Kronik yaraları tedavi etmek için önemli çabalara rağmen, başarı sınırlı kalmıştır. Normal iyileşmeyi bozan ve kronik yaraların başlamasına ve gelişmesine katkıda bulunan hücresel ve moleküler süreçler iyi anlaşılmamıştır. Sonuç olarak, bu yaralar için etkili tedaviler geliştirmenin zor olduğu kanıtlanmıştır. Bunun başlıca nedeni, insanlarda kronik yaraları taklit eden hayvan modellerinin olmaması ve kronik yaraları olan insanlarda yapılan deneylerin sınırlı olmasıdır. Daha önce, insanlarda diyabetik kronik yaralarla birçok özelliği paylaşan kronik yaraları incelemek için bir fare modeli yayınlamıştık. Bu model, deri mikrobiyotasında ve çevrede bulunan bakterilerden doğal olarak oluşan biyofilmlerin, yaralara dışarıdan bakteri sokulmasına gerek kalmadan varlığını içerir. Bu nedenle, bu model, yaraların nasıl kronikleştiğine dair temel anlayışı potansiyel olarak ilerletebilir. Burada, bu fare modelini geliştirmek için orijinal protokole bir güncelleme sunuyoruz. Farelerin ölüm oranını ~% 30'dan ~% 5'e düşürmeye odaklandık. Ayrıca, bu modelin, yeni nesil transkriptomik yaklaşımlar kullanarak, enfeksiyon ve biyofilm gelişimi sırasında bakteri popülasyon dinamiklerini açıklayarak ve küçük moleküller de dahil olmak üzere tedavilerin etkinliğini test etmenin değerini göstererek yara kronikliğinin başlangıcını ve ilerlemesini anlamak için nasıl kullanıldığını da açıklıyoruz. Şimdiye kadar, müdahale edilmeden iyileşmeyen tek kronik yara modeli budur.
Yöntem makalesi
Diyabetik farelerde kronik yaralar oluşturma protokolü - yayınlanan protokolde bir güncelleme
Bu makalede
Özet
Giriş
Bu, mevcut bir makaleye yönelik bir güncelleştirmedir. Orijinal halini görmek için lütfen tıklayınız.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
GÜNCELLEŞTİRME:
Bu, daha önce sunulan protokol için bir güncellemedir1
Tüm deneyler federal düzenlemelere uygun olarak tamamlandı ve Kaliforniya Üniversitesi politika ve prosedürleri Kaliforniya Üniversitesi, Riverside IACUC tarafından onaylandı.
1. Hayvan
Adım 1.1'e aşağıdaki notu ekleyin:
NOT: Homozigot diyabetik fareler doğrudan tedarikçilerden satın alınırsa, cildin normal cilt florası ile kolonizasyonuna izin vermek için fareleri geleneksel bir vivaryumda barındırın. Hem erkekler hem de dişiler kullanılabilir.
Adım 1.3'ten sonra aşağıdaki Bölümü ekleyin:
1.4.Genotipleme yapın
NOT: Hayvanı ürettikten sonra daha önce adım 1.31'e kadar açıklandığı gibi genotipleme yapın. Aşağıdaki protokol daha önce yayınlanmış bir prosedürdendeğiştirilmiştir 2. Hem erkek hem de dişi fareler, sütten kesilirken 14-21 gün gibi erken bir sürede genotiplendirilebilir.
1.4.1. Ham DNA ekstraksiyonu
1.4.1.1. Fareden kulak yumruğu biyopsisi alın ve doku örneğini bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
1.4.1.2. 180 μL 50 mM NaOH ekleyin, numunenin suya daldırıldığından emin olun.
1.4.1.3. Numuneyi 95 °C'de 10 dakika inkübe edin, tüpü her 5 dakikada bir basınçsız hale getirin ve girdaplayın.
1.4.1.4. Numuneyi buz üzerinde en az 1 dakika soğutun.
1.4.1.5. pH 8.0'da 20 μL 1 M Tris HCl ekleyin ve girdap yapın.
1.4.1.6. Numuneleri kullanana kadar -20 °C'de saklayın.
1.4.2. Polimeraz zincir reaksiyonu
1.4.2.1 Aşağıdaki astar karışımını bir mikrosantrifüj tüpüne monte edin (Primer Tablosu).
NOT: Primerler, LepR'nin nokta mutasyonu etrafındaki bölgeyi yükseltir.
1.4.2.2. PCR tüplerinde 20 μL polimeraz zincir reaksiyonu ayarlayın. 10 μL 2x Taq polimeraz ana karışımı ( Taq DNA Polimeraz, dNTP'ler, MgCl2 ve KCI içerir), 1 μL primer karışımı ( Primer Tablosuna bakınız), 4 μL ham DNA özü ve 5 μL H2O ekleyin.
1.4.2.3. Termodöngü parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: 94 dakika boyunca 2 °C; 30 sn boyunca 97 °C, 45 sn için 52 °C ve 45 sn boyunca 72 °C'de 40 döngü; ardından 2 dakika boyunca 72 °C ve sonsuz tutuş için 10 °C.
1.4.2.4. PCR tamamlandıktan sonra, PCR ürünlerine 4 μL 6x DNA Yükleme Boyası ekleyin ve %2'lik bir agaroz jel üzerinde ayırın (Şekil 1).
NOT: Her PCR reaksiyonu 3 PCR ürünü üretir: 610 bp ortak ürün, 406 bp mutant T alel ürünü ve 264 bp vahşi tip G aleli. Yabani tip genotip 610 bp ve 264 bp ürünlerinden oluşur, heterozigot genotip her üç üründen oluşur ve db/db genotip 610 bp ve 406 bp ürünlerinden oluşur.
2. Vivarium ve hayvancılık
Adım 2.1'i aşağıdaki adımla ve notla değiştirin:
2.1 Bir mikrofloranın db/db farelerin derisine yerleşebilmesi için db/ db fareleri konvansiyonel bir vivaryumda (bariyer/spesifik patojen içermeyen bir tesis değil) barındırın. Kronik yaralardan muzdarip insanları spesifik olarak modellemek için, fare ortamında bulunan doğal patojenlere maruz kalmayı önlemek için özel önlemler almayın, çünkü çalışmanın temel patojenleri daha katı vivaryum temiz koşullarıyla kaybolabilir.
NOT: Bu fareler çok büyük ve diyabetik olduklarından, kronik yara deneyleri için kullanmadan önce kafes başına 3 db / db'ye kadar fareyi barındırmak en iyisidir.
3. Kronik yaraların gelişimi için gereklilikler
Adım 3.2'den sonra aşağıdaki adımı ekleyin
3.3. Yara dokusunun kurumasını önlemek için yarayı her zaman şeffaf film sargısı ile kapalı tutun.
5. Reaktif Kurulumu
5.2'den sonra aşağıdaki notu ekleyin
NOT: Yalnızca Malzeme Tablosunda listelenen şirketin ATZ'sini kullanın. Diğer şirketlerden ATZ bu modelle uyumlu değildir ve ölüm oranını artıracaktır.
6. Ameliyat
6.1. Tedavi ve anestezi
NOT: Güncellenmiş bir anestezi rejimi aşağıda açıklanmıştır.
6.1.5. Açık bir sistemde, anesteziyi indüklemek için fareye bir akış hızında (2-3.5 L / dak) O2 ile verilen% 5 izofluran uygulayın. Farenin durumunu sürekli olarak izleyin.
NOT: Fare bilinçsiz olduğunda veya artık hareket etmediğinde, onu beyaz bir cerrahi ped üzerine yerleştirin ve ameliyat sırasında sürekli izofluran uygulanmasına izin vermek için buharlaştırıcıya sabitlenmiş bir burun konisi ile kafaya yerleştirin.
6.1.6. Açık bir sistemde, ameliyat sırasında aynı akış hızında% 1 izofluran uygulayın ve anestezi derinliğini korumak için izofluran akışını ayarlayın.
6.3. Yaralama
6.3.5. İşlemin sonunda fareye% 1 izofluran uygulanmasını durdurun.
7. Ameliyat sonrası tedavi ve iyileşme
Orijinal protokoldeki Adım 7.1'i aşağıdaki adımla değiştirin ve not edin:
7.1. Ameliyattan hemen sonra şeffaf film sargısını uyguladıktan sonra, bir insülin şırıngası kullanarak, şeffaf film sargısına iğne ile nüfuz ederek farenin sırtında oluşturulan yaranın üstüne topikal olarak MSA biriktirin. Ameliyattan sonra 10 dakika içinde steril PBS solüsyonunda 150 mg / kg MSA kullanın. Bu konsantrasyon, daha önce açıklandığı gibi kapsamlı bir literatür taramasından sonra belirlenmiştir 3,4.
NOT: MSA, sürekli çalkalanmazsa çökelme eğilimindedir. Hesaplanan dozu fareye vermek için yaraya uygulamadan önce MSA'nın çözelti içinde tamamen çözüldüğünden emin olun.
Özgün protokoldeki 7.4 adımını aşağıdaki adımla değiştirin:
7.4. Ameliyattan 6 saat sonra ikinci doz Buprenex uygulayın. Ardından, fareleri ilk 48 saat boyunca yerel IACUC kurallarına göre periyodik olarak dozlayın.
NOT: Bu fare modelinde deri altına uygulanması gereken analjeziklerin uzun süreli salimli formülasyonlarının kullanılması önerilmez. Lipide bağlı buprenorfin, orta zincirli yağ asidi trigliserit (MCT) yağında süspanse edilebilir. MCT yağının etkisi çok genç db / db farelerde test edilmiş olsa da, MCT'nin yaşlı veya geriatrik obez db / db fareler üzerindeki etkileri test edilmemiştir 5,6. Farelerin ağırlığı göz önüne alındığında, yaranın yakınına deri altına enjekte edilen büyük miktarlarda analjezikler, yara iyileşmesinin ve kronik yara başlangıcı ve gelişiminin hücresel ve moleküler süreçlerini önemli ölçüde etkileyebilir. Ayrıca, bu ağrı kesici bu farelerde yüksek yağ seviyelerinde çözülür ve bu nedenle ağrıyı öldürmede etkili olmayabilir ve toksik hale gelebilir.
8. Veri toplama, yaralamadan sonra farelerin ele alınması, hayatta kalma stratejileri ve ek ipuçları
8.1 Veri toplama
Adım 8.1.3'ten sonra aşağıdaki adımları ekleyin.
8.1.4. Analiz için toplanan dokunun hem kontrol hem de kronik yaralarda sadece yara kenarından 2 mm uzakta olan dokuyu içermesi gerektiğinden emin olun. Yaralar, MSA'nın uygulanmasından 1-2 saat sonra eksizyon ile toplanabilir.
8.1.5. Şeffaf film sargısını delerek steril bir şırınga ile yaradan veya yara eksüdasından biriken fazla sıvıyı toplayın. Bakteriyel çalışmalar için -20 °C'de veya kimya ve moleküler çalışmalar için -80 °C'de saklayın.
8.1.6 Biyofilm de dahil olmak üzere tüm yara dokularını toplamak için, 10 gün sonra, forseps ve makasla eksize etmeden önce yaraya topikal olarak 10 dakika boyunca PBS'de% 4 PFA uygulayın. Dokuyu çıkarırken, yara dokusunun ek normal doku ile desteklenmesi için 5-10 mm'lik ek bir yara marjı ekleyin. PBS'de% 4 PFA'da fiksasyona devam edin ve ardından yıkamalar ve gömme için hazırlık.
NOT: Ameliyattan 10 gün sonra kronik yaralar histoloji için toplanamayacak kadar kırılgan hale gelebilir.
8.5. Hayatta kalma stratejileri
8.5.1. Ekstra hidrasyon desteği sağlayın: Farelerin uyuşuk hale gelip gelmediğini ve aktif olarak yemek yiyip içmediğini kontrol edin, çünkü ameliyat ve kroniklik oluşumu streslidir. Ameliyattan sonraki ilk 48-72 saat boyunca 10 g vücut ağırlığı başına 0.25 mL hacimde deri altına veya intraperitoneal olarak ılık (35-38 ° C) salin uygulayın. Farelerin ne kadar uyuşuk olduğuna bağlı olarak günde 2-3 defaya kadar hidrasyon desteğine ihtiyaç duyulabilir. Ayrıca, daha sık kafes değişimi gerekebilse de, kolay erişim için yatak takımlarına yiyecek peletleri ve su jelleri yerleştirilebilir.
8.5.2. Ekstra sıcaklık desteği sağlayın: Fareler ameliyattan hemen sonra ve vivaryumda iken sirkülasyon suyu (93 oC) ile ısıtılan bir ped üzerindeki kafeslere yerleştirilirse ameliyat sonrası sağkalım önemli ölçüde artar. Hayvanın çok ısınırsa sıcaktan uzaklaşmasını ve üşürse yastığın üzerine geçmesini sağlamak için kafesi pedin 1/2 üzerine ve 1/2 dışına yerleştirin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1: Damızlıklar oluşturmak için heterozigotları tanımlamak için genotipleme. Örnek bir jel, 8 bilinmeyen fare örneğinin sonuçlarını göstermektedir. Örnek 2 ve 5, 3 bant (610 bp, 406 bp ve 264 bp) içerdikleri için heterozigotlardır. 1, 3, 4, 6, 7 ve 8 numaralı numuneler, sadece 2 bant (610 bp ve 264 bp) içerdikleri için vahşi türlerdir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu kronik yara modelini kullanan bulgular:
Bu model, kronik yara başlangıcı ve ilerlemesinin hücre ve moleküler mekanizmalarını anlamak amacıyla çeşitli çalışmalar yapmak için kullanılmıştır. Antioksidan enzimleri inhibe ederek, db / db farelerde kronik yaralar oluşturulabileceği gösterilmiştir. Yaralar başlangıçta, zamanla spesifik biyofilm oluşturan bakteriler için seçilen bir polimikrobiyal topluluk içeriyordu. Kroniklik, farelere...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1 mm kulak yumruğu | Fisherbrand | 13812201 | 2 mm delik çapı |
| 3-Amino-1,2,4-triazol (ATZ) | TCI | A0432 | |
| %70 etanol | |||
| Acu Punch 7mm cilt biyopsisi yumrukları | Acuderm Inc. | P750 | |
| agaroz | |||
| B6. BKS(D)-Leprdb/J | Jackson Laboratuvarı | 00697 | Homozigotlar ve heterozigotlar mevcut |
| Buprenex (buprenorfin HCl) | Henry Stein Hayvan Sağlığı | 059122 | 0.3 mg / ml, Sınıf 3 |
| Jel Yükleme Boyası, Mor (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
| Yatıştırıcı Aloe ve Lanolin | Nair | içeren | |
| Isı Terapisi (su) Pompası HTP-1500 | Adroit MedicalSystems | ||
| Isıtma yastığı | Conair | Nemli Kuru Isıtma Yastığı | |
| Hortum Adaptörleri | Adroit MedicalSystems | ||
| İnsülin şırıngaları | BD | 329461 | 0,35 mm (28G) x 12,7 mm (1/2 "") |
| İzofluran | Henry Schein Hayvan Sağlığı | 029405 | NDC 11695-6776-2 |
| İzofluran buharlaştırıcı | JA Baulch & İştirakler | ||
| Kimwipes | |||
| Maxi-Therm Hiper-Hipotermi Battaniyesi | Cincinnati Sub-Zero Cat | No. 247 | 22" x30 inç Yeniden Kullanılabilir Ağır Hizmet Tipi Ped |
| Merkaptosüksinik asit (MSA) | Aldrich | 88460 | |
| Fare burun konisi | |||
| Oksijen Tankı | buharlaştırma sistemi ile uyumlu olmalıdır | ||
| Fosfat tampon çözeltisi (PBS) | otoklav sterilize edilmiş | ||
| Keskin cerrahi makas | |||
| küçük plastik kaplar | |||
| Sodyum hidroksit | |||
| Tak 2X Master Mix | New England Biolabs | M0270L | |
| Tegaderm | 3M | Ref: 1624W | Şeffaf film sargısı (6 cm x 7 cm) |
| İnce metal spatula | |||
| Tri-HCl | |||
| Boru Cımbız | |||
| Wahl saç kesme makinesi | Wahl | Lityum İyon Pro |
Kaynaklar
- Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. J Vis Exp. (151), e57656(2019).
- He, J. -F., Tan, T., Zhu, H. A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice). Acta Pharmacol Sin. 39 (1), 117-123 (2018).
- Dhall, S., et al. Generating and reversing chronic wounds in diabetic mice by manipulating wound redox parameters. J Diabetes Res. 2014 (562625), (2014).
- Kim, J., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. Nat Protoc Exch. , (2016).
- Martínez-Carrillo, B. E., et al. Changes in metabolic regulation and the microbiota composition after supplementation with different fatty acids in db/db mice. Int J Food Sci. , (2022).
- Zhang, Y., et al. Medium-chain triglyceride activated brown adipose tissue and induced reduction of fat mass in C57BL/6J mice fed high-fat diet. Biomed Environ Sci. 28 (2), 97-104 (2015).
- Basu, P., Kim, J. H., Saeed, S., Martins-Green, M. Using systems biology approaches to identify signalling pathways activated during chronic wound initiation. Wound Repair Regen. 29 (6), 881-898 (2021).
- Basu, P., Martins-Green, M. Signaling pathways associated with chronic wound progression: a systems biology approach. Antioxidants. 11 (8), 1506(2022).
- Kim, J. H., et al. High levels of OS and skin microbiome are critical for initiation and development of chronic wounds in diabetic mice. Sci Rep. 9 (1), 19318(2019).
- Kim, J. H., et al. High levels of OS create a microenvironment that significantly decreases the diversity of the microbiota in diabetic chronic wounds and promotes biofilm formation. Front Cell Infect Microbiol. 10 (259), (2020).
- Kim, J. H., et al. Pseudomonas aeruginosa activates quorum sensing, antioxidant enzymes and type VI secretion in response to OS to initiate biofilm formation and wound chronicity. Antioxidants. 13 (6), 655(2024).
- Kim, J. H., et al. Skin microbiota and its role in health and disease with an emphasis on wound healing and chronic wound development. , Elsevier eBooks. 297-311 (2022).
- Kim, J. H., et al. Targeting anaerobic respiration in Pseudomonas aeruginosa with chlorate improves healing of chronic wounds. Adv Wound Care. 13 (2), 53-69 (2024).
- Jabbari, P., et al. Chronic wound initiation: single-cell RNAseq of cutaneous wound tissue during initiation of chronic wound development. Antioxidants. 14 (2), 214(2025).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste