Kalsiyum iyon kanallarının aktivasyonunu incelemek için tek hücreli kalsiyum görüntüleme

Özet

Bu makale, Fura-2/boyası ile tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme kullanılarak hücrelerde kalsiyum iyonu (Ca 2+) konsantrasyonlarının gerçek zamanlı, kantitatif izlenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, floresan yoğunluk oranları aracılığıyla verimli boya yüklemesi ve Ca²⁺ seviyelerinin doğru bir şekilde hesaplanmasını sağlayarak araştırma uygulamaları için basit ve hızlı bir yaklaşım haline getirir.

Özet

Tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme, sıcaklık, voltaj, doğal bileşik ve kimyasallar ve diğerleri gibi çeşitli stimülasyonlarla aktive edilen Ca²⁺ kanallarının incelenmesi için gereklidir. Öncelikle mikroskopi görüntüleme teknolojisine ve ilgili Ca^{2 +} indikatörü Fura-2 /'ye (, Asetoksimetil esterin kısaltmasıdır) dayanır. Hücrelerin içinde, Fura-2/, esterazlar tarafından Fura-2'ye hidrolize edilir, bu da serbest sitoplazmik Ca^{2 +} ile geri dönüşümlü olarak bağlanabilir. Maksimum uyarma dalga boyu, bağlanma üzerine 380nm'den 340nm'ye (Ca²⁺ ile doyurulduğunda) kayar. Yayılan floresan yoğunluğu, kantitatif olarak bağlı Ca^{2 +} konsantrasyonu ile ilişkilidir. 340/380 oranının ölçülmesiyle, sitoplazmadaki Ca²⁺ konsantrasyonu belirlenebilir ve farklı numuneler arasında floresan probun yükleme verimliliğindeki değişikliklerden kaynaklanan hatalar ortadan kaldırılabilir. Bu teknoloji, birden fazla hücredeki Ca²⁺ değişikliklerinin gerçek zamanlı, nicel ve eşzamanlı olarak izlenmesine olanak tanır. Sonuçlar " içinde saklanır. Hızlı olan ve sezgisel değişim eğrileri oluşturan sonraki analizler için XLSX" formatı, algılama verimliliğini büyük ölçüde artırır. Farklı deneysel perspektiflerden, bu makale, endojen veya aşırı eksprese edilmiş kanal proteinlerine sahip hücrelerde Ca²⁺ sinyallerini tespit etmek için bu teknolojinin kullanımını listeler. Bu arada, hücreleri aktive etmek için farklı yöntemler de gösterildi ve karşılaştırıldı. Amaç, okuyucuların tek hücreli Ca²⁺ görüntülemenin kullanımı ve uygulamaları hakkında daha net bir anlayış sağlamasını sağlamaktır.

Giriş

Ca^{2 +}, kas kasılması 1, sinir iletimi 2, sekresyon³ ve gen ekspresyonu ⁴ gibi çeşitli hücresel fonksiyonları düzenleyerek hücresel sinyal iletiminde çok önemli bir rol oynar ve böylece çoklu fizyolojik süreçleri etkiler. Anormal Ca²⁺ konsantrasyonları aritmiler⁵, pıhtılaşma bozuklukları⁶ ve hormonal dengesizlikler⁷ gibi hastalıklara yol açabilir. Bu nedenle, hücre içi Ca^{2 +} konsantrasyon değişikliklerinin mekanizmalarını incelemek büyük ....

Protokol

Deneysel yöntemler, Tsinghua Üniversitesi ve Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi'nin IACUC yönergeleri tarafından onaylandı ve takip edildi. Bu protokol, birkaç yenidoğan farenin derisinden izole edilen primer keratinositler dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri için tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme yöntemlerini tanıtır (doğumdan sonraki üç gün içinde, cinsiyet randomize yavrularla, C57BL / 6 fareler). Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Hücre hazırlığı

NOT: Birincil....

Sonuçlar

Sıcaklık tepkisi algılama
Birincil keratinosit
Primer keratinositler yenidoğan farelerden izole edildi ve belirlenen protokollere^{göre hazırlandı 10}. Bu hücreler, cam slaytlar içeren 24 oyuklu plakalara tohumlandı. Fura-2 probunun yüklenmesini takiben, Şekil 2A'da gösterildiği gibi, hücre morfolojisinin net bir görselleştirmesini elde etmek için odak mikroskop altında 380 nm dalga boyunda ayarlandı. Prob işlem sırasında başarılı bir şek.......

Tartışma

Tek hücreli Ca²⁺ görüntüleme sistemlerinin uygulaması kapsamlıdır ve keratinositler, kök hücreler¹⁶, karaciğer hücreleri, kalp hücreleri¹⁷, podositler¹⁸, bağışıklık hücreleri ve hedef proteinleri aşırı eksprese eden hücre hatları^10,19 dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde Ca²⁺ sinyallerinin incelenmesini sağlar. Bu teknik, hücresel .......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kamera	: Nikon
Capsaicine	Sigma	211275
CL-100 sıcaklık kontrol cihazı	Warner Instruments
Siklopiazonik Asit (CPA)	Sigma	C1530
DG-4 ışık	Sutter Instrument Company
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Amresco	231
DPBS	Thermofisher	14190144
Floresan görüntüleme yazılımı (MetaFluor, Ücretli yazılım)	Moleküler Cihazlar
Floresan mikroskobu	Nikon
Fura-2/	Invitrogen	F1201
HBSS tampon	Gibco	14175103
HEPES	Sigma	H3375
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
Pluronic F-127	Beyotime	ST501
poli-D-lizin	Beyotime	ST508
SC-20 sıvı sirkülasyonlu ısıtma/soğutma cihazı	Harvard Aygıtı
Beyaz ışık kaynağı	Nikon