Yöntem makalesi

Farelerde Otoimmün Kas Spesifik Kinaz (MuSK) Myastenia Gravis'i İndüklemek için Aktif Bağışıklama

DOI:

10.3791/67408

⸱

3 Temmuz 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Aziz Sancar Institute of Experimental Medicine, Istanbul University, 2Department of Immunology, Hellenic Pasteur Institute

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, hastalığın patofizyolojisini ve potansiyel terapötik stratejilerini araştırmayı amaçlayan, otoimmün kasa özgü kinaz (MuSK) myastenia gravis'in deneysel bir fare modeli için kapsamlı bir protokol sunmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myastenia gravis (MG), nöromusküler kavşağı etkileyen otoimmün bir hastalıktır. Çoğu MG hastası asetilkolin reseptörüne (AChR) karşı otoantikorlar üretirken, hastaların bir alt kümesi kasa özgü kinaz'ı (MuSK) hedef alan otoantikorlar sergiler. MuSK MG, sıklıkla mekanik ventilasyon gerektiren ciddi kas güçsüzlüğü, tedaviye dirençli klinik tablolar ve miyastenik krizler ile karakterizedir. Sonuç olarak, hastalar sıklıkla uzun süreli yan etkilerle ilişkili olan immünosupresanların uzun süreli kullanımına ihtiyaç duyarlar. MuSK-MG'nin ciddiyeti ve nadirliği göz önüne alındığında, yeni tedavi modalitelerini geliştirmek ve altta yatan patofizyolojik mekanizmaların daha derin bir şekilde anlaşılması için deneysel bir hayvan modeli geliştirmek çok önemlidir. Deneysel otoimmün miyastenia gravis (EAMG), MuSK-MG için bir hayvan modeli olarak hizmet eder ve insan MG'nin klinik ve immünolojik özelliklerini etkili bir şekilde ancak kısmen taklit eder. Otoimmün hayvan modellerinin indüksiyonu, aktif veya pasif bağışıklama yoluyla sağlanabilir. Burada sunulan deneysel protokolde, aktif bağışıklama, ısıyla öldürülen Mycobacterium tuberculosis ile tam Freund adjuvanında emülsifiye edilmiş insan MuSK'nin saflaştırılmış hücre dışı alanının deri altına uygulanmasıyla kullanılmıştır. Dört bölgede bağışıklama yapıldı, ardından 28. günde MuSK'nin takviye enjeksiyonu yapıldı. M. tuberculosis ile bu adjuvan, TLR4 yoluyla bağışıklık sisteminin aktivasyonunu ve uygulanan antijenin fagositozunu arttırır. Bu makale, MuSK-EAMG'nin gelişimini ve karakterizasyonunu başlangıçtan sonuca kadar kapsamlı bir şekilde detaylandırmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myastenia gravis (MG), T hücresine bağımlı, antikor aracılı mekanizmalarla gelişen otoimmün bir hastalıktır. Esas olarak hastaların %80-85'inde nöromüsküler kavşağın (NMJ) postsinaptik membranındaki nikotinik asetilkolin reseptörlerine (AChR) karşı antikorlar ve hastaların yaklaşık %5'inde kas spesifik kinaza (MuSK) karşı antikorlar ve diğer NMJ proteinleri neden olur. MG, otoimmün bozukluklar için bir prototip ve postsinaptik fonksiyonu anlamak için bir model haline gelmiştir1. Otoimmün bozuklukların hayvan modelleri iki ana kategoriye ayrılabilir: (1) Hayvanların doğal olarak bir otoimmün hastalık geliştirdiği spontan modeller ve (2) Otoimmün hastalığın yapay olarak taklit edildiği ve çoğaltıldığı indüklenmiş modeller. Miyastenia gravis (MG) üzerine yapılan çalışmalar, hem aktif hem de pasif bağışıklamanın hastalığı indükleyebileceğini ve antikor aracılı durumların anlaşılmasına önemli ölçüde katkıda bulunduğunu göstermiştir2.

Pasif transfer, otoantikor aracılı hastalıkların akut etkilerini değerlendirmek için oldukça etkili bir yöntemdir ve MG'de hasta kaynaklı antikorları incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yaklaşım, hastalığın altında yatan immünolojik faktörlerin anlaşılmasını genişletmede faydalı olmuştur. Örneğin, pasif transfer çalışmaları, anti-MuSK IgG4'ün AChR kümelerinin3 azaltılması üzerindeki patojenik etkisini göstermiştir. Bununla birlikte, pasif transfer modelinde, insan ve kemirgen IgG ve immün sistemler arasındaki fonksiyonel farklılıklar ve pasif transfer modelinin lenfoid dokularda meydana gelen anti-MuSK otoimmünitesinin başlangıç aktivasyon mekanizmalarını taklit etmedeki yetersizliği gibi bazı sınırlamalar vardır.

Öte yandan, bağışıklama çalışmalarının potansiyel bir sınırlaması, farklı fare suşları arasındaki immünogenetik değişkenliktir4. Örneğin, C57BL / 6 (B6) fareleri AChR ile aktif bağışıklamaya duyarlı iken, AKR / J fareleri dirençlidir. Bu nedenle, bir EAMG hayvan modeli oluştururken, hastalığı doğru bir şekilde yansıtmak için hayvan türünü, bağışıklama yöntemini ve protokol içeriğini doğru bir şekilde seçmek çok önemlidir5.

Ek olarak, hedef antijenin bütün bir protein olarak kullanılması genellikle yüksek antikor titreleri ile sonuçlanır. Bununla birlikte, tüm antikorlar fare antijeni ile çapraz reaksiyona girmeyebilir veya hastalığa neden olan epitoplar üretmeyebilir. Bu nedenle, aktif bağışıklama modelleri insan patolojisini her zaman doğru bir şekilde yansıtmaz. Bununla birlikte, uygun bir klinik ve fizyolojik fenotipi başarılı bir şekilde oluşturduklarında, bu modeller deneysel tedavileri test etmek için uzun vadeli bir platform sağlar.

Klinik çalışmalar, MuSK-MG için farklı hastalık mekanizmalarını ve terapötik gereksinimleri göstermekte ve bu MG alt tipininspesifik patojenik özelliklerinin daha fazla tanımlanmasına duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır 4,5,6. Önceki aktif bağışıklamaya dayalı MuSK EAMG çalışmaları, MuSK otoimmünitesinde Th2 tipi bağışıklık ve anti-fare IgG1'in baskın katılımını gösterdi ve insan MuSK MG 7,8,9 için bir dizi potansiyel tedavi modalitesi (ör., teriflunomid, mezenkimal kök hücre, FCRLB shRNA) tanımladı. Bu, yeni terapötik hedeflerin test edilmesinde ve MuSK MG patofizyolojisinin araştırılmasında MuSK EAMG modelinin önemini göstermiştir.

Bu makalede, hayvan modelini indükleme, hastalık ilerlemesini izleme ve EAMG indüksiyonunun doğrulanması için prosedürler detaylandırılmıştır. Klinik değerlendirme, bir gözlemci tarafından ağırlık, duruş, kavrama gücü ve klinik puanların izlenmesini içeriyordu. Farelere ikinci aşılamadan 28 gün sonra ötenazi yapıldı ve hastalığın oluşumunu doğrulamak için kan, arka bacak kası, dalak ve aksiller ve kasık lenf düğümleri dahil olmak üzere çeşitli dokular toplandı. Anti-MuSK antikorları, ELISA yöntemi kullanılarak serumlarda ölçüldü. Ek olarak, nöromüsküler kavşaktaki birikintileri görselleştirmek için kas dokuları üzerinde immünofloresan boyama yapıldı. Farklı MuSK EAMG duyarlılığına sahip fare gruplarında klinik ve immün yanıtları göstermek ve karşılaştırmak için, KCNS3 shRNA ile tedavi edilen fareler proinflamatuar etki gösterdi (yayınlanmamış) ve FCRLB shRNA, önceki çalışmalarda belirlendiği gibi anti-inflamatuar etki9 gösterdi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, İstanbul Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu (HADYEK) tarafından 2020/29 karar numarası ile onaylandı. Önceki çalışmalarımızda 7,8,9, EAMG modeli 8-10 haftalık BALB/c veya B6 farelerde MuSK proteini ile aktif bağışıklama yoluyla indüklenmiştir. Bu makale, MuSK ile aşılanmış BALB/C fareleri (grup başına 4-8 fare) kullanılarak yapılan farklı deneylerden elde edilen örnek verileri sunmaktadır. Reaktifler ve kullanılan ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Bağışıklama için insan MuSK'nin üretimi ve hazırlanması

  1. İnsan MuSK hücre dışı alan amino asitlerini 24-495 (NCBI Referans Dizisi: NP_005583.1) pPIC9 vektörüne klonlayın.
  2. Maya Pichia pastoris (GS115 suşu) sisteminde salgı ifadesi.
  3. Büyüme ortamına metanol (% 2.5 v / v) ilavesiyle ekspresyonu indükleyin.
  4. Saflaştırma amacıyla bir C-terminali 6xHIS etiketi ekleyin.
  5. Proteini salgılanan bir glikosile protein olarak ifade edin ve doğal koşullar altında saflaştırın. Kültür ortamını 50 mM fosfat tamponu pH 8.0, 300 mM NaCl'ye karşı diyalize edin.
  6. Ni2 + / nitrilotriasetat agaroz (Ni-NTA) kullanarak nikel iyon afinite kromatografisi ile devam edin. Saflaştırılmış proteini% 10 gliserol ilavesinden sonra -80 ° C'de saklayın, burada en az iki yıl stabil kalır10.
    NOT: Ni-NTA saflaştırmasından sonra tahmin edilen ekspresyon seviyeleri yaklaşık 0.4 mg / L kültürdür. SDS-PAGE tarafından analiz edilen örneklerde başka hiçbir protein safsızlığı tespit edilmedi.
  7. Bağışıklamadan önce, MuSK proteininin izole edilmiş hücre dışı alanının saflığını jel elektroforezi ile doğrulayın (Ek Şekil 1).
  8. MuSK'yi her fare için 45 μg/100 μL PBS konsantrasyonunda hazırlayın.
  9. MuSK'yi PBS (100 μL) ve Mycobacterium tuberculosis H37Ra (10 mg / 10 mL) içeren Complete Freund Adjuvanı (CFA-100 μL) ile 1: 1 oranında homojenize edin (emülsifiye edin) (emülsiyonun toplam hacmi fare başına 200 μL'dir).

2. Anestezi ve bağışıklama prosedürü

  1. Bağışıklamadan önce, propofol PBS'de (1: 5 oranında) seyreltin.
  2. Fare başına 50 mg / kg'da intraperitoneal olarak uygulayın.
    NOT: İzofluran, inhalasyon yoluyla anestezi için de kullanılabilir (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Başlangıç konsantrasyonu tipik olarak 1-2 L/dk'lık bir oksijen akış hızı ile %3-5'e ayarlanırken, bakım konsantrasyonu genellikle 0,5-1 L/dk'lık bir oksijen akış hızı ile %1-3'tür.
  3. İlk Bağışıklama: CFA'da toplam 45 μg / 200 μL hazırlanmış MuSK deri altına omuzlara ve iç arka pençelere enjekte edin (her kısım için yaklaşık 11.25 μg / 50 μL).
  4. İkinci Bağışıklama: CFA'da toplam 45 μg/200 μL hazırlanmış MuSK'yi deri altına omuzlara ve kalçalara enjekte edin (her kısım için yaklaşık 11.25 μg/50 μL).
    NOT: Modeli oluşturmak için enjeksiyonları 28 günlük aralıklarla iki kez uygulayın. Kas içi uygulama, klinik zayıflık değerlendirmesine müdahale edebilecek kas ağrısı ile ilişkilidir. EAMG bir kas hastalığı olduğundan, intramüsküler enjeksiyonun kullanılması ağrıya bağlı miyastenik olmayan güçsüzlüğe neden olabilir ve bu nedenle bir karıştırıcı olarak hareket edebilir. Sadece CFA ile aşılanmış (MuSK olmadan) bir kontrol grubu önerilir.

3. Klinik puanlama

  1. Farelerde myastenia gravis semptomları egzersiz ve yorgunluktan sonra daha belirgin hale geldiğinden, yorgunluğa neden olmak için ızgarayı kavramaya çalışırken fareleri bir kafesin üst ızgarası boyunca 40 kez nazikçe sürükleyerek egzersiz yapın.
  2. Egzersiz yaptıktan sonra, fareleri aktivite, ağırlık ve kas gücündeki değişiklikler açısından dikkatlice gözlemleyin. Değerlendirme kriterlerine rehberlik etmesi için bu gözlemlere dayalı olarak uygun puanlar atayın.
    NOT: Skor 0: Fareler aktif kalır ve çevrelerini keşfetmeye devam eder; Skor 1: Egzersizden sonra kambur bir duruş gözlenir, ancak fareler normal aktiviteye ve sosyalliğe geri döner. Kürk bakımı genellikle sürdürülür. Skor 2: Kambur bir duruş egzersizden önce bile görülebilir ve egzersizden sonra daha belirgin hale gelir. Kendi kendine bakım ve aktivitede bir azalma kaydedilmiştir. Skor 3: Egzersizden önce ve sonra dramatik bir kambur duruş gözlenir. Hareket, sosyallik ve kas gücünde önemli bir azalma olur, buna 2-3 günde bir 1-2 gram kilo kaybı eşlik eder. Dehidrasyon meydana gelir ve farelerin suya ve yiyeceğe ulaşmasını zorlaştırır. Dehidrasyon, cildin sıkıştırıldıktan sonra hızlı bir şekilde geri dönmemesi ve dışkıdaki değişiklikler ile tanımlanır. Acı çeken fareler şaşılık ve kambur bir duruş ile karakterizedir. Şiddetli ağrı belirtileri ve %20'yi aşan kilo kaybı gösteren fareler sakrifiye edilir. Skor 4: Fare kafeste ölü bulunur. Ölen fare derhal uzaklaştırılmalı ve kafes değiştirilmelidir5.
  3. İkinci aşılamadan yaklaşık 10 gün sonra semptomlar hızla ilerlediği için fareleri günlük olarak kontrol edin. İlk 28 gün boyunca haftada bir ve daha sonra haftada iki kez klinik puanlama ve ölçümler yapın.
  4. Ağırlık ölçümü yapın.
    NOT: Ağırlık ölçümü, hastalığın ilerlemesini izlemek için çok önemli bir parametre sağlar. Farelerin yüksek metabolik hızları nedeniyle, vücut ağırlığı önemli ölçüde değişebilir. Tüm ölçümler için aynı ölçeğin kullanılması ve bu ölçümlerin günün aynı saatinde yapılması tutarlılık açısından önemlidir.
  5. Kas gücü ölçümü yapın. Kas gücünü ölçmek için ızgara telli yatay bir dinamometre kullanın.
    1. Yorgunluğu tetiklemek için fareleri kafesin üzerinde 40 kez hafifçe sürükleyerek klinik puanlama için egzersiz yapın.
    2. Her fareyi hemen dinamometrenin ızgarasına yerleştirin ve tüm pençelerin ızgarayı sıkıca kavradığından emin olarak kuyruğundan yavaşça çekin. Yalnızca farelerin ızgarayı dört pençeyle de kavradığı ölçümleri göz önünde bulundurun.
      NOT: Her ölçüm sırasında eşit miktarda kuvvet uygulamaya çalışın ve güvenilirliği korumak ve değişkenliği azaltmak için tüm ölçümleri aynı araştırmacının yapması önerilir. Yorulma MG zayıflığının ayırt edici özelliği olduğundan, kavrama gücü ölçülmeden bir dizi kavrama gücü testi yapılmalıdır. Daha sonra, her fare için yedi ölçüm yapıldı ve maksimum ve minimum değerler atıldı. Güvenilir sonuçlar elde etmek için kalan beş ölçümün ortalaması hesaplanır.

4. Doku örneği hazırlama

NOT: Fareleri, kurumsal olarak onaylanmış protokolleri takip ederek ikinci aşılamadan 28 gün sonra sakrifiye edin. Kurban edilen farelerden kan, kas, dalak ve lenf bezlerinin toplanması daha ileri araştırmalar için faydalı olacaktır.

  1. Kardiyak kan alma
    NOT: Kardiyak kan toplamak için, etik kurul tarafından onaylanan uygun bir anestezik (örn., propofol) kullanarak fareleri uyuşturun. Kardiyak ponksiyon anestezi gerektirir ve terminal bir prosedürdür, yani hayvanlara hemen ardından ötenazi yapılmalıdır.
    1. Fareyi derin bir şekilde uyuşturduktan sonra, sırt üstü yatırın, karnını açın ve kalbi, en alt kaburganın yaklaşık 1 cm yukarısında ve hafifçe sağa doğru yerleştirin.
    2. 25-35 G'lik bir iğne kullanarak, komplikasyonları önlemek için şırıngayı hareket ettirmeden sol ventrikülden 45 derecelik bir açıyla dikkatlice kan alın11.
    3. Kan örneklerini serum ayrımı için kuru tüplere ve / veya planlanmışsa RNA izolasyonu için EDTA tüplerine aktarın.
    4. Serumu santrifüjleme ile ayırın ve serum örneklerini kullanılana kadar -20 °C'de tutun.
  2. Kas örneğinin korunması ve hazırlanması
    1. Anterior tibialis kasınıtoplayın 11,12,13. Buz gibi PBS ile durulayın.
    2. Numuneleri kriyotüplere yerleştirin, hemen -20 °C'de sıvı nitrojenle soğutulmuş izopentanın içine daldırın ve -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın.
      NOT: Deneylerde daha doğru sonuçlar için numuneler anında dondurulmalıdır.
    3. Dokuları dikey olarak bir kesit yuvasına yerleştirin; Bir mantar kullanılabilir. İmmünofloresan boyama için numuneleri OCT'ye (Optimal Kesme Sıcaklığı bileşiği) gömün.
    4. Dokunun sıvı azotla soğutulmuş izopentan üzerinde yüzmesine izin verin. Bir kriyostat ile bölümlere ayrılana kadar -80 ° C'lik bir dondurucuda saklayın.

5. İmmünofloresan etiketleme yoluyla nöromüsküler kavşakların değerlendirilmesi

  1. Kriyostat kesit alma ve fiksasyon
    1. OCT'ye gömülü donmuş dokuları -24 ° C'de bir kriyostat kullanarak 7 μm kalınlığa kadar bölümlere ayırın.
    2. Bölümleri -20 °C'ye soğutulmuş asetonda sabitleyin. PBS ile 5 dakika yıkayınız.
    3. % 0.4 Triton X (PBS-T) içeren PBS'yi 10 dakika boyunca tekrar yıkayın.
      NOT: Fiksasyondan etkilenen moleküllerin konformasyonunu düzeltmek ve daha doğru bağlanma sağlamak için bir geçirgenleştirme adımı gerçekleştirilebilir. Permeabilizasyon, 10 dakika boyunca% 1 FBS ve 10 dakika daha PBS-T içeren PBS ile tedaviyi içeriyordu.
    4. Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için %10 FBS içeren PBS-T ile bölümleri 30 dakika boyunca bloke edin.
  2. İmmünofloresan boyama
    NOT: Boyama için aşağıdaki antikorlar kullanılabilir: C3, IgG, Asetilkolin reseptör işaretleyicisi α-bungarotoksin.
    1. Seçilen antikorları% 1 FBS içeren PBS-T'de seyreltin.
    2. Karanlıkta oda sıcaklığında 2,5 saat inkübe edin.
    3. Bölümleri %1 FBS içeren PBS-T ile yıkayın.
    4. DAPI ile karşı leke.
    5. Kesitleri 4 °C'de karanlık ve nemli bir ortamda floresan mikroskobu altında incelenene kadar saklayın.
    6. Görüntüleme ve analiz gerçekleştirin.
      NOT: Her bölümdeki bungarotoksin (BTX) pozitif nöromüsküler bağlantılar bir floresan mikroskobu kullanılarak sayılmalıdır. 20x büyütme ile görüntü yakalayın. Analiz için, BTX ve C3 veya IgG pozitif nöromüsküler kavşaklar mikroskop altında manuel olarak sayıldı. Seri bölümlerdeki toplam BTX etiketli bağlantılara göre çift pozitif bağlantıların yüzdesi analiz için kullanılmalıdır.

6. Batı lekesi

  1. Protein izolasyonu ve miktar tayini
    1. Çırpılmış kas örnekleri kullanın.
    2. Proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile lizis tamponu hazırlayın.
    3. Numune ağırlığına eşit 0,5 mm zirkonyum oksit boncuklar ve lizis tamponunun hacminin 2 katı ekleyin.
    4. Numuneleri bir homojenizatör kullanarak homojenize edin.
    5. Lizatı 12.000 x g'da 4 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin.
    6. Protein lizatı içeren süpernatanı toplayın.
    7. Protein konsantrasyonunu ölçmek için bir BCA test kiti veya Bradford reaktifi kullanın.
    8. Lizis tamponu ile protein örneklerini istenen konsantrasyona hazırlayın. Kuyucuk başına 25 μg protein, AChR'yi göstermek için etkilidir.
  2. SDS-PAGE jel elektroforezi
    1. Protein örneklerini 4x Laemmli tamponu ile karıştırın.
    2. Numuneleri denatüre etmek için 95 °C'de 5 dakika ısıtın.
    3. Bir SDS-PAGE jelinin kuyucuklarına eşit miktarda protein ve bir protein merdiveni yükleyin.
    4. Jeli 30 dakika boyunca 200 V'ta çalıştırın (süre farklı güç kaynakları arasında değişebilir).
  3. Protein transferi
    1. Nitroselüloz membran ile yarı kuru transfer için, her bileşeni bir soğuk transfer tamponu ile ıslatın.
    2. Transfer sandviçini ayarlayın: sünger, filtre kağıdı, jel, membran, filtre kağıdı, sünger.
      NOT: Katmanlar arasında kabarcık olmadığından emin olun. Transfer programı, üreticinin talimatlarına göre seçilmelidir (bkz. Malzeme Tablosu).
  4. Bloke etme ve antikor inkübasyonu
    1. Membranı %5 yağsız kuru sütte veya TBST'de BSA'da oda sıcaklığında 1 saat boyunca hafifçe sallayarak bloke edin.
    2. Membranı% 2.5 bloke edici tampon içinde seyreltilmiş birincil antikor (anti-AChR) ile inkübe edin, gece boyunca 4 ° C'de hafif sallama ile.
    3. Membranı TBST'de her biri 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
    4. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 2.5 bloke edici tampon içinde seyreltilmiş HRP konjuge ikincil antikor (IgG HRP) ile membranı inkübe edin.
    5. Membranı TBST'de her biri 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
  5. Algılama ve görüntüleme
    1. ECL substratını üreticinin talimatlarına göre membrana uygulayın.
    2. Bir görüntüleme sistemi kullanarak kemilüminesan sinyali yakalayın.
    3. Görüntüleme yazılımı kullanarak bantları analiz edin.
      NOT: Bozulmayı önlemek için proteinleri ve reaktifleri daima buz üzerinde tutun. Kontrol olarak bir temizlik proteini (örneğin, beta-aktin, alfa-tubulin veya GAPDH) çalıştırarak eşit yüklemeyi sağlayın. En iyi sonuçlar için antikor konsantrasyonlarını ve inkübasyon sürelerini optimize edin. AChR proteininin MuSK ile aşılanmış farelerde daha az eksprese edildiğini göstermek çok önemlidir.

7. Ev Yapımı Anti-MuSK IgG ELISA

  1. MuSK antijenini 100 μL karbonat bikarbonat tamponunda (Plaka Kaplama) kuyu başına 0.5 μg konsantrasyonda hazırlayın.
  2. 100 μL antijen solüsyonunu bir immünoassay plakasının her bir oyuğuna dağıtın.
  3. Plakayı gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
  4. Plakayı %0,5 Tween 20 (yıkama solüsyonu) içeren PBS ile yıkayın.
  5. Spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke etmek için plakayı %5 FBS (bloke etme solüsyonu) içeren PBS ile 4 ° C'de 90 dakika inkübe edin (Blokaj).
  6. Optimizasyon çalışmaları yüksek seviyelerde MuSK-IgG gösterdiğinden, serum örneklerini 1/50.000 oranında bloke edici solüsyonda seyreltin.
  7. Blokajdan sonra yıkamadan, seyreltilmiş serum örneklerini kuyucuklara ekleyin.
  8. Plakayı 37 °C'de 90 dakika inkübe edin.
  9. Plakayı yıkama solüsyonu ile üç kez yıkayın.
  10. HRP konjuge anti-fare IgG ikincil antikoru (ab97023) 1/5000 bloke edici çözelti içinde seyreltin.
  11. Her oyuğa 100 μL seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin.
  12. Plakayı 37 °C'de 90 dakika inkübe edin.
  13. Plakayı yıkama solüsyonu ile üç kez yıkayın.
  14. Her oyuğa 100 μL TMB substrat ekleyin ve renk değişimini gözlemleyin.
  15. 2 M H2SO 4 kullanarak reaksiyonu uygun bir zamanda durdurun.
  16. Bir spektrofotometre kullanarak optik yoğunluğu 450 nm'de ölçün.
  17. Tutarlılık için tüm numuneleri çift kopyalar halinde ve aynı plaka üzerinde gerçekleştirin.
    NOT: Standart numune seyreltmeleri mevcut olmadığından analiz için optik yoğunluk değerleri kullanılmalıdır. Negatif kontrol kuyularında (boş) renk değişimi olmamalıdır. Hızlı bir renk değişimi beklenir, bu nedenle kuyucuklardaki reaksiyonu hemen durdurmak için durdurma çözeltisi yakınlarda tutulmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MuSK Deneysel Otoimmün Myastenia Gravis (EAMG) modelinin değerlendirilmesinde ve doğrulanmasında, hastalık modelinin başarılı bir şekilde indüksiyonunu ve karakterizasyonunu göstermek için birkaç temel parametre ve deneysel sonuç kritik öneme sahiptir. Aşağıda, MuSK EAMG modelinin kurulduğunu doğrulayan temsili sonuçlar yer almaktadır.

Klinik puanlama
Fareler, standart bir klinik skorlama sistemi kullanılarak myastenia gravis'in klinik semptomları açısından izlenir ve puanl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Murine MuSK-EAMG, kas güçsüzlüğü, bulber kas güçsüzlüğüne bağlı kilo kaybı, dolaşımdaki anti-MuSK antikorları ve azalmış kas AChR'si açısından hem klinik hem de immünopatojenik yönleriyle insan MuSK-MG'yi taklit eder. Bu MuSK-EAMG modeli için kilometre taşları ve beklenen zaman çizelgesine gelince, kas güçsüzlüğünün klinik belirtileri ikinci aşılamadan sonraki ilk hafta içinde ortaya çıkmalıdır. Farelerin yaklaşık% 5'i ilk aşılamadan sonra hastalık belirtileri geliştirebilir. İki aşılama...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyan edilecek herhangi bir açıklama yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırmanın tamamlanmasında İstanbul Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü ve Aziz Sancar Deneysel Tıp Enstitüsü'nün destek ve katkılarına teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
125I-&alfa;-bungarotoksinInvitrogenBTX T1175
2-MetilbütanSigma-AldrichM32631
40 & mu; m Hücre SüzgeciNEST258369
96 kuyulu Maxisorp plakasıSigma-AldrichM9410
Adjuvan EksikBecton Dickinson & Co.& nbsp;263910
Anti-AChR alfa1 AlomoneANC-001
Anti-fare IgG HRPAbcamab97023
Bullet Blender StormNext AdvanceDoku homojenizatör
C3NovusNB200-540G
Karbonat-Bikarbonat TamponMerckC3041
KriyostatLeicaCM1860  
Dinamometre Imada DST-50NMuromachiMK380Si
Floresan mikroskobuLeicaDM4M
Luer kilitli cam şırıngaISOLAB094.92.005
IgGAbcamab96871
Mikroplaka Fotometre, Multiskan FCThermo Scientific51119000
Fare Cerrahi KitiKent Bilimsel OrtaklığıINSMOUSEKIT
Mycobacterium tuberculosis H37RaBecton Dickinson & Co.& nbsp;
OCT BileşikAgar ScientificAGR1180
Şırıngaları, 1 mLBecton Dickinson & Co.& nbsp;
Şırıngalar, 2 mLB. Braun7389
Üniversal hayvan tutucuMerckZ756911-1EA
WesternBright Sirius-Western lekelenme tespit kitiAdvanstaK-12043-D10ECL
231141309625

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Keesey, J. A. A history of treatments for myasthenia gravis. Semin Neurol. 24, 5-16 (2004).
  2. Giannoccaro, M. P., Wright, S. K., Vincent, A. In vivo mechanisms of antibody-mediated neurological disorders: Animal models and potential implications. Front Neurol. 10, 1394(2020).
  3. Verschuuren, J. J. G. M., Plomp, J. J. Passive transfer models of myasthenia gravis with muscle-specific kinase antibodies. Ann N Y Acad Sci. 1413 (1), 111-118 (2018).
  4. Berman, P. W., Patrick, J. Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis. J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).
  5. Kusner, L. L., et al. Guidelines for pre-clinical assessment of the acetylcholine receptor-specific passive transfer myasthenia gravis model-recommendations for methods and experimental designs. Exp Neurol. 270, 3-10 (2015).
  6. Koneczny, I., et al. IgG4 autoantibodies in organ-specific autoimmunopathies: Reviewing class switching, antibody-producing cells, and specific immunotherapies. Front Immunol. 13, 834342(2022).
  7. Ulusoy, C., et al. Dental follicle mesenchymal stem cell administration ameliorates muscle weakness in MuSK-immunized mice. J Neuroinflammation. 12, 231(2015).
  8. Yilmaz, V., et al. Effects of teriflunomide on B cell subsets in MuSK-induced experimental autoimmune myasthenia gravis and multiple sclerosis. Immunol Invest. 50 (6), 671-684 (2021).
  9. Koral, G., et al. Silencing of Fcrlb by shRNA ameliorates MuSK-induced EAMG in mice. J Neuroimmunol. 383, 578195(2023).
  10. Trakas, N., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. J. Development of a highly sensitive diagnostic assay for muscle-specific tyrosine kinase (MuSK) autoantibodies in myasthenia gravis. J Neuroimmunol. 240-241, 79-86 (2011).
  11. JoVE, Science Education Database. Blood withdrawal I. JoVE Sci Educ. , (2023).
  12. Peretti, A. L., et al. Action of vanillin (Vanilla planifolia) on the morphology of tibialis anterior and soleus muscles after nerve injury. Einstein (Sao Paulo). 15 (2), 186-191 (2017).
  13. Van Der Meulen, J. H., Kuipers, H., Stassen, F. R., Keizer, H. A., Van Der Vusse, G. J. High energy phosphates and related compounds, glycogen levels and histology in the rat tibialis anterior muscle after forced lengthening and isometric exercise. Pflugers Arch. 420 (3-4), 354-358 (1992).
  14. Kucukerden, M., et al. MuSK-induced experimental autoimmune myasthenia gravis does not require IgG1 antibody to MuSK. J Neuroimmunol. 295-296, 84-92 (2016).
  15. Ulusoy, C., et al. Preferential production of IgG1, IL-4 and IL-10 in MuSK-immunized mice. Clin Immunol. 151 (2), 155-163 (2014).
  16. Mori, S., et al. Antibodies against muscle-specific kinase impair both presynaptic and postsynaptic functions in a murine model of myasthenia gravis. Am J Pathol. 180 (2), 798-810 (2012).
  17. Wu, B., Goluszko, E., Huda, R., Tuzun, E., Christadoss, P. Experimental autoimmune myasthenia gravis in the mouse. Curr Protoc Immunol. Chapter 15, Unit 15.23. , (2011).
  18. Klooster, R., et al. Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice. Brain. 135 (Pt 4), 1081-1101 (2012).
  19. Vergoossen, D. L. E., et al. Functional monovalency amplifies the pathogenicity of anti-MuSK IgG4 in myasthenia gravis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (13), e2020635118(2021).
  20. Oh, S., et al. Precision targeting of autoantigen-specific B cells in muscle-specific tyrosine kinase myasthenia gravis with chimeric autoantibody receptor T cells. Nat Biotechnol. 41 (9), 1229-1238 (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Otoimm n ModelDeneysel Otoimm n MiyasteniaMuSK AntikorlarN rom sk ler Bile kemm nosupresif TedaviHayvan ModeliKomple Freund Adjuvan
Video yakında

İlgili makaleler