Yöntem makalesi

İskelet Kası İnterstisyel Hücre Dışı Veziküllerin Enzimatik İzolasyonu

DOI:

10.3791/67439

⸱

7 Şubat 2025

 ,  ,  , 
1Regenerative Bioscience Center, Department of Animal and Dairy Science, College of Agricultural and Environmental Science, University of Georgia

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, mekanik dekolman, enzimatik ayrışma, filtrasyon ve diferansiyel ultrasantrifüjleme yoluyla iskelet kası interstisyel hücre dışı veziküllerini (SkM-EV'ler) kemirgen kas dokularından izole etmeyi ve saflaştırmayı amaçlar. Tutarlılık ve güvenilirlik gösterir. İzole edilmiş SkM-EV'ler, tanısal biyobelirteçler veya terapötik araçlar olarak potansiyel uygulamalarla birlikte kas homeostazı ve hastalıkları hakkında bilgi sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı veziküller (EV'ler), hücreler arası iletişim için proteinler, RNA'lar ve DNA'lar gibi biyoaktif kargoları taşımak için hücreler tarafından salınan lipid çift katmanlı kapalı nanopartiküllerdir. Kas homeostazı ve hastalıklarındaki hücreler arasında EV aracılı karışmayı araştırmak, kas gelişimi, rejenerasyonu ve atrofisi hakkındaki anlayışımızı geliştirmek için önemli bir potansiyel sunar. Bununla birlikte, iskelet kası türevli EV'leri (SkM-EV'ler) izole etmek için mevcut protokoller, öncelikle hücresel zarlardan ödün vermeden EV'lerin kas dokularından salınmasındaki zorluklar nedeniyle, yüksek saflık ve verim elde etmede zorluklarla karşı karşıyadır. Bu makale, mekanik ayırma, enzimatik ayrışma, filtreleme ve ultrasantrifüjlemeyi içeren SkM-EV izolasyonu için etkili bir protokol sunmaktadır. Bu adımlar, kas dokularından EV salınımını artırmak için optimize edilmiştir ve yüksek saflıkta SkM-EV'ler verir. Daha sonra, izole edilmiş SkM-EV'lerin miktarını ve kalitesini karakterize etmek için nano akış sitometrisi, BCA testi ve Western blot testi yapılır. Bu protokol, temel araştırmaları, hastalık teşhisini ve ilaç dağıtımını ilerletmek için doku kaynaklı EV'ler elde etmek için güvenilir bir platform oluşturma sözü taşımaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı veziküller (EV'ler), hücreler tarafından hücre dışı ortama salınan nano boyutlu, zara bağlı parçacıklardır. Bu EV'ler, alıcı hücreler tarafından alındıktan sonra çoklu sinyal yollarını modüle etmek için nükleik asitleri, proteinleri ve lipitleri aktarır. Spesifik olarak, iskelet kasından izole edilen EV'ler (SkM-EV'ler), miyojenik düzenleyici mikroRNA'ların veya transkripsiyon faktörlerinin 1,2,3,4 aktarılmasıyla kas dejenerasyonu, rejenerasyonu ve büyümesinde rol oynamıştır. SkM-EV alt popülasyonları ve özellikleri hakkındaki anlayışımız gelişmeye devam ettikçe, bu veziküller erken tanı 5,6 için biyobelirteçler ve nöromüsküler bozukluklar için terapötik hedefler olarak umut vaat etmektedir. Genişleyen bu alan hem patolojik araştırma hem de klinik uygulamalar için heyecan verici fırsatlar sunmaktadır.

SkM-EV'ler ile ilgili mevcut araştırmalar, ağırlıklı olarak ex vivo kültür 2,7,8'i takiben hücre kültürü süpernatantlarından elde edilenlere odaklanmakta ve ardışık geçişlerden sonra hedef hücre hatlarının aslına uygunluğu ve EV özelliklerinin yapay ortamlarda değişime duyarlılığı ile ilgili endişeleri artırmaktadır. Bu, ex vivo kültür etkilerinden kaçınmak ve in vivo koşulları daha iyi temsil etmek için SkM-EV'leri doğrudan kas dokularından izole etme ihtiyacını vurgulamaktadır. EV'leri kas dokularından izole etmek için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiş olmasına rağmen 9,10, çalışmalar protokol ayrıntılarında hala önemli ölçüde farklılık göstermekte ve tutarlılığı ve karşılaştırılabilirliği etkilemektedir. İlgili çalışmalarda güvenilirliği sağlamak için SkM-EV izolasyonu ve karakterizasyonu için standartlaştırılmış bir protokole acilen ihtiyaç duyulmaktadır.

İskelet kasının fizyolojik özelliklerini göz önünde bulundurarak, mekanik dekolman, enzimatik ayrışma, filtrasyon ve diferansiyel ultrasantrifüjleme kullanarak kemirgen iskelet kası örneklerinden SkM-EV'leri izole etmek ve saflaştırmak için bir protokol geliştirdik. Nano akış sitometrisi, BCA testi ve Western blot testi kullanan kapsamlı analizler sayesinde, bu protokolün sınırlı bir zaman dilimi içinde tutarlı bir şekilde yüksek saflık ve miktarda SkM-EV'ler verdiğini bulduk. Akut ve kronik kas yaralanmaları dahil olmak üzere çeşitli durumlarda iskelet kası örneklerine uygulanabilir. Ayrıca, uygun ayarlamalarla, bu yöntem insan hastalardan veya diğer hayvan modellerinden alınan kas dokuları için uyarlanabilir. SkM-EV izolasyon sürecinin standartlaştırılması, SkM-EV kalitesinde tutarlılığın sağlanması, verim, boyut, kargo bileşimi ve işlev gibi EV özelliklerinin karşılaştırılmasının kolaylaştırılması ve tanısal biyobelirteçler olarak potansiyel uygulamalarının geliştirilmesi ve çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerdeki rollerine ilişkin anlayışımızı geliştirmek için çok önemlidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, mekanik dekolman, enzimatik ayrışma, filtrasyon ve diferansiyel ultrasantrifüjleme kullanarak iskelet kası dokusundan hücre dışı vezikülleri (EV'ler) izole eder. Tibialis anterior (TA), ekstansör digitorum longus (EDL), soleus (SOL), gastroknemius (GAS) ve kuadriseps (QUA) dahil olmak üzere bireysel veya kombine kemirgen ekstremite kas gruplarından EV'lerin izolasyonuna izin verir. Hayvan kullanımı, Georgia Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı ve çalışma, araştırmada hayvanların bakımı ve kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri Kılavuzlarına uygun hale geldi. Hayvanlar, Georgia Üniversitesi Hayvan ve Süt Bilimi Bölümü bünyesindeki hayvan tesislerinde barındırıldı. Bu çalışmada vahşi tip (C57BL / 6J) yetişkin erkek fareler kullanıldı ve farelerden toplanan dokular 3 aylıkken kurban edildi. Kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. Kas gruplarının fareden mekanik olarak ayrılması

  1. Fareleri CO2 ile ötenazi yapın, ardından servikal çıkık yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Her iki arka ayağınızı da tıraş edin.
  2. Fare bacağını, bacağın ön tarafı yukarı bakacak şekilde steril bir plakaya sabitleyin (Şekil 1A).
  3. Diseksiyon makası kullanarak fare ayak bileğinin yan tarafındaki deride küçük bir kesi (5 mm) yapın.
  4. Makasın bir bıçağını dikkatlice insizyona yerleştirin, derinin altına yerleştirin, ancak alttaki kas dokusuna yerleştirmeyin. Ardından, kesi uzunluğunu uzatmak için cildi dizinize doğru yukarı doğru kesin.
  5. Pürüzlü uçlu cımbız kullanarak cildi kesi boyunca tutun ve kas görünene kadar açıklığı genişletin.
  6. Tibia kemiğinin11 yan tarafında dizden ayak bileğine kadar uzanan TA kasını bulun ve kası kaplayan ince bağ dokusu tabakasını kavramak ve soymak için keskin uçlu cımbız kullanın (Şekil 1B).
  7. Ayak bileğinin yakınında, TA'nın sonundaki, biri doğrudan TA kasına bağlı olan ve diğeri daha küçük olan ve lateral taraftaki TA tendonunun yanında bulunan EDL tendonunu tanımlayın. Diseksiyon makası kullanarak her iki tendonu da kesin.
  8. Her iki tendonu da kaba uçlu cımbızla tutun. Ardından, tendonları ayırmak için başka bir pürüzlü veya keskin uçlu cımbız kullanın, böylece TA'yı EDL'den ayırın (Şekil 1C).
  9. TA'yı yeni kesilmiş tendondan kaba uçlu cımbızla kaldırın. Ardından, diseksiyon makası kullanarak dizin yakınındaki TA tendonunu kesin, böylece kası çıkarın. EDL'yi çıkarmak için bu işlemi tekrarlayın ve her iki kası da PBS'de buz üzerinde saklayın.
  10. Bacağınızı serbest bırakın ve fareyi arka yüz yukarı bakacak şekilde ters çevirin.
  11. Bacaktaki deri şimdi kısmen çıkarılmışken, diseksiyon makası kullanarak ayak bileğine yakın cildi kesin. Ardından, cildi dizin arkasına doğru yukarı doğru kavramak ve soymak için kaba uçlu cımbız kullanın ve GAS'ı açığa çıkarın.
  12. Diseksiyon makası kullanarak ayak bileğine yakın GAS tendonunu kesin (Şekil 1D).
  13. GAS tendonunu pürüzlü uçlu cımbızla kavrayın ve GAS'ın alt tarafını ortaya çıkarmak için yukarı doğru kaldırın.
  14. GAS'ın alt tarafındaki küçük SOL tendonunu dize yakın bir yere yerleştirin (GAS'ın hala bağlı olduğu yer). Diseksiyon makası kullanarak SOL tendonunu kesin ve SOL'un yukarı doğru kasılmasına neden olun (Şekil 1E).
  15. Kopmuş SOL tendonunu keskin uçlu cımbızla kavrayın ve nazikçe kaldırın, böylece SOL'u GAS'ın altından ayırın.
  16. Diseksiyon makası kullanarak SOL'un GAS'ın kopan ucuna bağlandığı yeri kesin, böylece iki kası ayırın. PBS'deki SOL'u buz üzerinde koruyun.
  17. GAS'ın ucunu diz kenarından kesin ve buz üzerinde PBS'ye yerleştirin.
  18. Diz altında listelenen dört kası çıkardıktan sonra, ön yüz yukarı bakacak şekilde fareyi ters çevirin.
  19. Gerekirse, QUA'yı ortaya çıkarmak için cildi pürüzlü uçlu cımbızla daha fazla soyun. QUA'yı esnemeye zorlamak için fare bacağını 90°'lik bir açıyla konumlandırın. Diseksiyon makası kullanarak dize en yakın tendonu kesin.
    1. QUA sadece proksimal tendon ile bağlanana kadar kas ve kemik arasında keserek QUA'yı femurdan ayırın (Şekil 1E). Ardından, proksimal tendonu kesin ve QUA'yı çıkarın. QUA'yı PBS'ye buz üzerine yerleştirin.
  20. Kas dekolmanlarından sonra tibia ve fibulanın açıkça açığa çıktığından emin olun (Şekil 1F).
  21. Kürk ve kan gibi kirleticileri gidermek için kasları PBS ile birkaç kez durulayın (Şekil 1G). Ardından kasları kağıt havluyla nazikçe kurulayın. Kas ağırlığını ölçmek için daha sonra kas gramı başına toplanan EV'yi hesaplamak için kullanılacak olan analitik bir terazi kullanın.

2. Müstakil kas parçalarının enzimatik ayrışması

  1. Keskin uçlu cımbız, kıymık cımbız, neşter veya makas kullanarak kas örneğinden kas tendonlarını nazikçe çıkarın (Şekil 2A).
  2. Tendon çıkarıldıktan sonra, yüzey alanı-hacim oranını artırmak için makas veya neşter kullanarak kası kas lifleri boyunca (tendondan tendona) 1 mm kalınlığında kas parçalarına uzunlamasına kesin (Şekil 2B,C).
    NOT: Kesim sırasında miyofiber hasarını sınırlamaya çalışın. TA, GAS ve QA gibi daha büyük kaslar için, tüm kas örneklerinde kabaca eşit bir yüzey alanı-hacim oranı sağlamak için EDL ve SOL gibi daha küçük kaslara kıyasla ek kesimler yapın (Şekil 2D).
  3. Her fare için 10 mL taze sindirim enzimi tamponu (DEB) hazırlayın ve kullanana kadar buz üzerinde tutun.
    1. DEB'yi hazırlamak için,% 1 penisilin-streptomisin çözeltisi ile 1 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) başına 2 mg kollajenaz II enzimini karıştırın. Karıştırdıktan sonra çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtreden süzün.
    2. DEB'nin 250 birimin üzerinde enzimatik aktiviteye sahip olduğundan emin olun. Çözelti iyice karışana ve kollajenaz II enzim tozu artık görünmeyene kadar DEB'yi girdaplayın.
  4. Kas dokusunu, her biri 20 mg kas dokusu içeren alikotlara ayırın. Ardından, enzimatik ayrışma için her bir alikota 1 mL DEB ekleyin.
  5. DEB ve kas karışımını inkübatörde bir çalkalayıcı üzerinde 37 °C'de 12 saat boyunca dakikada 100 devir (rpm) çalkalama hızında inkübe edin (Şekil 2E).

3. SkM-EV'yi zenginleştirmek için filtrasyon ve düşük hızlı santrifüjleme

NOT: Soğutmalı santrifüjü 4 °C'ye ayarlayın ve ayarlanan sıcaklığa ulaşana kadar çalıştırın. Gerekli tüm tüpleri ve numuneleri kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde tutun.

  1. Enzimatik sindirim prosedürlerini takiben, fark edilebilir kas parçalarının görünmediğinden emin olun (Şekil 3A). Soğutmalı santrifüjlemeden önce, DEB-kas karışımından 10 μL çözelti çıkarın ve gerekirse hücre canlılığı testi için 0.2 mL'lik bir tüpe aktarın.
  2. Yeni boş 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerini hazırlayın ve etiketleyin. Pistonu çıkararak (atmayın) ve göbeği 0,45 μm filtrenin üst ucuna vidalayarak 0,45 μm'lik bir filtre ve 5 mL'lik bir şırınga ayarlayın. Filtreyi, alt ucu yeni etiketlenmiş boş bir tüpe yerleştirilecek şekilde konumlandırın (Şekil 3D). 1x PBS'yi 0,2 μm'lik bir filtreden geçirin.
  3. Herhangi bir kalıntıyı peletlemek için karışımı 1.000 x g ve 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin (Şekil 3B). Süpernatanı (yaklaşık 1 mL) bir P200 mikro pipet kullanarak şırıngaya aktarın (Şekil 3C,E).
  4. Şırınga pistonunu tekrar takın ve süpernatanı filtreden yavaşça itin, böylece yeni etiketlenmiş 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünden geçmesine ve toplanmasına izin verin (Şekil 3F).
  5. Pistonu tekrar çıkarın ve şırıngaya yaklaşık 200 μL 1x PBS pipetleyin.
  6. Pistonu yeniden takın ve 200 μL 1x PBS'yi filtreden yavaşça itin (Şekil 3G) filtreden kalan süpernatanı çıkarmak ve etiketli 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne sokmak için.
  7. Her doku örneği için yeni bir filtre kullanarak diğer tüpler için filtreleme işlemini tekrarlayın.
  8. Filtrasyondan sonra, çözeltinin şeffaf olduğundan ve artık kas parçalarından yoksun olduğundan emin olun (Şekil 3H).

4. SkM-EV saflaştırması için diferansiyel ultrasantrifüjleme

NOT: Soğutmalı santrifüjü 4 °C'ye ayarlayın ve ayarlanan sıcaklığa ulaşana kadar çalıştırın. Gerekli tüm tüpleri ve numuneleri buz üzerinde ve kullanıma hazır tutun.

  1. Filtrelenmiş çözeltiyi yeni 1,5 mL mikrotüplere aktarın (200.000 x g'a kadar uygundur). Mikro-ultrasantrifüje yerleştirmeden önce eşit hacim sağlamak için tüm mikrotüpleri ek bir 1x PBS ile dengeleyin.
  2. Tüm tüplerin hacminin eşit olduğundan emin olduktan sonra, tüpleri kapatın ve dengelenecek mikro-ultrasantrifüjün rotoruna yerleştirin (Şekil 4A).
  3. Mikro ultrasantrifüjü açın ve 100.000 x g ve 4 °C'de 1 saat çalışacak şekilde ayarlayın (Şekil 4B).
  4. Tüplerle yüklü rotoru mikro-ultrasantrifüje yerleştirin, kapağı kapatın ve vakumu açın (Şekil 4C).
  5. Vakum seviye 2'ye ulaştığında, başlat düğmesine basın ve santrifüjleme işlemi tamamlanana kadar bekleyin (Şekil 4D).
  6. Mikro ultrasantrifüj döngüsü tamamlandıktan sonra, rotoru ve tüpleri çıkarmadan önce hazneyi yeniden basınçlandırmak için vakum düğmesine tıklayın. Tüpleri buz üzerinde tutun ve peleti rahatsız etmemek için dik olarak konumlandırın.
  7. Peletin bozulmasını önlemek için süpernatanı bir P200 mikropipet ile dikkatlice çıkarın (Şekil 4E).
  8. Ucu çıkarın, ardından bir P50 mikropipet kullanarak süpernatanı çıkardıktan sonra tüpe 1 μL 200x PBS ekleyin. GAS ve QUA numuneleri için, çözünmeye yardımcı olmak için 500 μL'ye kadar 1x PBS ekleyin (Şekil 4F).
  9. Bir P20 mikropipet (veya 500 μL eklenmişse P200 mikropipet) kullanarak peleti tamamen parçalanana ve artık görünmeyecek hale gelene kadar hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti yeniden süspanse edin.
  10. Tüpü kapatın ve kısa süreli depolama için (bir haftadan az) 4 °C'de, uzun süreli depolama için -80 °C'de saklayın veya numune nano akış sitometrisi, Western blot veya diğer tahliller kullanılarak hemen karakterize edilecekse tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolü takiben, iskelet kası hücre dışı vezikülleri (SkM-EV'ler), tibialis anterior (TA), ekstansör digitorum longus (EDL), soleus (SOL), gastroknemius (GAS) ve vahşi tip farelerden kuadriseps (QUA) dahil olmak üzere çeşitli kas gruplarından başarıyla çıkarıldı. Bu SkM-EV'lerin müteakip karakterizasyonu, Tablo 1'de özetlendiği gibi farklı özelliklerini açıklığa kavuşturan nano-akış sitometrisi yoluyla gerçekleştirildi. Dikkat çekici bir şekilde, sadece 1 g kas dokusundan, ortalama partikül boyutu 7...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, farelerden arka bacak kas gruplarının diseksiyonu veya mevcut protokollere göre ölüm sonrası insan kas dokusunun elde edilmesiyle başlar16. Aşağıdaki iskelet kası hücre dışı veziküller (SkM-EV'ler) izolasyon prosedürleri üç ana bölümden oluşur: interstisyel SkM-EV'leri serbest bırakmak için dokunun hafif enzimatik sindirimi, filtrasyon ve düşük hızlı santrifüjleme ve ultrasantrifüjleme. Son olarak, izole edilmiş SkM-EV'lerin profilini çıkarmak için çeşit...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Savunma Bakanlığı W81XWH2210261 (Yao Yao'ya) tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0,6 mL mikrosantrifüj tüpleriThermoFisher Scientific05-408-120
1,5 mL mikro tüp (C) Eppendorf5720411009
1.5 mL mikrosantrifüj tüpleriThermoFisher Scientific3448Berrak, dereceli, steril olmayan
BD 5 mL ŞırıngaBecton Dickinson14-827-52 Luer-lok ucu
Hücre Sayma Slaytları, Hücre Sayacı için Çift OdacıklıBio-Rad145-0011
Santrifüj 5430REppendorf22620667
Temizleme solüsyonuNanoFCM Inc.
Kollajenaz IIWorthington Biochemical CorporationLS004176
DPBS (10x) Sıvı (-kalsiyum,-magnezyum)CytivaSH30378.02Son kullanılan seyreltme 1x
DPBS/Modifiye (1x)CytivaSH30264.02
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM)Genesee Scientific25-500
E-POD Pure Su Uzaktan SebiliMillipore SigmaZRXSP0D01
FA-45-30-11 Mikrosantrifüj RotoruEppendorf05-401-503
Fisher Vortex Genie 2ThermoFisher Scientific12-812
Akış NanoAnalizörüNanoFCM Inc.
Heratherm OGS60 Genel Protokol FırınThermoFisher Scientific51028112Yerçekimi konveksiyonu, 2.3 cu.ft. 120 V
MemGlow-488 ProbHücre İskeleti A.Ş.MG01-02
Millipak Özel KırlangıçMillipore SigmaTANKMPK02
Penisilin-StreptomisinGibco15070063
Pipet-Lite LTS Pipet L-1000XLS+Rainin17014382
Pipet-Lite LTS Pipet L-200XLS+Rainin17014391
Pipet-Lite LTS Pipet L-20XLS+Rainin17014392
Pipet uçları ER LTS 1000µ L F 768G/8Rainin30808038
Pipet uçları ER LTS 20µ L F 960G/10Rainin30807966
Pipet uçları ER LTS 200µ LF 960G/10Rainin30807967
Kalite Kontrol boncuklarıNanoFCM Inc.
S110-AT Sabit Açılı RotorThermoFisher Scientific455391,10.000 rpm
S16 exo 65-155nm boncuklarNanoFCM Inc.
MakasSPI, ABD
Sorvall mX 150+ Mikro-UltrasantrifüjThermoFisher Scientific50135641
TC 20 otomatik hücre sayacıBio-Rad1450102
Tripan MaviÇözelti Corning25-900-CI
CımbızSPI, ABD
VWR 15mL santrifüj tüpleriAvantor89039-668
Whatman Puradisc 13 FiltrelerCytiva6782-13040.45 & mikro; m gözenek boyutu
Vahşi tip C57BL / 6J farelerJackson Laboratuvarıstok #000664

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yamaguchi, A., et al. Pulsed ultrasound promotes secretion of anti-inflammatory extracellular vesicles from skeletal myotubes via elevation of intracellular calcium level. Elife. 12, 89512(2023).
  2. Yamaguchi, A., et al. Skeletal myotube-derived extracellular vesicles enhance itaconate production and attenuate inflammatory responses of macrophages. Front Immunol. 14, 1099799(2023).
  3. Takada, Y., et al. Tumor necrosis factor-α blunts the osteogenic effects of muscle cell-derived extracellular vesicles by affecting muscle cells. Calcif Tissue Int. 112 (3), 377-388 (2023).
  4. Bourgeois, B. L., Levitt, D. E., Molina, P. E., Simon, L. Differential expression of adipocyte and myotube extracellular vesicle miRNA cargo in chronic binge alcohol-administered siv-infected male macaques. Alcohol. 108, 1-9 (2023).
  5. Kargl, C. K., et al. Angiogenic potential of skeletal muscle derived extracellular vesicles differs between oxidative and glycolytic muscle tissue in mice. Sci Rep. 13 (1), 18943(2023).
  6. Vann, C. G., et al. Differential microRNA profiles of intramuscular and secreted extracellular vesicles in human tissue-engineered muscle. Front Physiol. 13, 937899(2022).
  7. Anakor, E., et al. The neurotoxicity of vesicles secreted by als patient myotubes is specific to exosome-like and not larger subtypes. Cells. 11 (5), 845(2022).
  8. Mendhe, B., et al. Lyophilized extracellular vesicles from adipose-derived stem cells increase muscle reperfusion but degrade muscle structural proteins in a mouse model of hindlimb ischemia-reperfusion injury. Cells. 12 (4), 557(2023).
  9. Madison, R. D., Robinson, G. A. Muscle-derived extracellular vesicles influence motor neuron regeneration accuracy. Neuroscience. 419, 46-59 (2019).
  10. Hanson, B., et al. EV-mediated promotion of myogenic differentiation is dependent on dose, collection medium, and isolation method. Mol Ther Nucleic Acids. 33, 511-528 (2023).
  11. Frimand, Z., Das Barman, S., Kjær, T. R., Porpiglia, E., De Morrée, A. Isolation of quiescent stem cell populations from individual skeletal muscles. J Vis Exp. 190, e64557(2022).
  12. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  13. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  14. Fan, Y., et al. Differential proteomics argues against a general role for CD9, CD81 or CD63 in the sorting of proteins into extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 12 (8), e12352(2023).
  15. Baietti, M. F., et al. Syndecan-syntenin-Alix regulates the biogenesis of exosomes. Nat Cell Biol. 14 (7), 677-685 (2012).
  16. Shanely, R. A., et al. Human skeletal muscle biopsy procedures using the modified bergström technique. J Vis Exp. (91), e51812(2014).
  17. Mousavi, K., Miranda, W., Parry, D. J. Neurotrophic factors enhance the survival of muscle fibers in edl, but not sol, after neonatal nerve injury. Am J Physiol Cell Physiol. 283 (3), C950-C959 (2002).
  18. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  19. Ishii, K., Suzuki, N., Mabuchi, Y., Sekiya, I., Akazawa, C. Technical advantage of recombinant collagenase for isolation of muscle stem cells. Regen Ther. 7, 1-7 (2017).
  20. Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. J Vis Exp. (86), e50846(2014).
  21. Mozzetta, C. Isolation and culture of muscle stem cells. Methods Mol Biol. 1480, 311-322 (2016).
  22. Clemens, Z., Wang, K., Ambrosio, F., Barchowsky, A. Arsenic disrupts extracellular vesicle-mediated signaling in regenerating myofibers. Toxicol Sci. 195 (2), 231-245 (2023).
  23. Ma, S., et al. Skeletal muscle-derived extracellular vesicles transport glycolytic enzymes to mediate muscle-to-bone crosstalk. Cell Metab. 35 (11), 2028-2043.e7 (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

skelet Kas EV leriEnzimatik DisosyasyonUltrasantrif jKas Dokusu zolasyonuNano Ak SitometrisiWestern BlotBCA AnaliziH creler Aras leti imTan sal Biyobelirte ler

İlgili makaleler