Yöntem makalesi

THP-1 Hücrelerinde Elektroporasyon Tabanlı CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Nakavt ve Tek Hücreli Klon İzolasyonu

4.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67469

⸱

28 Şubat 2025

 , 
1INSERM, CEA, Center for Immunology of Viral, Auto-immune, Hematological and Bacterial diseases (IMVA-HB/IDMIT), Université Paris-Saclay

Bu makalede

Özet

THP-1 hücre hattı, biyoloji ile ilgili çeşitli araştırma alanlarında insan monositlerinin / makrofajlarının işlevlerini araştırmak için bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu makale, sağlam ve tekrarlanabilir fenotipik verilerin üretilmesini sağlayan verimli CRISPR-Cas9 tabanlı mühendislik ve tek hücreli klon izolasyonu için bir protokolü açıklamaktadır.

Özet

İnsan akut monositik lösemi (AML) THP-1 hücre hattı, insan immün yetmezlik virüsü (HIV) gibi önemli insan patojenleri ile etkileşimleri de dahil olmak üzere, insan monositinden türetilmiş makrofajların işlevlerini incelemek için bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Miyeloid kökenli diğer ölümsüzleştirilmiş hücre dizileriyle karşılaştırıldığında, THP-1 hücreleri birçok sağlam enflamatuar sinyal yolunu korur ve forbol-12-miristat 13-asetat (PMA) ile tedavi edildiğinde makrofajlara farklılaşma yeteneği de dahil olmak üzere birincil monositlerinkine daha çok benzeyen fenotipik özellikler gösterir. Hedeflenen gen nakavt (KO) yoluyla THP-1 hücrelerini tasarlamak için CRISPR-Cas9 teknolojisinin kullanılması, virüs-konak etkileşimleri de dahil olmak üzere bağışıklıkla ilgili mekanizmaları daha iyi karakterize etmek için güçlü bir yaklaşım sağlar. Bu makale, önceden monte edilmiş Cas9:sgRNA ribonükleoproteinlerini hücre çekirdeğine iletmek için elektroporasyon kullanan verimli CRISPR-Cas9 tabanlı mühendislik için bir protokolü açıklamaktadır. Aynı lokusu biraz farklı pozisyonlarda hedefleyen çoklu sgRNA'ların kullanılması, büyük DNA fragmanlarının silinmesine neden olur, böylece T7 endonükleaz I testi tarafından değerlendirildiği gibi düzenleme verimliliğini artırır. Genetik düzeyde CRISPR-Cas9 aracılı düzenleme, Sanger dizilemesi ve ardından CRISPR Düzenlemelerinin Çıkarımı (ICE) analizi ile doğrulandı. Protein tükenmesi, fonksiyonel bir test ile birlikte immünoblotlama ile doğrulandı. Bu protokol kullanılarak, hedeflenen lokusta %100'e kadar indels ve protein ekspresyonunda %95'in üzerinde bir azalma elde edildi. Yüksek düzenleme verimliliği, seyreltmeyi sınırlayarak tek hücreli klonları izole etmeyi kolaylaştırır.

Giriş

THP-1, akut lösemiden (AML) muzdarip bir hastadan izole edilen ve primer monositlerinkine çok benzeyen fenotipik özellikler gösteren bir insan monosit türevi hücre hattıdır1. Fenotip olarak hem sınırlı yaşam süresi hem de donörler arası / donör içi değişkenliği göstermeyen ve bölünmeyen primer monosit türevli makrofajlarla karşılaştırıldığında, THP-1 hücreleri neredeyse sonsuza kadar kültürlenebilir ve sonuçların tekrarlanabilirliğini destekleyen daha homojen bir davranışa sahip olabilir 2,3,4,5,6. Özellikle, THP-1 hücreleri, forbol-12-miristat 13-asetat (PMA) ile makrofaj benzeri bir fenotipe doğru farklılaşabilir, bu da onları monositlerin / makrofajların enflamatuar sinyalleretepkilerini araştırmak için yaygın olarak kullanılan bir in vitro model haline getirir 7,8,9,10,11,12,13 veya HIV 14 dahil olmak üzere klinik olarak ilgili insan patojenlerinin neden olduğu enfeksiyon,15,16. THP-1 hücrelerini genetik olarak tasarlama olasılığı, biyoloji ile ilgili birçok araştırma alanında ilgi çekicidir.

Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar-CRISPR ilişkili protein 9 (CRISPR-Cas9), bir genetik mühendisliği aracı olarak yeniden programlanmış, istilacı viral genomları parçalamak için RNA güdümlü nükleaz üzerinde geçiş yapan prokaryotik adaptif bir bağışıklık sistemidir17. Genom düzenleme süreci üç adımda ilerler: tanıma, bölünme ve onarım. Tek kılavuzlu bir RNA (sgRNA), Cas9 nükleazını 20 bp kılavuz dizisi ile baz eşleşmesi yoluyla belirli bir genomik lokusa alır. 20 bp genomik hedef dizinin doğrudan 3'ü olan bir Protospacer Bitişik Motif (PAM) dizisinin varlığı, 17 ve 18 (PAM'ın 3-bp 5'i) arasındaki her iki DNA zincirinde Cas9 aracılı çözülmeyi ve bölünmeyi tetikler. Elde edilen çift iplikli kopma (DSB), iki ana onarım yolu tarafından işlenir. Hasarlı lokus ile homoloji taşıyan bir onarım şablonunun yokluğunda, hataya eğilimli Homolog Olmayan Uç Birleştirme (NHEJ) yolu, rastgele nükleotid eklemeleri ve/veya delesyonları (indels) başlatacak ve potansiyel olarak çerçeve kayması mutasyonlarına ve/veya erken sonlandırma kodonlarının (PTC) eklenmesine yol açacaktır. Buna karşılık, PTC içeren mRNA'lar, anlamsız aracılı mRNA bozunması (NMD) yolu tarafından bozunma ile hedeflenir ve sonuçta protein ekspresyonu/işlevinibozar 18,19,20. Alternatif olarak, şablona bağımlı Homoloji Yönelimli Onarım (HDR) yolu DSB'yi çalıştırabilir ve aslına uygun olarak onarabilir. Bu mekanizma, knock-in'ler ve baz ikameleri dahil olmak üzere hassas gen düzenlemesi elde etmek için kullanılmıştır. Hücre döngüsü durumunun, DSB onarım yolunun seçimini etkileyen önemli bir faktör olduğunu belirtmekte fayda var. Gerçekten de, NHEJ hücre döngüsünün tüm aşamalarında aktiftir, HDR ise esas olarak S / G2 fazları21 ile sınırlıdır.

THP-1 hücreleri süspansiyon halinde büyür ve plazmid DNA ile transfekte edilmesi herkesin bildiği gibi zordur, bu da muhtemelen canlılıklarını ve / veya farklılaşma kapasitelerini de değiştiren bir prosedürdür22,23. Hem Cas9'u hem de sgRNA'yı kodlayan HIV-1 bazlı lentiviral vektörlerle transdüksiyon, genellikle ilgilenilen bir geni nakavt etmek (KO) için kullanılır24. Cas9/sgRNA kasetinin hücresel genoma entegrasyonu, uzun süreli ekspresyon ve verimli KO sağlar, ancak aynı zamanda hedef dışı etkilerin kalıcı bir kaynağıdır25. Alternatif olarak, önceden monte edilmiş Cas9:sgRNA ribonükleoproteinleri (RNP'ler), elektrik darbelerinin uygulanması üzerine hem plazma hem de nükleer zarlarda geçici gözenek oluşumunu içeren bir yöntem olan elektroporasyon ile verilir. Hücre canlılığını korumak, bu yaklaşımı gerçekleştirirken önemli bir zorluktur.

Burada, verimli CRISPR-Cas9 tabanlı düzenleme elde etmek için bir protokol oluşturmak için bir araç olarak hizmet etmek üzere GFP'yi (THP-1_GFP) kararlı bir şekilde ifade eden bir THP-1 hücre hattı üretildi. Aynı anda üç sgRNA kullanarak EGFP genini inaktive etmek için bir strateji tasarlandıktan sonra (çoklu kılavuz yaklaşımı), bir okuma olarak GFP ekspresyonu kullanılarak çeşitli elektroporasyon koşulları arasında KO etkinliği belirlendi. Hücre proliferasyonu paralel olarak izlendi. Gen düzenleme, hem bir T7 endonükleaz I (T7EI) testi hem de Sanger dizilimi ile doğrulandı, ardından CRISPR Düzenlemelerinin Çıkarımı (ICE) algoritması26 ile analiz edildi. THP-1 hücrelerinin elektroporasyondan sonra normal büyüme oranlarını geri kazanmasıyla %95'e varan GFP ekspresyonu azalması sağlayan parametreler, endojen bir geni (SAMHD1) inaktive etmek ve tek hücreli THP-1 klonları üretmek için başarıyla kullanıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. CRISPOR ile kılavuz tasarımı (Şekil 1.1)

NOT: SnapGene Viewer yazılımı, düzenleme hedef bölgesine ve ilgilenilen gen içindeki PCR primer hibridizasyonunun konumuna açıklama eklemek için 4, 7 ve 10. adımlarda kullanılabilir.

  1. Ensembl web sitesine (www.ensembl.org) gidin. Arama kutusuna bir tür seçin ve ilgilendiğiniz genin adını girin. Git'e tıklayın. Gene karşılık gelen sonucu seçin (transkript değil).
  2. Transkript tablosunu göster'e tıklayın ve ardından Biotype sütununda altın etiketli Protein kodlamasına karşılık gelen Transkript Kimliğini seçin. Transkript sayfasına girdikten sonra, soldaki menüden Exons'a tıklayın.
  3. Aşağı kaydırın ve Sırayı indir'e tıklayın. Dosya biçiminin MOSTA olduğundan emin olun. Ayarlar - Dahil Edilen Diziler'de, Genomik dizi dışındaki her şeyin seçimini kaldırın.
    Transkript kutusunun her iki ucundaki Yan sırayla "500" sayısını girin. Önizleme'ye tıklayın, tüm diziyi seçin (başlık olmadan yalnızca nükleotidler) ve kopyalayın (Ctrl+C).
  4. SnapGene Viewer'ı açın ve Yeni > DNA dosyasına tıklayın. Sırayı (Ctrl+V) Sıra oluştur kutusuna yapıştırın. Ortak özellikleri algıla seçeneğinin işaretini kaldırın ve Topoloji'de Doğrusal'ı seçin.
    Dosyayı yeniden adlandırın ve Oluştur'a tıklayın. Soldaki menüde Enzimleri göster (ilk simge) seçimini kaldırın. Pencerenin alt kısmında, Sıra sekmesini seçin.
    NOT: Bu adım, ekzonlar, intronlar ve 500 bp yan diziler (isteğe bağlı) dahil olmak üzere tüm gen dizisinin alınmasına izin verir. Bu son bilgi, ilk ekzon içinde yer alan bir hedef bölgenin amplifikasyonu için PCR primerleri tasarlamak için kullanışlıdır.
  5. Ensembl web sitesine geri dönün, dosya önizlemesinde yukarı kaydırın ve Geri'ye tıklayın. Şimdi, Dosya biçimini RTF olarak değiştirin. Ayarlar - Dahil Edilen Diziler'de, Ekzonlar dışındaki her şeyin seçimini kaldırın. Varyasyonları göster bölümünde Hayır'ı seçin. Sayfanın üst kısmındaki İndir'e tıklayın.
  6. Ekzon dizisini içeren ve ilk ATG'den başlayarak kodlama dizisini mavi renkte gösteren indirilen dosyayı (Word ile) açın. CRISPR-Cas9 tarafından yönlendirilen düzenleme tarafından hedeflenecek eksonu seçin (öneriler için aşağıya bakın), seçin ve kopyalayın (Ctrl + C).
    1. Hedeflenen ekson, proteinin işlevsel olarak önemli bir alanını kodlayan erken bir ekzon veya bir ekzondur. 3' UTR'ye yakın geç bir eksonda bir PTC'nin kurulmasının muhtemelen NMD'yi ortaya çıkarmayacağını ve bunun da C-terminal olarak kesilmiş bir proteinin ekspresyonuna yol açacağını belirtmekte fayda var. Tersine, bir PTC'nin doğal başlatma bölgesine proksimalde erken bir ekzon sokulması, gayri meşru çeviri riski (ITL, diğer adıyla alternatif çeviri başlatma (ATI)) riski ile ilişkilidir ve bu, ilk ATG kodonunun akış aşağısındaki bir çerçeve içi çeviri başlatma bölgelerinde (TIS) başlayan N-terminal olarak kesilmiş bir proteinin beklenmedik ekspresyonunu verir. Bu ikinci riski azaltmak için, ATGpr27 (atgpr.dbcls.jp) ve/veya NetStart 1.028 (services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/) kullanılarak alternatif TIS oluşumunun değerlendirilmesi tavsiye edilir.
    2. Hedef ekzonun bir kodlama dizisi içerdiğinden emin olun. Bununla birlikte, silinen parçaya dahil etmek için ilk ATG'nin yukarı akışında 5'UTR bölgesi ile bir sgRNA tavlaması seçmek yararlı olabilir.
    3. İdeal olarak, hedeflenen ekson, genin tüm protein kodlayan transkript varyantları için ortak olmalıdır. İlgilenilen geni arayarak NCBI'nin Genom Veri Görüntüleyicisi'nde (www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/) durumun böyle olup olmadığını kontrol edin.
      Görüntüleme penceresindeki gen adına (yeşil renkte) tıklamak, transkript varyantlarını (mor renkte) gösterecektir. Ekzonlar bir dikdörtgen ile temsil edilir.
  7. SnapGene Viewer'da, ekzon dizisini aramak için Ctrl+F, Ctrl+V ve ardından Enter tuşlarına basın. Yeni bir özellik eklemek için Ctrl+T tuşlarına basın, adlandırın, türü "ekzon" olarak değiştirin ve Tamam'a tıklayın.
  8. CRISPOR web sitesine (http://crispor.gi.ucsc.edu/) gidin ve ekzon dizisini Adım 1'e yapıştırın. İlk olarak, Adım 2'de bir referans genomu seçin ve ardından Adım 3'te hedeflenecek PAM tipini, tipik olarak SpCas9 için 20bp-NGG seçin. GÖNDER'e tıklayın.
  9. Aralarında 150 bp'ye kadar olacak şekilde iki sgRNA seçin, ardından aralarında üçüncü bir sgRNA seçin. İşte sgRNA seçimi için bazı yönergeler:
    1. MIT özgüllük skoru, hedef dışı etkilerle ilgilidir. Daha yüksek bir puan, daha az potansiyel hedef dışı olduğunu gösterir. Sağ sütun, konumlarıyla birlikte (bir ekson, bir intron veya bir intergenik bölgede) en olasıdan en az olasıya doğru sıralanmış, tahmin edilen üç hedef dışı siteyi görüntüler. Tahmin edilen hedef dışı sitelerin tam listesine tümünü göster'e tıklayarak erişilebilir. Mümkünse, MIT puanı >80 olan sgRNA'ları seçin ve 0, 1 veya 2 uyumsuzluk için hedef dışı olmayanlara öncelik verin. Ek olarak, fenotipi etkileme potansiyeli en yüksek olan bir eksonda hedef dışı olan sgRNA'lardan kaçınılmalıdır.
    2. Tahmin edilen etkinlik için Doench '16 puanına bakın. Yüksek bir Doench '16 puanının, sgRNA'nın etkili olma olasılığının daha yüksek olduğunu gösterdiğini unutmayın. Gerçek etkinlik deneysel olarak belirlenmelidir. Bu nedenle, birlikte kullanılması amaçlanmamış olsalar bile, birkaç sgRNA'nın seçilmesi her zaman yararlıdır.
    3. Çok yüksek veya çok düşük bir GC içeriği ve belirli motifler, sgRNA verimliliğine zarar verebilir ve bundan kaçınılmalıdır. Bu parametreler CRISPOR tarafından vurgulanır.
  10. sgRNA dizisini ve ilişkili PAM dizisini SnapGene Viewer'daki gen dizisine eklemek için adım 1.7'yi tekrarlayın. Aynı zamanda, oligonükleotid siparişi verirken gereken 5'-3' oryantasyonunu korumak için sgRNA dizisini (PAM olmadan) bir metne veya Excel dosyasına yapıştırın.
  11. Hedef bölgenin PCR tabanlı amplifikasyonu için, onu çevreleyen birkaç primer tasarlayın. Amplikon boyutu 800 ile 1000 bp arasında olmalıdır. Bu protokol için primerleri tasarlamak için PrimerQuest kullanıldı (https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest). Alternatif olarak, CRISPOR, hedeflenen genomik bölgeyi ve hedef dışı bölgeleri çoğaltmak için bir primer listesi sağlar. Potansiyel hedef dışı sitelerin tam listesini görüntüledikten sonra (adım 1.9.1), sağ alt köşedeki Hedef dışı primerler'e tıklayın.

2. Elektroporasyon için reaktif ve hücre hazırlığı (Şekil 1.2)

  1. Kuyucukları %20 ısıyla inaktive edilmiş (56 ° C, 30 dakika), filtrelenmiş (0.20 μm) fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 500 μL RPMI 1640 ortamı ile doldurarak elektroporasyondan sonra hücreleri geri kazanmak için 24 oyuklu bir kültür plakası hazırlayın. Antibiyotik eklemeyin. Plakayı 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 24 saat boyunca elektroporasyona kadar nemlendirilmiş bir inkübatörde tutun.
  2. sgRNA'lar kuru olarak gönderilirse, bunları TE tamponu (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) ile 100 μM'lik bir nihai konsantrasyona (yani 1 nmol sgRNA başına 10 μL TE tamponu) rehidre edin. 30 saniye boyunca vorteks, tam rehidrasyona izin vermek için gece boyunca 4 °C'de inkübe edin ve kısa bir pipet homojenizasyonundan sonra sgRNA stok çözeltisini -20 °C'de saklayın. Son hacme bağlı olarak, birden fazla donma-çözülme döngüsünden kaçınmak için alikotlar yapın.
  3. 100 μM stok çözeltisini nükleaz içermeyen suda seyrelterek 30 μM'lik bir nihai konsantrasyonda çalışan bir sgRNA çözeltisi hazırlayın. 30 saniye boyunca vorteksleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  4. Cas9:sgRNA RNP'lerini, üç 30 μM sgRNA'nın her birinin 1 μL'sini ve 0.5 μL 20 μM Cas9 çözeltisini 3.5 μL resüspansiyon tamponu R'de aynı anda seyrelterek 1:9 molar oranda birleştirin, elektroporasyon kitinde bulunur (bir deneysel koşul için 7 μL'lik nihai hacim; buna göre ölçeklendirin). Kısa bir süre vorteks yapın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  5. Bu arada, 0,5 μL 20 μM Cas9'dan 6,5 μL resüspansiyon tamponu R. Vortex'e kısaca girerek düzenlenmemiş bir kontrol hazırlayın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  6. Elektroporasyon koşulu başına 12 μL'lik bir nihai hacim için tüm numunelere 5 μL yeniden süspansiyon tamponu R ekleyin.
  7. THP-1 hücrelerini elektroporasyon için hazırlayın.
    1. Tripan mavisi dışlama testi ile konsantrasyonu ve canlılığı değerlendirmek. Hücreleri %0.4'lük bir tripan mavisi boyama solüsyonunda 1: 2 oranında seyreltin. 30 sn inkübasyondan sonra, iyice homojenize edin ve Neubauer tarafından geliştirilmiş ızgara stiline sahip bir sayma odasının duvarına 10 μL ekleyin. Üç büyük kare sayın ve hücre konsantrasyonunu elde etmek için sayıyı 100'e bölün (x106 hücre / mL).
      NOT: Hücrelerin sağlığı, elektroporasyona karşı hassasiyetlerini etkiler. Hücre kültürünün en uygun koşullarda gerçekleştirilmesine özen gösterilmelidir. İnkübatörün dışındaki süre sınırlı olmalı ve tüm reaktifler ve çözeltiler önceden hazırlanmalı ve ısıtılmalıdır.
    2. Her koşul için 0,2 x 106 hücreye eşdeğer bir hacim toplayın ve santrifüjleyin (336 x g, 5 dk, 20 °C).
    3. Süpernatanı bir pipet kullanarak aspire edin ve peleti 500 μL PBS'de yeniden süspanse edin. Tekrar santrifüjleyin (336 x g, 5 dk, 20 °C).
    4. Süpernatanı bir pipet kullanarak dikkatlice aspire edin ve THP-1 hücre peletini 12 μL RNP çözeltisi ile yeniden süspanse edin (adım 2.6).

3. Elektroporasyon sistemi kurulumu ve nükleofeksiyon (Şekil 1.3)

  1. Pipet istasyonunu bir biyogüvenlik kabininin altına yerleştirin, desteğe bir elektroporasyon tüpü yerleştirin ve elektroporasyon kitinde bulunan 3 mL tampon E ekleyin.
  2. Elektroporasyon cihazını açtıktan sonra, aşağıdaki elektroporasyon parametrelerini ayarlamak için dokunmatik ekranı kullanın: Voltaj = 1 500 V, Süre = 10 ms, Sayı = 3.
  3. Elektroporasyon pipetini bir uçla donatın ve 10 μL RNP/THP-1 solüsyonunu aspire edin (adım 2.7.4). Pipeti elektroporasyon tüpüne yerleştirin ve elektroporasyon cihazı ekranında Başlat düğmesine basın. Tamamlandı mesajının görünmesini bekleyin ve pipeti tüpten çıkarın.
  4. Hücreleri önceden ısıtılmış 24 oyuklu plakanın bir kuyusuna aktarın ve nazikçe homojenize edin. Plakayı nemlendirilmiş inkübatöre geri koyun ve 72 saat boyunca rahatsız edilmeden dinlenmelerine izin verin.
    NOT: RNP/THP-1 süspansiyonunu pipetlerken herhangi bir kabarcık yapmamaya dikkat edin, çünkü bunlar elektroporasyon prosedürüne müdahale edecektir. Görünür bir elektrik arkı olmadığında bir hata mesajı görüntülenirse, elektroporasyon pipetini tüpten çıkarın ve tekrar Başlat'a basın. Bununla birlikte, kısa bir parlak kıvılcım şeklinde bir elektrik arkı gözlenirse, kabarcıkların varlığına işaret edebilir. Elektroporasyon prosedürü, bir hata mesajı olmasa bile büyük olasılıkla başarısız olacaktır.

4. Elektroporasyondan 72 saat sonra THP-1 geri kazanımı (Şekil 1.4)

  1. Elektroporasyondan 72 saat sonra konsantrasyonu değerlendirmek için hücreleri sayın (adım 2.7.1).
  2. Yeterli hücre varsa (ör.≥0.6 x 106 hücre / mL), bunları en az% 20 FBS ve% 1 Penisilin-Streptomisin ile desteklenmiş RPMI ile bir faktör 2 seyreltin ve konsantrasyonu 0.3-0.5 x 10mL başına 6 hücre arasına getirin. Aksi takdirde, hücrenin 72 saat daha iyileşmesine izin verin.
  3. KO doğrulaması için yeterli olana kadar hücreleri geçirin ve yükseltin. Bu arada, tek hücreli klonların izolasyonu başlatılabilir (adım 7).

5. T7EI uyumsuzluk testi ile gen düzenleme doğrulaması (Şekil 1.5)

NOT: T7EI'nin 1 bp'den büyük uyumsuzlukları tanıdığı göz önüne alındığında, tahlil düzenleme verimliliğini hafife alabilir. Bu nedenle, T7EI testi, uygun şekilde modifiye edilmedikçe homozigot hücre popülasyonlarını (yani tek hücreli klonları) taramak için yararlı değildir (adım 5.7).

  1. Hücre konsantrasyonunu değerlendirin (adım 2.7.1) ve 1.5 mL'lik bir tüpte 0.1 x 106 hücreye eşdeğer bir hacim çekin. Santrifüj (336 x g, 5 dk, 20 °C), süpernatanı aspire edin ve peleti 500 μL PBS'de yeniden süspanse edin. Tekrar santrifüjleyin ve bir pipet kullanarak, peleti rahatsız etmeden mümkün olduğunca fazla süpernatan aspire edin. Numuneyi hızlı bir şekilde dondurun ve -20 °C'de saklayın.
  2. PCR amplifikasyonu için bir matris görevi görmesi için genomik DNA'yı çıkarın.
    1. Peletleri 50 μL DNA ekstraksiyon solüsyonu ile yeniden süspanse edin, homojenize edin ve tüm hacmi 0.2 mL'lik bir PCR tüpüne aktarın. Kısaca vorteks ve santrifüj (3 saniye boyunca darbe).
    2. Tüpü bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve 65 °C'de 15 dakika, ardından 98 °C'de 10 dakika ısıtın.
    3. Ekstrakte edilen DNA'yı 90 μL ultra saf su ile seyreltin. Kısaca vorteks ve santrifüj (5.000 x g, 3 s).
  3. PCR astarını (Malzeme Tablosuna bakınız) 10 μM'lik (yani 10 pmol/μL) nihai konsantrasyon için ultra saf suda seyreltin.
  4. PCR karışımını (aşağıdaki NOT'u izleyerek) 0.2 mL'lik bir PCR tüpünde hazırlayın (bir koşul için son hacim = 50 μL). Genellikle, en az iki koşul olacaktır: KO ve yalnızca Cas9 ile düzenlenmemiş kontrol.
    NOT: Saflaştırılmış genomik DNA: 10 μL; İleri ve geri astar (10 μM): her biri 2,5 μL, nihai konsantrasyon 500 nM; Reaksiyon Tamponu (5x): 10 μL. Eklemeden önce iyice sarın. dNTP'yi karıştırın (her birinden 25 mM): 0.6 μL, her dNTP için 0.3 mM'lik nihai konsantrasyon. DNA polimeraz: 0.5 μL; Ultra saf su: 23,9 μL. Kısa bir süre vorteks ve santrifüj (3 saniye boyunca darbe).
  5. Tüpleri termal döngüleyiciye yerleştirin ve PCR programını aşağıdaki ayarlarla çalıştırın:
    NOT: 95 ° C'de 5 dakika boyunca bir döngü, ardından 30 döngü [20 s için 98 ° C (denatürasyon adımı), 15 s için X °C (tavlama adımı), 72 s için 45 ° C (uzama adımı)], ardından 72 ° C'de 2 dakika boyunca bir son döngü. Amplifikasyonun sonunda, tüpleri, vorteks ve santrifüjü kısa bir süre çıkarın (3 saniye boyunca darbe). Tavlama sıcaklığı (X), astarların erime sıcaklığı (Tm) eksi 5 °C'dir.
  6. Poliklonal düzenlenmiş bir popülasyon için: 0.2 mL'lik yeni bir tüpte, 19.5 μL'lik bir son hacim için 17.5 μL PCR amplikonu ve 2 μL NEBuffer 2 (10x) ekleyin. Kısaca girdap ve santrifüjleyin (3 saniye boyunca darbe). Alternatif olarak, tek hücreli klonları taramak için, hem düzenlenmiş hem de düzenlenmemiş kontrol hücrelerinden PCR ürünlerinin 1: 1'ini karıştırın (adım 5.6) (Ek Şekil 1).
  7. Heterodubleks oluşum için, tüpleri termal döngüleyiciye yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın: 95 °C'de 10 dakika boyunca bir döngü, biri 95 ila 85 °C arasında -2 °C/s'lik bir rampa ile, biri 85 ila 25 °C arasında -0,3 °C/s'lik bir rampa ile ve HOLD'da 10 °C'de bir son soğutma döngüsü.
  8. Heterodubleks oluşumundan sonra, tüpe 0.5 μL T7EI çözeltisi ekleyin. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
  9. % 1.2 agaroz jeli hazırlayın:
    1. Agarozu bir cam şişede tartın ve uygun hacimde 1x TAE tamponu (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA, pH 8.3) ekleyin. Kapağı sıkıca vidalamamaya dikkat ederek bir mikrodalgaya koyun. Agaroz kristalleri tamamen çözülene kadar birkaç kez ısıtın.
      NOT: Gerekirse, çözeltiyi karıştırın. Kaynamasına izin vermeyin, aksi takdirde agaroz konsantrasyonunu değiştirerek hacim azalır.
    2. 1/20.000 oranında seyreltilmiş DNA jel boyasını ekleyin ve iyice karıştırın.
    3. Agaroz çözeltisini bir kalıba dökün, bir tarak ekleyin ve oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin.
  10. 5 μL T7EI-sindirim ürününü (adım 5.9) veya sindirilmemiş PCR ürününü 5 μL su ve 2 μL 6x DNA yükleme boyası ile karıştırarak jel elektroforezi için numuneler hazırlayın. Numuneleri ve boyut merdivenini yükleyin ve 45 dakika boyunca 80 V'ta hareket ettirin (zaman, DNA parçalarının beklenen boyutuna bağlı olarak uyarlanabilir). Migrasyon bittikten sonra, uygun bir görüntüleme sistemi ile jelin bir görüntüsünü elde edin.

6. Sanger dizileme analizi ile gen düzenleme doğrulaması (Şekil 1.6)

  1. Genetik modifikasyonu karakterize etmek için PCR ürünlerini saflaştırın (adım 5.4) ve Sanger dizilemesinden sonra sonuçları ICE aracı (https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis) ile analiz edin.
  2. Modifikasyonlara rağmen bir proteinin üretilip üretilemeyeceğini kontrol edin.
    1. ICE sonuçlarını indirin ve contribs.txt dosyasını açın.
    2. Düzenlenen dizileri WT muadili ile karşılaştırın. İndelleri haritalayın ve hedeflenen genomik bölgede ortaya çıktıklarını doğrulayın. Boyutlarını değerlendirin. İç uzunluk üçün katı değilse, bir çerçeve kayması meydana gelecek ve muhtemelen bir PTC tanıtılacaktır. Mutasyona uğramış mRNA'nın NMD aracılı bozunmaya uğraması bekleniyor.

7. Seyreltmeyi sınırlayarak tek hücreli klon izolasyonu (Şekil 1.7)

NOT: Tek hücreli klonların izolasyonu zorunlu değildir. Bununla birlikte, bunu yapmayı seçerseniz, birden fazla klonu karakterize etmek ve fenotiplerini orijinal poliklonal popülasyonla karşılaştırmak önemlidir.

  1. Bir hücre süspansiyonu örneği alın, kültür ortamı ile 1/2 oranında seyreltin ve konsantrasyonu değerlendirin (adım 2.7.1). Seyreltme, sayım doğruluğunu artırır.
  2. 7 hücre / mL konsantrasyona ulaşmak için 2 ila 3 seri seyreltme adımı gerçekleştirin. Yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakada (yani, oyuk başına 0.7 hücre) oyuk başına 100 μL hücre süspansiyonu dağıtın. Bir hücre içeren kuyucukları tanımlamak için mikroskopta plakaları gözlemlemeden önce hücrenin birkaç saat boşalmasına izin verin.
  3. Düzenli olarak koloni oluşumunu ve büyümesini izleyin ve gerektiğinde hücreleri daha büyük bir kültür plakasına veya şişeye aktarın.

8. THP-1 KO SAMHD1 hücrelerinin HIV-1 kısıtlama testi ile fonksiyonel karakterizasyonu

  1. % 10 FBS,% 1 Penisilin-Streptomisin (tam RPMI) ile desteklenmiş ve farklılaşma için 300 ng / mL PMA içeren 300 μL RPMI'de oyuk başına 0.25 x10 6 hücreli 24 oyuklu bir kültür plakasında tohum THP-1. Plakayı 24 saat boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörde (37 °C,% 5 CO2) tutun.
  2. Ortamı PMA içermeyen tam bir RPMI ortamıyla değiştirin ve plakayı 24 saat daha inkübatöre geri koyun.
  3. Bir vakum pompası kullanarak tüm kültür ortamını aspire edin. 250 μL VSVg psödotipli HIV-1-GFP viral stok içeren çözelti ekleyin (MOI = 0.5 IFU/hücre). Enfekte olmayan bir kontrol ekleyin. Enfeksiyonu senkronize etmek için plakayı 2 saat boyunca 4 ° C'ye yerleştirin.
  4. Hücreleri RPMI ile bir kez yıkayın. Her oyuğa 500 μL tam RPMI ekleyin ve standart koşullarda 48 saat inkübe edin (zaman ayarlanabilir).
  5. Kültür ortamını çıkardıktan sonra, hücreleri bir kez soğuk 1x PBS ile yıkayın. Ardından, her oyuğa 100 μL% 0.05 Tripsin-EDTA ekleyin. Enzimi inaktive etmek için 200 μL tam RPMI eklemeden önce plakayı hücreler tamamen ayrılana kadar (5 dakika yeterli olmalıdır) 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin. Her oyuktan 250 μL'yi 96 oyuklu yuvarlak tabanlı bir plakaya aktarın (akış sitometresinin kültür plakalarını kabul ettiğinden emin olun).
  6. Plakayı santrifüjleyin (757 x g, 3 dk, yavaşlama = 6, 20 °C) ve çok kanallı bir pipet kullanarak süpernatanı aspire edin. Peleti 100 μL %4 PFA ile yeniden süspanse edin ve 4 °C'de 10 dakika inkübe edin. 100 μL soğuk 1X PBS ekleyin.
  7. Akış sitometrisi ile GFP pozitif hücreler tarafından temsil edilen enfeksiyon oranını analiz edin (önerilen bir geçit stratejisi için Ek Şekil 2'ye bakınız).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

GFP raportör proteinini (THP-1_GFP) stabil bir şekilde eksprese eden bir THP-1 hücre hattı oluşturuldu (Şekil 2A) ve verimli bir CRISPR-Cas9 aracılı gen baskısı için bir protokol oluşturmak için bir araç olarak kullanıldı. Bu amaçla, EGFP genini hedefleyen 3 sgRNA, CRISPOR web aracı29 (Şekil 2B) ile tasarlandı ve bunlar aynı anda Cas9 ile 9:1'lik bir molar oranda kompleks haline getirildi ve farklı ayarlar kullanılarak elektropor...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, THP-1 hücre hattının başarılı bir CRISPR aracılı düzenlemesini elde etmek için bir protokol açıklanmaktadır. Yaklaşım, önceden monte edilmiş sgRNA/Cas9 RNP'lerin elektroporasyon/nükleofeksiyon yoluyla transferine dayanır. Bu strateji, sgRNA/Cas9 kasetinin lentiviral aracılı entegrasyonu üzerine potansiyel olarak ortaya çıkan ve nükleazın kalıcı ekspresyonunu sağlayan hedef dışı etkileri sınırlamak için seçilmiştir. İlgili geni hedefleyen çoklu sgRNA'lar, güvenilir ve verimli düze...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Tüm yazarların çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

JP Concordet'e (MNHN, U1154/UMR7196, Paris), G. Bossis'e (IGMM, Montpellier) ve D. Schlüter'e (Hannover Tıp Fakültesi, Almanya) protokolleri paylaştıkları ve tartıştıkları için minnettarız. Bu proje, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programından (AZ'ye 101017572 No'lu hibe sözleşmesi) ve ANRS'den (AZ'ye hibe ECTZ162721) fon almıştır. Enfeksiyon Hastalıkları Modeli ve Yenilikçi Tedaviler (IDMIT) araştırma altyapısı, referans ANR_11_INSB_0008 altında "programme investissement d'avenir (PIA)" tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.2 ve mikro; m şırınga filtresiClearLine146560_
0.4 % tripan mavisiBeckman Coulter383200_
1.5 mL tüpEppendorf3810X_
24 kuyulu plakaCorning353047_
6x TriTrack DNA Yükleme BoyasıThermo scientificR1161_
75 cm² Kültür Şişesi Bacalı Kapaklı Corning353136_
8 Şeritli Kapaklı PCR TüpleriYaşam teknolojileriAM12230_
96 kuyulu plakalar Düz tabanlıCorning353072_
96 kuyulu plakalar Yuvarlak tabanlıCorning353077_
AgaroseEuromedexD5_
ATGpr__https://atgpr.dbcls.jp/
ChemiDoc Görüntüleme SistemiBIO-RAD12003153_
Sayma slaytıNanoEntekDHC-N04_
CRISPOR__http://crispor.gi.ucsc.edu/
DPBSGibco14190094_
EnsemblEMBL-EBI_https://www.ensembl.org/index.html
Fetal Sığır SerumSigma-AldrichF7524_
FlowJoBD Yaşam Bilimleriv10.10_
GeneRuler 100 bp Plus DNA MerdiveniThermo scientificSM0323_
Genome Veri GörüntüleyiciNCBI_https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/
GraphPad PrizmaDotmatics_Version 9.3.1
Herculase II Füzyon DNA PolimerazlarAgilent600679_
ICE CRISPR Analiz AracıSynthego_https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis
Image Lab TouchBIO-RAD_Version 2.4.0.03
NEBuffer 2New England BiolabsB7002ST7EI M0302S
Neon Kit, 10 & ile birlikte verilir; LInvitrogenMPK1025KUçlar, tüpler, tampon R ve E
Neon Transfeksiyon Sistemiiçeren elektroporasyon kiti InvitrogenMPK5000_
NetStart 1.0__https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/
Nükleaz İçermeyen SuSynthego__
PCR astarı (EGFP)Eurofins_Fw : GGAATGCAAGGTCTGTTGAATG ; Rev : CACCTTGATGCCGTTCTTCT
PCR astarı (SAMHD1)Eurofins_Fw : CGGGATTGATTTGAGGACGA ; Rev : GGGTGGCAAGTTAGTGAAGA
Penisilin-streptomisin (10.000 U/mL)Gibco15140122_
PFAElektron Mikroskobu Bilimleri15714_
PMASigma-AldrichP8139_
PrimerQuestIDT_https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest
QIAquick PCR Saflaştırma KitiQiagen28104_
QuickExtract DNA Ekstraksiyon ÇözümüBiyoarama TeknolojileriQE09050_
RPMI 1640, GlutaMAXGibco61870010_
SnapGene ViewerDotmatics_Version 7
SpCas9 2NLS NucleaseSynthego__
SYBR Güvenli DNA Jel LekeİnvitrojenS33102_
Sentetik sgRNA (EGFP)Synthego_#1 : CGCGCCGAGGUGAAGUUCGA ; #2 : UUCAAGUCCGCCAUGCCCGA ; #3 : CAACUACAACAAGACCCGCGCCG
Sentetik sgRNA (SAMHD1)Synthego_#1 : AUCGCAACGGACGCUUGG ; #2 : GCAGUCAAGAACCUCGGCGC ; #3 : CCAUCCCGACUACAAGACAU
Şırınga Plastipak Luer KilidiBD301229_
T100 Termal DöngüleyiciBIO-RAD1861096_
T7 endonükleaz IYeni İngiltere BiolabsM0302S_
TAE tampon UltraPure, 10xInvitrogen15558026400 mM Tris-Asetat, 10 mM EDTA
THP-1 hücreleriATCCTIB-202_
Tripsin-EDTA (%0,05)Gibco25300054_
ZE5 Hücre Analiz CihazıBIO-RAD12014135_

Kaynaklar

  1. Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  2. Danis, V. A., Millington, M., Hyland, V. J., Grennan, D. Cytokine production by normal human monocytes: inter-subject variation and relationship to an IL-1 receptor antagonist (IL-lRa) gene polymorphism. Clin Exp Immunol. 99, https://academic.oup.com/cei/article/99/2/303/6484286 (1995).
  3. Bol, S. M., et al. Donor variation in in vitro HIV-1 susceptibility of monocyte-derived macrophages. Virology. 390 (2), 205-211 (2009).
  4. Appleby, L. J., et al. Sources of heterogeneity in human monocyte subsets. Immunol Lett. 152 (1), 32-41 (2013).
  5. O'Neill, M. B., et al. Single-cell and bulk RNA-sequencing reveal differences in monocyte susceptibility to Influenza A virus infection between Africans and Europeans. Front Immunol. 12, 768189(2021).
  6. Wen, Y., et al. Comparability study of monocyte-derived dendritic cells, primary monocytes, and THP1 cells for innate immune responses. J Immunol Methods. 498, 113147(2021).
  7. Inagaki, Y., et al. Interferon-g-induced apoptosis and activation of THP-1 macrophages. Life Sci. 71 (21), 2499-2508 (2002).
  8. Boonkaewwan, C., Toskulkao, C., Vongsakul, M. Anti-inflammatory and immunomodulatory activities of stevioside and its metabolite steviol on THP-1 cells. J Agric Food Chem. 54 (3), 785-789 (2006).
  9. Chanput, W., et al. β-Glucans are involved in immune-modulation of THP-1 macrophages. Mol Nutr Food Res. 56 (5), 822-833 (2012).
  10. Cui, J., et al. USP3 inhibits type I interferon signaling by deubiquitinating RIG-I-like receptors. Cell Res. 24 (4), 400-416 (2014).
  11. Chen, S., et al. SAMHD1 suppresses innate immune responses to viral infections and inflammatory stimuli by inhibiting the NF-κB and interferon pathways. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (16), E3798-E3807 (2018).
  12. Pradhananga, S., Spalinskas, R., Poujade, F. A., Eriksson, P., Sahlén, P. Promoter anchored interaction landscape of THP-1 macrophages captures early immune response processes. Cell Immunol. 355, 104148(2020).
  13. Mezzasoma, L., Talesa, V. N., Romani, R., Bellezza, I. Anp and BNP exert anti-inflammatory action via npr-1/cgmp axis by interfering with canonical, non-canonical, and alternative routes of inflammasome activation in human THP1 cells. Int J Mol Sci. 22 (1), 1-17 (2021).
  14. Martinat, C., et al. SUMOylation of SAMHD1 at Lysine 595 is required for HIV-1 restriction in non-cycling cells. Nat Commun. 12 (1), 4582(2021).
  15. Rensen, E., et al. Clustering and reverse transcription of HIV-1 genomes in nuclear niches of macrophages. EMBO J. 40 (1), e105247(2021).
  16. Ikeda, T., et al. APOBEC3 degradation is the primary function of HIV-1 Vif determining virion infectivity in the myeloid cell line THP-1. mBio. 14 (4), e0078223(2023).
  17. Jinek, M., et al. A programmable dual RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
  18. Kurosaki, T., Maquat, L. E. Nonsense-mediated mRNA decay in humans at a glance. J Cell Sci. 129 (3), 461-467 (2016).
  19. Tuladhar, R., et al. CRISPR-Cas9-based mutagenesis frequently provokes on-target mRNA misregulation. Nat Commun. 10 (1), 4056(2019).
  20. Embree, C. M., Abu-Alhasan, R., Singh, G. Features and factors that dictate if terminating ribosomes cause or counteract nonsense-mediated mRNA decay. J Biol Chem. 298 (11), 102592(2022).
  21. Xue, C., Greene, E. C. DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editing. Trends Genet. 37 (7), 639-656 (2021).
  22. Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J Immunol Methods. 344 (2), 109-115 (2009).
  23. Tang, X., et al. A method for high transfection efficiency in THP-1 suspension cells without PMA treatment. Anal Biochem. 544, 93-97 (2018).
  24. Ji, W., Zhang, L., Liu, X. Protocol using lentivirus to establish THP-1 suspension cell lines for immunostaining and confocal microscopy. STAR Protoc. 4 (1), 102032(2023).
  25. Guo, C., Ma, X., Gao, F., Guo, Y. Off-target effects in CRISPR/Cas9 gene editing. Front Bioeng Biotechnol. 11, (2023).
  26. Synthego Performance Analysis, ICE Analysis. 3.0, Synthego. https://www.synthego.com/help/citing-ice (2019).
  27. Salamov, A. A., Nishikawa, T., Swindells, M. B. Assessing protein coding region integrity in cDNA sequencing projects. Bioinformatics. 14, 384-390 (1998).
  28. Pedersen, A. G., Nielsen, H. Neural network prediction of translation initiation sites in eukaryotes: Perspectives for EST and genome analysis. Proc Int Conf Intell Syst Mol Biol. 5, 226-233 (1997).
  29. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Res. 46 (W1), W242-W245 (2018).
  30. Laguette, N., et al. SAMHD1 is the dendritic- and myeloid-cell-specific HIV-1 restriction factor counteracted by Vpx. Nature. 474 (7353), 654-657 (2011).
  31. Hrecka, K., et al. Vpx relieves inhibition of HIV-1 infection of macrophages mediated by the SAMHD1 protein. Nature. 474 (7353), 658-661 (2011).
  32. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRI SPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. J Exp Med. 215 (3), 985-997 (2018).
  33. Batista Napotnik, T., Polajžer, T., Miklavčič, D. Cell death due to electroporation - A review. Bioelectrochemistry. 141, 107871(2021).
  34. Perretta-Tejedor, N., Freke, G., Seda, M., Long, D. A., Jenkins, D. Generating mutant renal cell lines using CRISPR technologies. Methods Mol Biol. 2067, 323-340 (2020).
  35. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Sci Rep. 8 (1), 888(2018).
  36. Makino, S., Fukumura, R., Gondo, Y. Illegitimate translation causes unexpected gene expression from on-target out-of-frame alleles created by CRISPR-Cas9. Sci Rep. 6, 39608(2016).
  37. Bowling, A., et al. Downstream alternate start site allows N-terminal nonsense variants to escape NMD and results in functional recovery by readthrough and modulator combination. J Pers Med. 12 (9), 1448(2022).
  38. Inácios, Â, et al. Nonsense mutations in close proximity to the initiation codon fail to trigger full nonsense-mediated mRNA decay. J Biol Chem. 279 (31), 32170-32180 (2004).
  39. Li, J., et al. Efficient inversions and duplications of mammalian regulatory DNA elements and gene clusters by CRISPR/Cas9. J Mol Cell Biol. 7 (4), 284-298 (2015).
  40. Guo, Y., et al. CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function. Cell. 162 (4), 900-910 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Elektroporasyon ProtokolTek H cre KlonlamaRibon kleoprotein Aktar mT7 Endon kleaz AnaliziSanger Dizilememm noblotlama AnaliziMonosit Diferansiyasyonu

İlgili makaleler