Yöntem makalesi

Farelerde Retinal Vasküler Perisitlerin İmmün Boyama ile 3D Görüntülenmesi

DOI:

10.3791/67436

⸱

1 Kasım 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Integration of Chinese and Western Medicine, School of Basic Medical Sciences, Peking University, 2Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinal vasküler sistemdeki perisitler, retroorbital floresan domates lektin enjeksiyonu sonrası trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü β ile immünofloresan boyama ile incelendi. Etiketli retina, doku temizleme yöntemi ile daha fazla tedavi edildi ve retina vaskülatürünü çevreleyen perisitlerin üç boyutlu görünümlerini konfokal mikroskop altında görselleştirmek için tamamen monte edildi.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retina perisitleri, retinanın vasküler gelişimi ve stabilitesi için gereklidir ve retina damar sisteminin bütünlüğünün korunmasında önemli bir rol oynar. Perisitlerin morfolojik özelliklerinin ayrıntılı bir görünümünü sağlamak için, bu çalışma, bir floresan ajanın retro-orbital enjeksiyonunu, immünofloresan boyamayı ve doku temizleme tedavisini birleştiren yeni bir yaklaşımı tanımlamıştır. İlk olarak, floresan domates lektini, retina vaskülatürünü etiketlemek için canlı farenin retro-orbital sinüsüne enjekte edildi. 5 dakika sonra, fare sakrifiye edildi ve sağlam retinası retina kabından dikkatlice çıkarıldı ve perisitleri ortaya çıkarmak için trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü β ile immünofloresan olarak boyandı. Ek olarak, lekeli retina doku temizleme reaktifi ile muamele edildi ve bütün mikroskop lamı üzerine monte edildi. Bu yaklaşımlar sayesinde şeffaf retinada retina vasküler sistemi ve perisitler net olarak gözlenmiştir. Konfokal bir mikroskop altında, retinal vasküler ağaç boyunca perisitlerin morfolojik özelliklerini üç boyutlu bir görünümde daha fazla yeniden yapılandırmak ve analiz etmek için yüksek çözünürlüklü görüntüler almak için daha fazla fırsat elde ettik. Metodolojik olarak, bu protokol retina vaskülatürü içindeki perisitleri görselleştirmek için etkili bir yaklaşım sunar ve hem fizyolojik hem de patolojik koşullar altındaki rolleri hakkında değerli bilgiler sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinal perisitler, vasküler endotel hücrelerinin abluminal tarafı boyunca bazal membranın içine gömülür ve retina kan damarlarının etrafına sarılmış kısa menzilli süreçlerin ağ benzeri bir modelini gösterir1. Perisitler ve retina vaskülatürü arasındaki bu yakın temas, retina çevresel homeostazınınkorunmasına katkıda bulunur 2. Çok sayıda çalışma retina vaskülatüründeki perisitlerin morfolojik kanıtlarını sağlamış olsa da, retina perisitlerinin morfolojik özelliklerini anlamamızın çoğu geleneksel histolojik tekniklerden gelmektedir3.

Bu çalışmalara paralel olarak, bu çalışmayı, geleneksel histolojik teknikleri modern en son bilimsel yöntemlerle birleştirerek retina mikrovaskülatüründeki perisitlerin daha morfolojik ayrıntılarını etkili bir şekilde göstermek için tasarladık. Buradaki yaklaşım üç temel tekniği bütünleştirir: canlı farelerde floresan domates lektininin retro-orbital enjeksiyonu, trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptör β (PDGFR-β) ile immünofloresan boyama ve solvent bazlı doku temizleme stratejisi. Floresan domates lektininin retro-orbital enjeksiyonunun, hem in vivo hem de in vitro ortamlarda fare retina damar sistemini gözlemlemek için etkili ve güvenilir olduğu kanıtlanmıştır 4,5. PDGFR-β, perisitlerin6 immünofloresan boyaması için yaygın olarak kullanılan bir biyobelirteç görevi görür. Daha kalın ve tam montajlı retinalardaki perisitlerin yüksek çözünürlüklü görüntülerini yakalamak için doku temizleme stratejisi histolojik şeffaflığı artırır 2,7,8.

Bu tekniklerin her biri retina çalışmalarında ayrı ayrı uygulanmış olsa da, fare retina vaskülatüründe perisitleri araştırmak için birleşik uyumlulukları belirsizliğini korumaktadır. Fare retinasının ortalama kalınlığı yaklaşık 180-220 μm9 olduğundan, temizleme tedavisi olmadan bu kalın dokuda antikor etiketleme ve konfokal görüntüleme genellikle yüksek arka plan sinyallerine neden olur ve perisitler ve kan damarları arasındaki uzamsal ilişkinin gözlemlenmesini zorlaştırır10. Burada açıklanan yaklaşımlarla, retina damar sistemi içindeki perisitleri konfokal mikroskop altında üç boyutlu (3D) bir görünümde görselleştirmek için basit bir yöntem sağlamayı amaçlıyoruz. Retina vaskülatüründeki perisitlerden gelen bu gelişmiş hücresel bilgi, retinal çevresel homeostaz anlayışımızı geliştirebilir ve vasküler koruma için potansiyel stratejilerin altını çizebilir, böylece retinal vasküler bozukluklarda fonksiyonel sonuçları iyileştirebilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma için üç genç yetişkin erkek C57BL / 6 fare (8-10 haftalık, 20-25 g ağırlığında) kullanıldı. Kontrollü sıcaklık ve nem ile 12 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsüne yerleştirildiler ve yiyecek ve suya serbest erişime izin verildi. Bu çalışma, Çin Tıp Bilimleri Akademisi, Akupunktur ve Yakı Enstitüsü Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (onay No. 2023-03-14-04) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'ne (National Academy Press, Washington, DC, 1996) uygun olarak yürütülmüştür.

1. Floresan domates lektininin in vivo retro-orbital enjeksiyonu

  1. Fareyi uyuşturmak için intraperitoneal olarak 50 mg / kg pentobarbital enjekte edin. Ayak parmağı sıkışma uyaranına yanıt verilmemesini değerlendirerek anestezi derinliğini değerlendirin.
  2. Fareyi, başı sola bakacak şekilde sağ yanal yaslanacak şekilde yerleştirin.
  3. Enjeksiyonun hayvanın sol retro-orbital sinüsüne en kolay şekilde uygulanmasını sağlamak için farenin sol gözünü ortaya çıkarmak için peri-orbital alana iki parmağınızı hafifçe bastırın11.
  4. İğnenin eğimi 45°'lik bir açıyla öne bakacak şekilde farenin orbital venöz sinüsünü yaklaşık 2-3 mm nazikçe delmek için 27G iğne ile donatılmış 1 mL'lik bir şırınga kullanın.
  5. Farenin orbital venöz sinüsüne 0.1 mL (1 mg / mL) floresan domates lektini enjekte edin.

2. Gözlerin perfüzyonu ve enükleasyonu

  1. Retroorbital enjeksiyondan 5 dakika sonra, fareyi derinlemesine uyuşturmak için intraperitoneal olarak tribromoetanol solüsyonu (250 mg / kg) enjekte edin. Daha sonra, hayvanı kan kaybı ve kardiyak perfüzyon yoluyla ötenazi yapın. Solunum durduğunda göğüs boşluğunu cerrahi makaslaaçın 12.
  2. Solunum durduğunda göğüs boşluğunu cerrahi makasla açın. Cerrahi aletleri önceden sterilize edin ve çeker ocakta çalıştırın. 24G'lik bir iğne kullanın ve sol ventrikül tepesinden sol kardiyak ventriküle 2 mm yerleştirin. 20 mL% 0.9 fizyolojik salin ile 3 mL / dk oranında perfüzyon gerçekleştirin, ardından 0.1 M fosfat tamponunda (PB, pH 7.4) 20 mL% 4 formaldehit uygulayın.
  3. Kurban edilen fareyi yan yatırın ve gözleri makasla kaplayan cildi çıkarın. Gözleri makas ve forseps ile enüklee edin.
  4. Optik siniri ve çevresindeki dokuları kesin, daha sonra gözü kaldırın ve 2 saat boyunca 0.1 M PB'de% 4 formaldehit içinde sonradan sabitleme için 12 oyuklu bir plakaya aktarın.
  5. Dokuyu 4 ° C'de 0.1 M PB'de (pH 7.4) %25 sükroz içinde çözeltinin dibine batana kadar kriyoprotekte tutun.
    NOT: Oküler doku bir sükroz çözeltisinde iyi bir şekilde dehidre olduğundan, retina daha kolay ve tamamen ayrılabilir ve bu da sonraki kapsamlı çalışmaları kolaylaştırır.

3. Retinaların diseksiyonu

  1. Gözleri plastik bir Pasteur pipeti kullanarak 0,1 M PB (pH 7,4) içeren bir Petri kabına aktarın.
  2. Korneanın kenarını keskin bir makasla delin, kornea ve irisin etrafını kesin ve atın.
  3. Lensi ve vitröz mizahı çıkarmak için forseps kullanın. Daha sonra fincan şeklindeki retinayı ince forsepslerle gözün merkezinden uzaklaştırın. Retinayı temiz bir Petri kabında 0.1 M PB (pH 7.4) ile durulayın.

4. Retinaların immünofloresan boyama ve doku temizleme

  1. Kap şeklindeki retinayı dikkatlice çıkarın ve gece boyunca 4 ° C'de 0.1 M PB (pH 7.4) içinde% 2 Triton X-100 çözeltisinde inkübe edin.
  2. Retinayı bloke edici solüsyona (0.1 M PB + %1 Triton-X 100 + %0.2 sodyum azid + %10 normal eşek serumu) aktarın ve gece boyunca 4 °C'de çalkalayıcı üzerinde 72 rpm'de döndürün.
  3. Retinayı, bir mikrosantrifüj tüpünde seyreltme tamponunda (0.1 M PB + %0.2 Triton-X 100 + %0.2 sodyum azid + %1 normal eşek serumu) keçi anti-PDGFR-β'nin (10 μg/mL) birincil antikorlarını içeren çözeltiye aktarın ve çalkalayıcı üzerinde 4 ° C'de 2 gün döndürün.
  4. Retina 2x'i oda sıcaklığında yıkama tamponu (0.1 M PB + %0.2 Triton-X 100) ile yıkayın, ardından çalkalayıcı üzerinde 4 °C'de gece boyunca yıkama tamponunda tutun.
  5. Ertesi gün, retinayı bir mikrosantrifüj tüpünde eşek anti-keçi 488 ve 0.2 ng / mL floresan nükleer 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolün (DAPI) 1 mg / mL ikincil antikorunu içeren karışık çözeltiye aktarın ve çalkalayıcı üzerinde 72 rpm'de 4 ° C'de 5 saat döndürün.
  6. Retinayı oda sıcaklığında 1 saat, 2 kez yıkama tamponu ile 6 oyuklu bir plakada yıkayın. Retinayı gece boyunca 4 °C'de çalkalayıcı üzerindeki yıkama tamponunda tutun. Doku temizleme öncesi görünümleri elde etmek için 5. adıma göre görüntüleme ve analiz yapın.
  7. Retinayı doku temizleme reaktifine aktarın ve 37 ° C'de 1 saat boyunca çalkalayıcı üzerinde 60 rpm'de hafifçe döndürün.
  8. Doku temizleme işleminden sonra, fincan şeklindeki retinayı temiz bir Petri kabında 0.1 M PB (pH 7.4) ile durulayın.
  9. Taç yaprağı şekli oluşturmak için yaylı makas kullanarak retina yarıçapının yaklaşık 2 / 3'üne ulaşan 4 radyal kesi yapın.
  10. Retinayı düzleştirin ve bir mikroskop lamına monte edin ve ardından fazla PB'yi küçük bir emici kağıt parçasıyla çıkarın. Retinanın iç kısmını slaytta yukarı bakacak şekilde tutun.
  11. Monte edilmiş retinayı bir ara parça ile daire içine alın ve boşluğu taze doku temizleme reaktifi ve bir lamel ile doldurun.

5. Görüntüleme ve analizler

  1. Doku temizleme tedavisinden önce (adım 4.6'yı tamamladıktan sonra) ve sonrasında retinanın dış görünümlerini elde edin.
  2. Etiketli retinanın montaj görünümlerini panoramik doku dilimi tarayıcısı ile tarayın. NA'sı 0,08 olan 2x objektif lensi kullanın.
  3. Aşağıdaki objektif lenslerle donatılmış konfokal görüntüleme sistemi ile daha yüksek büyütmeli görüntüler çekin: NA'sı 0.40 olan 10x lens ve NA'sı 0.95 olan 40x lens. Konfokal iğne deliğini 152 μm (10x objektif lens) ve 105 μm (40x objektif lens) olarak ayarlayın. Görüntü yakalamanın uzamsal çözünürlüğünü 1024 x 1024 piksel (10x objektif lens) ve 640 x 640 piksel (40x objektif lens) olarak ayarlayın.
  4. Etiketli retinadan 2 μm karelerde 50 görüntü (Z-yığını) yakalayın. Projeksiyon/topografi modunda tüm görüntüleri tek bir odakta birleştirin. Kurulum için Başlangıç Odak Düzlemini Ayarla > Bitiş Odak Düzlemini Ayarla > Adım boyutunu ayarla > Z serisi > Görüntü Yakalama > Derinlik Deseni Seç'e tıklayın.
  5. Farklı floresan sinyalleri için aşağıdaki uyarma ve emisyon dalga boylarını kullanarak görüntüler yakalayın: 499 nm ve 519 nm'de yeşil floresan sinyalleri; 591 nm ve 618 nm'de kırmızı floresan sinyalleri; ve 401 nm ve 421 nm'de mavi floresan sinyalleri.
  6. Yeni Yüzeyler Ekle > Ses ayarlarını seç > Kaynak Kanalı Seç > Ekranı ayarla > Yüzey Açısını Ayarla > Anlık Görüntü Al seçeneğini belirleyerek Z-yığını konfokal görüntüleri bir analiz yazılımına aktararak görüntüleri üç boyutlu desende yeniden oluşturun.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tam montajlı retinanın dış görünümlerinden, doku temizleme tedavisi kullanılarak tüm montajlı retinanın doku şeffaflığı, doku temizleme yapılmayan retinanınkine kıyasla arttırıldı (Şekil 1).

Tüm mount retina üzerindeki histolojik inceleme için, retina vaskülatürü retro-orbital enjeksiyon yoluyla floresan domates lektini ile kırmızı ile işaretlendi ve retinal perisitler PDGFR-β ile yeşil renkte gösterildi (Şekil 2, Şekil 3 ve Şekil 4). Bu etiketleme, doku temizlemeden önce ve sonra numune üzerinde gözlemlenebilse de, bir karşılaştırma olarak, retina örneğinin arka plan gürültüsü doku temizleme tedavisi ile azaltılmıştır (Şekil 2). Tedavi ayrıca panoramik doku dilimi tarayıcısı (Şekil 2) ve lazer taramalı konfokal mikroskop (Şekil 3) altında işaretli retina perisitlerini ve damar sistemini daha net hale getirdi.

Retinal perisitlerin kademeli dağılımı burada retinal vasküler ağaç boyunca da gösterilmiştir (Şekil 3). Retinanın orta kısmından periferik bölgesine kadar, perisitler, vasküler gövde ve dallar ve kılcal damarlar dahil olmak üzere retina vaskülatürünün bazal membranında bulunur (Şekil 3).

Yukarıdaki gözleme dayanarak, perisitlerin ve retinal vaskülatür arasındaki uzamsal korelasyon, temizlenmiş retina örneğinden alınan daha yüksek büyütülmüş Z-yığını görüntüleri ile daha fazla değerlendirildi (Şekil 4). Görüntü işleme sisteminin yardımıyla, perisitlerin retina vaskülatürü etrafında farklı çaplarda sıkıca sarıldığını göstermek için 3D görünümler sağladık (Şekil 4). Şekil 4A0-D0 , retina damarlarının en yüksekten en düşüğe doğru hiyerarşik dallanmasını temsil eder. Perisitler kılcal damarlarda daha bol dağıldığından, Şekil 4D0'daki PDGFRβ boyaması, Şekil 4A0-C0'a kıyasla daha güçlü yoğunluk ve sinyal gösterir.

Doku temizleme tedavisi olmayan fare retinasının aksine (Şekil 1A, Şekil 2A, Şekil 3A0-D0), mevcut yaklaşım, tam montajlı retinadan perisitler ve kan damarları arasındaki uzamsal ilişkiyi göstermek için retinal arka plan sinyallerini etkili bir şekilde azaltmıştır (Şekil 1B, Şekil 2B, Şekil 3A1-D1).

figure-results-1
Şekil 1: Doku temizleme tedavisi olmadan ve tedavi ile tüm mount retinanın optik şeffaflığının karşılaştırılması. (A, B) Doku temizleme tedavisinden önce (A) ve (B) sonrası tüm retina dağının dış görünümleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Doku temizleme tedavisi olmadan ve tedavi ile tüm mount retinadan retina perisitlerinin ve vaskülatürünün etiketleme özelliklerinin karşılaştırılması. (A, B) (A) doku temizleme tedavisi öncesi ve sonrası (B) tüm retina dağının temsili montaj görüntüleri Sanal Slayt Sistemi altında çekildi. Damar sistemi kırmızı (floresan domates lektini), perisitler yeşil (PDGFR-β) ve hücresel çekirdek mavi (DAPI) renktedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Doku temizleme tedavisi öncesi ve sonrası retina vasküler ağacı boyunca kademeli olarak retina perisitlerinin görüntüleme çözünürlüğünün karşılaştırılması. (A-D) Doku temizleme tedavisi öncesi (A0-D0) ve doku temizleme tedavisi sonrası (A1-D1) işaretli retinadan alınan temsili görüntüler, retina vaskülatürünü çevreleyen perisitlerin vasküler gövde sırasına göre dağılımını göstermektedir (A0, A1), birinci dereceden dallar (B0, B1), ikinci dereceden dallar (C0, C1) ve kılcal damar (D0, D1). Damar sistemi kırmızı (floresan domates lektini), perisitler yeşil (PDGFR-β) ve hücresel çekirdek mavi (DAPI) renktedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Perisitlerin farklı çaplardaki retina vasküler sistemi ile mekansal korelasyonu. (M.S.) Retina vasküler ağacı boyunca etiketlenmiş retinadan, vasküler gövde (A0, A1), birinci dereceden dallar (B0, B1), ikinci dereceden dallar (C0, C1) ve kılcal damar (D0, D1) dahil olmak üzere retina vasküler sistemini çevreleyen perisitlerin dağılımını gösteren temsili yüksek çözünürlüklü görüntüler. A1-D1: A0-D0 panellerinin karşılık gelen görüntüleri, üç boyutlu görünümlerde farklı çaplarda perisitlerin retinal vaskülatür ile uzamsal korelasyonunu göstermek ve ayrıca A1-D1 panellerindeki (oklar) iç kısımlarla yerel bölgelerin büyütülmüş görünümlerini göstermek için yeniden yapılandırıldı. Damar sistemi kırmızı (floresan domates lektini), perisitler yeşil (PDGFR-β) ve hücresel çekirdek mavi (DAPI) renktedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, retroorbital floresan domates lektin enjeksiyonu, PDGFR-β ile immünofloresan inceleme ve solvent bazlı doku temizleme kullanılarak retina vasküler sistemindeki perisitlerin morfolojisini göstermek için teknik süreç detaylandırıldı. Sonuçlar, bu tekniklerin tam montajlı retinadaki perisitleri vurgulamak için oldukça uyumlu olduğunu göstermektedir. Bu metodolojilerin kombinasyonu, retina vaskülatüründeki perisitlerin morfolojik özelliklerini ayrıntılı bir 3D perspektiften görselleştirmek için etkili bir yaklaşım sunar.

Anahtar tekniklerden biri olan farelerde retro-orbital enjeksiyonun, vasküler etiketleme ajanlarını vermek için basit ve optimal bir yöntem olduğu, fare retinal vaskülatürünü gözlemlemek için kuyruk veni ve intraperitoneal enjeksiyon yöntemlerinden daha iyi performans gösterdiği kanıtlanmıştır13,14. Retroorbital enjeksiyon yoluyla vasküler etiketlemenin arkasındaki prensip ve mekanizma tam olarak anlaşılmamış olsa da, bu yöntemin retina damar sistemini floresan domates lektini ile sağlam bir şekilde etiketlediği açıktır. Floresan etiketleme, hem histokimyasal işleme hem de doku temizleme yoluyla stabil kalır. Bu nedenle, in vivo görüntülemede kullanımının ötesinde, floresan domates lektini ile retro-orbital enjeksiyon, kan damarı lümenini etkili bir şekilde etiketleyerek in vitro ve ex vivo histolojik inceleme için retina vaskülatürünün net bir görünümünü sunar.

Retinal perisitleri etiketlemek için PDGFR-β15 ile immünofloresan boyama kullandık. Mikroskobik morfolojik inceleme altında doku ışık saçılımını azaltmak için lekelenmiş retinanın doku temizleme reaktifi ile daha fazla tedavi gördüğü göz önüne alındığında, antikorun penetrasyonunu arttırmak için retina boyama solüsyonunda daha uzun süre inkübe edildi16,17.

Tam montajlı retina nispeten şeffaftır ve retina vaskülatürüne genel bir bakışsağlar 18. Bununla birlikte, kalınlığı ile birlikte ışık saçılımı nedeniyle, ışık penetrasyonunu ve yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi sınırlar19. Doku temizleme tekniklerinin yardımıyla, tüm mount retinadaki perisitleri yüksek çözünürlüklü bir perspektiften görmek mümkün hale gelmiştir19,20. Bununla birlikte, bu yöntemler fare retinal perisitlerinin araştırılmasında henüz yaygın olarak uygulanmamıştır. Bu çalışmada, solvent bazlı doku temizleme yaklaşımı, retina vaskülatüründeki perisitleri görselleştirme yeteneğimizi önemli ölçüde geliştirerek, lazer taramalı konfokal mikroskop kullanarak yüksek çözünürlüklü Z-yığını görüntüleri elde etmemizi sağladı.

Mikrovasküler ağaç boyunca dağılan perisitler, retina kılcal damar ağı22 içindeki kanın karmaşık mekansal ve zamansal dağılımında önemli roller oynar. Yüksek plastik morfolojileri ve uyarlanabilir kasılma yetenekleri, perisitleri fizyolojik ve patolojik koşullar altında lokal nöronal aktiviteye yanıt olarak kılcal kan akışını düzenlemek için ideal kılar23. Kan-retina bariyerinin veya retinal nörovasküler eşleşmenin önemli bir oyuncusu olarak, retinal perisitler neovaskülarizasyon, anjiyogenez ve lökosit transmigrasyonunun sürdürülmesinde de dikkat çekmektedir24.

Teknik bir sınırlama olarak, PDGFR-β'ye ek olarak, perisitleri tanımlamak için NG-2 ve CD13 gibi diğer belirteçlerin de kullanıldığı unutulmamalıdır 22,24,25. Bu nedenle, perisitleri açık bir şekilde göstermek için uygun bir perisite özgü belirteç seçmek hala bir zorluktur. Bu çalışma, PDGFR-β'in perisitlerin morfolojik özelliklerini ortaya çıkarmak için daha iyi bir aday olduğuna dair daha fazla kanıt sunmaktadır.

Özetle, floresan domates lektininin retro-orbital enjeksiyonu, immünofloresan boyama ve doku temizleme kombinasyonunun, fizyolojik koşullar altında fare retinal vaskülatüründeki perisitlerin ayrıntılı morfolojisini ortaya çıkaran yüksek çözünürlüklü görüntülerin elde edilmesini sağladığını gösterdik. Bu bulgular, bu yöntemin patolojik koşullar altında retinal perisitlerin değişikliklerine yönelik gelecekteki araştırmalar için değerli olabileceğini düşündürmektedir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (No. 7244480), CACMS İnovasyon Fonu (No. CI2021A03407), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82004492) ve Merkezi kamu refahı araştırma enstitüleri için Temel Araştırma Fonları (No. ZZ-YQ2023008, ZZ14-YQ-032, ZZ-JQ2023008, ZZ-YC2023007).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Thermo Fisher ScientificD3571Işıktan koruyun
Alexa Fluor 488 eşek anti-keçi IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-11055Işıktan koruyun
C57BL/6 fareBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.SCXK (Jing) 2021-0006
Konfokal görüntüleme sistemiOlympusFV1200
Keçi anti-PDGFR-βAraştırma ve GeliştirmeAF104225 & mikro; g 
Imaris yazılımıOxford Instrumentsv.9.0.1
Lycopersicon esculentum (Domates) lektin, DyLight594Thermo Fisher ScientificL324711 mg
Mikrosantrifüj tüpüAxygenMCT-150-C1.5 mL
Normal eşek serumuJackson ImmunoResearch017-000-12110 mL
Panoramik doku dilimi tarayıcıOlympusVS120-S6-W
Photoshop ve  İllüstrasyonAdobeCS6
RapiClear 1.52 SolüsyonSunJin LabRC15200110 mL
Altı kuyulu plakaCostar3335
Yaylı makas Güzel Bilim Araçları15003-08
Superfrost Plus mikroskop slaytıThermo Fisher Scientific4951PLUS-00125 mm x 75 mm x 1 mm

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dreisig, K., Blixt, F. W., Warfvinge, K. Retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes. J Vis Exp. (140), e57733(2018).
  2. Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. J Vis Exp. (77), e50546(2013).
  3. Park, D. Y., et al. Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier. Nat Commun. 8, 15296(2017).
  4. Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (8), 2795-2806 (2004).
  5. Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: New experimental approach/new insights. Prog Retin Eye Res. 31 (3), 258-270 (2012).
  6. Hutter-Schmid, B., Humpel, C. Platelet-derived growth factor receptor-beta is differentially regulated in primary mouse pericytes and brain slices. Curr Neurovasc Res. 13 (2), 127-134 (2016).
  7. Wang, X., et al. Demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches. J Vis Exp. (183), e63807(2022).
  8. Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. J Vis Exp. (167), e61742(2021).
  9. Batista, A., et al. Normative mice retinal thickness: 16-month longitudinal characterization of wild-type mice and changes in a model of Alzheimer's disease. Front Aging Neurosci. 15, 1161847(2023).
  10. Huang, H. Pericyte-endothelial interactions in the retinal microvasculature. Int J Mol Sci. 21 (19), 7413(2020).
  11. Dong, X., et al. Exosome-mediated delivery of an anti-angiogenic peptide inhibits pathological retinal angiogenesis. Theranostics. 11 (11), 5107-5126 (2021).
  12. Li, S., et al. Retro-orbital injection of fitc-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Mol Vis. 17, 3566-3573 (2011).
  13. Riew, T. R., Jin, X., Kim, S., Kim, H. L., Lee, M. Y. Temporal dynamics of cells expressing ng2 and platelet-derived growth factor receptor-β in the fibrotic scar formation after 3-nitropropionic acid-induced acute brain injury. Cell Tissue Res. 385 (3), 539-555 (2021).
  14. Susaki, E. A., et al. Advanced cubic protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  15. Liang, H., et al. Cubic protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. J Vis Exp. (114), e54401(2016).
  16. Burns, S. A., Elsner, A. E., Gast, T. J. Imaging the retinal vasculature. Annu Rev Vis Sci. 7, 129-153 (2021).
  17. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced clarity for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  18. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nat Neurosci. 22 (2), 317-327 (2019).
  19. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  20. Alarcon-Martinez, L., Yemisci, M., Dalkara, T. Pericyte morphology and function. Histol Histopathol. 36 (6), 633-643 (2021).
  21. Dessalles, C. A., Babataheri, A., Barakat, A. I. Pericyte mechanics and mechanobiology. J Cell Sci. 134 (6), jcs240226(2021).
  22. Alarcon-Martinez, L., et al. Neurovascular dysfunction in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 97, 101217(2023).
  23. Uemura, M. T., Maki, T., Ihara, M., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. Brain microvascular pericytes in vascular cognitive impairment and dementia. Front Aging Neurosci. 12, 80(2020).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Retinal PericytesRetinal VasculatureImmunofluorescent StainingTissue ClearingConfocal MicroscopyThree Dimensional ImagingTomato Lectin LabelingPDGFR Beta StainingWhole Mount RetinaMorphological Analysis

İlgili makaleler