Kalsiyum iyon kanallarının aktivasyonunu incelemek için tek hücreli kalsiyum görüntüleme

Özet

Bu makale, Fura-2/boyası ile tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme kullanılarak hücrelerde kalsiyum iyonu (Ca 2+) konsantrasyonlarının gerçek zamanlı, kantitatif izlenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, floresan yoğunluk oranları aracılığıyla verimli boya yüklemesi ve Ca²⁺ seviyelerinin doğru bir şekilde hesaplanmasını sağlayarak araştırma uygulamaları için basit ve hızlı bir yaklaşım haline getirir.

Özet

Tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme, sıcaklık, voltaj, doğal bileşik ve kimyasallar ve diğerleri gibi çeşitli stimülasyonlarla aktive edilen Ca²⁺ kanallarının incelenmesi için gereklidir. Öncelikle mikroskopi görüntüleme teknolojisine ve ilgili Ca^{2 +} indikatörü Fura-2 /'ye (, Asetoksimetil esterin kısaltmasıdır) dayanır. Hücrelerin içinde, Fura-2/, esterazlar tarafından Fura-2'ye hidrolize edilir, bu da serbest sitoplazmik Ca^{2 +} ile geri dönüşümlü olarak bağlanabilir. Maksimum uyarma dalga boyu, bağlanma üzerine 380nm'den 340nm'ye (Ca²⁺ ile doyurulduğunda) kayar. Yayılan floresan yoğunluğu, kantitatif olarak bağlı Ca^{2 +} konsantrasyonu ile ilişkilidir. 340/380 oranının ölçülmesiyle, sitoplazmadaki Ca²⁺ konsantrasyonu belirlenebilir ve farklı numuneler arasında floresan probun yükleme verimliliğindeki değişikliklerden kaynaklanan hatalar ortadan kaldırılabilir. Bu teknoloji, birden fazla hücredeki Ca²⁺ değişikliklerinin gerçek zamanlı, nicel ve eşzamanlı olarak izlenmesine olanak tanır. Sonuçlar " içinde saklanır. Hızlı olan ve sezgisel değişim eğrileri oluşturan sonraki analizler için XLSX" formatı, algılama verimliliğini büyük ölçüde artırır. Farklı deneysel perspektiflerden, bu makale, endojen veya aşırı eksprese edilmiş kanal proteinlerine sahip hücrelerde Ca²⁺ sinyallerini tespit etmek için bu teknolojinin kullanımını listeler. Bu arada, hücreleri aktive etmek için farklı yöntemler de gösterildi ve karşılaştırıldı. Amaç, okuyucuların tek hücreli Ca²⁺ görüntülemenin kullanımı ve uygulamaları hakkında daha net bir anlayış sağlamasını sağlamaktır.

Giriş

Ca^{2 +}, kas kasılması 1, sinir iletimi 2, sekresyon³ ve gen ekspresyonu ⁴ gibi çeşitli hücresel fonksiyonları düzenleyerek hücresel sinyal iletiminde çok önemli bir rol oynar ve böylece çoklu fizyolojik süreçleri etkiler. Anormal Ca²⁺ konsantrasyonları aritmiler⁵, pıhtılaşma bozuklukları⁶ ve hormonal dengesizlikler⁷ gibi hastalıklara yol açabilir. Bu nedenle, hücre içi Ca^{2 +} konsantrasyon değişikliklerinin mekanizmalarını incelemek büyük önem taşımaktadır.

Hücrelerde Ca^{2 +} konsantrasyonunun düzenlenmesinde, yüksek Ca^{2 +} seçici kalsiyum salınımı ile aktive edilen kalsiyum (CRAC) kanalları⁸ ve TRP ailesinin⁹ seçici olmayan katyon kanalları dahil olmak üzere çeşitli iyon kanalları yer alır. Bu iyon kanalları, geleneksel Çin tıbbında¹¹ bulunan sıcaklık¹⁰, bileşikler ve aktif bileşenler gibi uyaranlarla aktive edilebilir ve Ca²⁺ ile ilgili çeşitli fizyolojik süreçlerde çok önemli bir rol oynar.

Hücre içi Ca^{2 +} konsantrasyon değişikliklerinin etkili bir şekilde izlenmesi, özellikle kalsiyum sinyal düzenlemesinin birçok terapötik yaklaşımda merkezi bir rol oynadığı geleneksel Çin tıbbı alanında, Ca^{2 +} ile ilgili iyon kanallarını incelemek için gereklidir. Şu anda, hücre içi Ca^{2 +} 'yı ölçmek için birincil yöntemler iki türe ayrılabilir: elektriksel ve optik ölçümler. Elektriksel ölçüm yaklaşımı, Ca²⁺ akışı¹² nedeniyle hücre zarı potansiyelindeki değişiklikleri değerlendirmek için yama-kelepçe tekniğini kullanır.

Optik ölçümde, floresan problar spesifik olarak Ca^{2 +} 'ya bağlanır ve araştırmacıların hücresel floresan yoğunluğundaki değişiklikleri izlemelerine olanak tanır. Yaygın optik yöntemler arasında floresan protein bazlı ve floresan boya bazlı teknikler bulunur. Floresan protein bazlı yöntemlerde, araştırmacılar hücrelerde Cameleon¹³ ve GCaMP¹⁴ gibi Ca^{2 +} 'ya duyarlı floresan proteinleri aşırı eksprese edebilir ve sitoplazmik Ca^{2 +} konsantrasyonlarındaki kaymaları gözlemlemek için floresan mikroskobu veya akış sitometrisi kullanarak floresan sinyal değişikliklerini izleyebilirler. Ek olarak, araştırmacılar bu proteinleri farelerde aşırı eksprese edebilir ve hücre içi Ca²⁺ konsantrasyonlarının gerçek zamanlı in vivo veya doku düzeyinde izlenmesi için iki fotonlu floresan mikroskobu kullanabilir, bu da yüksek çözünürlük ve derin doku penetrasyonu sağlar¹⁰.

Floresan boya bazlı yöntemler için, yaygın olarak kullanılan Ca^{2 +} probları arasında Fluo-3 /, Fluo-4 / ve Fura-2 /¹⁰ bulunur. Araştırmacılar, hücre zarını geçen ve hücre içinde kalan aktif bileşikler (örneğin, Fluo-3, Fluo-4 ve Fura-2) oluşturmak için hücre içi esterazlar tarafından parçalanan bu floresan probları içeren bir çözelti içinde hücreleri inkübe ederler. Bu problar, serbest ligand formlarında minimal floresan sergilerler, ancak hücre içi^Ca2+'ya bağlandığında güçlü floresan yayarlar, böylece sitoplazmik^Ca2+ konsantrasyonlarındaki değişiklikleri gösterir. Diğer floresan proteinler ve boyalarla karşılaştırıldığında, Fura-2 tipik olarak 340 nm ve 380 nm dalga boylarında uyarılır. Hücre içi serbest^Ca2+'ya bağlandığında, Fura-2, uyarma dalga boyu tepe noktasını 380 nm'den 340 nm'ye hareket ettiren bir absorpsiyon kaymasına uğrarken, 510 nm'ye yakın emisyon zirvesi değişmeden kalır. Floresan yoğunluğu ile bağlı Ca²⁺ konsantrasyonu arasında nicel bir ilişki vardır ve bu iki uyarma dalga boyunda floresan yoğunluk oranını ölçerek hücre içi Ca²⁺ konsantrasyonunun hesaplanmasına izin verir. Oran ölçümleri, fotoağartma, floresan prob sızıntısı, düzensiz yükleme ve hücre kalınlığındaki farklılıkların etkilerini azaltarak daha güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar verir (Şekil 1).

Tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme sistemleri, hücre içi Ca 2+ konsantrasyonlarını tespit etmek için öncelikle mikroskopi tekniklerini ve Ca²⁺ indikatörü Fura-2 /'yi kullanır. Bu sistemler, bir floresan mikroskobu, bir Ca²⁺ görüntüleme ışık kaynağı ve floresan görüntüleme yazılımından oluşur ve aynı anda birden fazla hücrenin sitoplazmasındaki Ca²⁺ değişikliklerinin gerçek zamanlı, nicel olarak izlenmesini sağlar (görüş alanı başına 50 hücreye kadar). Sonuçlar, sonraki analizler için ".xlsx" formatında kaydedilir. Sistem, hızlı bir analiz hızı sunar (bir görüş alanındaki bir hücre grubunu analiz etmek için yaklaşık 1 dakika) ve sezgisel değişim eğrileri oluşturarak algılama verimliliğini önemli ölçüde artırır. Tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme, Ca²⁺ ile ilgili kanalları incelemek için önemli bir teknik yaklaşımdır ve iyon kanalı ile ilgili biyomedikal araştırmalarda önemli bir değere sahiptir. Tek hücreli kalsiyum görüntüleme teknolojisindeki uygulamasının, geleneksel Çin tıbbının altında yatan mekanizmalar üzerine yapılan araştırmaları büyük ölçüde ilerletmesi bekleniyor.

Protokol

Deneysel yöntemler, Tsinghua Üniversitesi ve Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi'nin IACUC yönergeleri tarafından onaylandı ve takip edildi. Bu protokol, birkaç yenidoğan farenin derisinden izole edilen primer keratinositler dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri için tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme yöntemlerini tanıtır (doğumdan sonraki üç gün içinde, cinsiyet randomize yavrularla, C57BL / 6 fareler). Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Hücre hazırlığı

NOT: Birincil hücreler, endojen hedef genlere sahip hücre hatları veya aşırı eksprese edilmiş plazmitlerle transfekte edilenlerin tümü tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme için uygundur. Bu çalışmada kullanılan plazmitler, Profesör Xiao Bailong'un Tsinghua Üniversitesi'ndeki laboratuvarından elde edildi. Bu plazmitler, insan STIM1 ile GFP floresan proteini, insan Orai1 ile DsRed floresan proteini, tavşan TRPV1 ile mRuby floresan proteini ve ayrıca kırmızı floresan proteini mCherry dizilerinin faj plazmit vektörlerine¹⁰ dahil edilmesiyle oluşturulmuştur.

1. 24 oyuklu bir plakada 8 mm çapında steril cam slaytlar hazırlayın. Her oyuğa 500 μL poli-D-lizin (PDL) tamponu (DPBS'de 50 μg/mL) ekleyin.
2. Kaplamaya izin vermek için slaytları 37 °C'de 1 saat inkübe edin, ardından kaplama solüsyonunu bir pipet kullanarak atın.
3. Slaytları DPBS ile bir kez yıkayın ve daha sonra kullanmak üzere bir kenara koyun.
4. Birincil hücreleri ve hücre hatlarını özel yetiştirme yöntemlerine göre ayrı ayrı kültürleyin¹⁰.
5. Tohum hücreleri, oyuk başına yaklaşık 1.5 x^{10 5} hücre yoğunluğunda hazırlanan 24 oyuklu plakaya yerleştirin. Hücreleri, lamel üzerine yapıştıktan sonra Ca²⁺ görüntüleme için kullanın.
6. Plazmitleri aşırı eksprese eden hücreler için, 1^:1 oranında Lipofectamine 2000 (veya Lipofectamine 3000) transfeksiyon reaktifi kullanarak hedef plazmiti (1 μg/kuyu) ^10,15 transfekte edin ve yaklaşık 24 saat boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.
   NOT: Daha büyük eksprese edilen proteinler için daha uzun bir inkübasyon süresi gerekebilir.

2. Fura-2 / çalışma çözeltisinin hazırlanması

1. 50 μg Fura-2 / tozu içeren bir tüpe 50 μL dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin ve 1 μg / μL'lik bir Fura-2 / stok çözeltisi hazırlamak için iyice karıştırın.
2. Fura-2/stok çözeltisini ve Pluronic F-127'yi Hank'in 1.3 mM Ca²⁺ içeren tamponuna karıştırın.
   NOT: Çalışma çözeltisindeki Fura-2/ve Pluronic F-127'nin nihai konsantrasyonu 2.5 μg/mL'dir. Hank'in tamponu, 1x HBSS tamponuna 10 mM HEPES eklenerek hazırlanır.
3. Fura-2/çalışma solüsyonunu ışıktan korumak için alüminyum folyo kullanın.

3. Tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme için hücre ön işlemi

1. Hücreli cam slaytları, yıkama için Hank'in tamponunu içeren 24 oyuklu yeni bir plakaya aktarın.
2. Tamponu bir pipet kullanarak atın ve her oyuğa 500 μL Fura-2 / çalışma tamponu ekleyin.
3. Prob yüklemesine izin vermek için oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika inkübe edin.
4. Fura-2 / çalışma tamponunu çıkarın ve fazla Fura-2 /'yi ortadan kaldırmak için hücreleri Hank'in tamponu ile üç kez yıkayın. Hücreler artık kullanıma hazırdır.

4. Ca²⁺ görüntüleme sisteminin başlatılması

NOT: Bu çalışmada Ca²⁺ görüntüleme için floresan mikroskobu kullanılmıştır.

1. Aşağıdaki bileşenleri sırayla başlatın: DG4 ışığı (ksenon lamba), kamera, beyaz ışık kaynağı, mikroskop aşaması denetleyicisi, mikroskop, bilgisayar ve floresan görüntüleme yazılımı.
   NOT: İyon kanallarının sıcaklığa göre aktivasyonunu tespit ediyorsanız, aşağıdaki bileşenleri de açın: perfüzyon sistemi, ısıtma sistemi, sıcaklık kontrolörü ve sıvı sirkülasyonlu ısıtma/soğutma cihazı.

5. Hücresel Ca^{2 +} yanıt prosedürü

1. Floresan görüntüleme yazılımını açın (bkz. Malzeme Tablosu).
   1. Protokol'ü seçin, ardından Dosya'yı ve ardından Protokolü Yükle'yi seçin. Protokolü seçin ve Tamam'a tıklayın.
   2. Denemeyi yapılandırın (menü listesinde).
   3. Yeni Deneme'yi seçin.
2. Perfüzyon odasını mikroskobun üzerine monte edin.
   NOT: Objektifin hasar görmesini önlemek için hazneleri takarken veya çıkarırken kaba netleme düğmesini kullanarak objektifi her zaman tam olarak indirin.
3. Fura-2 / ile muamele edilmiş hücre slaytlarını çıkarın ve bunları Hank'in tamponunu içeren hazneye yerleştirin.
4. Perfüzyon sistemini başlatın.
5. 20x DIC hedefini seçin ve beyaz ışık altında odağı ayarlayın.
6. Görev çubuğundaki Cfg Exp'e tıklayın.
   1. Görüntüleme için istediğiniz florları seçin.
   2. Ekranda alım sıklığını ve görüntü ayarlarını belirleyin (Alma: 340, 380, GFP'yi kontrol edin; Edinme Aralığı: 1 s; Kaydetme Aralığı: 1 s).
7. Odak
   1. Deney kontrol panelinde, Odak düğmesine tıklayın.
   2. Edinme süresini (genellikle 100 ms) ayarlayın ve gerektiği gibi kazanın, ardından "bu dalga için tasarruf edin".
      NOT: UV ışığı için maruz kalma süresi yerine kazanç kullanın.
   3. Odaklama için istediğiniz dalga boyunu seçin (örn. 380) ve Odaklamayı Başlat'a tıklayın.
   4. Dürbünle görüntüyü bilgisayara geçirin.
   5. Dürbünle soluk yeşilimsi bir rengin göründüğünden emin olun.
   6. Hücrelere odaklanın, hedefi yakınlaştırmak için önce kaba odaklamayı, ardından ince odaklamayı kullanın.
      NOT: Mikroskop, sahneye çok yaklaşırsa bip sesi çıkaracaktır. Böyle bir durumda, hedefi indirin, plakayı sahneye yeniden hizalayın ve tekrar odaklanın. Lazer kaynaklı hücre hasarını azaltmak için odaklanmak için harcanan zamanı en aza indirin.
   7. Odaklama işlemi sırasında hücrelerin floresan yoğunluğunu kontrol edin.
   8. Maruz kalma süresini ve kazancını değiştirerek hücrelerin floresan yoğunluğunu ayarlayın.
      NOT: 340 ve 380 için maruz kalma süresi ve kazancı tutarlı olmalıdır.
   9. İyi bir odak elde edildiğinde, görüntüyü bilgisayara geçirmek için mikroskop üzerindeki düğmeye basın.
   10. Bilgisayardaki en keskin görüntüyü elde etmek için gerektiği gibi yeniden odaklanın, ardından Odaklamayı Durdur'a tıklayın.
8. GFP pozitif hücreleri bulmak için alternatif prosedür
   1. Hücrelere iyi bir odaklanma elde etmek için önce 340/380 prosedürünü kullanın.
   2. FITC'yi seçin ve ardından Odaklamayı Başlat'a tıklayın.
   3. GFP pozitif hücreleri bulmak için sahne denetleyicisini kullanın.
   4. Görünümü bilgisayara geçirin ve ardından Odaklamayı Durdur'a tıklayın.
9. Bölge seçimi
   1. Menü çubuğundaki Bölge düğmesine tıklayın.
   2. Tercih ettiğiniz aydınlatma tipini seçin (340/380/FITC/TRITC). FITC ve TRITC filtreleri, hedeflenen plazmitleri aşırı eksprese eden hücreler için sırasıyla GFP ve mCherry/DsRed/mRuby için seçilir; aksi takdirde Fura-2'yi seçin.
      NOT: Açıkça yuvarlatılmış veya aşırı maruz kalmış floresan proteinleri olanlar gibi kötü durumda veya ölü hücreleri seçmekten kaçının.
   3. Görüntüleri Al'a ve ardından Tamam'a tıklayın.
   4. Yeni bir pencere açılacaktır; Oval araca tıklayarak ve ardından hücrenin üzerine tıklayarak hücreleri seçin.
   5. Hedef protein (FITC veya TRITC) tarafından taşınan floresan altında istenen hücreleri seçin. 380 nm koşulu altında hedef proteini eksprese etmeyen kontrol hücrelerini seçin.
   6. Daireye sağ tıklayarak ve ardından Bölgeyi Sil'i seçerek bir bölgeyi geri alın.
   7. Son bölge olarak bir arka plan örneği seçin ve kimlik numarasını kaydedin.
   8. Kaydet'e ve ardından Bitti'ye tıklayın.
10. Arka plan çıkarma
    1. Referanslar menü düğmesine tıklayın.
    2. Arka plan bölgesinin numarasını belirtin.
       NOT: Arka plan en son seçilen bölgeyse, çok yüksek bir sayı girildiğinde otomatik olarak en son seçilen bölgeye geçilir.
    3. Referansları Çıkar kutusunu işaretleyin ve ardından Tamam'a tıklayın.
11. Günlük verileri
    1. Deneme kontrol panelindeki Günlük Verileri düğmesine tıklayın.
       NOT: Görüntüler, yalnızca deneyi daha sonra tekrarlama isteği varsa kaydedilir; Normalde, sadece veri kutusunu işaretlemek yeterlidir.
    2. Tercih edilen veri dosyası türünü soran bir istemin göründüğünden emin olun; Seçme. XLSX formatı önerilir.
    3. ".xlsx" türünde bir çalışma sayfası açılacaktır. Çalışma sayfasını simge durumuna küçültmek, ekranda yer kaplamasını önleyecektir.
12. Veri toplama
    1. Kontrol panelinin Time Lapse (Hızlandırılmış Çekim) bölümünde, veri toplama aralığını 1 s olarak ayarlayın.
       NOT: Bu, gerçek ihtiyaçlara göre ayarlanabilir.
    2. Denemeyi başlatmak için deney kontrol panelinde Zero Clock (Sıfır Saat ) ve Acquire (Edin ) öğesine tıklayın. Taban çizgileri, seçilen hücre bölgelerinin her birini gösteren bir grafikte görünür olacaktır.
    3. Deneysel gereksinimlere göre hücreler üzerinde bir dizi tedavi gerçekleştirin.
    4. Hücrelerin sıcaklık tepkisini gözlemlemek için, perfüzyon sistemindeki tamponu bir sıcaklık kontrolörü kullanarak uygun bir sıcaklığa ısıtın.
    5. İlaçların hücreler üzerindeki etkilerini gözlemlemek için perfüsün veya manuel olarak ilaç içeren tampon ekleyin ve hücre değişikliklerini kaydedin.
    6. Veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra Duraklat'a tıklayın.
       NOT: Veri alımı duraklatılabilir ve saat, deney sırasında herhangi bir zamanda sıfırlanabilir.
    7. Verileri kaydedin ve analiz edin.
13. Denemeyi sonlandırmak için Dosya ve Denemeyi Kapat'a tıklayın ve protokolü kaydetmek için iletişim kutusunda Hayır'ı seçin.
14. Menüde Yeni'ye tıklayarak yeni bir deneme açın ve işlemi tekrarlayın.
15. Kapat
    1. Yazılımı kapatın ve verileri bilgisayardan aktarın.
    2. Başlatma prosedürünü tersine çevirin.
    3. Saatleri kayıt sayfasına kaydedin ve herhangi bir karışıklığı temizleyin.
16. Veri analizi
    1. Hücre içi^Ca2+ konsantrasyonunu Fura-2 340/380 oranı ile temsil edin veya karşılık gelen^Ca2+ konsantrasyonuna dönüştürün.

Sonuçlar

Sıcaklık tepkisi algılama
Birincil keratinosit
Primer keratinositler yenidoğan farelerden izole edildi ve belirlenen protokollere^{göre hazırlandı 10}. Bu hücreler, cam slaytlar içeren 24 oyuklu plakalara tohumlandı. Fura-2 probunun yüklenmesini takiben, Şekil 2A'da gösterildiği gibi, hücre morfolojisinin net bir görselleştirmesini elde etmek için odak mikroskop altında 380 nm dalga boyunda ayarlandı. Prob işlem sırasında başarılı bir şekilde yüklenmezse, hücreler görünmez. Odadaki hücre dışı tampon, hücreler için en uygun koşulları sağlamak için bir perfüzyon sistemi aracılığıyla sürekli olarak değiştirildi. Sıcaklık kontrol sistemi perfüzyon sistemine bağlandı ve hücre dışı tampondaki sıcaklık değişikliklerini kontrol ederek hücresel termal tepkilerin tespit edilmesini sağladı. Bu işlem, hücre dışı tamponun kademeli olarak ısıtılmasını ve ardından kademeli olarak soğutulmasını içeriyordu.

Tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme sistemi, çeşitli deneysel koşullar altında hücre içi Ca²⁺ konsantrasyonundaki değişiklikleri izlemek için kullanıldı. Şekil 2B'de gösterildiği gibi, keratinositler, ısıtmaya maruz kaldıklarında belirgin bir termal tepki ve soğutma fazı sırasında gözle görülür bir tepki sergilediler. Özellikle, bu sıcaklık tepkisi, bu yanıttan birincil olarak sorumlu olan STIM1 geni silindiğinde ortadan kalktı (Şekil 2C)¹⁰. Tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme, çeşitli dış uyaranlara yanıt olarak hücre içi Ca²⁺ konsantrasyonundaki gerçek zamanlı değişikliklerin gözlemlenmesine olanak tanıyarak hücresel davranışın ve sinyalizasyonun ayrıntılı analizini sağlar.

HEK293T hücrelerin hedef plazmitleri aşırı eksprese etmesi
HEK293T hücreler, deneysel yönteme göre cam slaytlar içeren 24 oyuklu bir plakaya tohumlandı. Hücreler daha sonra STIM1 / Orai1 ile aşırı eksprese edildi ve aracılı termal tepkileri, birincil hücreler için yukarıda tarif edilenle aynı yöntem kullanılarak tespit edildi. Hedef plazmidi aşırı eksprese eden hücreler söz konusu olduğunda, plazmit tarafından TRITC veya FITC dalga boyları altında taşınan kırmızı veya yeşil floresan proteinler ile gösterildiği gibi, karşılık gelen plazmiti eksprese eden hücrelerin seçilmesiyle başarılı transfeksiyon doğrulandı. Bu deney için, FITC altında tespit edilen ve yeşil floresan yayan GFP ve TRITC altında tespit edilen ve kırmızı floresan yayan DsRed ile STIM1-GFP/Orai1-DsRed plazmitleri kullanıldı. Boş mCherry'yi (TRITC) aşırı eksprese eden hücreler negatif kontrol olarak kullanıldı. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, FITC altında gözlemlenen floresan hücreler, ısıtma ve soğutma işlemleri sırasında termal tepkilerinin seçilmesini ve kaydedilmesini sağlayan STIM1'in başarılı bir şekilde ekspresyonunu göstermiştir. Transfekte edilmeyen hücreler negatif kontrol görevi gördü. Şekil 3B , STIM1/Orai1'in, Şekil 3C'de gösterilen negatif kontrolün aksine, soğutma işlemi sırasında önemli bir termal tepki sergilediğini göstermektedir.

İlaç yanıtı tespiti
Tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme teknolojisi, bileşiklere hücre tepkilerini tespit etmek için de kullanılabilir. Termal yanıt tespiti için hücre hazırlığı, yukarıda tarif edilenle aynıdır. İlaç yanıtı ile termal yanıt arasındaki fark, termal yanıtın genellikle bir perfüzyon sistemi aracılığıyla hücre dışı tamponun sıcaklığını değiştirerek hücrelerin aktivasyonunu gerektirmesi gerçeğinde yatmaktadır, bileşikler ise perfüzyon yoluyla veya bir pipet kullanılarak doğrudan eklenerek uygulanabilir. Bir pipetle doğrudan ekleme, kullanılan bileşik miktarını etkili bir şekilde koruyabilir; Bununla birlikte, ortaya çıkan eğri her zaman perfüzyon yoluyla elde edilen kadar görsel olarak çekici olmayabilir.

Şekil 4'ü örnek olarak alırsak, Şekil 4A, hücre dışı Ca 2+ konsantrasyonu ve Siklopiazonik Asit (CPA) içeriğinin SOCE'yi indüklemek için bir perfüzyon sistemi aracılığıyla sırayla değiştirildiği STIM1/Orai1'in depoyla çalıştırılan kalsiyum girişi (SOCE) yanıtını göstermektedir. Şekil 4B'de, TRPV1 agonisti kapsaisin, TRPV1 plazmidini aşırı eksprese eden hücrelere bir pipet kullanılarak doğrudan eklenir. Kapsaisin, TRPV1'i aktive edebilir ve hücre dışı^Ca2+ akışını indükleyebilir.

Şekil 1: Fura-2'nin şematik diyagramı. Fura-2, hücre biyolojisinde yaygın olarak kullanılan, Ca²⁺ 'ya 1:1 oranında seçici olarak bağlanan ve floresan yayan bir Ca²⁺ floresan probudur. Asidik bir bileşik olarak oldukça polar yapısı nedeniyle, Fura-2 hücrelere giremez. Hücre geçirgenliğini arttırmak için, Fura-2 /'yi oluşturmak üzere negatif grubu üzerinde asetoksimetil () ile konjuge edilir. Bu modifikasyon ester çözünürlüğünü arttırır ve negatif yükü ortadan kaldırır. Hücrelerin içinde, Fura-2/, esterazlar tarafından Fura-2'ye hidrolize edilir, bu da serbest sitoplazmik Ca^{2 +} ile geri dönüşümlü olarak bağlanabilir. Bağlanma üzerine, maksimum uyarma dalga boyu 380 nm'den 340 nm'ye kayar (Ca^{2 +} ile doyurulduğunda). Yayılan floresan yoğunluğu, kantitatif olarak bağlı Ca^{2 +} konsantrasyonu ile ilişkilidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Primer keratinositlerin sıcaklık tepkisi tespiti. (A) 20x objektif lens altında gözlenen yenidoğan farelerden alınan keratinositlerin fura-2 boyaması. (B,C) Tek hücreli Ca^{2 +} görüntüleme sistemi kullanılarak WT keratinositlerinin (B) ve STIM1 nakavt keratinositlerinin (C) sıcaklık tepkisi. Büyütme: 20x. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: HEK293T hücrelerinde aşırı eksprese edilen STIM1-GFP/Orai1-Dsred'in sıcaklık tepkisi tespiti. (A) FITC kapsamında STIM1-GFP'yi eksprese eden pozitif hücreleri gösteren temsili bir şekil. (B,C) Tek hücreli bir Ca²⁺ görüntüleme sistemi tarafından tespit edilen ilgili plazmiti ifade eden HEK293T hücrelerinin sıcaklık tepkisi. Büyütme: 20x. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme kullanılarak ilaç yanıtı tespiti. (A) STIM1 / Orai1'i aşırı eksprese eden HEK293T hücrelerinin SOCE yanıtı. Hücre dışı tampon, bir perfüzyon sistemi kullanılarak Ca^{2 +} içerenden Ca^{2 +} içermeyen hale getirilir. Ca^{2 +} yokluğunda, endoplazmik retikulumdan Ca^{2 +} 'yı tüketmek için CPA eklenir. Hücre dışı tampon daha sonra, mağaza tarafından işletilen Ca^{2 +} girişini temsil eden hücre dışı Ca^{2 +} akışını indüklemek için Ca^{2 +} içeren bir tampon ile değiştirilir. Tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme, bu işlemlerin neden olduğu sitozolik Ca²⁺ konsantrasyonundaki değişiklikleri dinamik olarak kaydetmek için kullanılır. (B) mRuby'nin TRPV1-mRuby'yi aşırı eksprese eden hücreleri HEK293T, burada mRuby, TRPV1 proteininin transfeksiyon durumunu kontrol etmek için kullanılan bir floresan proteindir. Kapsaisin bir pipet kullanılarak eklenirken, Ca^{2 +} akışı tek hücreli Ca^{2 +} görüntüleme ile kaydedilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme sistemlerinin uygulaması kapsamlıdır ve keratinositler, kök hücreler¹⁶, karaciğer hücreleri, kalp hücreleri¹⁷, podositler¹⁸, bağışıklık hücreleri ve hedef proteinleri aşırı eksprese eden hücre hatları^10,19 dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde Ca²⁺ sinyallerinin incelenmesini sağlar. Bu teknik, hücresel Ca²⁺ konsantrasyonlarının değişikliklerini ve mutlak değerlerini ölçer ve Ca²⁺ ile ilgili iyon kanallarının araştırılmasında çok önemli bir rol oynar ve bu da onu iyon kanalı araştırma laboratuvarlarında temel araçlardan biri haline getirir.

Araştırma ilerledikçe, Ca^{2 +} sinyaliyle ilgili iyon kanallarının önemi, geleneksel Çin tıbbı araştırmacıları arasında artan bir tanınırlık kazanmıştır. Geleneksel Çin tıbbının temel konularını iyon kanallarının merceğinden çözmeyi amaçlıyorlar. Örneğin, Çin tıbbının sıcak ve soğuk özellikleri, "sıcağı soğukla tedavi etmek ve soğuğu ısıyla tedavi etmek" ilkesini bildirir. Ca²⁺ sinyallerine aracılık eden birçok sıcaklığa duyarlı iyon kanalı bu prensiple yakından ilişkilidir. Ayrıca, çok sayıda Çin tıbbı, anti-enflamatuar etkiler yoluyla terapötik etkiler gösterir ve çoklu Ca^{2 +} ile ilgili iyon kanalları, inflamasyonun^{düzenlenmesinde} önemli roller oynar 20.

Bu ilaçların farmakolojik özelliklerini moleküler düzeyde ortaya çıkarmak için geleneksel Çin tıbbındaki önemli bileşenlerin iyon kanalı özellikleri üzerindeki etkilerini incelemek esastır. Şu anda, geleneksel Çin tıbbındaki araştırmacılar öncelikle ilgili iyon kanallarının ekspresyonunu tespit etmeye odaklanmaktadır. Bununla birlikte, geleneksel Çin tıbbının Ca²⁺ ile ilgili iyon kanalları üzerindeki etkilerine ilişkin nispeten sınırlı gerçek zamanlı izleme vardır ve altta yatan birçok mekanizma belirsizliğini korumaktadır.

Bu araştırma grubu, STIM1/Orai1, STIM1/Orai3, TRPA1¹⁰ ve TRPV1 gibi Ca²⁺ ile ilgili iyon kanallarının araştırılmasına adanmıştır ve tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme sistemlerinin uygulanması ve ayrıntılı kullanımı konusunda bilgilidir. Bu çalışma, tek hücreli Ca²⁺ görüntülemenin farklı araştırma amaçları için özel kullanımını göstermekte ve okuyuculara kapsamlı uygulamaları ve ayrıntılı kullanımı hakkında kapsamlı bir anlayış sağlamayı amaçlamaktadır. Daha önce yayınlanmış ilgili çalışmalarla²¹ karşılaştırıldığında, bu araştırma, tek hücreli Ca²⁺ görüntülemenin çeşitli açılardan ve diğer sistemlerle birlikte uygulanması için yeni bir bakış açısı ve metodoloji sunmaktadır. Örneğin, hedef genlerin endojen ekspresyonuna sahip birincil hücreler veya hücre hatları, tek hücreli Ca 2 + görüntüleme sistemi kullanılarak çeşitli uyarıcı faktörler altında hücre içi Ca^{2 +} sinyallerindeki değişiklikleri gerçek zamanlı olarak izlemek için Fura-2 probu ile doğrudan yüklenebilir. Ek olarak, hücre hatlarında floresan proteinleri içeren plazmitlerin aşırı ekspresyonu gerçekleştirilebilir. Başlangıçta, hücreler daha önce tarif edildiği gibi Fura-2 probu ile yüklenir. Daha sonra, hedef proteinin başarılı bir şekilde ekspresyonuna sahip hücreler, FITC veya TRITC sinyallerine dayalı olarak seçilir ve bunlar daha sonra Fura-2 Ca^{2 +} sinyallerinin gerçek zamanlı izlenmesi için vurgulanır.

Tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme, deneysel hedeflere göre diğer çeşitli deney düzenekleri ile entegre edilebilen bir tespit sistemidir. Örneğin, sıcaklığa duyarlı iyon kanallarının sıcaklık değişikliklerine tepkisinin tespit edilmesi gerekiyorsa, sistem, hücre dışı tampon çözeltisinin¹⁹ sıcaklığını kontrol ederek hücre içi Ca²⁺ sinyallerindeki değişiklikleri aynı anda izlemek için bir sıcaklık kontrol işletim sistemi ve bir perfüzyon cihazı ile birleştirilebilir. Bu yaklaşım, ilgili iyon kanallarının sıcaklığa tepkisini doğrular. Ayrıca, tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme, ilgili deneyler için ilgili ilaç dağıtım cihazları veya diğer hücre stimülasyon cihazları ile de birleştirilebilir.

Aslında, tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme sistemi yalnızca 340/380 oranının gerçek zamanlı olarak izlenmesine değil, aynı zamanda belirli ayarlar aracılığıyla FITC veya TRITC değerlerinin de izlenmesine olanak tanır. Ayrıca, tek hücreli kalsiyum görüntüleme teknolojisi, sadece sitoplazmada değil, aynı zamanda endoplazmik retikulumda (ER) da kalsiyum iyonu konsantrasyonundaki değişiklikleri tespit etmek için uygulanabilir ve geniş kapsamlı uygulamalarını gösterir¹⁹. Bu sistem tarafından elde edilen veriler, sonuçları elde etmek için hızlı bir şekilde analiz edilebilen ".xlsx" bir formatta eşit şekilde kaydedilir. Değişim eğrisi, hücrelerin aktivasyon durumunun ve özelliklerinin hızlı bir şekilde anlaşılmasını kolaylaştırır ve uygun bir Ca²⁺ sinyal izleme sistemi oluşturur. Bu araştırma raporunun, geleneksel Çin tıbbı araştırmaları alanında tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme sisteminin yaygın olarak uygulanmasını etkin bir şekilde teşvik edeceği ve geleneksel Çin tıbbının kodunun çözülmesine katkıda bulunacağı tahmin edilmektedir.

Bununla birlikte, tek hücreli kalsiyum görüntüleme teknolojisinin uygulanmasının, yüksek verimli taramanın elde edilememesi gibi belirli sınırlamaları vardır. Örneğin, bazı deneylerde, belirli bir kanalın agonistlerini veya antagonistlerini taramak gerektiğinde, kalsiyum görüntüleme tek tek taramayı gerektirir ve bu çok zaman alıcıdır. Bu gibi durumlarda, bu tekniğin, tek hücreli kalsiyum görüntüleme ile sonuçları daha fazla doğrulamadan önce yüksek verimli tarama gerçekleştirmek için FLIPR²² gibi diğer teknolojilerle birleştirilmesi gerekebilir. Ek olarak, tek hücreli kalsiyum görüntülemeden elde edilen görüntüler, konfokal mikroskopiye¹⁵ kıyasla daha düşük çözünürlüğe sahip olan geleneksel floresan mikroskobundan üretilir. Bu nedenle, tek hücreli kalsiyum görüntüleme teknolojisini, ilgili avantajlarından yararlanmak için diğer tekniklerle etkili bir şekilde birleştirmek, bu alandaki zorlukların ele alınmasında önemli bir yaklaşımdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kamera	: Nikon
Capsaicine	Sigma	211275
CL-100 sıcaklık kontrol cihazı	Warner Instruments
Siklopiazonik Asit (CPA)	Sigma	C1530
DG-4 ışık	Sutter Instrument Company
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Amresco	231
DPBS	Thermofisher	14190144
Floresan görüntüleme yazılımı (MetaFluor, Ücretli yazılım)	Moleküler Cihazlar
Floresan mikroskobu	Nikon
Fura-2/	Invitrogen	F1201
HBSS tampon	Gibco	14175103
HEPES	Sigma	H3375
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
Pluronic F-127	Beyotime	ST501
poli-D-lizin	Beyotime	ST508
SC-20 sıvı sirkülasyonlu ısıtma/soğutma cihazı	Harvard Aygıtı
Beyaz ışık kaynağı	Nikon