Geleneksel Çin tıbbı (TCM), doğal tedavi seçeneklerinin zengin bir hazinesini temsil eder ve dünya çapında çeşitli sağlık ihtiyaçlarının karşılanmasında önemli bir rol oynar. Bu çalışma, Flos sophorae immaturus'un temel aktif bileşeni olan rutinin ekstraksiyonu, ayrılması ve fizikokimyasal özellikleri üzerine kapsamlı bir deneysel araştırma sunmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Geleneksel Çin Tıbbı Flos sophorae immaturus'tan Flavonoid Rutinin Ekstraksiyonu ve Karakterizasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Geleneksel Çin tıbbı (TCM), uzun süredir doğal terapötik çözümlerin zengin bir deposu olarak hizmet vermiş ve dünya çapında çeşitli sağlık ihtiyaçlarının karşılanmasında önemli bir rol oynamıştır. TCM'de kullanılan çeşitli bitkiler arasında Sophora flavescens , çok çeşitli tıbbi özellikleri ile bilinir. Uygulaması yüzyıllar öncesine dayanmaktadır ve özellikle kardiyovasküler hastalıkların tedavisindeki terapötik faydaları nedeniyle modern tıpta oldukça değerli olmaya devam etmektedir. Biyoaktif bir flavonoid bileşiği olan rutin, bitkiler aleminde yaygın olarak dağılmıştır ve en yüksek konsantrasyon Flos sophorae immaturus'ta bulunur. Rutin'in anormal kapiller geçirgenliği ve kırılganlığı azalttığı ve kardiyovasküler ve serebrovasküler damarlar için koruyucu bir ajan görevi gördüğü bildirilmiştir. Bu çalışma, Flos sophorae immaturus'tan türetilen rutinin fizikokimyasal özelliklerinin ekstraksiyonu, ayrılması ve karakterizasyonu için ayrıntılı bir deneysel protokol sunmaktadır. Ek olarak, alkali ekstraksiyon ve asit çökeltme yöntemi kullanılarak TCM'den flavonoidlerin ekstraksiyonu için protokol tanıtılmış ve açıklanmıştır.
Giriş
Sophora japonica L.'nin kurutulmuş çiçek tomurcuğu olan Flos sophorae immaturus (FSI), yüzyıllardır geleneksel Çin tıbbının (TCM) temel taşı olmuştur. Ana aktif bileşenleri arasında rutin, izoquercitrin, Sophorae Flos ve diğer flavonoidler ve saponinler bulunur. Bu bileşenler toplu olarak ısıyı temizlemek ve detoksifiye etmek, kanı ve hemostazı soğutmak ve kan basıncını düşürmek gibi çeşitli farmakolojik etkiler sağlar. Klinik uygulamada, FSI öncelikle kılcal geçirgenliğikoruma 1, kardiyovasküler sistem fonksiyonunusürdürme 2, kanı soğutma, kanamayı durdurma ve karaciğer ateşinidüzenleme 3 yeteneği nedeniyle değerlidir. Terapötik özellikleri, kuru ağırlığının %20-30'unu oluşturan biyoaktif bir flavonoid olan yüksek konsantrasyonda rutine (quercetin-3-rutinosid) atfedilir4.
Rutin, bitkilerde yaygın olarak bulunan bir flavonoiddir. Kimyasal adı Que-3-O-rutindir (C27H30O16) (Şekil 1). Oda sıcaklığında rutin, açık sarı ila sarı-yeşil kristal toz halinde görünür. Erime noktası kristal formuna ve saflığına göre değişir, tipik olarak 125 °C ile 195 °C arasında değişir. Rutin belirgin polar özellikler sergiler: soğuk suda az çözünür, etanol ve metanol gibi polar organik çözücülerde yüksek oranda çözünür ve eter ve kloroform gibi polar olmayan çözücülerde neredeyse çözünmez. Ayrıca çözünürlüğü pH'a duyarlıdır ve sodyum veya potasyum tuzları oluşturan fenolik hidroksil gruplarının ayrışması nedeniyle alkali koşullar altında önemli ölçüde artar. Bu fiziksel özellikler, moleküler yapısındakipolihidroksil ve glikozit gruplarıyla yakından ilişkilidir 5 ve ekstraksiyon sürecini ve tıp, gıda ve diğer endüstrilerdeki uygulamalarını doğrudan etkiler6. Rutin, bitkilerde her yerde bulunurken, en çok FSI'da bulunur ve kılcal stabilizasyon7, anti-inflamatuar, antioksidan8, antimikrobiyal9 ve metabolik düzenleyici etkiler10 dahil olmak üzere çoklu farmakolojik aktiviteler sergiler.
Klinik potansiyeline11 rağmen, rutinin zayıf suda çözünürlüğü ve stabilitesi, ekstraksiyon ve formülasyon5 için zorluklar yaratmaktadır. Bu sınırlamaları gidermek için, fenolik hidroksil gruplarının pH'a bağlı davranışından yararlanan alkali ekstraksiyon-asit çökeltme (AEAP) yöntemi etkili bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır.
Rutinin fiziksel özelliklerine dayanarak, AEAP yöntemi, alkali çözeltilerdeki çözünürlüğünü ve ardından asidik koşullar altında kristalizasyonunu kullanarak rutini FSI'dan izole etmek için standartlaştırılmış bir teknik haline gelmiştir12. AEAP, verimi artırmak ve FSI'dan yüksek saflıkta rutin ekstraksiyonu elde etmek için fenolik hidroksil gruplarının pH değiştirilebilir iyonizasyonundan yararlanır. Alkali koşullar altında (pH >10), fenolik -OH grupları hidrofilik -O- iyonları oluşturmak üzere protondan arındırılır ve oksidatif bozulmayı en aza indirirken bitki dokularından tam çözünmeyi sağlar. pH 2-3'e asitleştirme, bu iyonlaşmayı tersine çevirerek, polar safsızlıkların minimum birlikte çökelmesi ile hedef fenolikleri çökeltir. PH'a bağlı çözünürlüğe sahip bir polifenol olarak rutin, alkali çözeltilerde (örneğin sodyum hidroksit) kolayca çözünür, ancak hidroksil grubu protonasyonu nedeniyle asidik koşullar altında çökelir. AEAP, toksik çözücülerden kaçınarak yeşil kimya ilkelerine uygun, uygun maliyetli, ölçeklenebilir ve çevre dostu bir alternatif sunar13. Doğal ürün kimyasında pH'a dayalı ayırma tekniklerini destekleyen daha geniş bir eğilimi yansıtır14. Kurkumin (zerdeçaldan) ve berberini ( Coptis chinensis'ten) izole etmek için karşılaştırılabilir yöntemler kullanılır ve seçici ekstraksiyon için belirli pH değerlerindeki çözünürlük değişikliklerinden yararlanılır. AEAP yöntemi, yalnızca temel laboratuvar ekipmanı (örn. pH metreler, santrifüjler) gerektiren, FSI gibi flavonoid açısından zengin kaynaklardan yüksek verimli rutin üretimi için idealdir. Düşük rutin içeriğine veya kompleks enterferans yapan bileşiklere sahip bitki matrisleri için, ekstraksiyon verimliliğini artırmak amacıyla gelecekte enzimatik hidroliz ön işlemi düşünülebilir.
Sonuç olarak AEAP, rutin ekstraksiyon, dengeleme etkinliği, güvenlik ve ölçeklenebilirlik için uygun bir yaklaşımı temsil eder. TCM modernizasyonundaki rolü, geleneksel uygulamalar ile çağdaş farmasötik standartlar arasında köprü kurma potansiyelini vurgulamaktadır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Rutin, birden fazla fenolik hidroksil grubu içeren bir flavonoiddir ve sıcak alkali çözeltilerde çözünür, ardından asitleştirme ve çökeltme yapılır. Alkali ekstraksiyon-asit çökeltme işlemi kullanılarak ekstrakte edilebilir. Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Deneysel hazırlık
- Aşağıdaki malzemeleri edinin: Flos sophorae immaturus (20 g), boraks (0,8 g), birkaç beher, kireç tozu (1,5 g), konsantre hidroklorik asit, termometre ve pH test şeritleri. Bu görüntünün daha büyük bir versiyonu için Şekil 2'ye bakın.
2. Rutinin çıkarılması
NOT: 0,8 g boraks ila 200 mL su boraks-su oranı kullanın. 10 mL suya 1,5 g kireç tozu oranında limonlu süt kullanın. pH'ı hızlı ve doğru bir şekilde ayarlayın. Kaybedilen suyu gerektiği gibi yenileyin.
- Alkali ekstraksiyonu
NOT: 6 cm yuvarlak filtre kağıdı kullanarak süzün.- 500 mL'lik bir behere 250 mL su ve 0,8 g boraks ekleyin. Kaynayana kadar ısıtın, ardından 20 g Flos sophorae immaturus ekleyin. 2-3 dakika kaynatmaya devam edin.
- Kaynattıktan sonra limonlu süt ile karıştırarak pH'ı 8-9'a ayarlayın. 20 dakika ısıtmaya devam edin. Sarı-kahverengi bir süzüntü elde etmek için sıcakken gazlı bezden süzün.
- Asit çökeltme ekstraksiyonu
- Konsantre hidroklorik asit kullanarak ekstraktı pH 2-3'e ayarlayın ve çökmesini bekleyin. Berrak sarı-kahverengi bir çözeltiden bulanık bir çözeltiye geçiş, kabın dibinde kademeli olarak turuncu-sarı topaklaştırıcı çökelti oluşumu ile birlikte, etkili rutin ayrımını gösterir.
- 6 saat bekletildikten sonra çökeltiyi atmosferik basınçlı emme filtrasyonuna tabi tutun. Ham rutin elde etmek için toplayın ve kurutun.
NOT: Filtre filmini kullanılan Brinell huni boyutuna (150 mm çap) göre kesin. - Atmosferik basınç emme filtrasyonu sırasında çökeltiyi nötr olana kadar suyla yıkayın.
3. Rutinin rafine edilmesi
- Kaba tartımdan sonra rutini 1:200 çözünürlük oranında sıcak su kullanarak yeniden kristalleştirin. Sulu çözeltiyi 30 dakika kaynatın ve sıcakken süzün. Rutin solüsyonun nihai hacminin 210 mL olduğundan emin olun.
- Kalıntıyı filtreleyin. Süzüntünün bozulmadan beklemesine izin verin, ardından tekrar süzün ve rafine rutin elde etmek için 60-70 °C'de bir fırında vakum altında kurutun (Şekil 3).
NOT: Filtre filmini kullanılan Brinell huni boyutuna (150 mm çap) göre kesin.
4. Rutinin fizikokimyasal tanımlanması
- Hidroklorür-magnezyum tuzu reaksiyonu - flavonoid ana çekirdeklerin tanımlanması
- Numunenin 1-2 mL'sini metanol içinde çözün ve 50 mg magnezyum tozu ekleyin.
- Birkaç damla konsantre hidroklorik asit ekleyin. Hafifçe sallayın. Çözelti kırmızıya dönmelidir (Şekil 4).
- Molisch reaksiyonu - şeker bileşiklerinin tanımlanması
- %10'luk bir etanol α-naftol çözeltisi ekleyin ve çalkalayın. Test tüpünü eğin ve konsantre sülfürik asidi iç duvar boyunca damla damla dikkatlice ekleyin.
- Arayüzde kahverengi bir halka oluşumunu gözlemleyin (Şekil 5).
- Yeşillendirme zirkonya-sitrik asit reaksiyonu
- Numunenin etanol çözeltisine 1-2 mL %10 α-naftol çözeltisi ekleyin. İyice çalkalayın. Yavaşça 10 damla konsantre Hekleyin2 SO4 sallamadan tüpün duvarı boyunca.
- % 2 sitrik asit metanol çözeltisi ekleyin. Çözelti rengi açılmalıdır (Şekil 6).
- İnce tabaka ayrımı
- Hem rafine rutin hem de rutin standardını kullanın.
- Geliştirme maddesi olarak kloroform:metanol:formik asit (15:5:1) ve kromojenikmadde olarak % 1 AlCl3 etanol çözeltisi kullanın. 365 nm'de bir UV lambası altında floresansı gözlemleyin.
5. Rutinin TLC incelemesi
NOT: Rutinin saflığını değerlendirmek için ince tabaka kromatografisi (TLC) yöntemi kullanılmıştır. Sabit faz olarak bir silika jel plakası kullanıldı.
- Rafine rutin numunesini ve rutin standardını (metanol içinde 1 mg/mL) plakaya yerleştirin. Plakayı etil asetat:formik asit:sudan (8:1:1, v/v/v) oluşan hareketli bir fazda geliştirin.
- Kuruduktan sonra plakayı 254 nm'de UV ışığı altında görselleştirin.
- Numune noktasının tutma faktörünü (Rf) hesaplayın ve standartla karşılaştırın.
NOT: Aynı Rf değerine sahip tek bir nokta (bu koşullar altında yaklaşık 0,35-0,50) yüksek saflığı gösterirken, ek noktalar safsızlıkların varlığını gösterir.
6. HPLC ile rutin saflığının belirlenmesi
NOT: Rutinin saflığı, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile kantitatif olarak analiz edildi. Analiz koşulları aşağıdaki gibidir: Kromatografik kolon- (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); mobil faz-asetonitril (A) ve %0,2 asetik asit sulu çözeltisi (B). Doğrusal gradyan elüsyon programı: 0-15 dk, %20-%30 A; 15-30 dk, %30-%60 A. Akış hızı-1 mL/dk. Enjeksiyon hacmi-10 μL. Algılama dalga boyu-355 nm. Kolon sıcaklığı-40 °C.
- 0,1 g rutin numune tozunu hassas bir şekilde tartın ve 10 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. 5.0 mL %60 etanol çözeltisi ekleyin ve iyice çalkalayın.
- Sabit sıcaklıktaki su banyosunu veya kolon fırınını 30 °C'ye ayarlayın ve numuneyi 30 dakika boyunca ultrasonikleştirin.
- Numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 55.900 × g'da santrifüjleyin. HPLC analizi için test çözümü olarak süpernatanı kullanın.
7. LC-MS ile rutin tayini
NOT: İzole edilen bileşikler, sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi (LC-MS) ile tanımlandı. LC koşulları HPLC yöntemiyle eşleşti. Kütle spektrometrisi, 3,5 kV kılcal gerilim ile negatif iyon modunda elektrosprey iyonizasyon (ESI) kullanılarak gerçekleştirildi. Çözünme sıcaklığı-350 °C; Kütle tarama aralığı-m/z 100-1000.
- 10 mg saflaştırılmış rutin numunesini tartın ve 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Numune tamamen eriyene kadar bir pipet kullanarak 0,6 mL döteryumlu DMSO ekleyin. Aynı prosedürü kullanarak rutin standart çözeltileri hazırlayın.
- Proton nükleer manyetik rezonans (1H NMR) spektroskopisi kullanarak işlenmiş numuneleri ve standartları analiz edin.
- Uyumlu yazılım kullanarak spektral verileri işleyin15.
- Doğrulama için spektral verileri literatür veya NIST veya PubChem gibi veritabanı referanslarıyla karşılaştırın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Rutinin fizikokimyasal tanımlama deneyinde, magnezyum tozu ve az miktarda konsantre hidroklorik asit eklendikten sonra çözelti kırmızıya döndü ve ardından çalkalandı, bu da bir flavonoid ana çekirdeğin varlığını gösterdi. Molisch reaksiyonunda, arayüzde pozitif bir sonucu ve moleküler yapıda şeker parçalarının varlığını gösteren mor bir halka oluştu. Numune çözeltisi, metanol içinde %2 kloro-oksidasyon reaktifinin eklenmesiyle parlak sarıya döndü, bu da 3-OH veya 5-OH grupları içeren flavon yapılarının varlığını düşündür...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Rutinin ekstraksiyonu öncelikle basit ekipman gereksinimleri, kullanım kolaylığı, yüksek verimlilik ve düşük maliyet avantajları sunan alkali ekstraksiyon-asit çökeltme (AEAP) yöntemi6'ya dayanmaktadır. Bu teknik genellikle reaktif tüketimini azaltan, ekstraksiyon süresini hızlandıran ve genel verimi artıran mikrodalga destekli ekstraksiyon (MAE)7 ve ultrason destekli ekstraksiyon (BAE)8 ile desteklenir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Bu makalenin yazarları, bu araştırmanın yürütülmesi ve bu makalenin yazılması sırasında ortaya çıkabilecek her türlü çıkar çatışmasını açıkladıklarını beyan ederler. Bu çalışmada sunulan sonuçlara veya sonuçlara ilişkin yorumumuzu potansiyel olarak saptırabilecek hiçbir finansal, kişisel veya profesyonel ilişkimiz olmadığını onaylıyoruz. Özellikle, burada bildirilen bulgulardan yararlanabilecek herhangi bir ilaç şirketi, araştırma kurumu veya diğer kuruluşlarla hiçbir bağımız yoktur. Son olarak, bulgularımızın ve sonuçlarımızın yalnızca bu makalede sunulan verilere ve analizlere dayandığını ve herhangi bir dış faktörden etkilenmediğini onaylıyoruz. Tüm araştırma faaliyetlerimizde en yüksek akademik dürüstlük ve etik davranış standartlarına bağlı kalıyoruz.
Teşekkürler
Deneysel platformu sağladığı için Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi Farmasötik Kimya Laboratuvarı'na derin şükranlarımızı sunmak isteriz. Onların desteği ve kaynakları, araştırma ve deneylerimizin yürütülmesinde çok değerli olmuştur. Bilimsel mükemmelliğe olan bağlılıklarını ve genç araştırmacıların gelişimini destekleme konusundaki kararlılıklarını derinden takdir ediyoruz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1-Naftal | MACKLIN | C16245764 | |
| Asetik asit | MACKLIN | C12662811 | |
| Asetonitril | MACKLIN | C16129374 | |
| Alüminyum klorür | MACKLIN | C16485922 | |
| Sitrik asit | MACKLIN | C16429480 | |
| DMSO | FUCHEN (Tianjin) Kimyasal Reaktif Şirketi, Ltd. | 20230306 | |
| Etanol | FUCHEN (Tianjin) Kimyasal Reaktif Şirketi, Ltd. | 20250102 | |
| Etil asetat | FUCHEN (Tianjin) Kimyasal Reaktif Şirketi, Ltd. | 20240318 | |
| Flos sophorae immaturus | Pekin Tongrentang | 10092026329782 | |
| Formik asit | FUCHEN (Tianjin) Kimyasal Reaktif Şirketi, Ltd. | 20150402 | |
| MestReNova | Mestrelab Araştırmaları | / | |
| Metanol | innochem | C16365684 | |
| Silika jel 60F254 | STEEMA | 20210222 | |
| Xcalibur | Thermo Fisher Scientific | / | |
| Zirkonil klorür oktahidrat | MACKLIN | C15350627 |
Kaynaklar
- Drew, A. K., et al. Chinese herbal medicine toxicology database: Monograph on Radix Sophorae Flavescentis, "ku shen". J Toxicol Clin Toxicol. 40 (2), 173-176 (2002).
- Chua, L. S. A review on plant-based rutin extraction methods and its pharmacological activities. J Ethnopharmacol. 150 (3), 805-817 (2013).
- Huang, R., et al. Evaluation of the synergetic effect of Yupingfeng San and Flos Sophorae Immaturus based on free radical scavenging capacity. Biomed Pharmacother. 128, 110265(2020).
- Li, R., Wang, C., Lei, P., Huang, L., Yuan, S. Chemical constituents in Flos sophorae carbonisatus. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 35 (5), 607-609 (2010).
- Ghorbani, A. Mechanisms of antidiabetic effects of flavonoid rutin. Biomed Pharmacother. 96, 305-312 (2017).
- Calabrese, E. J., et al. Rutin, a widely consumed flavonoid, that commonly induces hormetic effects. Food Chem Toxicol. 187, 114626(2024).
- Li, R. R., Yuan, S. T., Li, Z. H., Qin, H. L. Studies on chemical constituents in Flos sophorae carbonisatus. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 30 (16), 1255-1257 (2005).
- Nikfarjam, B. A., Adineh, M., Hajiali, F., Nassiri-Asl, M. Treatment with rutin - a therapeutic strategy for neutrophil-mediated inflammatory and autoimmune diseases: Anti-inflammatory effects of rutin on neutrophils. J Pharmacopuncture. 20 (1), 52-56 (2017).
- Singh, S., et al. Rutin protects t-butyl hydroperoxide-induced oxidative impairment via modulating the Nrf2 and iNOS activity. Phytomedicine. 55, 92-104 (2019).
- Cushnie, T. P., Lamb, A. J. Antimicrobial activity of flavonoids. Int J Antimicrob Agents. 26 (5), 343-356 (2005).
- Budzynska, B., et al. Rutin as neuroprotective agent: From bench to bedside. Curr Med Chem. 26 (27), 5152-5164 (2019).
- Tan, Y. Q., et al. Pharmacological properties of total flavonoids in Scutellaria baicalensis for the treatment of cardiovascular diseases. Phytomedicine. 107, 154458(2022).
- Tobar-Delgado, E., Mejía-España, D., Osorio-Mora, O., Serna-Cock, L. Rutin: Family farming products' extraction sources, industrial applications and current trends in biological activity protection. Molecules. 28 (15), 5864(2023).
- Wang, S., et al. Effect of combined ultrasonic and enzymatic extraction technique on the quality of noni (Morinda citrifolia L.) juice. Ultrason Sonochem. 92, 106231(2023).
- Dos Santos Dantas, T., et al. Phytochemical profile analysis by LC-ESI-MS(n) and LC-HR-ESI-MS and validated HPLC method for quantification of rutin in herbal drug and products from leaves of Croton blanchetianus. Biomed Chromatogr. 37 (9), e5665(2023).
- Santiago, M., Strobel, S. Thin layer chromatography. Methods Enzymol. 533, 303-324 (2013).
- Ravber, M., et al. Hydrothermal degradation of rutin: Identification of degradation products and kinetics study. J Agric Food Chem. 64 (48), 9196-9202 (2016).
- Zhang, Z., et al. Effect of pH regulation on the components and functional properties of proteins isolated from cold-pressed rapeseed meal through alkaline extraction and acid precipitation. Food Chem. 327, 126998(2020).
- Lv, H., et al. Extraction and separation of vitisin D, ampelopsin B and cis-vitisin A from Iris lactea Pall. var. chinensis (Fisch.) Koidz by alkaline extraction-acid precipitation and high-speed counter-current chromatography. J Chromatogr Sci. 54 (5), 744-751 (2016).
- Yang, Y., Chu, X., Li, Y., Meng, H., Qin, L. Alkali-extracted rhamnogalactoarabinan from Chaetomorpha linum: Characterisation and anti-type 2 diabetic effect. Carbohydr Polym. 356, 123388(2025).
- Gao, S., et al. Unveiling polysaccharides of Houttuynia cordata Thunb.: Extraction, purification, structure, bioactivities, and structure-activity relationships. Phytomedicine. 138, 156436(2025).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
