Yöntem makalesi

Isı Stresi Altında Polizom Profilleri Kullanılarak Translasyon Verimliliği Testi

DOI:

10.3791/67445

⸱

11 Ekim 2024

 , 
1Department of Biochemical Science and Technology, National Taiwan University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan protokol, ribozomlarla ilişkili mRNA'lar olan translatom'u, sakaroz yoğunluk gradyan santrifüjlemesi yoluyla Arabidopsis'ten polisomal olmayan ve polisomal RNA'lara izole etmek için polisomal profillemeyi içerir. Bu yöntem, ısı stresli Arabidopsis'in çeviri verimliliğini göstermektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Isı stresi altında farklı genlerin translasyonel kontrolü, bitkinin çevreye adaptasyonu için kritik bir adımdır. Çeşitli genlerin translasyonel aktivitelerini değerlendirmek, bitki direncinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamamıza yardımcı olabilir ve küresel iklim değişikliği karşısında gelişmiş stres toleransına sahip mahsullerin geliştirilmesine katkıda bulunabilir. Bu makale, ısı stresine maruz kalan bitkilerde polizom profillemesi yoluyla translasyon verimliliğini değerlendirmek için ayrıntılı bir metodoloji sunmaktadır. Prosedür üç bölüme ayrılmıştır: Arabidopsis için ısı stresi tedavisi, polizom profilleri kullanılarak translasyon verimliliği testi ve profile dayalı olarak polizomal olmayan ve polisomal RNA'yı izole ederek translasyon verimliliğinin hesaplanması. İlk bölümde, Arabidopsis bitkileri, çevresel zorlukları taklit etmek için kontrollü ısı stresi koşullarına tabi tutulur. Arıtma, bitkilerin belirli süreler boyunca yüksek sıcaklıklara maruz bırakılmasını ve tutarlı ve tekrarlanabilir stres indüksiyonunun sağlanmasını içerir. Bu adım, bitkinin ısı stresine verdiği fizyolojik ve moleküler tepkileri incelemek için çok önemlidir. İkinci bölüm, polizom profillemesi kullanılarak translasyon verimliliği testini içerir. Polizomlar, ribozomal yüklemeye dayalı olarak mRNA'ları ayıran sakaroz gradyan santrifüjlemesi yoluyla ekstrakte edilir. Bu, mRNA'lar üzerindeki ribozom doluluğunun incelenmesine izin vererek, stres koşulları altında translasyonel kontrol mekanizmaları hakkında bilgi sağlar. Üçüncü bölümde, RNA hem polizomal hem de polizomal olmayan fraksiyonlardan izole edilir. Spike-in RNA, her fraksiyondaki RNA miktarını doğru bir şekilde ölçmek için kullanılır. Translasyon verimliliğinin hesaplanması, normal ve ısı stresi koşulları altında mRNA'ların bu fraksiyonlar arasındaki dağılımı karşılaştırılarak gerçekleştirilir. Spesifik genlerin translasyon aktiviteleri, ribozomla ilişkili RNA ve toplam RNA ile kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) gerçekleştirilerek daha fazla değerlendirilir. Bu metodoloji, yalnızca ısı stresinin etkilerine odaklanır ve bitkilerde translasyonel düzenlemeyi analiz etmek için ayrıntılı bir protokol sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Translasyon, organizmaların mRNA'dan fonksiyonel proteinleri sentezlemesi, temel hücresel fonksiyonları ve metabolizma ve sinyalleşme gibi biyolojik süreçleri desteklemesi ve stres tepkilerini etkinleştirmesi için çok önemlidir. Translasyon olmadan, hücreler hayati proteinleri üretemez, yapılarını, işlevlerini ve düzenlemelerini etkiler, böylece yaşamın sürdürülmesini ve biyolojik çeşitliliğin teşvik edilmesini etkiler 1,2. Bu nedenle, bitkilerin translasyon verimliliğini incelemek çok önemlidir. Çeviri birkaç temel adımı içerir. İlk olarak, başlatma, mRNA'nın bir ribozoma bağlanmasıyla gerçekleşir ve ökaryotlardaki eIF'ler gibi başlatma faktörleri tarafından kolaylaştırılır ve bu da başlangıç kodonunu, tipik olarak AUG'yi tanımlar. Daha sonra, uzama, her biri belirli amino asitler taşıyan transfer RNA (tRNA) molekülleri olarak ribozoma sırayla bağlanır. Peptit bağları, bitişik amino asitler arasında oluşur ve polipeptit zincirini mRNA dizisine göre uzatır. Son olarak, ribozomun yeni sentezlenen proteini serbest bırakmasını sağlayan salım faktörleri tarafından tanınan bir durdurma kodonu (UAA, UAG veya UGA) ile karşılaşıldığında sonlandırma başlatılır. Translasyon boyunca, çeşitli ökaryotik başlatma faktörleri (eIF'ler), uzama faktörleri ve ribozomal RNA'lar, doğruluk ve verimliliği sağlamak için birlikte çalışır 3,4.

Önceki çalışmalar, çeviri sonrası değişikliklerin eIF'ler arasındaki etkileşimleri düzenlemede kritik bir rol oynadığını ve dolayısıyla çeviri verimliliğini etkilediğini göstermiştir. İn vitro araştırmalar, KAZEIN KINAZ 2 (CK2) kinazın eIF3c, eIF5 ve eIF2β'yi fosforile ederek birbirleriyle ve eIF1 ile etkileşimlerini artırdığını ortaya koymuştur 5,6. Karanlıkta, E3 ligaz YAPISAL FOTOMORFOJENİK 1 (COP1), S6K-RPS6'nın TOR aracılı fosforilasyonunu inhibe ederek translasyonu baskılar. Fosforile olmayan RPS6, fonksiyonel ribozomlar oluşturamaz, bu nedenle translasyon7'yi durdurur. Tersine, ışık koşulları altında, PHYA 105'İN BASKILAYICISI (SPA1) kinaz, eIF2 kompleks montajını kolaylaştırmak ve çeviri başlatmayı teşvik etmek için eIF2α'yı fosforile eder8. Bu bulgular, çevresel sinyallere yanıt olarak çeviriyi düzenleyen karmaşık kontrol mekanizmalarını vurgulamaktadır.

Orta derecede çevresel uyaranlar, fotomorfogenez 8,9 gibi büyümeyi kolaylaştırmak için translasyonel süreçleri etkili bir şekilde teşvik edebilir. Bununla birlikte, çevresel faktörler aşırı olduğunda, hareketsiz bitkilerin çevresel stresin neden olduğu hasarı azaltmak için uygun düzenleyici mekanizmalar geliştirmesi gerekir10. Bitki stres tepkileri ile ilgili önceki çalışmalarda, çoğunluk metabolik, hormonal ve transkripsiyonel seviyelerde düzenlemeye odaklanmıştır 11,12,13,14. Bununla birlikte, son araştırmalar, translasyonel düzenlemenin bitki stres toleransı 15,16,17 üzerindeki etkisini vurgulamaya başlamıştır. Bitkiler, öteleme verimliliğini azaltarak stres toleranslarını artırabilir ve böylece gereksiz enerji tüketimini en aza indirebilir. Bitki hücrelerinde zarsız stres granüllerinin oluşumu nedeniyle, translasyonel olmayan mRNA ve ilişkili proteinler, translasyon verimliliğini azaltmak için bunların içinde toplanır18. Bitkilerin sıklıkla karşılaştığı yaygın çevresel streslerden biri, bitki hücreleri içinde stres granüllerinin oluşumunu indüklediği bildirilen ısı stresidir19,20. Küresel ısınmaya bağlı olarak ortalama sıcaklıklardaki küresel artış, mahsul verimini ciddi şekilde etkilemektedir21. Bu nedenle, ısı stresi altındaki bitkilerin fizyolojik düzenlemesini incelemek çok önemlidir. Önceki bir çalışma, buğdayın ısıl işleminin polizome bağlı mRNA'da bir azalmaya yol açtığını göstermiştir. Bununla birlikte, stres granüllerinde depolanan mRNA'lar serbest bırakıldı ve ribozomlara yeniden bağlandı, bu da geri kazanımdan sonra translasyonu kolaylaştırdı22. Ek olarak, önceki araştırmalar, batık bitkilerde toplam mRNA ile polizoma bağlı mRNA arasındaki gen ekspresyonunu karşılaştırmıştır16. Sonuçlar, absisik asit ve abiyotik stres tepkileri ile ilişkili mRNA'nın kararlı durum seviyelerinin, suya batırıldıktan sonra hafifçe arttığını gösterdi. Ayrıca, polizoma bağlı mRNA'ların miktarı önemli ölçüde artmıştır. Bu sonuçlar, translasyon düzenlemesinin bitkilerde stres toleransını kontrol etmede daha kritik bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Bu nedenle, stresle muamele edilmiş numunelerin translatomunu incelemek için etkili bir polisomal RNA izolasyon yöntemi çok önemlidir.

Bu protokolde, RNA izolasyon yöntemini, LiCl çökeltme yöntemi ile yüksek riskli ve hacimli fenol/kloroform ekstraksiyonundan, daha az hacim gerektiren küçük ölçekli fenol/guanidinyum tiyosiyanat ekstraksiyon yöntemine değiştirdik. Eski yöntem, polisomal fraksiyonlarla doğrudan karıştırmayı içerir ve bu da daha büyük bir deneysel atıkile sonuçlanır 9,15,23. Buna karşılık, bu modifiye edilmiş yaklaşım diferansiyel yoğunluk ilkelerini kullanır: polisomal RNA önce yüksek tuzlu, şekersiz bir çözelti ile karıştırılır ve daha sonra ultrasantrifüjleme ile çökeltilir. Daha sonra, RNA ekstraksiyonu, küçük bir hacimde fenol / guanidinyum tiyosiyanat reaktifi kullanılarak gerçekleştirilir. Bu yöntem, organik atık oluşumunu etkili bir şekilde azaltarak deneyimizi daha çevre dostu hale getirir. Ek olarak, kullanılan organik çözücüler daha düşük toksisiteye sahiptir. Bu nedenler bizi deneysel prosedürleri buna göre ayarlamaya ve geliştirmeye yöneltti. Ek olarak, önceki yöntemler, daha derinlemesine translatomik analizler için gerekli olan ani normalleştirme kullanarak çeviri verimliliklerini hesaplamak için kapsamlı bir protokol sağlamıyordu.

Burada, ısı şoku stresi altında Arabidopsis'te translasyon verimliliğini ve translatomik analizleri araştırmak için polizom profillemesi ve polizomal RNA izolasyon protokolünü açıklıyoruz. Bu protokol, normal, ısı şoku ve geri kazanım sonrası koşullar altında Col-0 vahşi tipinde çeviri verimliliğini değerlendirmek için kullanıldı. Polizom profilleme sonuçları ve polisomal RNA yüzdesi, Arabidopsis fidelerinde ısı stresi işlemini takiben translasyon verimliliğinde değişiklikler olduğunu ortaya koydu.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Isı stresi ile muamele edilmiş Arabidopsis fide numunesi hazırlama

  1. Murashige ve Skoog (MS) bazal media agar plakası üzerine yerleştirilen filtre kağıdı üzerine yerleştirilen filtre kağıdı üzerine yerleştirilen her replike için 250 tohum ve her koşul için 250 tohum sakaroz (pH 5.6) içermez ve %1.2 fitoagar ile desteklenir.
    NOT: MS plakalarına fidan dikmek için, fide köklerinin ortamın derinliklerine nüfuz etmesini önlemek için plaka üzerine steril filtre kağıdı yerleştirilir ve daha kolay numune almayı kolaylaştırır. Tohumlar daha sonra filtre kağıdının üzerine ekilir. Şekerlerin bitki büyümesi ve deneysel sonuçlar üzerindeki etkisini dışlamak için, yetiştirme için sakaroz içermeyen bir MS ortamının kullanılması önerilir.
  2. Işığı engellemek için ekilen tohumları içeren MS plakasını alüminyum folyo ile sarın ve vernalizasyonu indüklemek için 2 gün boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  3. Vernalize tohumları, 100 μmol/m2 / s ışık yoğunluğu ile 22 ° C'de 16 saat: 8 saat, açık-koyu fotoperiyot altında yetiştirilecek bir büyüme odasına aktarın.
  4. Isı stresi numuneleri için, 5 günlük fideleri içeren MS orta plakalarını su geçirmez yapışkan bantla kapatın ve 1 saat boyunca 40 °C su banyosuna koyun.
  5. Isıl işlemden sonra geri kazanılan numuneler için, ısıl işlemden hemen sonra plakaları soğutun. Daha sonra, 2 saat boyunca 22 ° C'de bir büyüme odasına yerleştirin.
  6. Her çoğaltma için işlenmiş veya işlenmemiş 250 fideyi 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine hasat edin ve numuneleri hemen sıvı nitrojen içinde dondurun.
    NOT: Her koşul için iki grup numune hazırlandı. Biri polizom profilleme analizleri, diğeri ise polizomal olmayan ve polisomal RNA ekstraksiyonu içindir.

2. Sükroz gradyanı hazırlama

  1. Aşağıdaki sükroz konsantrasyonlarını içeren gradyan çözeltisini hazırlayın:% 12.5,% 24.4,% 36.3,% 48.1 ve% 60. Çözelti bileşimi 50 mM Tris-HCl, 25 mM KCl, 10 mM MgCl2, 100 μg/mL Heparin ve 50 μg/mL sikloheksimid (CHX) içerir.
  2. Gradyan çözeltilerini aşağıdan başlayarak ve yukarı doğru hareket ettirerek yüksek konsantrasyondan düşük konsantrasyona doğru yükleyin. Her bir gradyan çözeltisi konsantrasyonunu ekledikten sonra, bir sonraki konsantrasyonu eklemeden önce çözeltiyi katı hale getirin. Her sükroz gradyanı konsantrasyonu için 2.2 mL ekleyin. Bu işlem, süreksiz bir sükroz yoğunluk gradyanı ile sonuçlanacaktır.
  3. Hazırlanan sükroz gradyanını geçici olarak -80 °C'de saklayın ve kullanmadan önce gece boyunca 4 °C'de çözdürün.

3. Polizom profil oluşturma numunesi hazırlama

  1. Daha önce bir homojenizatör kullanılarak toz haline getirilmiş 250 adet 5 günlük Col-0 fidesini, ısıl stresli veya işlenmemiş, 30 döngü/sn frekansında 1 dakika boyunca öğütün.
    NOT: Aynı arka plana sahip bitki sayısı eşit olduğunda, aynı RNA ekstraksiyon verimine sahiptirler. Bununla birlikte, farklı geçmişlere sahip aşırı eksprese eden transgenik veya mutant bitkiler karşılaştırıldığında, kullanılan bitki miktarı bitki koşullarına göre ayarlanmalıdır.
  2. Polizomal olmayan ve polisomal RNA içeren bir ekstraksiyon çözeltisi elde etmek için, her tüpe 500 μL polizom ekstraksiyon tamponu (200 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM KCl, 25 mM MgCl2, 50 μg/mL sikloheksimid, 100 μg/mL heparin, %2 PTE, %10 DOC, 400 U/mL Ribonükleaz inhibitörü) ekleyin ve numuneleri ters çevirerek ve vorteksleyerek karıştırın. Numunelerin proses boyunca 4 °C'de tutulduğundan emin olun.
  3. Ekstraksiyon çözeltisini 4 ° C'de, 12.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Ardından, berrak ve partikül içermeyen bir ekstraksiyon çözeltisi elde etmek için süpernatanı 100 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.
    NOT: Ekstraksiyon çözeltisinde bulunan parçacıklar, ultrasantrifüjleme sırasında çökelebilir ve potansiyel olarak polizom profil oluşturma ölçümlerinin doğruluğunu etkileyebilecek bir pelet oluşturabilir.
  4. Filtrelenmiş süpernatanı önceden hazırlanmış bir sükroz gradyanına yükleyin ve dengeye ulaştığından emin olun.
    NOT: Ultrasantrifüjün yüksek dönme hızı nedeniyle, ultrasantrifüjün hem güvenliğini hem de düzgün çalışmasını sağlamak önemlidir. Bunu başarmak için, rotasyondan önce numune ağırlıklarının aynı olduğunu doğrulamak gerekir. Bu nedenle, gradyanların ağırlıklarının tamamen aynı olduğunu doğrulamak için hassas bir terazi kullanıyoruz.
  5. Numunelerle yüklenen sakaroz gradyanını bir ultrasantrifüj sallanan kova rotoru kullanarak 3,5 saat boyunca 4 °C, 210.000 x g'de santrifüjleyin. Hızlanma ve yavaşlama oranlarını maksimuma ayarlayın. Ultrasantrifüjlemeden sonra, polizomal olmayan ve polisomal RNA, karşılık gelen sükroz gradyan çözeltisinde yoğunluklarına göre dağıtılır.
    NOT: Sükroz gradyanında, daha düşük yoğunluğa sahip polisomal olmayan RNA üst tabakada dağılırken, mRNA üzerinde aktif translasyon yapan çok sayıda ribozomun varlığına bağlı olarak daha yüksek yoğunluk ile karakterize edilen polisomal RNA alt tabakada dağılır. Daha sonra, polizom profillemesi, bir yoğunluk gradyan fraksiyonlayıcı kullanılarak ölçülebilir.

4. Polizom profil analizi

NOT: Polizom profillemesini ölçmek için mikro hacimli şırınga pompalı bir yoğunluk gradyan fraksiyonatörü kullanılır.

  1. Mikro hacimli şırınga pompası için kovalama solüsyonunu (%70 sakaroz, %10 gliserol ve %0.02 Bromofenol mavisi) hazırlayın.
  2. Yoğunluk gradyan fraksiyonlayıcısını kontrol etmek için yazılım kullanın. Makineyi deiyonize su kullanarak kalibre edin. Kalibrasyondan sonra, polizom profili oluşturma yapmak için kullanın.
    1. Taban çizgisi ayarını yapmak için, ışık kırmızıdan yeşile dönene kadar UV/VISDelector'ı açın. İşaret çizgisini hizalamak için Kaydedici Ofset düğmesini ayarlayın, ardından Taban Çizgisi Ayarı düğmesini minimum açık konuma çevirin. UV/VISDETECTOR üzerindeki Hassasiyet düğmesini seviye 2.0'a ayarlayın ve Otomatik Taban Çizgisi düğmesine basın. Son olarak, istenen taban çizgisini 20'ye ayarlamak için Kaydedici Ofset düğmesini kullanın. Kalibre edilen işlem, mekanizmanın markasına ve farklı numunelere bağlı olarak değişecektir.
  3. Ultrasantrifüjlemeden sonra, tüplerin bulunduğu tüpleri, tüp delme sistemini kullanarak yoğunluk gradyan fraksiyonatörüne yerleştirin, böylece tüp, takip çözeltisi ve UV dedektörü ile şırınga pompasına bağlanabilir.
  4. Yoğunluk gradyan fraksiyonlayıcısını yazılım kontrol moduna (REMOTE) getirin ve mikro hacimli şırınga pompasının enjeksiyon akış hızını 3 mL/dk'ya ayarlayın.
  5. OD254'ü ölçerek fraksiyonatörü kullanarak polizom profil grafiğini başlatmak ve elde etmek için yazılım ayarlarını başlatın.

5. Polizomal olmayan ve polisomal RNA'nın izolasyonu

NOT: Protokolün bu kısmı için, daha önce açıklandığı gibi aynı adımlar izlenerek ultrasantrifüjleme gerçekleştirildikten sonra aynı partiden farklı bir numune grubu kullanıldı.

  1. Polizom profili ölçüm sonuçlarına dayanarak, polisomal olmayan ve polisomal RNA fraksiyonlarını ayrı ayrı toplayın. Hem polizomal olmayan hem de polisomal fraksiyonlar için çözelti hacimlerini hesaplayın ve polizomal olmayan fraksiyonu (üst kısım) toplayın.
    NOT: Profillere göre, ikiden fazla ribozoma sahip fraksiyon polisomal fraksiyon olarak tanımlanırken, 40S, 60S ve 80S rRNA zirvelerine sahip fraksiyon, polizomal olmayan fraksiyon olarak tanımlanır.
  2. RNA'nın hedef fraksiyonlarını önceden soğuk 2x yüksek tuz çözeltisi (400 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM KCl, 50 mM MgCl2) ile iyice karıştırın.
  3. Kitten 8 μL seyreltilmiş Ökaryotik Poli-A RNA Kontrolü stoğu ekleyin.
    NOT: Yedinci adım için gerekli olan ani normalleştirme için. Ökaryotik Poli-A RNA Kontrol Kiti, bitkilerde bulunmayan DAP geni gibi B. subtilis genlerini referans gen olarak içerir. Ekstraksiyondan sonra reaksiyon sırasında referans gen kaybının oranını belirlemek için, ekstraksiyondan önce polizomal olmayan veya polizomal RNA içeren farklı tüplere DAP geninin RNA örneğini içeren eşit miktarda reaktif ekleyin. Bu, ekstraksiyondan sonraki reaksiyon sırasında referans gen kaybının oranının belirlenmesine izin verir ve normalizasyon amaçları için kullanılabilir.
  4. Yüksek tuzlu çözelti karışımlı RNA'yı 4 °C'de, 450.000 x g'da, bir ultrasantrifüj sallanan kova rotoru kullanarak 5 saat boyunca santrifüjleyin.
  5. Ultrasantrifüjlemeden sonra, RNA santrifüj tüpünün dibinde çökelecektir. Alttaki RNA peletini korumak için süpernatanı yukarıdan dikkatlice dökün.
  6. RNA peletini 500 μL önceden soğuk Dietilpirokarbonat (DEPC) ile arıtılmış su ile hızlı bir şekilde yıkayın ve bu adımı 3 kez tekrarlayın.
    NOT: DEPC ile arıtılmış suyun yıkama işlemi sırasında RNA'yı yeniden çözmesini önlemek için, çözünürlüğünü azaltmak için kullanmadan önce DEPC ile arıtılmış suyun önceden soğutulması gerekir. Ek olarak, yıkama sırasında DEPC ile arıtılmış su ile RNA peleti arasındaki temas süresi en aza indirilmelidir.

6. Polizomal olmayan ve polisomal RNA ekstraksiyonu

  1. 500 μL RNA ekstraksiyon reaktifi ekleyin ve ekstrakte edilecek RNA numunesi ile karıştırın. 10 dakika inkübe edin.
  2. 100 μL kloroform ekleyin, iyice karıştırın ve faz ayrımı için 10 dakika inkübe edin.
  3. Reaksiyon karışımını 4 °C'de, 12.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. RNA içeren üst berrak sulu tabakayı yeni bir tüpe aktarın, eşit hacimde izopropanol ile nazikçe karıştırın ve RNA çökelmesi için -20 ° C'de 2 saat inkübe edin.
  4. Çökeltmeden sonra, 4 °C'de, 12.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice atın ve RNA peletini altta tutun.
  5. RNA peletini 1 mL önceden soğuk %75 etanol ile yıkayın. 4 ° C'de, 12.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin, süpernatanı atın ve RNA peletini havayla kurutun.
  6. RNA peleti kuruduktan sonra, RNA peletini 30 μL DEPC ile arıtılmış suda yeniden süspanse edin ve tam spektrumlu (220 nm-750 nm) spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonunu (OD260) ölçün.

7. Ani normalleşme

  1. Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir qPCR kiti kullanılarak yapılan ters transkripsiyon için 1000 ng ekstrakte edilmiş RNA kullanın. Hem polizomal olmayan hem de polizomal RNA'nın cDNA'ya ters kopyalanması gerekir.
  2. 1 μL cDNA'yı DAP gen primerleri ile karıştırın ve üreticinin talimatına göre hedef genin ekspresyon seviyesini ölçmek için SYBR tamponunu kullanın. Ardından, DAP gen ekspresyonunu tespit etmek için gerçek zamanlı PCR kullanın.
    NOT: DAP geninin primerlerinin dizileri aşağıdaki gibidir:
    İleri astar = 5'-ATA, AAA, GAA, TTC, TTC, AAG, TAA, CGC, TTC, C-3'
    Ters astar = 5'-TTG TTT CTT TGC CTC TAT TGT ATC C-3'
  3. Ölçülen polizomal olmayan ve polisomal RNA gruplarındaki DAP genlerinin ekspresyon seviyelerini karşılaştırın ve oransal kayıp koşulları altında RNA içeriğini tahmin edin. Normalleştirilmiş RNA içeriğini kullanarak, polizomlardaki RNA oranını hesaplayın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arabidopsis'in vahşi türü olan Col-0, MS ortamında 16 h: 8 h ışık fotoperiyodu altında büyütüldü. Kontrol için, ısı stresi işlemi yapılmadan 5 günlük fideler kullanıldı. Isı stresi grubu, önceden ısıtılmış bir su banyosunda 40 °C'de 1 saat ısıl işleme tabi tutulurken, geri kazanım grubu, ısıl işlemden hemen sonra 2 saat boyunca 22 °C'ye yerleştirildi. Farklı ısıl işlem koşulları ve geri kazanım koşulları kullanarak, translasyon verimliliklerini ölçmek için sonraki adımları kullanabiliriz.

RNA ekstraksiyonundan önce, önce sükroz gradyanı hazırlanmalıdır. Polizomal olmayan ve polisomal RNA'yı yoğunluk farklarına göre ayırmak için .5, $.4, 6.3, H.1 ve ` sükroz konsantrasyonlarına sahip bir gradyan çözeltisi hazırladık. Daha sonra gradyan çözeltilerini alttan başlayarak yüksek konsantrasyondan düşük konsantrasyona doğru yükledik (Şekil 1A). Daha sonra, bu gradyanı üst katmanda düşük yoğunluklu polisomal olmayan RNA'yı ayırmak için kullanabiliriz, daha yüksek yoğunluklu polisomal RNA ise daha yüksek sükroz konsantrasyonlarına sahip alt katmanda dağıtılacaktır. Polizomal olmayan ve polisomal RNA, tedavi edilmiş veya tedavi edilmemiş Col-0'dan ekstrakte edildi. Çözeltideki partiküllerin polizom profilleme analizinin sonuçlarını etkilemesini önlemek için, RNA içeren çözelti, partikül içermeyen bir ekstraksiyon çözeltisi elde etmek için bir hücre süzgecinden süzülmelidir. Filtrelenmiş süpernatant, önceden hazırlanmış bir sükroz gradyanına yüklendi ve dengelendi. Sükroz gradyan yüklü numunelerin ultrasantrifüjlenmesinden sonra, polisomal olmayan ve polisomal RNA, sükroz gradyanı içindeki yoğunluğa göre dağıtıldı. Daha sonra, bir yoğunluk gradyan fraksiyonlayıcı kullanılarak polizom profillemesi gerçekleştirildi (Şekil 1B). Yoğunluk gradyan fraksiyonlayıcı, başlangıçta deiyonize su ile kalibre edilmiş yazılım kullanılarak kontrol edilir. Kalibrasyonun ardından numuneler, ultrasantrifüjleme sonrası fraksiyonlayıcıya yüklenir. Yazılım kontrol modunda çalışan mikro hacimli şırınga pompası, numuneyi iterek gradyan içine sakaroz gradyanından daha yüksek konsantrasyonlara sahip sakaroz solüsyonu enjekte eder. Bu, ölçümün yoğunluğun daha düşük olduğu sükroz gradyanının tepesinden başlamasına ve yoğunluğun daha yüksek olduğu yere doğru ilerlemesine izin verir. Daha sonra, OD254 ölçümü yoluyla polizom profil grafiği oluşturularak veri toplamaya başlamak için yazılım ayarları etkinleştirilir (Şekil 1B). Polizomal fraksiyonda daha yüksek bir sinyal yoğunluğu gözlemlediğimizde, numunenin daha yüksek translasyon verimliliği sergilediğini gösterir.

Farklı işlemler altında 5 günlük Col-0 fideleri için polizom profilleme grafikleri Şekil 2'de gösterilmektedir. Kontrol grubunun sonuçları, polisomal olmayan fraksiyon ile polizomal fraksiyon arasında net bir ayrım olduğunu göstermektedir (Şekil 2A). Bununla birlikte, 40 ° C'de 1 saatlik ısı stresinden sonra, polisomal fraksiyonun sinyal yoğunluğu önemli ölçüde azalmıştır (Şekil 2B). Isıl işlem görmüş fidelerin 22 °C'de 2 saat boyunca toparlanmasına izin verildiğinde, polisomal fraksiyonun sinyal yoğunluğu kontrol grubuna benzer bir seviyeye geri kazanılmıştır (Şekil 2C). Sonuçlarımız, 1 saatlik ısı stresi işleminin Arabidopsis fidelerinin çeviri verimliliğini önemli ölçüde azalttığını göstermiştir. Bununla birlikte, bitkilerin, translasyon verimliliğini ısı stresinden muzdarip olmayan fidelerinkiyle karşılaştırılabilir seviyelere geri yüklemek için 2 saatlik bir geri kazanıma ihtiyacı vardı.

Farklı tedavi koşulları altında Col-0 fidelerinin translasyon verimliliğini karşılaştıran daha fazla kanıt toplamak için, polisomal olmayan ve polisomal RNA fraksiyonlarını izole ettik ve ekstrakte ettik. Polizomal olmayan ve polisomal RNA fraksiyonlarının toplanması, polizom profil ölçümlerinin sonuçları tarafından yönlendirildi. Polizomal olmayan ve polisomal RNA ekstraksiyonu için, izole edilmiş polizomal olmayan ve polizomal RNA örneklerini çıkarmak için fenol / guanidinyum tiyosiyanat reaktifini kullanıyoruz. Kullandığımız RNA ekstraksiyon yöntemi ile aşağıdaki analizimiz için stabil ve yüksek kaliteli RNA elde edebiliriz (Tablo 1). Daha sonra, değişen ekstraksiyon kayıplarının neden olduğu hataları azaltmak için ekstrakte edilen RNA'yı GeneChip Ökaryotik Poli-A RNA Kontrol Kiti ile normalleştirin. Daha sonra, kite eklenen B. subtilis genlerinde bulunan DAP genlerinin ekspresyonunu ölçmek için gerçek zamanlı PCR kullanıldı. Polizomal olmayan ve polisomal RNA grupları arasındaki DAP gen ekspresyon seviyelerinin karşılaştırmalı analizi, oransal kayıp koşulları altında RNA içeriğini tahmin etmek için yapılmıştır (Şekil 3A). Aralarındaki translasyon verimliliğini netleştirmek için normalleştirilmiş polizomal RNA'nın toplam RNA'ya oranını hesapladık (Şekil 3B). Son olarak, polizomlardaki RNA oranı, normalleştirilmiş RNA içeriği kullanılarak hesaplandı (Şekil 3C). Col-0'ın farklı tedavileri altındaki polizomlardaki RNA oranının sonuçları, Şekil 2A'da gösterilen polizom profili sonuçlarıyla tutarlı bir model sergiledi. Her iki sonuç da ısı stresinin polisomal fraksiyondaki RNA oranını önemli ölçüde azalttığını ve bu etkinin 22 ° C'de 2 saatlik bir geri kazanımdan sonra tersine çevrilebileceğini göstermektedir (Tablo 1).

Bu yöntemden, RNA'yı ek fraksiyonlara ayırmak yerine, polizomal olmayan veya polizomal RNA fraksiyonunun tamamını yüksek kalitede elde edebiliriz23. Sonuçlarımız ayrıca, hem polizom profillerinin hem de polizomlardaki RNA yüzdesinin, farklı tedavi koşullarıyla Arabidopsis'teki translasyon verimliliğini etkili bir şekilde yansıtabileceğini göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1: Polizom profil oluşturma iş akışı şeması. (A) 13 mL'lik bir santrifüj tüpünde sükroz gradyanının hazırlanmasının şematik gösterimi. (B) Akış şeması, polizom profillemenin deneysel sürecini göstermektedir. İlk olarak, translatom çıkarılır. Daha sonra, polizomal olmayan ve polizomal RNA, değişen yoğunluklardaki sakaroz gradyanlarında ultrasantrifüjleme kullanılarak yoğunluk farklılıklarına göre ayrılır. OD254 , aşağıdaki polizom profil oluşturma sonuç grafiğini elde etmek için bir yoğunluk gradyan fraksiyonlayıcı kullanılarak ölçülür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Farklı koşullar altında Col-0'ın polizom profili. (A, B, C) (A) ısıl işlem yapılmaması (kontrol), (B) 40 °C'de 1 saat ısıl işlem ve (C) ısıl işlemden sonra 1 saat boyunca 22 °C'de geri kazanım koşulları altında Col-0'ın polizom profilleme sonuçları. Polizomal olmayan ve polisomal RNA, .5-` sükroz gradyanı kullanılarak fraksiyone edildi. Polizomal olmayan (NP) ve polizomal (PL) RNA'nın pozisyonları profillerde belirtilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Polizomal olmayan ve polizomal RNA ekstraksiyonu iş akışı diyagramı. (A) Spike ile RNA normalizasyonunun bir örneği. (B) Polizomal olmayan ve polizomal RNA'nın ayrılmasının ve polisomal RNA yüzdesinin hesaplanmasının bir gösterimi. (C) Farklı koşullarla tedavi edilen Col-0'daki polisomal RNA yüzdesi. Hata çubukları SD ± ortalamayı gösterir (n=3 biyolojik tekrar). *p değeri < 0.01, Öğrenci t testi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

İçerik (ng)260/280260/230
KontrolRNANP758.32.192.16
RNAPL302.32.212.13
Isı stresiRNANP821.52.22.15
RNAPL174.32.192.21
KurtarmaRNANP797.22.172.16
RNAPL300.92.192.18

Tablo 1: Polizomal olmayan ve polisomal RNA içerikleri ve nitelikleri. Bu tablo, RNA içeriğinin ve niteliklerinin analiz edildiğini gösterdi. RNA içeriği, modifiye yöntemler kullanılarak ekstraksiyondan sonra normalize edildi.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Arabidopsis fidelerinin çeviri verimliliğini ölçmek için basit ve standartlaştırılmış bir yöntemin ana hatlarını çizmektedir. Bu protokolün kritik adımları, ikincil santrifüjleme ve RNA ekstraksiyon reaktif ekstraksiyonu ile RNA stabilitesinin sağlanmasının yanı sıra sükroz gradyanının titiz bir şekilde hazırlanmasıdır. Ayrıca, spike-in normalizasyon yöntemi ile polizomal olmayan ve polizomal RNA'nın normalleştirilmesi ve miktarının belirlenmesi için kritik adımlar sağlıyoruz. Tüm işlemlerin RNaz içermeyen tamponlar ve aletler kullanılarak buz üzerinde yapılması çok önemlidir. Ayrıca, sükroz konsantrasyonunun doğru bir şekilde hazırlanmasını sağlayın ve gradyan üzerindeki etkisini azaltmak için sallanmayı en aza indirin. Önceki çalışmalarda24,25,26, stres tepkileri üzerine yapılan araştırmalar ağırlıklı olarak transkripsiyonel ve fenotipik analizlere odaklanmıştır. Polizom profil analizleriyle, stres veya diğer çevresel uyaranlar altındaki bitkilerde translasyon süreçlerinin düzenlenmesini daha fazla araştırabiliriz.

Translasyonel süreçleri anlamak, yalnızca polizom profil oluşturma deneyleri yürütmeyi değil, aynı zamanda bunları Azidohomoalanin (AHA) etiketleme deneyleri ile tamamlamayı da içerir. AHA etiketlemesi, protein sentezini ve translasyonel aktiviteyi araştırmak için kullanılır27. Yöntem, yeni sentezlenen proteinlerdeki metiyonin kalıntılarını, bir azid grubu içeren bir metiyonin analoğu olan AHA ile değiştirir. Hücreler, translasyon sırasında AHA'yı yeni sentezlenen proteinlere entegre eder. Daha sonra, tıklama kimyası gibi azid kimyası tabanlı teknikler kullanılarak, AHA içeren proteinler seçici olarak etiketlenebilir ve tespit edilebilir, bu da aktif olarak çevrilen proteinlerin kantitatif analizini ve görselleştirilmesini sağlar28. Araştırmacılar, AHA etiketlemesini polizom profillemesi ile birleştirerek, bitki hücreleri içindeki protein sentezinin dinamikleri hakkında daha derin bilgiler edinebilirler8.

Bu polisomal RNA izolasyonu ve spike-in normalizasyon yöntemiyle, ekstrakte edilen RNA'yı RNA dizileme analizi için de kullanabiliriz. Polizoma bağlı mRNA'yı analiz ederek, hangi mRNA'ların aktif olarak translasyon geçirdiğini belirleyebiliriz. Ayrıca, kararlı durum mRNA'sını polizoma bağlı mRNA ile karşılaştırmak, translasyon veya transkripsiyon düzeyinde aşırı eksprese edilen genleri tanımlamamıza olanak tanır. Kararlı durum mRNA'nın ekspresyon seviyesi, transkripsiyonel aktiviteyi yansıtırken, polizoma bağlı mRNA, aktif olarak translasyon geçiren genleri gösterir. Translasyon verimliliği, çevresel uyaranlardan ve translasyon sonrası modifikasyonlardan etkilenir 7,8,9,16. Bu nedenle, bu yöntem, ilgilenilen hedef proteinin etkili bir şekilde çevrilip çevrilmediğine dair kapsamlı bir anlayış sağlar. Bununla birlikte, bu yöntemin sınırı, ekstraksiyon prosedürü sırasında hala bir RNA kaybı olacağıdır. qRT-PCR yoluyla elde edilen spike-in RNA'nın nispi ekspresyonu da hafif ölçüm hatalarına neden olabilir. Hedef proteinin fonksiyonel yönlerini araştırmak için proteomik veya Western blot kullanılarak daha fazla araştırma ve doğrulama gereklidir.

Özetle, bu protokol, çeviri verimliliğini değerlendirmek için net sonuçlarla basit bir yaklaşım sağlayan basit bir yöntemi temsil eder. Daha da önemlisi, uygulanabilirliği, diğer çeşitli çevresel uyaranlara maruz kalan fideleri kapsayacak şekilde ısı stresi ile muamele edilmiş fidelerin ötesine uzanır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaşam Bilimleri Koleji'ndeki Technology Commons'tan ve Ulusal Tayvan Üniversitesi (Tayvan) Bilim ve Teknoloji Bakanlığı tarafından desteklenen Enstrümantasyon Merkezi'nden ultrasantrifüj teknik araştırma hizmetlerini kabul ediyoruz. Ayrıca teknik destek için Yu-Ling Liang'a ve el yazmasının eleştirel okuması için Cheng laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, Tayvan'daki Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi'nden Young Scholar Fellowship Einstein Programı tarafından hibe nos kapsamında desteklenmiştir. NSTC 113-2636-B-002-007 - M.-C.C. M.-C.C., Ulusal Tayvan Üniversitesi'nden gelen mali desteği kabul eder.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 mL eppendorf tüpüLabcon3012-870-000-9RNA ekstraksiyonu
13.2 mL santrifüj tüpüBeckman Coulter331372ultrasantrifüjleme
Bromofenol mavisiHoneywell32712Polizom profili
KloroformHoneywell32211RNA ekstraksiyonu
Sikloheksimid (CHX)Sigma-AldrichSI-C7698Polizom profili
Dietil pirokarbonat (DEPC)Sigma-AldrichD5758RNA ekstraksiyonu
EtanolSigma-Aldrich32221RNA ekstraksiyonu
GeneChip Ökaryotik Poli-A RNA Kontrol Kitiİnvitrojen900433Normalizasyon
GliserolHoneywell15523Normalizasyon
HeparinSigma-AldrichSI-H3149Polizom profili
HiScript III RT SuperMix qPCR kiti içinVazymeR323-01Normalizasyon
KClJTbaker  3040-01Polizom profili
MgCl2Sigma-AldrichSI-M8266Polizom profili
MS bazal ortamFitoM524Bitki kültürü
Tepe Tablosu Şırınga PompasıBrandelSYN4007LSPolizom profili
Polioksietilen-10-Tridesil-Eter (PTE)Sigma-AldrichP2393Polizom profili
RNasinPromegaN251BPolizom profili
Sodyum deoksikolat (DOC) Sigma-AldrichSI-D6750Polizom profili
SükrozSigma-AldrichS5391Polizom profili
SYBR Green SupermixBio-RadBP170-8882Normalizasyon
TRI reaktifiMRCTR118RNA ekstraksiyonu
Tris-HClJ.T.Baker  4109-06Polizom profili
UltrasantrifüjBeckman CoulterOptima L-100Kultrasantrifüj
UV/VISDETECTORBrandelUA-6Polizom profili

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Picard, F., Loubière, P., Girbal, L., Cocaign-Bousquet, M. The significance of translation regulation in the stress response. BMC genomics. 14, 1-11 (2013).
  2. Yuan, S., Zhou, G., Xu, G. Translation machinery: the basis of translational control. J Genet Genom. 51 (4), 367-378 (2024).
  3. Dever, T. E., Green, R. The elongation, termination, and recycling phases of translation in eukaryotes. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (7), a013706(2012).
  4. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
  5. Dennis, M. D., Browning, K. S. Differential phosphorylation of plant translation initiation factors by Arabidopsis thaliana CK2 holoenzymes. J Biol Chem. 284 (31), 20602-20614 (2009).
  6. Dennis, M. D., Person, M. D., Browning, K. S. Phosphorylation of plant translation initiation factors by CK2 enhances the in vitro interaction of multifactor complex components. J Biol Chem. 284 (31), 20615-20628 (2009).
  7. Chen, G. H., Liu, M. J., Xiong, Y., Sheen, J., Wu, S. H. TOR and RPS6 transmit light signals to enhance protein translation in deetiolating Arabidopsis seedlings. Proc Natl Acad Sci. 115 (50), 12823-12828 (2018).
  8. Chang, H. H., Huang, L. C., Browning, K. S., Huq, E., Cheng, M. C. The phosphorylation of carboxyl-terminal eIF2α by SPA kinases contributes to enhanced translation efficiency during photomorphogenesis. Nat Comm. 15 (1), 3467(2024).
  9. Liu, M. J., Wu, S. H., Chen, H. M., Wu, S. H. Widespread translational control contributes to the regulation of Arabidopsis photomorphogenesis. Mol Sys Biol. 8 (1), 566(2012).
  10. Des Marais, D. L., Juenger, T. E. Pleiotropy, plasticity, and the evolution of plant abiotic stress tolerance. Ann New York Acad Sci. 1206 (1), 56-79 (2010).
  11. Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. Reactive oxygen species signalling in plant stress responses. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (10), 663-679 (2022).
  12. Shulaev, V., Cortes, D., Miller, G., Mittler, R. Metabolomics for plant stress response. Physio Plantarum. 132 (2), 199-208 (2008).
  13. Sun, M., et al. Transcriptome analysis of heat stress and drought stress in pearl millet based on Pacbio full-length transcriptome sequencing. BMC Plant Biology. 20, 1-15 (2020).
  14. Wasternack, C. Action of jasmonates in plant stress responses and development-applied aspects. Biotechnol Adv. 32, 31-39 (2014).
  15. Chen, T., et al. Global translational induction during NLR-mediated immunity in plants is dynamically regulated by CDC123, an ATP-sensitive protein. Cell Host Microbe. 31 (3), 334-342 (2023).
  16. Cho, H. Y., Chou, M. Y., Ho, H. Y., Chen, W. C., Shih, M. C. Ethylene modulates translation dynamics in Arabidopsis under submergence via GCN2 and EIN2. Sci Adv. 8 (22), eabm7863(2022).
  17. Wen, J., et al. Alternative splicing of TaHSFA6e modulates heat shock protein-mediated translational regulation in response to heat stress in wheat. New Phytol. 239 (6), 2235-2247 (2023).
  18. Maruri-López, I., Figueroa, N. E., Hernández-Sánchez, I. E., Chodasiewicz, M. Plant stress granules: trends and beyond. Front Plant Sci. 12, 722643(2021).
  19. Hamada, T., et al. Stress granule formation is induced by a threshold temperature rather than a temperature difference in Arabidopsis. J Cell Sci. 131 (16), jcs216051(2018).
  20. Jang, G. J., Jang, J. C., Wu, S. H. Dynamics and functions of stress granules and processing bodies in plants. Plants. 9 (9), 1122(2020).
  21. Ostberg, S., Schewe, J., Childers, K., Frieler, K. Changes in crop yields and their variability at different levels of global warming. Earth Sys Dyn. 9 (2), 479-496 (2018).
  22. Wen, J., et al. Alternative splicing of TaHSFA6e modulates heat shock protein-mediated translational regulation in response to heat stress in wheat. New Phytol. 239 (6), 2235-2247 (2023).
  23. Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. J Vis Exp. (87), e51164(2014).
  24. Hsieh, E. J., Cheng, M. C., Lin, T. P. Functional characterization of an abiotic stress-inducible transcription factor AtERF53 in Arabidopsis thaliana. Plant Mol Biol. 82, 223-237 (2013).
  25. Cheng, M. C., Liao, P. M., Kuo, W. W., Lin, T. P. The Arabidopsis ETHYLENE RESPONSE FACTOR1 regulates abiotic stress-responsive gene expression by binding to different cis-acting elements in response to different stress signals. Plant Physiol. 162 (3), 1566-1582 (2013).
  26. Van den Broeck, L., et al. From network to phenotype: the dynamic wiring of an Arabidopsis transcriptional network induced by osmotic stress. Mol Sys Biol. 13 (12), 961(2017).
  27. Dieterich, D. C., et al. detection and identification of newly synthesized proteomes with bioorthogonal non-canonical amino-acid tagging. Nat Protoc. 2 (3), 532-540 (2007).
  28. Zhang, J., et al. Proteomic profiling of de novo protein synthesis in starvation-induced autophagy using bioorthogonal noncanonical amino acid tagging. Acad Press. 588, 41-59 (2017).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Polysome ProfilingTranslation EfficiencyHeat StressArabidopsis PlantsTranslational RegulationSucrose GradientRNA IsolationSpike In NormalizationRibosome OccupancyqRT PCR

İlgili makaleler