Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hücresel Siliyogenez Modelinde Sonik Kirpi Sinyalini Ölçmek için Kantitatif PCR Tabanlı Test

1.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67407

⸱

31 Ocak 2025

 , 
1CellBio Lab, Institute of Health Sciences, Presidency University

Bu makalede

Özet

Çalışma, hücresel bir siliogenez modelinde SHH agonisti kullanılarak primer kirpi aracılı Sonic Hedgehog (SHH) sinyal yolu aktivasyonu için kantitatif PCR tabanlı bir testi göstermektedir.

Özet

Siliyopati, mikrotübül bazlı hücre çıkıntıları olan hareketli veya hareketsiz (birincil) kirpiklerin yapısının veya işlevinin sapması nedeniyle ortaya çıkan multisistemik ve poligenik insan hastalıkları ve bozuklukları topluluğunu ifade eder. Primer kirpikler (PC), çoğu insan epitel ve endotel dokusunda bulunur ve Sonic Hedgehog (SHH) sinyali de dahil olmak üzere fizyolojik sinyal iletimi için bir merkez görevi görür. Çeşitli durumlar, neredeyse tamamen PC'nin aracılık ettiği kanonik SHH sinyal yolunun ölçülmesiyle elde edilebilecek PC'nin işlevinin incelenmesini gerektirir. Burada, çoğunlukla PC içeren hareketsiz hTERT-RPE1 (veya RPE1) hücrelerinde SHH yolağı genlerinin transkripsiyonel seviyesini ölçmek için kantitatif PCR (qPCR) tabanlı bir teknik geliştirilmiştir. RPE1 hücrelerinde sessizlik, 48 saat boyunca serum açlığı ile elde edilirken, SHH yolunun aktivasyonu spesifik bir agonist tarafından desteklenir. Bu hücre kültürü bazlı testin takip edilmesi kolay ve hassastır. Bu testin siliyer RPE1 hücrelerinde başarılı bir şekilde gösterilmesi, çeşitli siliyopatilerle ilişkili olabilecek bir veya daha fazla genin genetik veya epigenetik değişikliği üzerine PC'nin uygun işlevini incelemek için bir in vitro test olarak muazzam potansiyelini gösterir.

Giriş

Bir silyum, bir bazal gövde1 üzerine monte edilen, hücre yüzeyinden mikrotübül bazlı ve zarla kaplı bir çıkıntıdır. Omurgalılarda hareketli ve hareketsiz olmak üzere iki tür kirpik görülür. Hareketli kirpikler özel dokularda bulunur ve hareketlilik sağlar. Hareketsiz primer kirpikler (PC) çoğu omurgalı hücresinde bulunur ve duyusal işlevleri yerine getirir ve hücre dışı ortamdan hücrelerin içine kritik sinyalleri iletir2. Bir kez monte edildikten sonra, siliyer uzamaya, kinesinler (anterograd hareket) ve dynein-II motor proteinleri (retrograd hareket) tarafından tahrik edilen kargoyu taşıyan çift yönlü bir taşıma sistemi olan intraflagellar taşıma (IFT) makinesi yardımcı olur3,4. Hareketli veya primer kirpiklerdeki yapısal veya fonksiyonel kusurlar, topluca siliopatiler olarak bilinen çok sayıda multisistemik insan hastalığına yol açabilir 5,6.

PC, Kanatsız (Wnt), G-proteinine bağlı reseptörler (GPCR), reseptör-tirozin kinazlar (RTK'lar), Dönüştürücü büyüme faktörü β (TGFβ) ve Trombositten türetilmiş büyüme faktörü (PDGF) gibi çeşitli gelişimsel sinyalleme süreçleri için merkez görevi görür 7,8. Memelilerde, Sonic Hedgehog (SHH) sinyali, PC 9,10,11 içeren hücrelerde neredeyse yalnızca PC tarafından dönüştürülen kritik bir sinyaldir. PK'nin anormal yapısı veya işlevi, konjenital kalp kusurları, polikistik böbrek hastalığı, kraniyofasiyal anormallikler, retina distrofisi gibi hastalıklarla ve Bardet-Biedl Sendromu (BBS), Joubert Sendromu (JBTS), Alström Sendromu, Jeune Asfikizan Torasik Displazi (JATD) gibi birkaç nadir hastalıkla ilişkili zayıflamış sinyal yolaklarına yol açar12,13,14,15. Bunların çoğu epitelyal veya endotel dokularının poligenik hastalıklarıdır ve bu hastalıkların erken tanı ve tedavisinde zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Bu tür mutasyonların bir hücre kültürü modelinde zayıflatılmış PC aracılı sinyallemeye nasıl katkıda bulunduğunu belirlemek, yalnızca bu sinyal yolunun moleküler karmaşıklığı hakkında bilgi sağlamakla kalmaz, aynı zamanda çeşitli siliyopatilerin teşhisini kolaylaştırır ve terapötik müdahaleler önerebilir. Bu düşünceyle, insan telomeraz ters transkriptaz (hTERT) ölümsüzleştirilmiş retina pigment epitel hücrelerinde (hTERT-RPE1, burada RPE1 olarak anılacaktır) PC aracılı SHH sinyal yolundaki değişikliği belirlemek için kantitatif PCR (qPCR) tabanlı bir test geliştirilmiştir. RPE1 hücreleri, siliogenez için hücresel model olarak yaygın olarak kullanılan diploide yakın, transforme edilmemiş insan hücreleridir, çünkü bu hücrelerin yaklaşık% 75-80'i, 24-48 saat boyunca serum açlığı üzerine (serumsuz ortamda hücrelerin inkübe edilmesi) PC'yi birleştirir, asenkron olarak büyüyen bir RPE1 hücresi kültüründe sadece% 15 -% 18 kirpiklenmeye kıyasla16.

Kirpi sinyali (HH), embriyonik gelişim için omurgalılar arasında korunur17. Memelilerde, üç farklı Kirpi sinyalizasyonuna tanık olunur: Sonic (SHH), Indian (IHH) ve Desert (DHH), bunlardan SHH ve IHH, doku seviyesindeörtüşen işlevler gösterir 11. SHH sinyali, sinir sistemindeki uzuvların desenlenmesini ve hücre tipi spesifikasyonunu düzenleyerek ve yetişkin doku homeostazını koruyarak embriyonik gelişim sırasında kilit rol oynar 10,11,18. SHH sinyalizasyonu karmaşık olmasına rağmen, kanonik SHH sinyalizasyonunun, Gli transkripsiyon faktörlerinin (Gli1, Gli2 ve Gli3) kolektif fonksiyonlarının aracılık ettiği PC 7,11,19'a bağlı olduğunu gösteren artan kanıtlar vardır. HH sinyalizasyonu ve PC'nin, düşük ligand oranlarına11 etkili tepkiler sağlamak için silyumun ucundaki kompakt hacimde yoğunlaşan kritik sinyalizasyon bileşenleri ile birlikte evrimleştiği öne sürülmüştür.

SHH ligandlarının yokluğunda, PC membranı üzerinde lokalize olan Patched1 (Ptch1), muhtemelen lipid taşınmasını içeren kötü anlaşılmış bir mekanizma yoluyla Düzleştirilmiş (Smo) aktivitesini inhibe eder, böylece yolu baskılanmıştutar 7,20. G-bağlı bir protein reseptörü ve sistemin negatif bir düzenleyicisi olan yapısal olarak aktif siliyer GPR161, protein kinaz A'nın (PKA) aktivitesini artıran yüksek seviyelerde siliyer siklik AMP (cAMP) koruyarak baskının sürdürülmesini sağlar.21 ve PKA7'nin siliyer lokalizasyonunu koruyarak. PKA aktivitesi, kazein kinaz 1 (CK1) ve glikojen sentaz kinaz 3 β (GSK3β) ile birlikte, PC içindeki Gli proteinlerinin, Gli2 ve Gli3'ün çoklu kalıntılarını fosforile eder. Gli2 ve Gli3, hedef genlerin transkripsiyonunun hem aktivatörleri hem de baskılayıcıları olarak işlev görebilir. PKA aracılı fosforilasyon, Gli2'nin aktivatör fonksiyonunun inhibisyonuna neden olurken, fosforile Gli3, Gli3R22 baskılayıcı formunu üretmek için proteazlar tarafından parçalanır. Genel olarak, SHH hedef genlerinin ekspresyonu bu tür koşullarda baskılanır.

SHH ligandı mevcut olduğunda, Ptch1 ona bağlanır ve GPR161 PC'den ayrılır ve G proteinine bağlı reseptör (GPCR) kinaz 2 (GPRK2) ve CK1 tarafından fosforile edilen Smo, β-arrestin ve mikrotübül motoru KIF3A23 ile birlikte PC'ye aktarılır. Konserde, siliyer uçta Gli2/3, Fused Suppressor (SUFU) ve Kif7'nin lokalizasyonu teşvik edilir ve azalmış Gli2/3 bölünmesi ile bağlantılıdır, böylece Gli2/3'ün aktivatör fonksiyonunu arttırır24,25. Bir kez aktive edildiğinde, Gli2 / 3, yalnızca bir aktivatör olarak işlev görebilen Gli1'in ekspresyonunu indükler ve böylece SHH yolu22'nin yanıtını yükseltir. SHH'nin Ptch1'e bağlanması, onkogenler (CDO), CDO'nun kardeşi (BOC), büyüme durmasına özgü 1 (GAS1) ve düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü ile ilişkili protein 2 (LRP2) tarafından CAM ile ilişkili / aşağı regüle edilerek kolaylaştırılır. Tersine, Kirpi ile etkileşime giren protein (HHIP), SHH ile doğrudan etkileşime girerek SHH'yi tecrit edebilir ve ayrıca SHH26 ile etkileşime girerek Ptch1 ile rekabet eder. Daha da önemlisi, GLI1, HHIP ve PTCH1, SHH yolu aktivasyonu üzerine kopyalanırken, son ikisi SHH yolunun negatif regülasyonuna katılır.

Önceki çalışmalar, SHH hedef genlerinin transkript seviyelerinin, farklı hücre tiplerinde önemli ölçüde değişebilmesine rağmen, SHH yolunu değerlendirmek için ölçülebileceğini göstermiştir27,28. SHH yolağı yanıtındaki bu tür bir varyasyon, muhtemelen PC'nin yokluğunda, hücre zarının aracılık ettiği PC aracılı SHH sinyallemesi ve SHH sinyalinin farklı kombinasyonlarına bağlanabilir. SAG, bu yöntemde, büyük ölçüde kirpikli olan seruma aç RPE1 hücrelerinde SHH sinyal aktivasyonunu taklit etmek için kullanılan bir Smo agonistidir. HHIP, GLI1 ve PTCH1 gibi SHH hedef genlerinin ve hedef olmayan bir gen SMO'nun transkript seviyeleri, kontrol ve SAG ile tedavi edilen hücrelerde qPCR kullanılarak ölçüldü ve SHH yolunun aktivasyonunu belirlemek için karşılaştırıldı. PC aracılı SHH sinyalini ölçmek için bu hücre kültürüne dayalı hassas testin başarılı bir şekilde gösterilmesi, primer silia fonksiyonu ile ilişkili biyomedikal araştırmalarda umut verici bir uygulama olduğunu göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Hücre kültürü

  1. Orijinal kültürün 1: 5 seyreltilmesinde RPE1 hücrelerinin birleşime yakın bir T-25 hücre kültürü şişesini, %10 Fetal Sığır Serumu (FBS), %1 penisilin-streptomisin karışımı (nihai konsantrasyon - 100 U/mL penisilin G ve 100 μg/mL streptomisin) ile desteklenmiş 5 mL Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyeri (DMEM) içeren taze bir T-25 hücre kültürü şişesine geçirin. Bu ortam, tam ortam olarak adlandırılır. % 5 CO2 varlığında hücreleri 37 ° C'de büyütün.
    NOT: RPE1 hücreleri, hücre kültüründe PC montajı ve sökülmesinin moleküler regülasyonunu incelemek için yaygın olarak kullanılan dönüştürülmemiş hücrelerdir. RPE1 hücrelerinin yaklaşık% 80'i serum açlığı üzerine PC'yi birleştirir ve bu, serum16'nın yeniden eklenmesiyle tekrar parçalarına ayrılır.
  2. 12 mm'lik yuvarlak cam lamelleri, 50 mL 1 N HCl içinde kapalı bir cam beherde gece boyunca 60 °C'de sallanmadan su banyosunda veya inkübatörde inkübe ederek hazırlayın.
  3. Ertesi gün, 25 mL'lik bir pipet kullanarak asit çözeltisini pipetleyin ve kimyasal tehlike kabına uygun şekilde atın. Daha sonra, lamelleri 100 mL damıtılmış suda 3 kez ara sıra çalkalayarak 15 dakika inkübe ederek yıkayın ve ardından pipetleyin.
  4. Yıkama adımlarını %70 etanol ve %95 etanol ile tekrarlayın. Lamelleri bir biyogüvenlik kabinindeki bir laboratuvar kurutma kağıdına tek tek yerleştirerek kurutun. Kuruduktan sonra 60 dakika UV radyasyonu ile sterilize edin.

2. Hücre büyümesi, serum açlığı ve SAG tedavisi

  1. Önceden ısıtılmış% 0.25 Tripsin-EDTA çözeltisinin enzimatik aktivitesi ile hücreleri yerinden çıkardıktan sonra, T-25 şişesindeki hücreleri önceden ısıtılmış tam bir ortamda yeniden süspanse edin. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayarak süspansiyonun hücre yoğunluğunu belirleyin.
  2. İki adet 35 mm'lik hücre kültürü kabı hazırlayın ve her birine iki adet steril 12 mm'lik lamel yerleştirin. Geçiş 2 x 10 Lameller içerenher 35 mm'lik tabakta eşzamansız olarak büyüyen RPE1 hücreleri ve hücreleri 24 saat boyunca 2 mL tam ortamda büyütün.
  3. 24 saat sonra, büyüyen RPE1 hücrelerinin ortamını çıkarın ve hücreleri 1x önceden ısıtılmış 1 mL DPBS tamponu ile yıkayın. Her tabağa %1 penisilin-streptomisin içeren ancak FBS (serumsuz ortam) içermeyen 2 mL önceden ısıtılmış DMEM ortamı ekleyin ve hücreleri %5 CO2 varlığında 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
  4. 24 saat sonra, ortamı, kontrol çözücüsü olarak 250 nM'lik bir nihai konsantrasyona veya DMSO'ya SAG içeren serumsuz ortamla değiştirin ve hücreleri 24 saat daha inkübe edin. Hücre kültürü protokolünün çizgi film diyagramı Şekil 1A'da gösterilmiştir.

3. Hücre toplama

  1. Lamelleri, her kuyucukta bir lamel olacak şekilde 24 oyuklu bir plakaya aktarın. Her bir oyuğa 0,5 mL soğutulmuş metanol ekleyin ve hücreleri lamellere sabitlemek için plakayı -20 °C'de 10 dakika inkübe edin. Hemen ardından, lamelleri 3x 0,5 mL yıkama tamponu ile yıkayın (0,5 mM MgCl2 ve %0,05 Triton-X 100 içeren 1x PBS).
  2. Ortamı atın ve her yemeğe doğrudan 0,5 mL trizol reaktifi ekleyin. Eşit şekilde dağılmasına izin verin ve 5 dakika bekletin. Homojen bir karışım elde etmek için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve 1,5 mL nükleaz içermeyen mikrosantrifüj tüplerinde toplayın.

4. Toplam RNA ve cDNA'nın hazırlanması

  1. Parçalanmış hücreler içeren her tüpe 0.1 mL kloroform ekleyin ve 2-3 dakika inkübe edin. Her bir numuneyi 4 °C'de 12.000 x g'de 15 dakika santrifüjleyin. RNA'yı içeren sulu fazı taze mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
  2. Sulu faza 0.25 mL izopropanol ekleyin ve 10 dakika inkübe edin. 4 ° C'de 12.000 x g'de 10 dakika santrifüjleyin. RNA çökeltisi beyaz jel benzeri bir pelet oluşturur. Bir mikropipet kullanarak süpernatanı atın.
  3. RNA peletini 0.5 mL taze seyreltilmiş %75 etanol içinde yeniden süspanse edin. Numuneleri kısa bir süre vorteksleyin ve ardından 4 ° C'de 7500 x g'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir mikropipet ile atın.
  4. RNA peletini 10 dakika havayla kurutun ve 25 μL nükleaz içermeyen suda yeniden süspanse edin. Bir mikrohacim spektrofotometresi kullanarak 260 nm'de absorbansı ölçerek toplam RNA konsantrasyonunu belirleyin.
  5. Üreticinin bir cDNA sentez kiti talimatlarını izleyerek cDNA'ları hazırlamak için her iki numuneden 1-3 μg toplam RNA kullanın. cDNA'ları -20 °C'de saklayın.

5. Kantitatif PCR

  1. GLI1, PTCH1, HHIP, SMO ve β-ACTIN primer setleri ile her numuneden 1: 5 seyreltilmiş cDNA kullanarak qPCR reaksiyonlarını (üç kopya halinde, Tablo 1) ayarlayın (temizlik geni olarak; Tablo 2) uygun bir çok kuyulu, floresansa duyarlı PCR plakasında uygun DNA polimeraz, dNTP'ler ve tampon içeren bir qPCR ana karışımına sahip genler.
  2. Plakayı uygun bir sızdırmazlık maddesi ile örtün, uygun bir qPCR cihazına yerleştirin ve programın sonunda 40 amplifikasyon döngüsü ve bir erime eğrisi analiz adımı ile standartlaştırılmış bir qPCR programı çalıştırın. Bir erime eğrisi analizi de dahil olmak üzere standartlaştırılmış 40 döngülü qPCR programı, Şekil 1B'de şematik olarak gösterilmiştir.
  3. qPCR programı tamamlandığında, istenen sıcaklıkta tek bir tepe noktası için her bir amplikonun erime eğrisini kontrol edin.
    NOT: Amplifikasyon döngülerinin sonunda, ilgili eriyik eğrisi analizi, her bir kuyucuğun sıcaklığını 65 ° C'den 95 ° C'ye çıkararak, 5 saniyelik adım başına 0,5 ° C'lik artışla amplikonun erime sıcaklığını ölçer.
  4. Amplifikasyon verilerini bir elektronik tabloya aktarın ve her numune için β-ACTIN geninin nispi ifadesine karşı normalleştirerek her transkriptin göreceli ifadesini (2−ΔΔCT yöntemi) hesaplayın. Grafiği çizin ve eşleşmemiş bir T-Testi kullanarak her bir transkriptin göreceli ifadesindeki değişikliklerin istatistiksel anlamlılığını hesaplayın.

6. Floresan mikroskobu kullanarak immün boyama ve görüntü elde etme

  1. Sabit hücreleri 200 μL bloke edici tamponda (1x PBS'de %2 BSA ve %0.1 TritonX-100) lameller üzerinde 30 dakika inkübe edin.
  2. Hücreleri, bloke edici tamponda seyreltilmiş birincil antikorların (tipik olarak asetillenmiş α-tübüline karşı bir anti-fare ve siliyer membran ve sentriyola karşı tavşan önleyici antikorlara karşı bir anti-fare) inkübe edin (son seyreltme için Malzeme Tablosuna bakınız) nemlendirilmiş bir odada gece boyunca 4 ° C'de.
    1. Boş 1 mL pipet ucu kutusunun alt yarısına ıslak bir kağıt havlu koyarak nemlendirilmiş bir oda yapın. Raf yüzeyine bir şeffaf film şeridi yerleştirin ve inkübe edilecek her lamel için bir tane olmak üzere filmin üzerine bir damla antikor çözeltisi (20-25 μL) yerleştirin. Hücrelerin daldırılması için damlacıkların üzerine bir lamel yerleştirin ve uç kutusunun kapağını kapatın.
  3. Ertesi gün, lamelleri tekrar ters çevirin ve 24 oyuklu tabağa geri koyun. Lamelleri yıkama tamponu ile yıkayın ve daha sonra önceden standartlaştırılmış bir antikor seyreltmesi ile 150 μL ikincil antikor karışımı içinde inkübe edin (burada, yeşil floresan boya konjuge anti-fare ve kırmızı floresan boya konjuge anti-tavşan bloke edici tampon içinde seyreltilmiş) ve nükleer DNA boyama reaktifleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca. Lamelleri 3 kez yıkayın.
  4. Bir cam mikroskop lamı üzerinde antifade reaktifi içeren montaj çözeltisinin bir damlacığını (kabaca 3-5 μL) tespit edin. Montaj çözeltisinin üzerine, hücre tarafı aşağı bakacak şekilde bir lamel yerleştirin. Temiz bir mendile hafifçe bastırarak fazla sıvıyı silin. Lamel üzerine yapıştırmak için lamel kenarı boyunca şeffaf oje sürün.
  5. Motorlu bir tabla ve dijital görüntüleme yapabilen bir kamera ile bağlı mikroskobun üzerine bir slayt koyun ( Malzeme Tablosuna bakınız). Ortam sıcaklığında seruma aç RPE1 hücrelerinin görüntülerini elde etmek için 60x Plan Apo yağa daldırma objektifi (1.4 sayısal açıklığa sahip) kullanın, bahsedilen antikorlarla işaretlendiği gibi hücrelerdeki PC'yi görselleştirmek için.
  6. Bir dijital mikroskopi görüntüleme yazılım paketi kullanarak Z ekseni boyunca farklı floroforlar için aynı pozlama süresini kullanarak ayrı lameller üzerinde farklı numunelerin görüntülerini elde edin. 48 saatlik serum açlığı durumunda kirpik yüzdesini belirlemek için en az 500 hücreden PC içeren hücrelerin sayısını sayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

PC aracılı SHH sinyal iletim yolunun aktivasyonu, PC7'nin uygun işlevini anlamanın bir yoludur. Burada, SHH yolu hedef genlerinin nispi ekspresyonu, çoğunlukla kirpikli olan RPE1 hücrelerinde SHH yolunun SAG aracılı aktivasyonu üzerine RT-qPCR testi kullanılarak ölçülür. SHH yolunun doğrudan transkripsiyonel çıktıları GLI1 ve PTCH1, bu yol11'in aktivitesini ölçmek için sıklıkla kullanılır. Bu protokol aynı zamanda SHH yolu tarafından düzenlenen HHIP transkriptini de içerir....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

PC'nin işlevselliğini incelemek, siliasyon dinamiklerini ve PK'nin disfonksiyonu ile ilişkili hastalıkları veya bozuklukları anlamak için çok önemli bir adımdır. Siliyer belirteçler veya florofor etiketli siliyer yapısal bileşenler için immün boyama yoluyla siliyerin incelenmesinin yanı sıra, PC'nin işlevi yaygın olarak, floresan mikroskobu27,31 kullanılarak dokularda ve hücrelerde Smo'nun siliyer translokasyonunu ölçerek kanonik...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden herhangi bir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Departmanı (DBT) tarafından SM'ye Ramalingaswami bursu ve Hindistan Hükümeti Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu'ndan (SERB) araştırma bursu ile desteklenmektedir (CRG/2020/004042). PH Bursu, Hindistan Hükümeti Üniversite Hibe Komisyonu (UGC) tarafından desteklenmektedir. Yazarlar, Cumhurbaşkanlığı Sağlık Bilimleri Enstitüsü RNABio Laboratuvarı'ndan Dr. Chandrama Mukherjee ve Bay Avik Mukherjee'ye sırasıyla qPCR cihazına erişim ve cihazla ilgili eğitim için içtenlikle teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DMSO, steril filtreliSigmaD2650
Eşek, anti-Fare IgG (H+L) Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA21202
Eşek, anti-Tavşan IgG (H+L) Alexa Fluor 568ThermoFisher ScientificA10042
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)Gibco, ThermoFisher Scientific41965039
Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS)Gibco, ThermoFisher Scientific14190144
Fetal sığır serumu (FBS)HimediaRM1112
Floresan Mikroskobu, 60X objektifCarl Zeiss  ile donatılmıştır;Axio gözlemci colibri 5
hTERT-RPE1 hücreleriATCCCRL-4000
iScript cDNA Sentez KitiBio-Rad Laboratuvarları1708891
Fare, monoklonal anti-asetillenmiş tübülin antikoruMilipore Sigma-AldrichT7451Son seyreltme 1:1000
Penisilin-Streptomisin, 100XGibco, ThermoFisher Scientific15140122
Kantitatif PCR makinesi, CFX 96Bio-Rad Laboratuvarları
Tavşan, poliklonal Arl13B antikoruProteinTech17711-1-APSon seyreltme 1:250
Tavşan, poliklonal Cep135 antikoruProteinTech24428-1-APSon seyreltme 1:500
SlowFade altın Antifade moutantThermoFisher ScientificS36940
Yumuşatılmış Agonist (SAG) AbmoleM4865Stok çözümü: DMSO'da, 5 mM
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratuvarları1725271
TRIzol ReaktifiInvitrogen15596026
TrypLEGibco, ThermoFisher Scientific12605028

Kaynaklar

  1. Nigg, E. A., Raff, J. W. Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease. Cell. 139 (4), 663-678 (2009).
  2. Halder, P., Khatun, S., Majumder, S. Freeing the brake: Proliferation needs primary cilium to disassemble. J Biosci. 45, 117(2020).
  3. Eguether, T., Cordelieres, F. P., Pazour, G. J. Intraflagellar transport is deeply integrated in hedgehog signaling. Mol Biol Cell. 29 (10), 1178-1189 (2018).
  4. Ishikawa, H., Marshall, W. F. Intraflagellar transport and ciliary dynamics. Cold Spring Harb Perspect Biol. 9 (3), a021998(2017).
  5. Hildebrandt, F., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. N Engl J Med. 364 (16), 1533-1543 (2011).
  6. Reiter, J. F., Leroux, M. R. Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (9), 533-547 (2017).
  7. Hilgendorf, K. I., Myers, B. R., Reiter, J. F. Emerging mechanistic understanding of cilia function in cellular signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (7), 555-573 (2024).
  8. Bansal, R., et al. Hedgehog pathway activation alters ciliary signaling in primary hypothalamic cultures. Front Cell Neurosci. 13, 266(2019).
  9. Gigante, E. D., Caspary, T. Signaling in the primary cilium through the lens of the hedgehog pathway. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 9 (6), e377(2020).
  10. Anvarian, Z., Mykytyn, K., Mukhopadhyay, S., Pedersen, L. B., Christensen, S. T. Cellular signalling by primary cilia in development, organ function and disease. Nat Rev Nephrol. 15 (4), 199-219 (2019).
  11. Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian hedgehog signaling. Cold Spring Harb Perspect Biol. 9 (5), a028175(2017).
  12. Brown, J. M., Witman, G. B. Cilia and diseases. Bioscience. 64 (12), 1126-1137 (2014).
  13. Hanaki, K., et al. Alstrom syndrome: A review focusing on its diverse clinical manifestations and their etiology as a ciliopathy. Yonago Acta Med. 67 (2), 93-99 (2024).
  14. Merrill, A. E., et al. Ciliary abnormalities due to defects in the retrograde transport protein dync2h1 in short-rib polydactyly syndrome. Am J Hum Genet. 84 (4), 542-549 (2009).
  15. Dagoneau, N., et al. Dync2h1 mutations cause asphyxiating thoracic dystrophy and short rib-polydactyly syndrome, type iii. Am J Hum Genet. 84 (5), 706-711 (2009).
  16. Majumder, S., Fisk, H. A. Vdac3 and mps1 negatively regulate ciliogenesis. Cell Cycle. 12 (5), 849-858 (2013).
  17. Briscoe, J., Therond, P. P. The mechanisms of hedgehog signalling and its roles in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (7), 416-429 (2013).
  18. Placzek, M., Briscoe, J. Sonic hedgehog in vertebrate neural tube development. Int J Dev Biol. 62 (1-2-3), 225-234 (2018).
  19. Wong, S. Y., et al. Primary cilia can both mediate and suppress hedgehog pathway-dependent tumorigenesis. Nat Med. 15 (9), 1055-1061 (2009).
  20. Deshpande, I., et al. Smoothened stimulation by membrane sterols drives hedgehog pathway activity. Nature. 571 (7764), 284-288 (2019).
  21. Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary g-protein-coupled receptor gpr161 negatively regulates the sonic hedgehog pathway via camp signaling. Cell. 152 (1-2), 210-223 (2013).
  22. Niewiadomski, P., et al. Gli protein activity is controlled by multisite phosphorylation in vertebrate hedgehog signaling. Cell Rep. 6 (1), 168-181 (2014).
  23. Kovacs, J. J., et al. Beta-arrestin-mediated localization of smoothened to the primary cilium. Science. 320 (5884), 1777-1781 (2008).
  24. He, M., et al. The kinesin-4 protein kif7 regulates mammalian hedgehog signalling by organizing the cilium tip compartment. Nat Cell Biol. 16 (7), 663-672 (2014).
  25. Wen, X., et al. Kinetics of hedgehog-dependent full-length gli3 accumulation in primary cilia and subsequent degradation. Mol Cell Biol. 30 (8), 1910-1922 (2010).
  26. Griffiths, S. C., et al. Hedgehog-interacting protein is a multimodal antagonist of hedgehog signalling. Nat Commun. 12 (1), 7171(2021).
  27. Gomez, A. E., Christman, A. K., Van De Weghe, J. C., Finn, M., Doherty, D. Systematic analysis of cilia characteristics and hedgehog signaling in five immortal cell lines. PLoS One. 17 (12), e0266433(2022).
  28. Schmidt, S., et al. Primary cilia and shh signaling impairments in human and mouse models of parkinson's disease. Nat Commun. 13 (1), 4819(2022).
  29. Dutta, A., et al. Increase in primary cilia number and length upon vdac1 depletion contributes to attenuated proliferation of cancer cells. Exp Cell Res. 429 (2), 113671(2023).
  30. De, K., et al. Hyperphosphorylation of cdh1 in glioblastoma cancer stem cells attenuates apc/c(cdh1) activity and pharmacologic inhibition of apc/c(cdh1/cdc20) compromises viability. Mol Cancer Res. 17 (7), 1519-1530 (2019).
  31. Yang, S., Zheng, X. The immunofluorescence-based detection of hedgehog pathway components in primary cilia of cultured cells. Methods Mol Biol. 2374, 89-94 (2022).
  32. Wang, W., et al. The mir-669a-5p/g3bp/hdac6/akap12 axis regulates primary cilia length. Adv Sci (Weinh). 11 (6), e2305068(2024).
  33. Alanazi, A., et al. Identifying the roles of mir-17 in ciliogenesis and cell cycle. Front Cell Dev Biol. 12, 1397931(2024).
  34. Bustin, S. A., et al. The miqe guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time pcr experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Primer SilyaSiliyogenez DeneyiRPE1 H creleriSerum A lGen Ekspresyon AnaliziSmoothened AgonistiRNA zolasyonuSiliyopati Modeli
Hücresel Siliyogenez Modelinde Sonik Kirpi Sinyalini Ölçmek için Kantitatif PCR Tabanlı Test
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.