin, hücre peletini 1 mL ACK lizis tamponunda nazikçe yeniden süspanse edin, RT'de 2-5 dakika inkübe edin, ardından 2 mL tam RPMI ekleyin, döndürün, 5 mL tam RPMI'de yeniden süspanse edin ve hücreleri sayın.
    2. Lenf nodu hücreleri için, süpernatanı aspire edin, hücre peletini 5 mL taze tam RPM'de yeniden süspanse edin ve hücreleri sayın.
  6. Naif CD4 izolasyon kitine giriş için, izolasyon için istenen hücre sayısına ulaşmak için splenositleri lenf nodu hücreleriyle karıştırın.
    NOT: Tipik olarak, WT-B6 farelerinden 1 ×10 8 lenf nodu ve dalak hücresi 2-8 × 106 saf CD4 T hücresi verir.
  7. Havuzlanmış dalak ve lenf nodu hücrelerini 500 × g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve hücre peletini üreticinin protokolünde belirtildiği gibi uygun hacimde MACS tamponunda (Malzeme Tablosu) yeniden süspanse edin (saf CD4 T hücre izolasyon kiti).
  8. Naif CD4 + T Hücresi Biyotin Antikor Kokteyli, Anti-Biotin Mikroboncukları ve CD4 Mikroboncukları kullanarak negatif seçim (Malzeme Tablosu) ile saf CD4 T hücrelerini izole etmek için üreticinin protokolünü tam olarak takip edin; bu izolasyon için LS kolonlarını kullanın ve hücreleri 15 mL konik tüplerde toplayın.
  9. İzolasyonu takiben, hücreleri 5 dakika, 4 ° C boyunca 500 × g'da santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın, hücre peletini 2 mL tam RPMI ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri sayın.
  10. Hücreleri, nükleofeksiyona başlamaya hazır olana kadar 4 ° C'de saklayın.

3. Cas9-gRNA kompleksi oluşumu

NOT: Negatif kontrol ve gene özgü crRNA stoklarını hazırlayın. Negatif kontrol koşulları için bir benzersiz crRNA ve gen hedefleme koşulları için üç benzersiz crRNA kullanmayı özetliyoruz. Üç farklı crRNA'nın aynı anda kullanılması, ilgilenilen genlerin KO'sunu sağlar.

  1. crRNA'ları ve tracrRNA'yı dubleks tampon kullanarak 100 μM stok konsantrasyonlarına yeniden süspanse edin (Malzeme Tablosu). Bu, 1 nmol RNA başına 10 μL tampona karşılık gelir.
  2. Tek tek crRNA'ları steril PCR tüplerinde 1:1 oranında tracrRNA ile birleştirin ve pipetleme ile karıştırın. Bir termocycler'da 5 dakika boyunca 95 ° C'ye ısıtın. Ardından, kompleksleri en az 10 dakika boyunca bir tezgah üzerinde RT'ye soğumaya bırakın.
    NOT: crRNA/tracrRNA dupleksleri bu noktadan itibaren gRNA'lar olarak adlandırılır. Kompleksler -20 °C'de saklanırsa en az 6 ay stabildir. Tipik olarak çalışma başına 6 μL gRNA (3 μL crRNA + 3 μL tracrRNA) yaparız ve bu da kabaca beş numune (1 μL/numune) için yeterli malzeme sağlar.
  3. Gen hedefleme gRNA'ları için: Steril PCR tüplerine 3 μL gRNA (hedef başına üç benzersiz gRNA'nın her biri 1 μL), 1 μL Cas9 proteini ve 1 μL Dubleks tampon (numune başına toplam 5 μL) ekleyin. Karıştırmak için nazikçe pipetleyin ve tüm malzemelerin tüpün dibinde olduğundan emin olun. RT'de 10 dakika inkübe edin. Bu adımın zamanlamasını nükleofeksiyon ile senkronize edin (adım 4.1-4.2).
  4. Negatif kontrol gRNA için: Steril PCR tüplerine 1 μL gRNA, 1 μL Cas9 proteini ve 3 μL Dubleks tampon (numune başına toplam 5 μL) ekleyin. Karıştırmak için nazikçe pipetleyin ve tüm malzemelerin tüpün dibinde olduğundan emin olun. RT'de 10 dakika inkübe edin. Yine, bu adımın zamanlamasını nükleofeksiyon ile senkronize edin (adım 4.1-4.2).
    NOT: Negatif kontrol için 50 pmol gRNA kullanılması (test için 3 x 50 pmol'e karşı) daha uygun maliyetlidir ve sonuçlar üzerinde hiçbir etkisi yoktur.

4. Nükleofeksiyon - Cas9-gRNA aracılı gen ablasyonu

  1. 1-8 × 106 saflaştırılmış T hücresini 500 × g'da 5 dakika, nükleofeksiyon numunesi başına 4 ° C'de santrifüjleyin. Mümkün olduğu kadar çok süpernatanı dikkatlice çıkarın.
  2. Hücreleri 20 μL P3 tamponunda (numune başına 16.4 μL P3 + 3.6 μL takviye) yeniden süspanse edin; Nükleofektör Kiti, Malzeme Tablosu) ve süspansiyonu Cas9-gRNA komplekslerini içeren PCR tüplerine aktarın. Karıştırın ve 16 oyuklu bir nükleobüvetin (Nükleokozmetik Kiti, Malzeme Tablosu) bağımsız kuyularına aktarın. Hücreleri küvete aktarırken kabarcıkların oluşmadığından emin olun, çünkü bu nükleofeksiyon verimliliğini olumsuz etkileyebilir. Tüm malzemenin her bir kuyunun dibinde olduğundan ve kabarcık içermediğinden emin olmak için küveti bir çalışma yüzeyine vurun.
  3. Referans alınan nükleofektörün DN100 programını kullanarak nükleofeksiyon gerçekleştirin (Malzeme Tablosu). Hemen 125 μL önceden ısıtılmış tam IMDM ortamını nükleobüv kuyucuklarına ekleyin ve hücreleri 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Tüm hücrelerin toplanmasını sağlamak için her bir kuyuyu 125 μL önceden ısıtılmış ortamla bir kez daha durulayın.
  4. Hücreleri 5 × g'da 5 dakika, 4 ° C santrifüjleyin, tüm ortamı çıkarın ve 200 μL ısıtılmış tam IMDM ortamı + 5 ng / mL IL-7 (Malzeme Tablosu) içinde yeniden süspanse edin.
  5. Hücrelerin 200 μL'sini kültür plakasına aktarın ve plaka boyutuna göre istenen nihai hacmi aşağıdaki gibi yapmak için ısıtılmış tam IMDM ortamı + 5 ng / mL IL-7 ekleyin: 48 oyuklu bir plaka üzerinde oyuk başına 1-2 ×10 6 hücre (oyuk başına 1 mL ortam), 24 oyuklu bir plaka (oyuk başına 1.5 mL ortam) hacminde oyuk başına 2-4 ×10 6 hücre, 12 oyuklu bir plaka (kuyucuk başına 2 mL ortam) üzerinde oyuk başına 4-6 ×10 6 hücre ve 6 oyuklu bir plaka (oyuk başına 4 mL ortam) üzerinde oyuk başına 6-10 ×10 6 hücre. Hücreleri bir inkübatörde 37 ° C'de,% 5 CO2 3 gün boyunca kültürleyin.
    NOT: Protein döngüsüne ve aşağı akış testine bağlı olarak, bu kültür periyodunu optimize edin. 3 günlük optimal bir dinlenme süresi bulduk, ancak bu, bu koşullar kullanılarak hedef gene göre 1 ila 7 gün arasında ayarlanabilir.
  6. Tam IMDM ortamında + 5 ng / mL IL-7'de kültürü takiben, hücreleri pipetleme ile yeniden süspanse edin ve 15 mL konik tüplere hasat edin. Hücreleri 5 × g'da 5 dakika, 4 ° C santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 1 mL tam RPMI ortamında yeniden süspanse edin.
  7. İlgilenilen gRNA çekirdekli hücrelere karşılık gelen canlı saf CD4 T hücrelerinin sayısını belirlemek için hücreleri sayın.
    NOT: Nükleofeksiyon sürecinde, bu protokol süresince giriş hücrelerinin ~% 50'sini kaybetmeyi bekleyin ve kullanılan saf CD4 T hücrelerinin sayısını buna göre ayarlayın. Ayrıca, bu noktada, çeşitli teknikler (akış sitometrisi, western blot, qPCR veya T7EI testi) kullanarak saf CD4 T hücrelerinde gen hedeflemenin etkinliğini test edebilirsiniz.

5. Antijen sunan hücre (APC) izolasyonu

NOT: İzolasyonu takiben APC'leri tedavi etmek için kullanılacak olan mitomisin reaktifinin hazırlandığından emin olun (Malzeme Tablosu). Başlamadan önce üreticinin anti-FITC mikro boncuk protokolünü okuyun ve LS sütunlarının uygun şekilde hazırlandığından emin olun (Malzeme Tablosu).

  1. APC izolasyonu için belirlenmiş WT farelerinden dalakları izole edin.
  2. Yukarıda tarif edildiği gibi tek hücreli süspansiyonlar yapın (2.2, 2.5.1) - ACK lizis tamponu ile eritrositleri parçalayın, hücre peletini 5 mL tam RPMI'de (4 ° C) yeniden süspanse edin ve hücreleri sayın.
    NOT: APC izolasyonunu takiben, giriş hücrelerinin yaklaşık yarısını elde etmeyi bekleyin, örneğin, 1 × 108 giriş splenositleri ~ 40-50 × 106 APC verecektir. İzolasyon için istenen sayıda splenosit hazırlayın.
  3. Hücreleri 5 × g'da 5 dakika, 4 °C santrifüjleyin ve hücre peletini 800 μL MACS tamponunda yeniden süspanse edin (Malzeme Tablosu).
  4. Splenositlere 4 μL FITC konjuge anti-CD4 ve anti-CD8 antikorları (Malzeme Tablosu) ekleyin. İyice karıştırın ve 4 °C'de 15 dakika inkübe edin.
  5. Hücreleri 500 × g'da 5 dakika, 4 °C santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Üreticinin talimatlarını izleyerek, önerilen MACS tamponu hacmindeki hücreleri yeniden askıya alın ve uygun miktarda anti-FITC mikro boncuk ekleyin (Malzeme Tablosu).
  6. Hücreleri 4 ° C'de 15 dakika inkübe edin. Hücreleri 500 × g'da 5 dakika, 4 ° C'de santrifüjleyin. Hücreleri 500 μL MACS tamponunda yeniden süspanse edin ve hücreleri, üreticinin protokolünde açıklandığı gibi hazırlanan LS kolonundan geçirin ve hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın.
  7. Hücreleri 5 dakika, 4 ° C boyunca 600 × g'da santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve hücreleri 2.7 mL steril 1x PBS'de yeniden süspanse edin.
    NOT: APC'ler zayıf bir şekilde peletlenebilir; Santrifüjleme için daha yüksek bir hız kullanın.
  8. 50 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için hücrelere 300 μL mitomisin C çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın ve 37 ° C'de bir su banyosunda 30 dakika veya 37 ° C'de 45 dakika, bir inkübatörde% 5 CO2 inkübatörde inkübe edin.
  9. İnkübasyondan sonra, hücreleri 600 × g'da 5 dakika, 4 ° C santrifüjleyin ve 10 mL steril 1x PBS ile yıkayın. Mümkün olduğu kadar çok süpernatanı çıkarmak için vakum kullanın. Yıkamayı 2 kez tekrarlayın.
  10. Hücreleri 5 dakika, 4 ° C boyunca 600 × g'da tekrar santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 5 mL tam RPMI ortamında (4 ° C) yeniden süspanse edin. Hücreleri sayın. CD4 T hücre farklılaşmasını gerçekleştirmeye hazır olana kadar APC'leri 4 °C'de saklayın.

6. CD4 T hücresi farklılaşması

NOT: Bu protokol, 48 oyuklu plaka formatı-2 × 105 saf CD4 + 1 × 106 APC kuyucuk başına 1:5 oranında hücre kültürüne ayarlanmıştır. Hücreler tam IMDM ortamında kültürlenir. Burada, Th1, Th2, Th17 ve Treg CD4 T hücrelerinin farklılaşması için koşullar sağlayacağız; Bununla birlikte, kullanıcının odağına bağlı olarak bireysel köken koşulları seçilebilir.

  1. Kullanılacak 48 oyuklu bir plakadaki hücre sayısını belirleyin ve her hücre tipi için gereken hücre sayısını hesaplayın.
    NOT: Örneğin, 10 kuyu, 1:5 oranını korumak için 2 × 106 saf CD4 ve 10 ×10 6 APC gerektirecektir. Hücre sayıları izin veriyorsa, kaplama sırasında herhangi bir pipetleme hatasını hesaba katmak için ek bir kuyucuk için yeterli hücreyi hesaplayın.
  2. İstenilen sayıda saf CD4 ve APC'yi 1: 5'te karıştırın, hücreleri 5 dakika, 4 ° C boyunca 600 × g'da santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve hücre peletini oyuk başına 500 μL tam IMDM ortamında yeniden süspanse edin (ör., 5 mL ortamda 10 oyuğa karşılık gelen hücreler).
  3. Plaka 500 μL'lik artışlarla 48 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına hücreler, her kuyucuğun 2 × 105 saf CD4 + 1 × 106 APC içerdiğinden emin olun.
  4. İstenen CD4 T hücresi farklılaşma koşulları için, Tablo 1'de tarif edildiği gibi tam IMDM'de 2x sitokin + antikor karışımları hazırlayın. Reaktiflerin nihai konsantrasyonlarını 1x yapmak için önceden kaplanmış 500 μL'lik hücre artışlarına 500 μL 2x karışımı ekleyin.
    NOT: Bu örnekler, her koşul için beş kuyu için yeterli olan 2,5 mL 2x preparat yapılmasına dayanmaktadır. Yine, reaktif miktarları izin veriyorsa, pipetleme hatasını hesaba katmak için karışımda 2 katlık ek bir artış yapın.
  5. 1x'te nihai bir reaktif konsantrasyonu oluşturmak için 500 μL CD4 / APC hücreleri içeren kuyucuklara 500 μL 2x sitokin + antikor ortamı ekleyin.
  6. 48 oyuklu plakayı% 5 CO2 ile 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin. CD4 polarizasyonunun tamamlanmasını sağlamak için hücreleri 72 saat boyunca kültürleyin.
    NOT: Sağlam bir büyüme sağlamak için kültür periyodundan sonra plakayı inceleyin. Besiyeri, inkübasyondan sonra turuncu bir renk olmalıdır ve sarı besiyeri, potansiyel hücre büyümesini gösterir.

7. CD4 T hücre farklılaşmasında gen ablasyonunun etkisinin değerlendirilmesi

NOT: Tüm boyama adımları için, gerekli boyama tamponuna uygun seyreltmede eklenen bir ana antikor karışımı hazırlayın. Numune başına 50 μL hacimde antikor/tampon kokteyli kullanılır. Deneye dayalı olarak kullanılan spesifik antikorları ayarlayın. Kullanıcılar, kendi özel deneyleriyle ilgili antikor panellerini seçmelidir; Burada, burada hedeflenen genler bağlamında buna yaklaşmak için bir şablon sunuyoruz.

  1. CD4 farklılaşmasını takiben, süpernatanın 600 μL'sini dikkatlice çıkarın, ardından pipetleme ile her bir oyuktaki hücreleri yeniden süspanse edin.
  2. Her bir oyuktan 200 μL hücre çıkarın ve bunları transkripsiyon faktörü boyama için etiketli 96 oyuklu bir plakaya ekleyin. Numuneleri 500 × g'da 4 °C'de 5 dakika döndürerek peletleyin, süpernatanı hafifçe vurun ve yüzey boyamaya devam edin (adım 7.5).
  3. Sitokin analizi için, kalan 200 μL hücreyi PMA (50 ng / mL), İyonomisin (500 ng / mL) ve Golgi Stop (1 / 2.000 seyreltme) ile tam IMDM'de yeniden uyarın. Her bir oyuğa 200 μL 2x restimüle karışımı ekleyin ve 37 ° C'de,% 5 CO2 4 saat boyunca inkübe edin.
    NOT: 48 oyuklu plakada 200 μL kalmalıdır; bu nedenle, 2x, 100 ng/mL), İyonomisin (2x, 1 μg/mL) ve Golgi Stop (2x, 1/1,000) karışımının 200 μL'sinin eklenmesi, 1x'lik bir nihai konsantrasyon oluşturacaktır (Malzeme Tablosu).
  4. Bu arada, transkripsiyon faktörü boyamaya başlayın. Hücreleri, numune başına istenen florokrom-konjuge antikorları içeren 50 μL FACS tamponunda yeniden süspanse ederek yüzey antijen boyaması gerçekleştirin (Tablo 2). Karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.
  5. Boyama tamponunu yıkamak için her bir oyuğa 150 μL FACS tamponu ekleyin. Plakayı 500 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı hafifçe vurun. Toplam iki yıkama için tekrarlayın.
  6. Hücreleri 100 μL Foxp3 fiksasyon solüsyonu (Malzeme Tablosu) ile karanlıkta RT'de 25 dakika sabitleyin.
  7. 25 dakika sonra, fiksatifi yıkamak için her bir oyuğa 100 μL FACS tamponu ekleyin. Plakayı 500 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı hafifçe vurun. Toplam iki yıkama için tekrarlayın.
  8. Hücreleri, karanlıkta 4 ° C'de en az 1 saat boyunca, numune başına doğrudan konjuge transkripsiyon faktörüne özgü antikorlar içeren 50 μL 1x Foxp3 geçirgenlik tamponunda (Tablo 2) yeniden süspanse ederek hücre içi boyama gerçekleştirin.
  9. Hücre içi boyama tamamlandıktan sonra, her oyuğa 100 μL FACS tamponu ekleyin. Plakayı 500 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı hafifçe vurun. Toplam iki yıkama için tekrarlayın. Akış sitometrisi için hücreleri 200 mL'lik bir son hacimde yeniden süspanse edin.
  10. PMA / iyonomisin / Golgi Stop restimulasyonundan sonra, hücreleri pipetleme ile yeniden süspanse edin ve her sitokin örneğinin 400 μL'sini 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Numuneleri 500 × g'da 4 °C'de 5 dakika boyunca pellet yapın ve süpernatanı çıkarın. Hücre örneklerini 100 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve yüzey boyama için 96 oyuklu bir plakaya aktarın. 500 × g'da 4 °C'de 5 dakika döndürerek numuneleri tekrar peletleyin, süpernatanı hafifçe vurun.
  11. Yüzey antijenlerine karşı yönlendirilmiş floresan antikorlar içeren FACS tamponu ile bir yüzey boyama kokteyli hazırlayın (Tablo 2). Hücreleri numune başına 50 μL boyama tamponunda yeniden süspanse edin ve karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
  12. Boyama tamponunu yıkamak için her bir oyuğa 150 μL FACS tamponu ekleyin. Plakayı 500 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı hafifçe vurun. Toplam iki yıkama için tekrarlayın.
  13. Hücreleri 100 μL% 4 PFA'da (Malzeme Tablosu) karanlıkta RT'de 25 dakika sabitleyin.
  14. Fiksatifi yıkamak için her kuyucuğa 100 μL FACS tamponu ekleyin. Plakayı 500 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı hafifçe vurun. Toplam iki yıkama için tekrarlayın.
  15. Hücreleri karanlıkta 4 ° C'de en az 1 saat boyunca numune başına% 0.5 Triton X-100 boyama tamponu içeren 50 μL anti-sitokin antikoru içinde yeniden süspanse ederek hücre içi sitokin boyama gerçekleştirin (Tablo 2).
  16. Hücre içi boyama tamamlandıktan sonra, her oyuğa 100 μL FACS tamponu ekleyin. Plakayı 500 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı hafifçe vurun. Toplam iki yıkama için tekrarlayın. Akış sitometrisi için hücreleri 200 mL'lik bir son hacimde yeniden süspanse edin.
  17. Transkripsiyon faktörünü ve sitokin lekeli numuneleri akış sitometrisi ile analiz edin.
    NOT: Ana hatlarıyla belirtilen boyama panellerinden beklenen akış sitometrisi profilleri, temsili sonuçlar bölümünde gösterilecektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Protokolümüz (Bölüm 2) kullanılarak saf bir saf CD4 T hücresi popülasyonunun elde edildiğini doğrulamak için, bu hücreleri manyetik izolasyondan önce ve sonra tanımlamak için akış sitometrisi kullandık. Yaklaşımımızı kullanarak, izolasyonu takiben oldukça saf bir canlı CD4 + TCRb + CD25-CD44-CD62L + naif CD4 T hücresi popülasyonu elde ettik (Şekil 3A). Ayrıca, Cas9-gRNA komplekslerinin naif CD4 T hücrelerine başarılı bir...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

CRISPR-Cas9 komplekslerini saf CD4 T hücrelerine iletmek için protokollerin CD4 T hücre farklılaşmasını incelemek için yöntemlerle entegre edilmesi, CD4 T hücre biyolojisini düzenleyen yeni genleri keşfetmek için sağlam bir araç sağlar. Burada, üzerinde çalışılması kolay, ticari olarak temin edilebilen Cas9 ve gRNA reaktiflerini kullanmak için kapsamlı bir kılavuz sunuyoruz. Cas9-gRNA komplekslerinin naif CD4 T hücrelerine nükleofeksiyon aracılı verilmesi, ilgilenilen genlerin neredeyse ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu araştırma, NIAID, NIH Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0,5 M EDTA, pH = 8,0IPM Scientific11005-016
%16 Paraformaldehit, PFAElektron Mikroskobu Bilimleri15710%4 PFA fiksatif solüsyon yapmak için PBS ile seyreltin
1x eBioscience Tamponu (1x Geçirgenleştirme tamponu)Thermo Fisher Scientific00-5523-001x çözelti yapmak için kitten geçirgenleştirme tamponu kullanın
1x PBS, pH = 7.4Kalite Biyolojik114-058-101
2-merkaptoetanol (1000x)Gibco21985-023
4D Nükleofektör Çekirdek ÜnitesiLonzaAAF-1003B
4D Nükleofektör X ÜnitesiLonzaAAF-1003X
60 mm çanakFalcon353002
70 & mikro; m naylon örgü süzgeçFisherbrand22363548
ACK Lizing TamponuGibcoA10492-01
Amaxa P3 Birincil Hücre 4D-Nükleofektör X KitiLonzaV4XP-3032Bu kit şunları içerir: P3 Birincil Hücre Çözeltisi, Ek 1 ve 16 oyuklu nükleosite şeritleri
anti-FITC mikro boncuklarMiltenyi Biotec130-048-701Miltenyi Anti-FITC Mikro Boncuk Protokolünü Takip Edin
anti-fare CD28 (37.51)bioXcellBE0015-1stok konsantrasyonu için Tablo 1'e bakın
anti-fare CD3e (145-2C11)bioXcellBE0001-1stok konsantrasyonu için Tablo 1'e bakın
, anti-fare IFN&gama; (XMG1.2)bioXcellBE0055stok konsantrasyonu için Tablo 1'e bakın
anti-fare IL-12p40 (C17.8)bioXcellBE0051stok konsantrasyonu için Tablo 1'e bakın
anti-fare IL-4 (11B11)bioXcellBE0045stok konsantrasyonu için Tablo 1'e bakın
BioLite 48 kuyulu ÇokThermo Fisher Scientific130187
Sığır Serum Albümini, BSASigma Life BilimA3059
Cas9 enzimiIDT1081059Alt-R Sp Cas9 Nükleaz V3 (10mg / mL) - nükleer lokalizasyon dizisi içerir
Komple IMDM + IL-7 Ortamı5 ng / mL IL-7 ile
IMDM Komple IMDM OrtamıIMDM + GlutMAX, %10 FBS, %1 L-Glutamin, %1 Pen/Strep, %0.1 BME
Komple RPMI OrtamıRPMI-1640, %10 FBS, %1 L-Glutamin, %1 Kalem/Strep, %0.1
BME CRISPick
https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public İstenilen crRNA'lar IDT IDTweb sitesinden önceden tasarlanmış olarak kullanılır: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_PREDESIGN  
eBioscience FOXP3/Transkripsiyon Faktörü Boyama Tampon SetiThermo Fisher Scientific00-5523-00Kit üç reaktif içerir: Fiksasyon/Geçirgenleştirme Konsantresi (4x), Fiksasyon/Geçirgenleştirme Seyreltici ve Geçirgenleştirme Tamponu (10x)
FACS Tamponu1x PBS, %1 FBS, 1 mM EDTA
Fetal Sığır Serumu (FBS)VWR Seradigm Yaşam Bilimleri97068-085Kullanmadan önce ısıyı etkisiz hale getirin (56 ° C'ye kadar ısıtın; 45 dakika boyunca C)
FITC anti-fare CD4 (RM4-5)Biolegend1005101/200 seyreltme (0.5 mg / mL stok konsantrasyonu)
FITC anti-fare CD8 ve alfa; (53-6.7)Biolegend1007061/200 seyreltme (0.5 mg/mL stok konsantrasyonu)
Golgi StopBD Biosciences51-2092KZ1/2000 seyreltme
IMDM (1x) + GlutMAX-1 MediaGibco31980-030
Streptomyces conglobatus'tan iyonomisin kalsiyum tuzu (1 mg/mL)Sigma Aldrich10634Önerilen nihai konsantrasyon 500 ng/mL
L-Glutamin 200 mM (100x)Gibco25030-081
LS sütunlarıMiltenyi Biotec130-042-401
MACS Tamponu1x PBS,% 0.5 BSA, 1 mM EDTA, filtre sterilize
Mitomisin C (0.5 mg / mL)Millipore SigmaM4287-2MG ve nbsp;
Fare Naï ve CD4 T Hücre İzolasyon KitiMiltenyi Biotec130-104-453Miltenyi Naï'u takip edin; ve CD4 T Hücre İzolasyon Protokolü. Bu kit Naï içerir; ve CD4+ T Hücresi Biotin Antikor Kokteyli, Anti-Biotin Mikroboncuklar ve CD44 Mikroboncuklar
Negatif kontrol crRNAIDT1072544kendi negatif kontrol tasarımına alternatif
Nükleaz İçermeyen Dubleks TamponIDT1072570
PCR tüp şeritleriABD Bilimsel1402-2700
Penisilin StreptomisinGibco15140-023
Phorbol 12-miristat 13-asetat, PMA (100 & mikro; g/mL)Sigma AldrichP8139Önerilen nihai konsantrasyon 50 ng/mL
ProSeries Yüksek Performanslı 15 mL Santrifüj TüpleriAlkali ScientificPS560015 mL konik tüpler
rekombinant insan (h) IL-2Peprotech200-02stok konsantrasyonu için Tablo 1'e bakın
rekombinant insan TGF-b1 (HEK293 türevi)Peprotech100-21stok için Tablo 1'e bakınız konsantrasyon
rekombinant murin IL-12p70Peprotech210-12stok konsantrasyonu için Tablo 1'e bakın
rekombinant murin IL-4Peprotech214-14stok konsantrasyonu için Tablo 1'e bakın
rekombinant murin IL-6Peprotech216-16stok konsantrasyonu için Tablo 1'e bakın
REKOMBINANTIL-7217-17100 ng/mL'de hazırlayın
RPMI 1640 MedyaGibco21870-076
Termal DöngüleyiciUygulamalı Biyosistemler4375786Bu termocycler modelini kullanıyoruz, ancak benzer herhangi bir ekipman bu protokolde iyi çalışacaktır
tracrRNA Atto550 etiketli IDT1075928Okuma olarak Atto550 floresan kullanılarak nükleoefasyondan sonra Cas9-gRNA komplekslerinin saptanmasına izin verir. Mümkünse bu reaktifi öneriyoruz. 
Triton-X Tampon1x PBS, %0,5 TritonX-100, %0,1 BSA
TritonX-100BioRad161-0407
etiketsiz tracrRNA IDT1072534daha uygun maliyetli bir tracrRNA seçeneğidir, ancak Cas9-gRNA komplekslerinin çekirdek elevoskop verimliliğinin değerlendirilmesine izin vermez
Veriti Thermal Cycler, 96 kuyulu FastThermo Fisher Scientific4375305Bu termosikleyici modelini kullanıyoruz, ancak benzer herhangi bir ekipman bu protokolde iyi çalışacaktır
, ; Yönlü Komple Peprotech

Kaynaklar

  1. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. J Exp Med. 215 (3), 985-997 (2018).
  2. Nussing, S., et al. Efficient CRISPR/Cas9 gene editing in uncultured naive mouse T cells for in vivo studies. J Immunol. 204 (8), 2308-2315 (2020).
  3. Albanese, M., et al. efficient and activation-neutral gene editing of polyclonal primary human resting CD4+ T cells allows complex functional analyses. Nat Methods. 19 (1), 81-89 (2022).
  4. Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein transfection for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Curr Protoc Immunol. 124 (1), e69(2019).
  5. Huang, B., Johansen, K. H., Schwartzberg, P. L. Efficient CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis in primary murine T lymphocytes. Curr Protoc Immunol. 124 (1), e62(2019).
  6. Huang, B., et al. In vivo CRISPR screens reveal a HIF-1α-mTOR network regulates T follicular helper versus Th1 cells. Nat Commun. 13 (1), 805(2022).
  7. Asmamaw, M., Zawdie, B. Mechanism and applications of CRISPR/Cas-9-mediated genome editing. Biologics. 15, 353-361 (2021).
  8. Li, T., et al. CRISPR/Cas9 therapeutics: progress and prospects. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 36(2023).
  9. Yang, H., et al. Methods favoring homology-directed repair choice in response to CRISPR/Cas9-induced double-strand breaks. Int J Mol Sci. 21 (18), (2020).
  10. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annu Rev Immunol. 28, 445-489 (2010).
  11. Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., Xia, B. CD4+ T cells: differentiation and functions. Clin Dev Immunol. 2012, 925135(2012).
  12. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  13. Rumble, J., Segal, B. M. In vitro polarization of T-helper cells. Methods Mol Biol. 1193, 105-113 (2014).
  14. Yang, W., Chen, X., Hu, H. CD4(+) T-cell differentiation in vitro. Methods Mol Biol. 2111, 91-99 (2020).
  15. Wang, W., Ai, X. Primary culture of immature, naive mouse CD4+ T cells. STAR Protoc. 2 (3), 100756(2021).
  16. Hsieh, C. S., et al. Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages. Science. 260 (5107), 547-549 (1993).
  17. Szabo, S. J., et al. A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100 (6), 655-669 (2000).
  18. Zhang, D. H., Cohn, L., Ray, P., Bottomly, K., Ray, A. Transcription factor GATA-3 is differentially expressed in murine Th1 and Th2 cells and controls Th2-specific expression of the interleukin-5 gene. J Biol Chem. 272 (34), 21597-21603 (1997).
  19. Zheng, W., Flavell, R. A. The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells. Cell. 89 (4), 587-596 (1997).
  20. Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
  21. Wan, Y. Y., Flavell, R. A. Regulatory T-cell functions are subverted and converted owing to attenuated Foxp3 expression. Nature. 445 (7129), 766-770 (2007).
  22. Williams, L. M., Rudensky, A. Y. Maintenance of the Foxp3-dependent developmental program in mature regulatory T cells requires continued expression of Foxp3. Nat Immunol. 8 (3), 277-284 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

CRISPR Cas9 Gen AblasyonuT H cresi AktivasyonuNaif T H cresi zolasyonuNukleofeksiyona Dayal Aktar mGen Nakavt Farelern Vitro PolarizasyonTh1 Th2 Th17 TregAdaptif Transfer al malar
Video yakında

İlgili makaleler