İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Beyin Topluluklarını Kullanarak Epilepsiyi Modellemek için Çok Elektrotlu Bir Dizi Platformu

Summary

Bu protokol, in vitro epilepsiyi modellemek için dorsal-ventral kaynaşmış asembloidleri çoklu elektrot dizileri üzerinde stabil bir şekilde plakalamayı amaçlamaktadır.

Abstract

İnsan beyni organoidleri, fetal beyin gelişiminin yönlerini özetleyen insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) türetilen üç boyutlu (3D) yapılardır. Dorsalın in vitro olarak ventral bölgesel olarak belirlenmiş beyin organoidleri ile füzyonu, uyarıcı ve inhibitör nöronlarla fonksiyonel olarak entegre mikro devrelere sahip assembloidler oluşturur. Yapısal karmaşıklıkları ve çeşitli nöron popülasyonları nedeniyle, assembloidler, anormal ağ aktivitesini incelemek için yararlı bir in vitro araç haline gelmiştir. Çok elektrotlu dizi (MEA) kayıtları, hücre zarı bütünlüğünden ödün vermeden bir nöron popülasyonundan elektriksel alan potansiyellerini, ani yükselmeleri ve uzunlamasına ağ dinamiklerini yakalamak için bir yöntem olarak hizmet eder. Bununla birlikte, uzun süreli kayıtlar için asambleleri elektrotlara yapıştırmak, büyük boyutları ve elektrotlarla sınırlı temas yüzeyi alanı nedeniyle zor olabilir. Burada, 2 aylık bir süre boyunca elektrofizyolojik aktiviteyi kaydetmek için asambleleri MEA plakalarına plakalamak için bir yöntem gösteriyoruz. Mevcut protokol insan kortikal organoidlerini kullanmasına rağmen, diğer beyin bölgelerini modellemek için farklılaşmış organoidlere geniş ölçüde uyarlanabilir. Bu protokol, bir nöronal ağın gelişimini incelemek için sağlam, uzunlamasına, elektrofizyolojik bir test oluşturur ve bu platform, epilepside terapötik gelişim için ilaç taramasında kullanılma potansiyeline sahiptir.

Introduction

İnsan pluripotent kök hücre (hPSC) türevi beyin organoidleri, doku mimarisini ve gelişimsel yörüngeleri in vivo olarak yansıtan, uzamsal olarak kendi kendini organize eden 3D yapılardır. Progenitörler (nöroepitel hücreleri, radyal glia, nöronal progenitörler, glial progenitörler), nöronlar (kortikal benzeri uyarıcı nöronlar ve inhibitör internöronlar) ve glial hücreler (astrositler ve oligodendrositler) dahil olmak üzere çoklu hücre tiplerinden ^{oluşurlar1,2}. Assembloidler, bir 3D kültür içinde birden fazla beyin bölgesini ve/veya hücre soylarını entegre edebilen yeni nesil beyin organoidlerini temsil eder. İn vivo muadillerine benzeyen çeşitli beyin bölgeleri arasındaki bağlantıları modellemek, olgun ve karmaşık sinir ağlarını daha iyi taklit etmek için nöronlar ve astrositler arasındaki etkileşimleri yakalamak ve nöral devrelerin montajını incelemek için yararlı bir araç sağlarlar. Bu nedenle, assembloidler, hastalığın nedeninin altında yatabilecek anormal sinir ağlarını sorgulamak için fonksiyonel önlemlerin gerekli olduğu epilepsi patofizyolojisinin ayırt edici özelliklerini özetlemek için yaygın olarak kullanılan bir araç haline gelmektedir 3,4,5,6.

Kortikal glutamaterjik nöronlar ve GABAerjik internöronlar arasındaki etkileşimleri modellemek için, birkaç grup dorsal ve ventral beyne benzeyen ayrı organoidler geliştirdi ve daha sonra bunları çok bölgeli bir toplulukta bir araya getirdi 7,8,9,10. Burada, bölgesel olarak spesifik nöral alt tiplere sahip daha önce tanımlanmış bir assembloid kültür protokolü uygulanmıştır⁹. Bununla birlikte, önemli bir engel, nörogelişim sırasında sinir ağı aktivitesini izlemek için tekrarlanabilir fonksiyonel tahlillerin olmamasıdır. Organoidlerdeki ağların birçok fonksiyonel testi, farklılaşma grupları ve hücre hatları arasında yüksek değişkenliğe sahip sonuçlar verir. Organoidlerin dilimlenmesini veya ayrıştırılmasını içeren teknikler, sinaptik bağlantıyı keserek doğal ağlarını değiştirir⁸.

Çok elektrotlu diziler (MEA), kültür koşullarını veya hücre zarı bütünlüğünü bozmadan organoidlerin elektrofizyolojik özelliklerini karakterize etmek için yüksek zamansal çözünürlükle zaman içindeki ağ aktivitesinin büyük ölçekli bir görünümünü sağlar¹¹. Yama kelepçe elektrofizyolojisi ile karşılaştırıldığında, MEA, tek hücreler yerine büyük nöron popülasyonlarına dayalı yüksek verimli veri toplamayı mümkün kılar. MEA platformları, elektrot yoğunluklarına göre değişir ve beyin organoid araştırmalarında farklı ihtiyaçları karşılar¹². Yaygın olarak kullanılan sistemler, bu protokolde gösterildiği gibi, kuyu başına 8 ila 64 elektrot kaydeder 13,14,15. Kuyu başına 26.400'e kadar elektrot içeren yüksek yoğunluklu MEA'lar, artan uzamsal ve zamansal çözünürlük, aksiyon potansiyeli yayılma hızının ölçülmesi ve optogenetik stimülasyon 14,16,17 ile kombinasyon sağlar. Bu nedenle, MEA, in vitro epilepsiyi modellemek için güçlü bir araç ve nöbet önleyici ilaç taraması için translasyonel bir paradigma olarak hizmet eder.

En büyük zorluklardan biri, uzun süreli kayıtlar için büyük boyutlu asambleleri hidrofobik bir metal yüzey üzerinde stabilize etmektir. Bu protokol, farmakolojik tahlillerle birlikte uzun süreli uzunlamasına kayıt için sağlam assembloidlerin MEA plakaları üzerine kaplanması için ayrıntılı bir metodolojinin ana hatlarını çizmektedir. Protokolün benzersiz avantajları arasında, elektriksel aktiviteyi kaybetmeden asembloidlerin elektrot yüzeyine stabil bir şekilde bağlanması, kaplamadan sonra fonksiyonel ağ olgunlaşmasını hızlandırmak için ticari olarak temin edilebilen nörofizyolojik bazal ortamın kullanılması, ilaç tedavisi gibi aşağı akış fonksiyonel tahlilleri yürütmek için fizibilite ve diğer bölgeye özgü protokollerle üretilen organoidlere geniş uygulama yer alır.

Amaç, ağ aktivitesini araştırmak, hastalığa özgü değişiklikleri incelemek ve epilepside terapötik potansiyele sahip ilaçları test etmek için yüksek zamansal çözünürlüğe sahip fonksiyonel bir test sağlamaktır. Bu protokolün en zorlu adımları için, MEA plakaları üzerine asambleleri kaplama tekniklerinin yanı sıra bu kültürlerden temsili kayıtları gösteren video talimatları sağlanmıştır.

Protocol

Aşağıda gösterilen tüm deneysel prosedürler, Michigan Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal İnceleme Kurulu ve İnsan Pluripotent Kök Hücre Araştırma Gözetim Komitesi'nin etik yönergelerine uygun olarak yürütülmüştür. Bu protokolde kullanılan iPSC hatları ve temsili deneyler, ticari bir kaynaktan elde edilen insan sünnet derisi fibroblastlarından türetilmiştir. Bu çalışmada kullanılan hücre hatlarının, reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. iPSC'lerden kadere özgü beyin organoidlerinin türetilmesi

NOT: Bu protokol, 6 oyuklu bir plakanın 5 birleşik (~%85) kuyusundan mikrokuyu kültür plakasında 3 kuyu hazırlamak için bilgi içerir. iPSC bakım protokolü, hücre hatlarına bağlı olarak değişir.

1. Tablo 1'de ayrıntıları verilen bileşimi kullanarak tek tek hücre kültürü ortamını hazırlayın. 4 °C'de 2 haftaya kadar ışıktan korunarak saklayın.
2. Mikrokuyu kültür plakasında kullanılacak tüm kuyucukları 1 mL DMEM/F-12 ile bir kez durulayın. 1 mL / kuyu mTeSR plus + 50 μM Y-27632 ekleyin ve mikro kuyulardan hava kabarcıklarını çıkarmak için plakayı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2000 x g'da döndürün. Plakayı 37 °C% 5 CO₂ inkübatörde saklayın.
3. Steril bir P10 pipet ucu ile steril bir P10 pipet ucu ile laminer akışlı temiz bir tezgahta farklılaştırılmış iPSC'lerin bölgelerini temizleyin. Tek tabakadaki hücre kalıntılarını kalsiyum veya magnezyum içermeyen 1 mL / kuyu PBS ile yıkayın.
4. 1 mL / kuyucuk önceden ısıtılmış hücre ayrışma reaktifi ekleyerek ve plakayı 37 ° C% 5 CO₂ inkübatöre 4-7 dakika boyunca (hücre hatlarının özelliklerine ve birleşmesine bağlı olarak) yerleştirerek tek tabakayı tek hücrelere ayırın çoğu hücre kalkana kadar, her 2-3 dakikada bir hafif çalkalama ile.
5. Hücre ayrışma reaktifini seyreltmek için her oyuğa 4 mL DMEM / F-12 ekleyin ve 10 mL'lik bir serolojik pipet ile orta derecede ezin. Aynı hattın tüm kuyucuklarından hücre süspansiyonunu 50 mL'lik konik bir tüpte toplayın.
6. Oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 200 x g'da döndürün, süpernatanı 10 mL serolojik pipet kullanarak aspire edin ve hücreleri 2 mL mTeSR artı + 50 μM Y-27632 içinde yeniden süspanse edin. 10 μL hücre süspansiyonunu çıkarın, tripan mavisi ile 1: 1 (h/v) karıştırın ve otomatik bir hücre sayacı ile hücreleri sayın.
7. Plaka 3 x 10^{Kuyucuk başına 6} canlı hücre, hat başına 3 kuyu. Toplam hacmi 2 mL / kuyuya getirmek için gerektiği gibi ek mTeSR plus + 50 μM Y-27632 ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 100 x g'da döndürün ve inkübatöre geri koyun.
   NOT: Burada kullanılan mikrokuyu kültür plakası, oyuk başına 300 mikrokuyu içerir, bu nedenle 3 x 10⁶ hücreli kaplama, 10.000 hücre/mikrokuyu ile sonuçlanır.
8. Ertesi gün, 1 mL medyayı nazikçe çıkararak ve P1000 pipet ucuyla yavaşça 1 mL mTeSR artı medya (Y-27632 olmadan) ekleyerek yarım hacimli bir medya değişikliği yapın. Ucu ortam yüzeyine yakın tutun ve alttaki toplayıcı hücreleri rahatsız etmemek için mümkün olduğunca yavaş aspire edin.
9. Ortam değişikliğinden bir gün sonra ters çevrilmiş bir mikroskop altında kontrol edin ve her bir agreganın net bir taslağı görülebilir. P1000 pipet uçlarıyla orijinal ortamı her kuyucuktan çıkarın.
10. Dorsomorfin (DM) ve SB-4321542 (SB) ile 0.5 mL nöral indüksiyon ortamı (NIM) steril, kesilmiş P1000 uçları ile her bir oyuğa orta derecede püskürtün. Hemen, ortamda asılı duran agregaları nazikçe pipetleyin ve bunları 10 cm'lik steril bir süspansiyon kültür kabına aktarın. Tüm agregalar aktarılana kadar tekrarlayın. Tritürasyon yapmayın.
11. Toplam hacmi 10 mL/tabağa getirmek için gerektiği kadar ilave NIM + SB/DM ekleyin. Agregaların kendiliğinden füzyonunu önlemek için çanağı 37 °C% 5 CO₂ inkübatörde bir orbital çalkalayıcı üzerine koyun. Aktarım tarihini organoid kültürün 0. günü olarak işaretleyin.
12. 1. Günden sonuna kadar, Tablo 1'deki medya tarifini ve Şekil 9'deki medya değiştirme zaman çizelgesi^1'u takip edin. Özellikle, organoidler 4. günde "dorsal" ve "ventral" olarak adlandırılan iki süspansiyon kültürü kabına ayrılır.
    NOT: Akılda tutulması gereken birkaç önemli zaman noktası: organoid genişlemesi, ortamın EGF/FGF ile Nöral Farklılaşma Ortamına (NDM) geçirildiği 6. günde başlar. Nöronal farklılaşma, 25. günden itibaren NDM + BDNF/NT3 ile desteklenir ve organoidler, 46. günden itibaren büyüme faktörleri olmadan NDM'de tutulur.

2. Viral etiketleme ve asambloidlerin üretilmesi

NOT: Viral etiketleme ^7,9, bir asembloiddeki her bölgeye özgü organoidin kimliğini tanımak ve belirli elektrotlardan assembloid bölgelerine elektrofizyolojik aktivite atamak için önerilir. Her bir MEA kuyusu için yalnızca tek bir organoidin kaplanması en uygunudur. Bu protokol aynı zamanda tek organoid kaplama için de geçerli olabilir.

1. Kullanılacak virüs stoğu ve seyreltme ortamının hacimlerini hesaplayın: Etiketlenecek her organoid için virüslü 200 μL ortam gereklidir. Dorsal organoidler, tipik olarak 1:1000 (v/v) veya yaklaşık 2 x 10¹⁰ vg/mL'lik bir seyreltme oranında pAAV1-CAG-tdTomato ile etiketlenir. Ventral organoidler için 1:300 (h/v) veya 2 x 10¹¹ vg/mL pAAV1-mDLX-GFP virüsü kullanılır.
   NOT: Seyreltmeler istenen etkiye titre edilmelidir ve viral titreden etkilenir.
2. Uygun miktarda ortamı 37 °C'ye ısıtın. Buz üzerinde -80 °C'de saklanan virüs stoğunu çözün. Tüm etiketli organoidleri barındırmak için yeterli sayıda 48 oyuklu plakayı etiketleyin.
3. Kaputuna% 10 çamaşır suyu içeren bir beher koyun. Virüslerle temas eden tüm malzemeleri behere boşaltın. Tamamen çözülmüş virüsleri kültür ortamında "dorsal" ve "ventral" olarak etiketlenmiş ayrı 15 mL konik tüplerde seyreltin.
4. Gün 56 organoidlerini kültür kaplarından 48 oyuklu plakalara taşıyın. Statik kültürde spontan füzyonu önlemek için oyuk başına bir organoid önerilir. Mümkün olduğu kadar çok kalıntı kültür ortamını çıkarın.
5. Her kuyucuğa sırasıyla 200 μL virüs-ortam karışımı ekleyin. Plakaları 37 °C %5 CO₂ inkübatöre geri koyun. Viral partikülleri kuyunun dibine konsantre etmeye ve iletim verimliliğini optimize etmeye yardımcı olmak için plakaları steril boş bir plaka üzerine eğin.
   NOT: Viral partiküller 15 mL'lik konik tüpün dibine batma eğilimindedir, bu nedenle virüsleri her bir oyuğa eklemeden önce ortamla karıştırmak için tüpü sık sık ters çevirmek, tüm organoidler için tek tip transdüksiyon verimliliği sağlamak için çok önemlidir.
6. Ertesi gün (57. Gün), toplam hacmi 1 mL / kuyuya getirmek için her kuyucuğa 800 μL daha kültür ortamı ekleyin.
7. Üç gün sonra (60. gün), etiketli organoidler üzerinde tam bir medya değişikliği yapın. Viral partiküllerle temas eden herhangi bir malzemeyi ağartın.
8. Üç gün sonra (63. gün), epifloresan ters çevrilmiş mikroskop altında floresan ekspresyonunu kontrol edin. Sinyal güçlüyse, asambloidler oluşturmaya başlayın (bkz. adım 2.9).
9. Organoid füzyonu sırasında kalan viral partiküllerin çapraz kontaminasyonunu önlemek için etiketli tüm organoidleri 1 mL / kuyu PBS ile iki kez durulayın. Bir ventral organoidi her bir sırt kuyucuğuna aktarmak için kesilmiş bir P1000 pipet ucu kullanın (veya tam tersi) ve montaj plakasını buna göre yeniden etiketleyin. Daha iyi füzyon için plakaları adım 2.5'teki gibi eğin.
10. Füzyon işleminden 3 gün sonra (66. gün) asambleleri kesintiye uğratmadan yarım hacimli bir ortam değişikliğini dikkatlice gerçekleştirin. Stabil asembloidlerin oluşması genellikle yaklaşık bir hafta sürer (70. gün).

3. Asambloidlerin ön işlem görmüş MEA plakalarına yerleştirilmesi

NOT: Kaplama montajlarından önce MEA plakaların yüzey hazırlama prosedürlerinin tamamlanması en az 4 gün sürer. Zaman kazanmak için, dorsal ve ventral organoidlerin kaynaştırılması (yani, adım 2.9) ve MEA ön tedavisi paralel olarak gerçekleştirilebilir.

1. Yüzey ön işlemi ve kaplama için reaktifler hazırlayın.
   1. % 1 deterjan / enzim çözeltisi hazırlamak için, 0.5 g enzim / deterjan tozunu 50 mL deiyonize suda çözün. Toz tamamen eriyene kadar iyice girdaplayın. Çözeltiyi MEA kuyularına eklemeden önce biyogüvenlik kabininde steril tüp üstü vakum filtresi ile sterilize edin. Her kullanımdan önce taze yapın.
      NOT: Deterjan/enzim, MEA yüzeyini sterilize eder, MEA üretim sürecinden kalan yağları giderir ve yüzeyin hidrofilik bileşik polietilenimin (PEI)¹⁸ ile etkileşimleri teşvik edecek kadar hidrofilik olmasını sağlar.
   2. % 0.07'lik bir PEI çözeltisi¹⁹ hazırlamak için, 1 mL %50 PEI çözeltisini 6 mL 1x borat tamponu ile 15 mL konik bir tüpe karıştırarak bir stok %7 PEI çözeltisi yapmakla başlayın. Nihai çalışma konsantrasyonunu elde etmek için 1 mL stok% 7 PEI çözeltisini 99 mL 1x borat tamponu içinde seyreltin. Sterilizasyon için, kullanmadan önce biyogüvenlik kabinindeki 0,22 μm'lik bir filtre ünitesinden filtreleyin.
      NOT: Pozitif yüklü bir polimer olan PEI, negatif yüklü bir ikincil kaplamanın Bodrum Membran Matrisi (BMM) ve assembloidler²⁰ ile bağlanmasını kolaylaştırmak için birincil kaplama işleminde kullanılır. Stok çözeltisi çok viskoz olduğu için konik tüpe pipetlemek yerine dökerek 1 mL %50 PEI çıkarın. İhtiyaç duyulan miktar, konik bir tüpe tartılarak daha kolay ölçülebilir ve %50 PEI çözeltisinin yoğunluğu 1,08 g/mL'dir. % 7 stok PEI çözeltisi, -20 ° C'de 1 mL alikotlarda bir aya kadar saklanabilir. Sonraki tüm adımları biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin.
2. Her bir montajın boyutu göz önüne alındığında, kuyu başına 64 elektrotlu 6 oyuklu MEA plakaları, kuyu başına bir asembloidi barındırmak için kullanılır. Yeterli biyolojik kopyayı sağlamak için deneyler için gereken MEA plakalarının sayısını hesaplayın.
3. Steril bir MEA plakasının her bir oyuğuna 1 mL %1 deterjan/enzim çözeltisi ekleyin. Pipet ucuyla elektrotlara zarar vermemeye dikkat edin. Yıkamalar için vakumlu aspiratör kullanıyorsanız, ucun elektrot dizisine temas etmesine izin vermeyin. 37 °C'lik bir inkübatörde 2 saat inkübe edin.
4. Deterjanı/enzimi çıkarın ve her kuyuyu 1,5 mL steril deiyonize su ile beş kez yıkayın. Deterjan/enzim biyouyumlu olmadığından, kalan kimyasalların tamamen yıkandığından emin olmak önemlidir.
5. Ön koşullandırma için her kuyucuğu 1 mL kültür ortamı ile doldurun. Plakaları 2 gün boyunca 37 °C %5 CO₂ inkübatöre geri koyun. MEA yüzeyinin hücre kültürü koşullarına maruz bırakılması, hücre bağlanmasını teşvik eder.
6. Kültür ortamını çıkarın ve birincil kaplama için her bir oyuktaki MEA elektrotlarını 50 μL% 0.07 PEI çözeltisi ile kaplayın. 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
7. PEI çözeltisini tamamen aspire edin. Her kuyuyu 1 mL steril deiyonize su ile yıkayın. Toplamda 3 hızlı yıkama gerçekleştirin. Plakaları oda sıcaklığında kapağı kapalı olarak biyogüvenlik kabininde 15 dakika kurutun.
8. İkincil kaplama için kültür ortamında seyreltilmiş 50 μL 1:20 (h/h) BMM ile her bir oyuktaki elektrot alanını örtün. MEA plakalarını gece boyunca 37 °C inkübatöre geri koyun. Kaplama boyunca yeterli nemi sağlamak için kuyuları çevreleyen bölmelere steril su ekleyin.
9. Ertesi gün, seyreltilmiş BMM'yi bir vakumla aspire edin ve yüzeyde ince bir tabaka bırakın. Kalın bir tabaka oluşmuşsa, bir P1000 pipet ucu kullanarak elektrot temas alanına kültür ortamı ile kuvvetlice püskürtün. Kalın parçaları çıkarmak için gerektiği kadar yıkayın.
   NOT: Artık kalın BMM, hücrelerle elektrot temasını engelleyebilir.
10. Geniş kesilmiş bir P1000 ucu olan bir asambloid toplayın ve mümkün olduğunca az medya aktarırken bir kuyudaki elektrotların üzerine yerleştirin.
11. Bir diseksiyon kapsamı altındaki bir laminer akış başlığında, steril bir diseksiyon iğnesi veya P20 ucu ile assembloid'i hem dorsal hem de ventral organoidlerin çoğunlukla elektrotlarla kaplanabileceği istenen yere dikkatlice itin. Asambloidin etrafındaki sıvıyı çıkarmak için bir P20 ucu kullanın. Bunu tüm asambloidler veya bir alt küme için tekrarlayın, bu birkaç dakika içinde yapılabilir.
    NOT: Pipet ucu ve/veya iğne ile MEA yüzeyine DOKUNMAMAYA veya ÇİZİLMEYEMEYE çalışın. Asembloid'i pipet uçlarıyla dürtmemeye veya yırtmamaya çalışın. Organoidin tamamen kurumasını önlemek için kaplamayı mümkün olduğunca çabuk bitirin.
12. Asambloidleri 37 °C'de 10 dakika inkübe edin (ortam olmadan). Plakaları inkübatörden laminer akış başlığına aktarın ve bir diseksiyon kapsamı altında asambloidlerin üzerine kültür ortamında seyreltilmiş 2-3 küçük damla 1:50 BMM uygulayın. 37 °C'de 30 dakika daha inkübe edin.
13. Bir diseksiyon kapsamı altında asambloidlere yakın 3 damla kültür ortamını dikkatlice ekleyin. Bu, organoidleri nemli tutar. 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
    NOT: Montaj sonraki adımlarda hareket eder veya yüzerse, kaplama adım 3.11'den itibaren yeniden başlatılmalıdır.
14. Her saat, bir diseksiyon kapsamı altında her bir oyuğa dikkatlice 20-50 μL hücre kültürü ortamı ekleyin. Bu bir gün boyunca yapılabilir. Hedef, günün sonunda en az 250 μL toplam hacme ulaşmaktır.
15. Ertesi gün, tüm asambleidlerin diseksiyon kapsamı altında yerleşip yerleşmediğini ve stabilize olup olmadığını kontrol edin. Toplam 1 mL/kuyucuk hacmine ulaşmak için fazladan 750 μL kültür ortamı ekleyin. Plakaları en az 2 gün boyunca rahatsız edilmeden bırakın.
16. 500 μL kültür ortamı çıkararak ve 700 μL nörofizyolojik bazal ortam ekleyerek haftalık ortam değişikliklerini dikkatli bir şekilde gerçekleştirin. Eklenen ek ortam hacmi buharlaşmayı hesaba katar ve kullanılan MEA plakasının ne kadar buharlaşmaya sahip olduğuna bağlı olarak ayarlanabilir. MEA kuyularından buharlaşmayı en aza indirmek için kuyuların etrafına gerektiği kadar steril su ekleyin.

4. MEA kaydı ve veri analizi

1. Nörofizyolojik bazal ortama geçtikten yaklaşık bir hafta sonra (genellikle 78. gün civarında) MEA kaydına başlayın.
2. Kayıt odası ayarlanan sıcaklığa (genellikle 37 °C) ulaşana kadar bekleyin. Cihaza bir plaka aktarın ve kayıttan önce en az 5 dakika dengelenmelerine izin verin.
3. Donanım canlı ayarları
   1. Örnekleme frekansını, yani ham voltaj verilerinin kaydedilme hızını ayarlayın. Varsayılan ayar (12,5 kHz) önerilir.
   2. Belirli uygulamalar için donanım bant genişliğini ve kazancını yapılandırmak için analog modu (bu durumda olduğu gibi genellikle Neural Spikes) belirtin. Kayıt sırasında aktivitenin görsel olarak izlenmesi için Spike Detector ve Burst Detector modüllerini kullanın.
      NOT: Analog ayarlar, ham voltaj verilerinin nasıl kaydedildiğini etkiler ve veriler kaydedildikten sonra değiştirilemez.
   3. (İsteğe bağlı) Kayıt verilerine bir donanım dijital filtresi uygulayın. Alçak geçiren filtre seçenekleri arasında 2 kHz veya 3 kHz Kaiser Penceresi bulunur. Varsayılan ayarlar, Analog ayarlar seçildikten sonra değiştirilebilir.
   4. Bu durumda olduğu gibi nöral kayıt için şiddetle tavsiye edilen medyana göre referans vermeye (varsayılan) ayarlayın. Referanslama, kanal gruplarında yaygın olan gürültü girişimini azaltarak düşük genlikli sinyallerin kalitesini artırır.
      NOT: Yukarıdaki parametreler, montajlarda görülen aktiviteye bağlı olarak gerektiği gibi ayarlanabilir, ancak belirli bir deneydeki tüm kayıtlar için tutarlı tutulmalıdır.
4. Plaka haritaları ve açıklamaları ekleyin (gerekirse). Tutarlılığı sağlamak ve toplu veri işlemeyi kolaylaştırmak için aynı plaka için önceki kayıttan plaka haritasını içe aktarın. Dosyaların doğru adlandırıldığından emin olun.
5. Sinyaller iyi görünüyorsa (minimum gürültü ve artefakt), ham verileri kaydedin. Temsili bir örnek için genellikle 2-5 dakikalık kayıt yeterlidir.
6. Deneysel tasarıma bağlı olarak, haftada bir veya iki kez, 5-15 dakika boyunca uzunlamasına elektriksel aktiviteyi kaydedin. Her ortam değişikliğinden hemen sonra elektriksel aktivite düştüğünden, bir sonraki kayıt turuna başlamadan önce her ortam değişikliğinden sonra en az 24 saat bekleyin.
7. (İsteğe bağlı) Elektriksel aktivitenin dorsal ve ventral organoidler arasında lokalize edilmesi ve ayırt edilmesi gerekiyorsa veya her elektrotun aktivitesinin ayrı ayrı analiz edilmesi gerekiyorsa, her kayıttan sonra parlak alan ve epifloresan altında her bir asembloidin bir görüntüsünü elde edin (Şekil 2B).
8. Verileri analiz ederken, ani artış/patlama algılayıcısı ve istatistik derleyicisi dahil olmak üzere bir analiz yapılandırması uygulayın. Ani artış tespiti için taban çizgisinden 5,5-6 standart sapmaya ayarlanmış uyarlanabilir bir eşik kullanın. Ani artışları 100 ms'de ≥5 ani artışla bir etkinlik olarak tanımlayın¹³. Toplam aktif elektrotların %25'inden fazlası 100 ms içinde ateşlendiğinde ve ağ patlaması başına en az 50 ani yükselme olduğunda ağ etkinliğini tanımlayın^13,14.
   NOT: Bu parametreler, belirli bir deneyin ateşleme özelliklerine bağlı olarak modüle edilir. Düşük genlikli ani yükselmeler için hassasiyeti artırmak için, ani yükselme algılaması için uyarlanabilir eşik düşürülebilir. Patlama algılaması için çeşitli yöntemler kullanılabilir ve parametreler, arka plan etkinliğinden önemli ölçüde farklı olan ani artış patlamalarını algılamak için uyarlanabilir. Ağ aktivitesi parametreleri, özellikle montajbloidler tüm elektrot alanını kapsamadığında, daha düşük bir elektrot yüzdesine modüle edilebilir. Boylamsal karşılaştırmalara izin vermek için tüm parametreler bir deney süresince tutarlı kalmalıdır.
9. Kaydedilen verileri yeniden yürütürken toplu işleme için İstatistik Derleyicisi modülünü çalıştırın. Gelişmiş analiz için gelişmiş ölçümleri ve/veya ani artış çıktı dosyalarını dışa aktarın.
   NOT: Gelişmiş ölçüm çıktısı, ortalama ateşleme, patlama ve senkronizasyon için elektrot, kuyu ve grup ortalamalarını içeren .csv dosya içerir. Ani artış çıktısı (.spk dosyası), tüm ani artışlar için dalga biçimi izlerini içerir ve bu izler, ani artış sıralama gibi gelişmiş analiz için diğer platformlara aktarılabilir.

5. Son nokta farmakolojik tahlil ve plaka geri dönüşümü

NOT: İlaç tedavisi tahlilleri, assembloidler yeterince olgunlaştıktan ve elektriksel aktivite zirve yaptıktan sonra yapılabilir. Başlangıç / tedavi öncesi aktivite ve tedavi sonrası aktivitenin kaydedilmesi aynı gün yapılmalıdır.

1. Asamblenin hemen üzerine 1-10 μL ilaç çözeltisi ekleyin ve homojen bir karışım sağlamak için plakayı hafifçe döndürün. Bazı durumlarda ilaç içeren ortamlarda daha uzun inkübasyon süresi önerilir, ör., glutamat / GABA reseptör agonistleri / antagonistleri ile sinaps ile ilişkili ilaç tedavisi testleri (Şekil 2E) (ayrıntılar için Sonuçlar bölümüne bakınız).
   NOT: Nihai bir çalışma konsantrasyonu elde etmek için her bir oyuğa az miktarda ilaç çözeltisi eklenmesi önerilir, çünkü büyük bir hacim değişikliği genel olarak elektriksel aktiviteyi geçici olarak azaltacaktır. İlgilenilen ilaçların çözüldüğü bir aracın eklenmesinin elektrofizyolojik parametrelerde önemli değişikliklere neden olmamasını sağlamak önemlidir.
2. Yeterli PBS yıkaması yapın (tipik olarak 3) ve tedavi sonrası kayıttan sonra ilaçları yıkayın. Elektriksel aktivitenin başlangıç seviyesine dönüp dönmediğini görmek için ilacın yıkanmasından sonraki gün ek bir kayıt yapın.
3. İsteğe bağlı olarak, canlı görüntüleme, tam montajlı immün boyama için %4 paraformaldehit ile fiksasyon veya RNA veya protein ekstraksiyonu için lizis gibi daha fazla deney yapmak için kayıtların sonunda asembloidleri MEA plakasından ayırmak için ortamı kuvvetlice pipetleyin.
4. Analiz amacıyla, her koşul için en az üç teknik ve biyolojik kopya kullanın. Elektrofizyolojik verileri ortalama olarak ifade edin ≥ 3 kopyalar.
5. Deneylerin sonunda plakayı geri dönüştürmek için, ekli asambloidleri çıkardıktan sonra kalan ortamı aspire edin. Steril PBS ile bir kez yıkayın. Metal alanı 200 μL/kuyucuk %0,25 tripsin-EDTA ile tamamen örtün ve plakayı gece boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre geri koyun.
6. Ertesi gün, tripsin aspire edin,% 70 steril etanol ile iki kez ve steril deiyonize su ile üç kez yıkayın.
7. Biyogüvenlik kabinindeki plakayı, kapağı kapalıyken veya tamamen kuruyana kadar 15 dakika havayla kurutun. Temizlenmiş plakayı plastik bir torbaya koyun ve ileride kullanana kadar oda sıcaklığında saklayın.
   NOT: İyi temizlenmiş bir MEA plakası, kayıt kalitesini önemli ölçüde kaybetmeden üç kez yeniden kullanılabilir.

Results

İnsan dorsal-ventral asambleidleri, her biri 64 elektrot içeren 6 oyuklu bir MEA plakası (diferansiyasyon başına n = 6, 3 diferansiyasyon) üzerine kaplandı (Şekil 2A). Uzunlamasına kayıt için planlanan on assembloidden dokuzu, in vitro olarak 50 günden fazla bir süre boyunca elektrotlara sıkıca bağlandı (Şekil 2D). Farmakolojik tahliller için belirlenen 8 assembloidden 6'sı, geliştirme aşamasına uygun ağ aktivitesi ile yıkama aşamasından başarıyla yerleştirildi (Şekil 2E). AAV-CAG-tdTomato etiketli dorsal ve AAV-mDLX-GFP etiketli ventral organoidlerin kolayca ayırt edilebildiği bir temsili kuyudan alınan faz kontrastı ve floresan görüntüleri gösterilmiştir (Şekil 2B) ^7,9.

Bir MEA üzerindeki nöronların aktivitesi, çeşitli parametreler aracılığıyla genel hücresel uyarılabilirliği ve ağ aktivitesini değerlendirmek için analiz edilebilir. Kültür boyunca genel ateşleme oranları, hücresel ve ağ uyarılabilirliği hakkında bilgi sağlarken, çoklu elektrotlar arasında senkronize patlamaların sıklığı, sinaptik olarak aktif nöron ağlarının aralığını gösterir. Kısa bir süre boyunca uzamsal olarak farklı elektrotlar arasında meydana gelen çoklu tekrarlanan ani artışlar (ağ patlaması), nöbet benzeri aktivite ile biyolojik bir korelasyon görevi görebilir, ancak MEA'lar üzerindeki assembloidler, iyi niyetli nöbetler geçirebilen bütün bir organizmaya kıyasla sınırlı kalır. Şekil 2C , 84. ve 91. günlerde ticari olarak temin edilebilen nörofizyolojik bazal ortamda kültürlenen assembloidlerin ağ patlama modellerini göstermektedir ve muhtemelen nöronların fonksiyonel olgunlaşmasına bağlı olarak daha sonraki zaman noktasında patlama süresi artmıştır. Bu durumda, hücresel ve ağ aktivitesi, asembloidlerin kaplandığı günden itibaren kademeli olarak artar, genellikle 92. günde zirveye ulaşır ve 125. günde neredeyse kaybolur (Şekil 2D). Daha sonraki aşamada artan olgunlaşma, muhtemelen daha sonraki kayıt zaman noktasında uzatılmış senkronize seri çekim süresine katkıda bulunur.

Bir GABA_A reseptör antagonisti olan Bicuculline, ilacın 108. günde eklenmesinden sonra önemli ölçüde daha yüksek ateşleme oranları ve (ağ) patlama frekansları ile gösterildiği gibi, assembloidlerin senkronize ağ aktivitesini arttırır (Şekil 2E). Bu, daha önce tek hücreli elektrofizyoloji kayıtlarında^{gösterilene benzer 21}. Farmakolojik tahlil için bir güç analizi, 0.94'lük bir etki büyüklüğü ve 0.05'lik bir alfa üzerinde G * Power3 tabanı kullanılarak gerçekleştirildi. 0.8'lik bir güç elde etmek için n = 5'lik üç eşit büyüklükte gruba sahip toplam 15 assembloid'den oluşan bir örnek gerekliydi (Şekil 2E). Yanıtın gerçek bir sinyalleşme olayı olduğunu ve yalnızca az miktarda ortamın eklenmesinden kaynaklanabilecek sinyal yoğunluğundaki bir değişiklik olmadığını doğrulamak için bir araç kontrolü dahil edilmiştir (Şekil 2E).

Şekil 1: Çalışmaya genel bakış. Kritik aşamaları ve karşılık gelen küçük moleküllü takviyeleri detaylandıran farklılaşma protokolünün MEA zaman çizelgesinde çift etiketli assembloidlerin üretilmesi ve kaplanması için protokol (bileşim hakkında ek bilgi için, Tablo 1 ve Malzeme Tablosuna bakınız). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Asambleidlerin MEA kaydı. (A) 82. günde, yani kaplama sonrası 10. günde tek bir MEA plakasından (n = 6 kuyu) ortalama ateşleme aktivitesinin ısı haritası. Tüm kuyular aynı durum ve genotipteki kültürleri temsil eder. (B) Dorsal asembloid kırmızı ve ventral yeşil ile işaretlenmiş assembloidin temsili faz kontrastı ve konfokal görüntüleri. Beyaz ok uçları, ventralden dorsal tarafa göç etmiş GABAerjik internöronları gösterir. Ölçek çubuğu = 500 μm. (C) Temsili raster, tek bir kuyudan 120 sn'den fazla kayıt süresi çizer. Ağ patlamaları mor bir kutuyla vurgulanır. İki ayrı zaman noktası, Gün 78 (kaplamadan 1 hafta sonra, kaydın başlangıç günü) ve Gün 92 (kaplamadan 3 hafta sonra, ayrıca aktivitenin zirveye ulaştığı zaman) gösterilmiştir. (D) 78. günden 127. güne kadar ortalama ateşleme hızlarının, patlama frekansının ve şebeke patlama frekansının ölçülmesi (n = 3 farklılaşma, 3 assembloid/farklılaşma). Her eğri, 3 farklılıktan (renk kodlu) derlenen ayrı bir topluluğu gösterir. Kırmızı eğri ortalama değeri gösterir. (E) Bikükülin tahlil sonuçlarının ölçülmesi (n = 6 assembloids / durum). Çubuk grafik ortalama ± SEM olarak görüntülendi. Her nokta, 3 grup farklılaşmadan (renk kodlu) derlenen bir topluluğu temsil eder. Parametrik olmayan bir Friedman testi yapıldı. **p < 0.01; ns, önemli değil. MEA, çok elektrotlu diziler. Isı haritası ve raster grafikleri, analitik yazılım Neural Metric Tool kullanılarak oluşturulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Çeşitli farklılaşma aşamalarında ortamın bileşenleri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Epilepsinin in vitro modellemesi için iPSC'den türetilmiş assembloidlerde ağ aktivitesinin elektrofizyolojik kayıtları için MEA tabanlı yöntemler kullanılmıştır^22,23. Uyarıcı ve inhibitör sinaptik bağlantıları entegre eden bu önerilen platform, nöronal hipereksitabilitenin mekanizmalarını ve epileptogenez sürecinde kortikal internöronların rolünü ele alma potansiyeline sahiptir. Ek olarak, bu platform, farmakolojik bozulmaların varlığında bile, in vitro olarak yaklaşık 50 gün boyunca assembloidlerin stabilizasyonuna ve uzunlamasına elektrofizyolojik verilerin toplanmasına izin verir, böylece potansiyel terapötik hedeflere sahip bileşiklerin test edilmesi için bir yaklaşım sağlar.

Hidrofobik bir yüzey üzerinde olgun, nispeten büyük asambleidlerin uzun süre in vitro olarak stabilize edilmesi teknik olarak zor olmuştur. Bu engelin üstesinden gelmek için, organoidlerin elektrot yüzeyine kısa ve uzun süreli yapışmasını kolaylaştırmak için ters yüklü kimyasallarla iki kez kaplama stratejisi uygulanır. Bu protokol, plaka kaplama reaktiflerini poli-L-ornitin (PLO)/lamininden PEI/BMM'ye geçirerek, yüksek başarı oranları ve düşük toksisite ile katı bağlantı elde ederek daha önce kullanılan yöntem^24'ü optimize eder. Ayrıca, bu stabilize edilmiş uzun vadeli kültür sistemi, yüksek verimli veriler sağlama potansiyeline sahiptir. Örneğin, ikili virüslerle ön etiketleme, farklı bölgelerden gelen aktiviteyi lokalize etmek ve karşılaştırmak için tek tek elektrotlara göre ani sıralamayı tamamlayabilir. Önerilen platform ayrıca, assembloidlerin²⁵ bozulmamış yapısını bozmadan internöron işleviyle son derece ilgili olan yerel alan potansiyellerini kaydetmek için kararlı bir araç sağlar. Bu protokolün en büyük sınırlaması, montajın kaplamadan sonra düzleşmesidir, bu da ilk 3D yapıların korunup korunmadığı konusunda endişeleri artırır. Bir organoidi elektrotlar²⁶ ile saran daha gelişmiş MEA platformları kullanarak elektrotların etrafında büyüyen organoidler, potansiyel olarak sınırlamanın üstesinden gelebilir.

Organoidlerin elektrofizyolojik kaydı için MEA tabanlı yöntemlerin ana engellerinden biri, deneysel bulguların farklılaşma protokolleri ve hatta farklılaşma grupları arasında değişkenliği ve tekrarlanabilirliğidir. Önceki çalışmalar, MEA ile ölçülen nöronların ağ aktivitesinin hem dorsal hem de ventral organoidlerin nöronal olgunlaşma durumuna bağlı olduğunu göstermektedir²⁷. Nispeten olgun nöronlar ve devrelerle daha sonraki bir zaman noktasında assembloidlerden kayıt yapmak, tutarlılığı artırmanın bir yoludur. Ayrıca, yüksek verimli veriler üreten çok kuyulu MEA sistemlerinin seçimi, deneysel değişkenlik ışığında istatistiksel karşılaştırmalara izin verecektir. Bir kültürün elektrofizyolojik aktivitesi, belirli bir zaman noktasında beklenenle tutarsızsa, immünositokimyasal ve transkriptomik analiz de dahil olmak üzere kalite kontrol önlemleri için bozulmamış kültürün fonksiyonel platformdan toplanması önemli ve yardımcı olacaktır.

Önerilen platform için en önemli şey, dorsal tarafta bölgesel olarak belirlenmiş uyarıcı kortikal nöronları ve ventral tarafta inhibitör internöronları işlevsel olarak entegre etmektir. Literatürde bulunan beyin bölgesine özgü organoidlerin üretilmesi için protokoller, diğer faktörlerin yanı sıra ortam koşulları, kültürlerin zamanlaması, verim ve olgunlaşma profilleri ile ilgili olarak büyük ölçüde farklılık gösterir²⁸. Bu protokol, uyarıcı nöronlar ve GABAerjik internöronlar üretme kabiliyetinde korteks ve ganglionik üstünlüğe özgü olsa da, motor nöronlar²⁹ ve Purkinje hücreleri³⁰ gibi diğer kimlikleri gösteren iPSC'den türetilmiş nöronlar oluşturmak için iyi bilinen farklılaşma teknikleri kullanılabilir. Bu nedenle, önerilen platform, serebral korteks ve omurilik/beyincik arasındaki nöral devreleri modelleme potansiyeline sahiptir. Viral etiketleme ile hücre tiplerinin kaplanması ve görselleştirilmesi zamanlaması ile ilgili bazı optimizasyonlardan sonra, bu yöntem epilepsi dışında Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS)¹⁷ gibi diğer hastalık modellerine de çevrilebilir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Corning TC ile muamele edilmemiş kültür kapları	Corning	08-772-32	Çalkalayıcı üzerinde süspansiyon kültürü için
100 mL Beher	Fisher Scientific	FB100100
%100 Etanol	Fisher Scientific	BP28184-4L
2-Merkaptoetanol (β-ME)	Thermo Fisher	21985023	Çalışma konsantrasyonu 100 μ M
48 oyuklu hücre kültürü plakası	Fisher Scientific	50-202-140
6 oyuklu hücre kültürü plakası	Fisher Scientific	07-200-83
Aggrewell 800	Fisher Scientific	501974754
Allegra X-14R Soğutmalı Santrifüj	Beckman Coulter	BE-AX14R
Allopregnanolone	Cayman	16930	1 mM stok çözeltisi elde etmek için DMSO'ya 5 mg askıya alındı. Aliquot ve &eksi derecede dondurun; 80 ° C. Kullanım için 1: 10.000'de seyreltin. Çalışma konsantrasyonu 100 nM.
Otomatik hücre sayacı	Thermo Fisher	AMQAX2000
Axion CytoView MEA 6 kuyulu plakalar ve nbsp;	Axion Biosystems	M384-tMEA-6B
Axion Maestro MEA platformu	Axion Biosystems	Maestro	Geçici çevre kontrolü ile
B-27 takviyesi (düzenli, A Vitamini ile)	Thermo Fisher	21985023
B-27 takviyesi (A Vitamini olmadan)	Thermo Fisher	12587010
Bodrum membran matrisi - Geltrex	Thermo Fisher	A1569601
Boncuk banyosu	Fisher Scientific	10-876-001	Isotemp
Masaüstü ters mikroskop	Olympus	CKX53	Laminer akışta tutulur temiz tezgah
Bicuculline	Sigma-Aldrich	14340	Çalışma konsantrasyonu 10 μ M
Çamaşır Suyu	CLOROX	67619-26
Borat tamponu 20x	Thermo Fisher	28341	1x
BrainPhys ortamında	Kök Hücre Teknolojileri	5790
Hücre ayrışma reaktifi (StemPro Accutase)	Thermo Fisher	A1110501
Celltron orbital çalkalayıcı	HT-Infors	I69222
Deterjan / enzim (Terg-A-Zyme)	Sigma-Aldrich	Z273287	Çalışma konsantrasyonu% 1 m / v
DMEM / F12 + HEPES / L-Glutamin	Thermo Fisher	113300
DMSO	Sigma-Aldrich	67685
Dorsomorfin	Sigma-Aldrich	P5499	10 mM stok çözeltisi elde etmek için 5 mg'ı DMSO'ya çözün. Aliquot ve &eksi derecede dondurun; 20 ° C. Kullanım için 1:2000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 5 & mu; M)
Kalsiyum veya magnezyum içermeyen D-PBS	Thermo Fisher	14190144
Glial hücre hattı kaynaklı nörotrofik (GDNF)	Peprotech	450-10	100 & mu'yu çözün; 1 mL PBS'de 100 &mu'ya g; g/mL'dir. Aliquot ve &eksi derecede dondurun; 20 ° C. Kullanım için 1:5000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 20 ng/mL).
GlutaMAX takviyesi	Thermo Fisher	35050061
Hemasitometre	Seçim Mikroskobu Bilimleri	63510-20
HEPES	Thermo Fisher	15630080
Heraguard ECO Clean Bench	Thermo Fisher	51029692
Nem kontrollü hücre kültürü inkübatörü	Thermo Fisher	370	37 dereceye ayarlandı; C,% 5 CO2
IWP-2	Selleckchem	S7085	Aliquot ve & eksi derecede dondurun; 80 derece >C. Oda sıcaklığında çözülürse çökelir. Dondurulmuş alikotlar doğrudan 37 ° C'ye yerleştirilmelidir; Kullanmadan önce C.
Nakavt serum replasmanı (KOSR)	Thermo Fisher	10828010
mTeSRplus (orta + takviyeler)	StemCell Technologies	100-0276	cGMP, insan iPSC hücreleri için stabilize besleyici içermeyen ortam
N2 takviyesi	Thermo Fisher	17502048
Neurobazal A	Thermo Fisher	21103049
Esansiyel olmayan amino asitler (NEAA)	Thermo Fisher	11140050
NT3	Peprotech	450-03	Çözün 100 μ 1 mL PBS'de 100 &mu'ya g; g/mL'dir. Aliquot ve &eksi derecede dondurun; 20 ° C. Kullanım için 1:5000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 20 ng/mL).
NuFF İnsan yenidoğan sünnet derisi fibroblastları	MTI-GlobalStem	GSC-3002
Parafilm	PARAFILM	P7793
Penisilin / Streptomisin	Thermo Fisher	15140122
Pipet (P10, P200, P1000)	Eppendorf	EP4926000034	Organoid toplama için otoklavlı kesim P1000 uçları
Poli (Etilenim) (PEI)	Sigma-Aldrich	P3143	Stoku steril borat tamponunda seyreltin. Çalışma konsantrasyonu% 0.07. El yazmasındaki ayrıntılara bakınız.
Rekombinant insan epidermal büyüme faktörü (EGF)	R& D Systems	236-EG-200	PBS'de askıya alındı. Aliquot ve -20 ° C'de dondurun.
Rekombinant İnsan fibroblast büyüme faktörü (FGF)-temel	Peprotech	100-18B	PBS'de askıya alındı. Aliquot ve -20 ° C'de dondurun.
Rekombinant insan-beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF)	Peprotech	450-02	Sulandırmadan kısa bir süre önce santrifüjleyin. 100 &mu çözün; 1 mL PBS'de 100 &mu'ya g; g/mL'dir. Aliquot ve &eksi derecede dondurun; 20 ° C. Kullanım için 1:5000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 20 ng/mL).
Retinoik asit (RA)	Sigma-Aldrich	R2625	100 mM stok çözeltisi elde etmek için 100 mg'ı 3.3 mL DMSO'ya çözün. Aliquot hisse senedi 100 μ L / tüp ve & eksi dondurun; 80 derece >C. 200 &mu alın; L 100 mM stok yapın ve 10 mM stok yapmak için 10x seyreltin (1.8 mL DMSO ekleyin). Alikot 50 μ L / tüp ve & eksi olarak saklayın; 80 ° C. Kullanım için 1: 100.000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 100 nM).
ROCK inhibitörü Y-27632	Tocris	1254	1:200 10 mM stoktan
SAG (yumuşatılmış agonist)	Selleckchem	S7779	Aliquot ve & eksi derecede dondurun; 80 °C. Stok konsantrasyonu 1mM. 1: 10.000 seyreltmede kullanın (çalışma konsantrasyonu 100 nM).
SB-431542	Tocris	1614	10 mM stok çözeltisi elde etmek için 5 mg'ı 1.3 mL DMSO'ya çözün. Aliquot ve &eksi derecede dondurun; 80 ° C. Kullanım için 1:1000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 10 & mu; M)
Serolojik pipet dolgusu	Fisher Scientific	14-387-166
Steriflip vakum tüplü üst filtre	Sigma-Aldrich	SE1M179M6
Steril hücre kültürü davlumbazları	Baker Company	SG-600
Tripan mavisi çözeltisi (% 0.4)	Thermo Fisher	15250061
Tripsin-EDTA (% 0.25)	Thermo Fisher	25200056
Zoom stereomikroskop	Olympus	SZ61/SZ51	Laminer akışlı temiz tezgahta tutulur