Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Eucommia ulmoides Kabuğu Özü Kullanılarak Çinko Bazlı Nanomalzemelerin Formülasyonu ve Yara İyileştirme Potansiyelleri

1.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67416

⸱

27 Aralık 2024

 ,  ,  , 
1Biological Experiment Center, School of Life Sciences, Central South University, 2Department of Cell Biology, School of Life Sciences, Central South University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, Eucommia ulmoides ağaç kabuğundan elde edilen poliizopren bakımından zengin sulu ekstraktı kullanarak çinko oksit (ZnO) nanopartiküllerini sentezlemek için bir protokol sunuyoruz. Sentezlenen ZnO nanopartiküllerinin insan göbek veni endotel hücreleri (HUVEC'ler) üzerinde sergilediği yara iyileşme potansiyeli, basit, uygun maliyetli ve verimli bir yöntem olan çizik testi kullanılarak değerlendirildi.

Özet

Eucommia ulmoides'in kabuğundan elde edilen sulu ekstrakt, sayısız sağlık yararına sahip zengin bir biyoaktif bileşik kaynağı olarak hizmet eder. Buradaki protokol, Eucommia ulmoides kabuğu aracılı poliizopren bakımından zengin sulu ekstrakt kullanılarak çinko oksit (ZnO) nanopartiküllerinin hazırlanmasını araştırmayı amaçlamaktadır. Bu arada, önerilen protokol, süreci kolaylaştırarak yara iyileştirici materyalin hazırlanması ile ilişkilidir. Ek olarak, sentezlenen nanopartiküllerin (Eu-ZnO-NP'ler) yara iyileşme potansiyeli, bir insan göbek veni endotel hücresi (HUVEC) tek tabakası üzerinde basit bir çizik testi kullanılarak değerlendirildi. Eu-ZnO-NP'lerle 24 saatlik tedaviden sonra, HUVEC hücrelerinin hücre proliferasyonu ve göçü değerlendirildi. Çalışmanın sonunda, farklı konsantrasyonlarda Eu-ZnO-NP ile muamele edilmiş çizik tek tabakada hücre proliferasyonu ve migrasyonu gözlenirken, kontrol hücrelerinde zayıf hücre migrasyonu ve proliferasyon oranları gözlenmiştir. Seçilen konsantrasyonlardan 20 μg/mL Eu-ZnO nanomalzemeler daha iyi hücre göçü ve gelişmiş yara iyileşme potansiyeli gösterdi.

Giriş

Tıbbi bitkiler ve bitki türevli bileşiklerin çok sayıda sağlık yararı sergilediği gösterilmiştir1. Dünya Sağlık Örgütü (WHO), küresel nüfusun %80'inin birinci basamak sağlık hizmetleri için geleneksel şifalı bitkilere bağımlı olduğunu bildirmiştir. Çin, Geleneksel Çin Tıbbı (TCM) uygulamalarıyla tanınmakta ve popülerdir. Çin şifalı bitkilerinin çeşitli hastalıkları tedavi ettiği ve biyolojik potansiyelleri için kullanıldığı bildirilmiştir. Tıbbi bitkiler, biyoaktif bileşikler ve çoklu terapötik roller için rezervuar görevi görür. Yaraları tedavi etmek için şifalı bitkiler de kullanılmıştır. Kronik yaraları tedavi etmek için uygulanan çeşitli yaklaşımlar vardır2. Yakın zamanda yapılan bir araştırma, şifalı bitkilerin iyileşme için uygun koşullar sağlayarak, enfeksiyonlardan arınmış ve doku yenilenmesini hızlandırarak yara iyileşme sürecine dahil olduğunu ortaya koymuştur3. Bu arada, şifalı bitkilerde bulunan biyoaktif bileşiklerin antibakteriyel ve antifungal özellikleri, yaraları iyileştirmeye ve yara iyileşme verimliliğini hızlandırmaya yardımcı olabilir4.

Metal bazlı nanomalzemeler, biyouyumlu ve biyobozunur olmaları nedeniyle dikkat çekmektedir. Yaygın olarak Çin kauçuk ağacı olarak adlandırılan Eucommia ulmoides, Çin'in yerli bir türüdür. Ağacın yaprakları ve kabuğu tıbbi uygulamalarda kullanılır. En önemlisi, bitki türleri Çin'in orta ve batı eyaletlerinde yetiştirildi5. Peng ve ark.6, yaprakların, kabukların ve staminat çiçeklerin terapötik potansiyele sahip yenilebilir olduğunu bildirmiştir. Ek olarak, E. ulmoides lignans, fenilpropanoidler, iridoidler, flavonoidler, amino asitler ve eser elementlerin en iyi kaynağı olarak hizmet eder. Ayrıca kabuk, kan basıncını kontrol etmek, yağı düşürmek ve antiosteroporoz ve hipoglisemik aktiviteyi teşvik etmek gibi çeşitli biyomedikal uygulamalar için kullanılmıştır7. Bu nedenle, kuşkusuz, E. ulmoides kabuğu ekstraktının geleneksel Çin tıbbında uzun bir geçmişi olduğu kanıtlanmıştır. Daha önceki raporlar, doğal polimer poliizoprenin Eucommia ulmoides8'in kabukları açısından zengin olduğunu öne sürdü. Yukarıdaki bilgilere dayanarak, bu çalışma, Eucommia ulmoides kabuğu özlerini kullanarak nanomalzemeler üretmeyi amaçlamaktadır. Çinkonun kabuk özü ile kombinasyonu, nanomalzemelerin hazırlanması için çekici bir seçimdir. Genel olarak, mevcut araştırmanın nihai amacı, yara iyileşme uygulamaları için yeni bir hibrit nanomalzeme üretmekti.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Ekstrakt hazırlanmadan önce, elde edilen kabuk materyali deiyonize su kullanılarak iki kez yıkanmış ve gölgeli bir yerde kurutulmuştur. Gölgede kurutulmuş kabuklar hava geçirmez bir kapta saklandı.

1. Eucommia ulmoides kabuğu ekstraktının hazırlanması

  1. Eucommia ulmoides ağacından toplanan kabuğu makas yardımıyla küçük parçalara ayırın.
  2. Kıyılmış kabuk malzemelerini çift damıtılmış su ile iki kez yıkayın.
  3. Kabuk parçalarını 37 °C'nin altında 24 saat gölgeli koşullarda kurutun.
    1. Kurutma işleminin süresini, çalışma için kullanılan kabuk miktarına göre ayarlayın. Kabukları küçük parçalar halinde doğramadan önce kabukların tamamen kuruduğundan emin olun. Doğrudan güneş ışığından kaçının.
  4. 20 g gölgede kurutulmuş kabuğu 220 mL steril çift damıtılmış su içeren konik bir şişeye aktarın ve 130 °C'de 20 dakika ısıtın.
    1. Reaksiyon çözeltisinin rengi açık sarıya döner. Çözeltinin rengindeki değişiklikler 10 dakika sonra ortaya çıkar. Çözeltinin 10 dakika daha ısınmasına izin verin. Numune miktarına göre çift damıtılmış suyun hacmini ayarlayın.
  5. Poliizopren içeren ham ekstraktı daha sonra kullanmak üzere 4 °C'de saklayın. İplik benzeri bir yapının oluşumu, ekstraktlarda poliizopren varlığını gösterir.

2. E. ulmoides kabuğu aracılı ZnO nanopartiküllerinin biyosentezi

  1. 500 mL'lik bir şişeye 1 M Çinko nitrat dihidrat Zn (NO3)2 ila 50 mL deiyonize su ekleyin. Manyetik karıştırma (60 RPM) kullanarak sürekli karıştırın. Zn (NO3)2'nin tamamen çözünmesi 30 dakika sürer.
  2. 20 mL 1 M Çinko nitrat dihidrat (Zn (NO3)2) çözeltisine damla damla 15 mL E. ulmoides kabuğu özütü ekleyin.
  3. Kapalı reaksiyon karışımını manyetik bir karıştırıcıya yerleştirin, karıştırıcıyı açın ve 60 saat boyunca (3 RPM) döndürün.
  4. PH'ı 9'a ayarlamak için reaksiyon karışımına damla damla 1 N sodyum hidroksit NaOH (3 mL) çözeltisi ekleyin. Çözelti karışımı süt beyazına dönene ve pH 9'dan fazla olmayana kadar NaOH ekleyin. ZnO nanopartikülleri oluştuğunda çözelti süt beyazı bir renk alır.
    1. 1 M Çinko nitrat dihidrat Zn (NO3)2 çözelti hacminin hazırlanması deneysel ihtiyaçlara göre değişebilir. Taze hazırlanmış kabuk özlerini kullandığınızdan emin olun. PH 10'u aşarsa, nanopartikül agregasyonu ile sonuçlanacaktır.
  5. Sentezlenen Eu-ZnO-NP'leri 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: Kirlilikler hemen yıkama ile önlenebilir.
  6. Yıkanmış Eu-ZnO-NP'leri bir cam tabakta toplayın ve sıcak hava fırınında 1 saat boyunca 45-50 °C'de kurutun.
    NOT: Eu-ZnO-NP'ler 30 dakikadan fazla tutulursa, nanopartiküllerin fizikokimyasal yapısını etkileyebilir

3. TEM kullanarak boyut onayı

  1. DDH 2O'da 1 mg / mL nanopartikül hazırlayınve bakır ızgaraya 5 μL Eu-ZnO-NP numunesi yükleyin ve tamamen kuruyana kadar bekleyin. Bakır ızgaraya yüklemeden önce numuneyi vorteksleyin.
  2. Eu-ZnO-NP'leri içeren bakır ızgarayı TEM numune tutucusuna yükleyin ve 50x ve 100x büyütmelerde görüntüler elde edin.
    NOT: Bu adım sırasında ızgaralar cımbız kullanılarak alınmalıdır.

4. Sitotoksisite değerlendirmesi

  1. 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 1 ×10 4 HUVEC tohumlayın ve %5 CO2 37 °C inkübatöre koyun.
  2. % 90 birleşik hücrelere 10 μL çeşitli konsantrasyonlarda 0, 10, 20, 30, 40 ve 50 μg / mL Eu-ZnO-NP ekleyin ve 24 saat inkübe edin.
  3. İnkübasyondan sonra, hücreleri rahatsız etmeden eski ortamı çıkarın, 90 μL taze DMEM ortamı içeren her oyuğa 10 μL CCK-8 çözeltisi ekleyin ve% 5 CO2, 37 ° C'lik bir inkübatörde inkübe edin.
  4. Bir spektrofotometre kullanarak 450 nm'de CCK8 çözeltisi ile muamele edilen hücrelerin emilimini ölçün.
    NOT: Absorbanstaki değişiklikleri önlemek için absorbans hemen 15 dakika içinde ölçülmüştür.

5. Çizik testi için HUVEC hücrelerinin hazırlanması

  1. %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 pen-strep içeren Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyerini içeren 12 kuyucuklu kültür plakasına uygun (1 × 10,5) miktarda HUVEC tohumlayın ve %5 CO2 37 °C inkübatörde inkübe edin.
    1. Çizik tahlilini gerçekleştirmeden önce, ters çevrilmiş mikroskobu kullanarak birleşmeyi kontrol edin.
      NOT: Çizik testini gerçekleştirmek için gereksinimlere göre 6 kuyulu plaka veya 12 kuyulu plaka kullanılacaktır ve hücre yoğunluğu farklı kültür plakaları için değişecektir. % 70 -% 80 birleşik hücrelerin kullanımı idealdir ve çizik testi için önerilir. DMEM ortamının hacmi, çalışmada kullanılan kültür plakalarına bağlı olarak değişebilir. Örneğin, 6 oyuklu plaka 1-1.5 mL kültür ortamı gerektirir ve 12 oyuklu plaka 0.5-1.0 mL büyüme ortamı gerektirir.
  2. 200 μm yara genişliğine sahip temsili yarada steril 200 μL pipet ucu kullanarak nazikçe çizik yapın.
  3. Hücre tek tabakasında çizik yapmak için kullanılan ucun hücrelerin yüzeyi ile temas ettiğinden emin olun.
    NOT: Her çizik yapıldığında steril ucu kullanın.
  4. Ortamın tamamını çıkarın ve ayrılan hücreleri çıkarmak için 1 mL 1x PBS kullanarak HUVEC tek tabakasını yıkayın.
    NOT: Ayrılmış tek katmanlı hücrelerin ilgili kuyucuklardan tamamen çıkarıldığından emin olun. Yara oluşturulan bölgede herhangi bir hasar meydana gelmediğini onaylayın.
  5. Sentezlenen Eu-ZnO-NP'lerin yara iyileşme potansiyelini değerlendirmek için, kuyucuklara 0 (Kontrol), 10 ve 20 μg/mL konsantrasyonlarda %10 FBS içeren tam bir ortam ile birleştirilmiş Eu-ZnO nanopartikülleri ekleyin. Deney plakalarını %5 CO2 inkübatörde 37 °C'de tutun.
    NOT: Taze, eksiksiz ortamı eklerken hücre tek katmanını rahatsız etmeyin. Tek katmanlı hücrelerin inkübasyon sırasında rahatsız edilmediğinden emin olun.
  6. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak 0 saat ve 24 saatte mikrofoto elde edin. Yara kapanmasını farklı zaman aralıklarında ölçmek için açıklama aracını kullanın.
    1. Aşağıdaki formülü kullanarak yara kapanma yüzdesini hesaplayın: Yara kapanması (%) = [(0 saatte hücre göçü (μm cinsinden) - 24 saatte hücre göçü (μm cinsinden))/ 0 saatte hücre göçü (μm cinsinden)] x 100.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu araştırma, Eucommia ulmoides ağacının kabuklarını kullanarak nanopartikülleri sentezlemeyi amaçlamaktadır. Kabuk materyali gölgeli bir ortamda tamamen kurutulmuştur (Şekil 1). Kabuk malzemeleri, numuneleri 130 °C'de 20 dakika ısıtarak sıcak su sulu ham ekstraktını hazırlamak için kullanıldı. Sıcaklık ve süredeki hafif bir değişiklik, fitobileşikleri bozabilir ve onları sulu ekstraktın hazırlanması için uygun hale getirmeyebilir. E. ulmoides'in sulu ham kabuk ekstraktları...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

E. ulmoides kabuğu, tohumu ve yapraklarının çok sayıda sağlık yararı gösterdiğine inanılmaktadır. Sonuçlarımız, EU-ZnO nanopartiküllerinin sentezinin basit ve uygun maliyetli bir yaklaşım kullanılarak elde edildiğini göstermiştir. Sulu ekstrakt, nanopartikülleri sentezlemek için kullanıldı. Kabuk materyalinin yüksek sıcaklıklarda ısıtılması, bazı bitki bileşenlerinin bozulmasına ve ekstraksiyon verimliliğinin düşmesine neden olabilir. Sulu bitki ekstraktında bulunan fitobileşenl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok

Teşekkürler

Yazarlar, enstrümantasyon olanaklarını sağladıkları için Çin'in Changsha kentindeki Orta Güney Üniversitesi Hücre Biyolojisi Bölümü'ne içtenlikle teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
12 oyuklu plakaNEST703011Hücre kültürü ve tahlil için kullanılır
SantrifüjSCILOGEXSC1406Nanopartikülleri kolloidal karışımdan ayırmak için kullanılır
Santrifüj Tüpü – 15 mLBIOFILCFT-312150Sentezlenen çözeltiyi santrifüjlemek için 
Santrifüj tüpü – 5 mLBiosharp BS-50-CM-SNanopartikülleri depolamak için
CO2 inkübatörüThermo scientific3010HUVEC hücrelerini kültürlemek için
Gürültüden arındırılmış suMilliporeUygulanamaz Ekstraktın hazırlanması için 
DMEM ortamıCytivaSH30243.01Hücre kültürü çalışmaları için kullanılır
HuniTermo bilimsel42600060Filtrasyon sırasında filtre kağıdını tutmak için
Cam beherlerBorosilikat 1102-50Sulu ekstraktı hazırlamak için kullanılır
Sıcak hava fırınıGenetimesUygulanamaz Nanopartikülleri kurutmak ve toz halinde toplamak için kullanılır
Manyetik karıştırıcıKYLIN-BELLGL-5250-ANanopartikül sentezi için kullanılır
MikroskopNikon EclipseTs2Mikrofotofotoğraf çekmek için kullanılır 
Petri kabıNEST753001Nanopartikülleri toplamak için kullanılır 
Pipet 1 mLLab Science YEA17AD0055580Belirli hacimde çözelti/ekstrakt almak/eklemek için
Pipet uçları 1 mLSAINING 3014200-TBelirli hacimde çözelti/ekstrakt almak/eklemek için
PTFE Manyetik Karıştırıcı Karıştırma ÇubuklarıLAN RANUygulanamaz Nanomalzeme sentez işlemi için kullanılır
Sodyum hidroksitSigma Alrich71690Sentez sırasında pH'ı ayarlamak için kullanılır
Paslanmaz MakasDeli6034Kabuk malzemelerini doğramak için kullanılır
T25 doku kültürü şişesiNEST707001Hücreleri korumak için kullanılır 
Tartı Terazisi Radwag AS220R2Kimyasalları tartmak için kullanılır 
Whatman filtre kağıdı No.1NewstarGB/T1914-2017Sentez için ekstraktı filtrelemek için kullanılır
Çinko nitrat Sigma Alrich13778-30-8Nanoparçacık için öncü olarak kullanılır' S sentezi

Kaynaklar

  1. Williamson, E. M., Liu, X., Izzo, A. A. Trends in use, pharmacology, and clinical applications of emerging herbal nutraceuticals. Br. J. Pharmacol. 177 (6), 1227-1240 (2020).
  2. Cedillo-Cortezano, M., Martinez-Cuevas, L. R., López, J. A. M., Barrera López, I. L., Escutia-Perez, S., Petricevich, V. L. Use of medicinal plants in the process of wound healing: a literature review. Pharmaceuticals. 17 (3), 303(2024).
  3. Budovsky, A., Yarmolinsky, L., Ben-Shabat, S. Effect of medicinal plants on wound healing. Wound Repair Regen. 23 (2), 171-183 (2015).
  4. Yazarlu, O., et al. Perspective on the application of medicinal plants and natural products in wound healing: A mechanistic review. Pharmacol Res. 174, 105841(2021).
  5. Zhu, M. Q., Sun, R. C. Eucommia ulmoides Oliver: a potential feedstock for bioactive products. J Agric Food Chem. 66 (22), 5433-5438 (2018).
  6. Peng, M., Zhou, Y., Liu, B. Biological properties and potential application of extracts and compounds from different medicinal parts (bark, leaf, staminate flower, and seed) of Eucommia ulmoides: A review. Heliyon. 10 (6), e27870(2024).
  7. Xing, Y. Y., et al. Inhibition of rheumatoid arthritis using bark, leaf, and male flower extracts of Eucommia ulmoides. Evid Based Complement Alternat Med. 2020, 3260278(2020).
  8. Guo, M., et al. Quantitative detection of natural rubber content in Eucommia ulmoides by portable pyrolysis-membrane inlet mass spectrometry. Molecules. 28 (8), 3330(2023).
  9. Yusof, H. M., Rahman, N. A., Mohamad, R., Zaidan, U. H., Samsudin, A. A. Biosynthesis of zinc oxide nanoparticles by cell-biomass and supernatant of Lactobacillus plantarum TA4 and its antibacterial and biocompatibility properties. Sci Rep. 10, 19996(2020).
  10. Gosens, I., et al. Impact of agglomeration state of nano-and submicron sized gold particles on pulmonary inflammation. Part Fibre Toxicol. 7 (1), 37(2010).
  11. Zare, Y. Study of nanoparticles aggregation/agglomeration in polymer particulate nanocomposites by mechanical properties. Compos A Appl Sci Manuf. 84, 158-164 (2016).
  12. Kim, M. G., et al. Effects of calcination temperature on the phase composition, photocatalytic degradation, and virucidal activities of TiO2 nanoparticles. ACS Omega. 6 (16), 10668-10678 (2021).
  13. Aydin Acar, C., Gencer, M. A., Pehlivanoglu, S., Yesilot, S., Donmez, S. Green and eco-friendly biosynthesis of zinc oxide nanoparticles using Calendula officinalis flower extract: Wound healing potential and antioxidant activity. Int Wound J. 21 (1), e14413(2024).
  14. Sana, S. S., et al. Crotalaria verrucosa leaf extract mediated synthesis of zinc oxide nanoparticles: assessment of antimicrobial and anticancer activity. Molecules. 25 (21), 4896(2020).
  15. Zhang, H., Liang, Z., Zhang, J., Wang, W. P., Zhang, H., Lu, Q. Zinc oxide nanoparticle synthesized from Euphorbia fischeriana root inhibits the cancer cell growth through modulation of apoptotic signaling pathways in lung cancer cells. Arab J Chem. 13 (7), 6174-6183 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Çinko Oksit NanoparçacıklarEucommia Ulmoides EkstraktıNanomalzeme SenteziÇizik Deneyiİnsan Endotel HücreleriHücre GöçüPoliizopren EkstraktıSitotoksisite DeğerlendirmesiManyetik Karıştırma
Eucommia ulmoides Kabuğu Özü Kullanılarak Çinko Bazlı Nanomalzemelerin Formülasyonu ve Yara İyileştirme Potansiyelleri
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.