Yöntem makalesi

Enfeksiyonla İlgili Gen Ekspresyonunu İncelemek için Kistik Fibroz Agregat Biyofilm Modeli

1.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67477

⸱

18 Nisan 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, University of Liverpool, 2Division of Molecular Microbiology, School of Life Sciences, University of Dundee

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, kistik fibroz akciğer ortamını yansıtan Pseudomonas aeruginosa gen ekspresyonunu değerlendirmek için bir agrega polimikrobiyal biyofilm modeli geliştirmek ve bir RNA ekstraksiyon protokolünü optimize etmek için bir çerçeveyi özetlemektedir. Uygulamalar, antimikrobiyal etkilerin değerlendirilmesini ve kistik fibroz ile ilgili koşullar altında antibiyotik alternatiflerinin çalışılmasını içerir.

Özet

Kistik fibrozisli kişilerde kronik akciğer enfeksiyonlarını tedavi etmek için kullanılan yeni antimikrobiyal terapötikler için standart klinik öncesi test yöntemleri, düşman akciğer nişinin çevresel koşullarını yansıtmaz. Mevcut indirgemeci test koşulları, kistik fibroz akciğer nişine uygun koşullar altında aktivitelerine dair kanıt olmaksızın bileşiklerin klinik öncesi bir boru hattı boyunca ilerlemesine yol açabilir. Geleneksel antimikrobiyalleri incelemek için kullanılan çeşitli yaklaşımlar, anti-çekirdek algılayıcı ajanlar ve siderofor inhibitörleri gibi anti-virülans terapötikler dahil olmak üzere antibiyotik alternatifleri için uygun olmayabilir. Bu protokol, tek tür ve çok tür kültürlerinde (Staphylococcus aureus ve Candida albicans) direnç ve enfeksiyonla ilgili gen ekspresyonunu karşılaştırmak, koloni oluşturan birim (CFU) azalmalarını ve gen ekspresyonundaki değişiklikleri incelemek için Pseudomonas aeruginosa'nın agrega biyofilm modelini belgelemektedir. Model, bileşik miktarlarının sınırlı olabileceği ilaç geliştirme boru hattının keşif aşamasında yeni bileşiklerin incelenmesine izin vermek için küçük, statik hacimlerde bakteri kültürleri için optimize edilmiştir. Tek tür P. aeruginosa biyofilmleri, 24 saat daha farklı konsantrasyonlarda (1, 16 ve 256 μg / mL) meropenem ile muameleden önce 24 saat boyunca Sentetik Kistik Fibrozis Ortamı 2'de (SCFM2) oluşturuldu. Polimikrobiyal biyofilmler, Staphylococcus aureus ve Candida albicans'ın SCFM2'de birlikte büyütülmesi, daha sonra 24 saat daha P. aeruginosa ile aşılanması ve meropenem ile muamele edilmesiyle oluşturulmuştur. Klinik öncesi testlerde bileşik etkinlik ölçümleri ile klinik araştırma sonuçları arasında doğrudan bir bağlantının olmaması, mevcut laboratuvar tarama araçlarının uygulanabilirliği konusunda şüphe uyandırmıştır. Bu model, direnç ve virülansa katkıda bulunan genler de dahil olmak üzere ilgili faktörlerin P. aeruginosa gen ekspresyonu üzerindeki etkisini anlamamızı ve böylece bu boşluğu doldurmamızı sağlar.

Giriş

Kistik fibrozis (KF), Kafkas popülasyonlarında en sık görülen otozomal resesif geçişli bozukluktur1. Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü (CFTR) genindeki mutasyonlar, solunum yollarında aşırı mukoza üretimi de dahil olmak üzere bir dizi klinik semptomla sonuçlanır. Bozulmuş iyon taşınması, bu mukozanın susuz kalmasına neden olur, bunun sonucunda mukoziliyer sistem tarafından yeterince temizlenmez ve kronik akciğer enfeksiyonlarına karşı duyarlılığı artırır1. KF akciğerinin mikrobiyolojisi, Haemophilus influenzae ve Staphylococcus aureus'un KF'li bebeklerin ve çocukların akciğerlerini enfekte eden birincil organizmalar olarak kabul edildiği, ardından bu organizmaların azalması ve ardından yetişkinlik döneminde Burkholderia spp. veya Pseudomonas aeruginosa ile kolonizasyon ile ayrı bir fırsatçı patojen grubundan oluşur<>sup class="xref"1,2,3,4. Bakteri türlerine ek olarak, mantar mikroorganizmaları da KF akciğer ortamında yaygındır ve Candida spp ve Aspergillus spp en sık izole edilen mantar türleri arasındadır3,4,5. Bu organizmalar KF akciğer enfeksiyonlarında önemli roller oynamasına rağmen, kültür tekniklerindeki ve kültürden bağımsız yöntemlerdeki ilerlemeler, KF akciğer enfeksiyonlarının nadiren tek bir bakteri türüyle sınırlı olduğunu göstermiştir, bu nedenle KF akciğer1,6'nın karmaşık, polimikrobiyal yapısını vurgulamaktadır.

Bu bilgiye rağmen, kronik akciğer enfeksiyonlarında kullanılmak üzere antibiyotiklerin geliştirilmesi ve test edilmesi için mevcut in vitro ve in vivo yöntemler, KF akciğer nişi7 ile tam benzerlik göstermemektedir ve tek tür kültürlere karşı ilacın minimum inhibitör konsantrasyonunu (MIC) belirlemeye odaklanılmaktadır. Bu, KF akciğer patolojisinin önemli bir bileşeni olan enfeksiyöz mikro çevrenin sınırlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar8. Bu nedenle, yöntemler tipik olarak bakterilerin planktonik kültürler olarak büyümesini içerir, bu da muhtemelen KF akciğerindeki bakterilerinkini yansıtmayan bir büyüme durumudur. Bu, tipik olarak diğer bakteri ve mantar türlerini de içeren biyofilm agregaları olarak ortaya çıkan P. aeruginosa için özellikle önemlidir9. Bu tür faktörler, kronik akciğer enfeksiyonları için antibiyotiklerin test edilmesinde zorluklar ortaya çıkarmakta ve antibiyotik duyarlılık test yöntemleri ile KF akciğer ortamı içindeki antimikrobiyal aktivite arasındaki eşitsizliği vurgulamaktadır9,10. Bu zorluklar, MIC testlerinin aktivitenin bir göstergesi olmadığı ve konakçı-patojen etkileşimlerinin anlaşılmasını sağlamadığı anti-virülans terapötikleri gibi antibiyotik alternatifleri taranırken daha da kötüleşir11.

Hücre dışı bir polisakkarit olan aljinat, akciğer nişi içindeki P. aeruginosa biyofilmlerinin önemli bir bileşenidir ve antibiyotiklere ve bağışıklık ajanlarına karşı bakteriyel toleransı arttırır, ayrıca yüzey yapışmasını arttırır12. Aljinat, anti-virülans tedavisi gelişimi için çekici bir hedeftir ve aljinat biyosentezinde anahtar bir gen olan algD'yi hedefleyenler gibi aljinat biyosentezini hedefleyen çeşitli terapötikler geliştirilmiştir13,14. Bu tür terapötikler, KF'li kişilerde antibiyotik tedavileri ile birlikte P. aeruginosa biyofilmlerini bozmak ve bakterileri planktonik bir duruma dönüştürmek için kullanılabilir. Bu, antibiyotiğin etkinliğini artırır, çünkü biyofilm hücre dışı matrisin bozulması, antibiyotiğin bakteriyel hedefe ulaşma yeteneğinin artmasına izin verir15. Bununla birlikte, in vitro aktivite kanıtlarına rağmen, bu terapötiklerin KF akciğer nişi içindeki etkisi belirsizliğini korumaktadır.

Burada sunulan agrega biyofilm modeli, CF akciğeri içinde P. aeruginosa ile ortak kolonizatörler olan S. aureus ve C. albicans'ın eklenmesi yoluyla bu sorunları ele almak için hareket eder. Ayrıca P. aeruginosa'nın solunum ortamında görüldüğü gibi biyofilm agregatlarında büyümesine izin verir. Büyüme için beslenme ortamı olarak balgam taklit eden Sentetik Kistik Fibrozis Ortamı 2'nin (SCFM2) kullanılması, müsin, hücre dışı (e)DNA ve CF akciğeri16 içinde görülenleri kopyalayan bir amino asit profili dahil olmak üzere konakçı etkilerinin eklenmesine izin verir.

KF akciğerinin koşullarını daha iyi yakalamak için biyofilmler, pulmoner alevlenme dönemlerinde KF'li kişilere sıklıkla reçete edilen bir antibiyotik olan meropenem'e maruz bırakılır. Bu model içinde bir antibiyotiğin kullanılması, bir anti-virülans ajanının reçete edilebileceği klinik durumları çoğaltmanın bir yolu olarak önerilmektedir, ör., alevlenme sırasında solunum semptomlarını yönetmek için antibiyotik tedavisi ile birleştirilmiş bir kombinasyon tedavisi olarak. Ayrıca, meropenemin dahil edilmesi, enfeksiyonla ilgili koşullar altında antibiyotik maruziyetine P. aeruginosa transkripsiyonel yanıtının değerlendirilmesine izin verir. Bu model, KF akciğerinde hangi faktörlerin uygun ilaç hedefleri olacağı hakkında bilgi sağlamak için kullanılabilir. Model ayrıca, tobramisin gibi diğer ilgili antibiyotikleri içerecek ve diğer ilgili genlerin ekspresyonunu değerlendirecek şekilde değiştirilebilir.

Burada, bu agrega polimikrobiyal model, Staphylococcus aureus ve Candida albicans varlığının ve değişen meropenem konsantrasyonlarının (1, 16 ve 256 μg/mL) P. aeruginosa tarafından algD ekspresyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılmıştır.Meropenem, esas olarak P. aeruginosa akciğer enfeksiyonlarını tedavi etmek için reçete edilir ve S. aureus veya C. albicans üzerinde doğrudan bir etkisi yoktur, burada bu birlikte yaşayan türlerin her ikisi için MIC >256 μg / mL'dir.

Bu çalışma, SCFM2 içindeki konak faktörleri ve birlikte kolonize olan mikroorganizmalar gibi ilgili faktörlerin P. aeruginosa enfeksiyonu ile ilgili genlerin ekspresyonunu nasıl etkileyebileceğinin anlaşılmasını artıracak ve kronik KF solunum yolu enfeksiyonlarında kullanılmak üzere anti-virülans terapötiklerinin geliştirilmesi ve test edilmesi için temeller sağlayacaktır.

Protokol

1. Tek tür biyofilmlerin hazırlanması

  1. Dondurulmuş boncuk stok kültürlerinden P. aeruginosa PAO1'i, Lizojeni Et Suyu (LB) agar üzerine tek bir boncuk çizerek ve 37 ° C'de 24 saat inkübe ederek canlandırın.
  2. Çizgi plakasından tek bir koloni alarak ve 5 mL LB ortamına ekleyerek gece boyunca PAO1 kültürlerini hazırlayın. Gece boyunca (18 saat) inkübe edin, daha sonra 0.05 OD600'e (1 x 108 CFU / mL'ye eşdeğer) seyreltin ve Palmer ve ark.16'ya göre hazırlanan SCFM2'de 1:100 oranında seyreltin.
  3. Yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir mikrotitre plakasının kuyucuklarına 180 μL aşı ekleyin. Koloni oluşturan birimler (CFU'lar) ile sayım için biyolojik üçlü biyofilmler hazırlayın. Sadece qPCR için biyolojik replikat başına toplam 3 replikasyon gerçekleştirilir. 3 ayrı kuyucuğa, medya kontrolleri için kullanılmak üzere 180 μL steril SCFM2 ekleyin.
    NOT: Yuvarlak tabanlı plakalar, tüm biyofilmin çevredeki büyüme ortamına homojen bir şekilde maruz kalmasına izin vermedeki üstünlükleri nedeniyle geleneksel düz tabanlı plakaların aksine seçilmiştir17.
  4. Biyofilmlerin 24 saatten fazla oluşmasına izin verin, 37 ° C'de inkübe edin ve 75 rpm'de çalkalayın.

2. Çok türlü biyofilmlerin hazırlanması

  1. P. aeruginosa PAO1 ve S. aureus SH1000'i yukarıda tarif edildiği gibi donmuş boncuk stok kültürlerinden canlandırın. Dondurulmuş boncuk stok kültürlerinden C. albicans CAF2.1'i, Saboraud dekstroz agar üzerine tek bir boncuk çizerek ve 37 ° C'de 24 saat inkübe ederek canlandırın.
  2. Çizgi plakasından tek bir koloni alarak ve 5 mL LB (her organizma için ayrı gece kültürleri) ekleyerek SH1000 ve CAF2.1'in gece boyunca kültürlerini hazırlayın. Gece boyunca 18 saat inkübe edin. S. aureus SH1000 ve C. albicans CAF2.1'in gece kültürlerini LB'de OD600 değerine standartlaştırın, bu da sırasıyla 1 x 109 ve 1.2 x 107 CFU/mL'ye eşittir17,18.
  3. SCFM2'de sırasıyla 1 x 106 ve 1 x 105 CFU / mL konsantrasyonlarda her iki türü içeren tek bir aşı oluşturmak için S. aureus ve C. albicans'ı seyreltin.
  4. 96 oyuklu bir mikrotitre plakasının kuyucuklarına 162 μL aşı ekleyin. Biyofilmleri, koloni oluşturan birimler (CFU'lar) ile sayım için biyolojik üçlü olarak aşılayın. Sadece qPCR için biyolojik replikat başına toplam 3 replikasyon gerçekleştirilir. 3 ayrı kuyuya, medya kontrolleri için kullanılmak üzere 180 μL steril SCFM2 ekleyin.
  5. Biyofilmlerin 24 saat boyunca oluşmasına izin verin, 37 ° C'de inkübe edin ve 75 rpm'de çalkalayın.
  6. Çizgi plakasından tek bir koloni alarak ve 5 mL LB ortamına ekleyerek bir gece boyunca PAO1 kültürü hazırlayın. Gece boyunca (18 saat) inkübe edin, daha sonra 0.05 OD600'de (1 x 108 CFU / mL'ye eşdeğer) ekleyin ve SCFM2'de 1 x 105 CFU / mL'ye seyreltin.
  7. 96 oyuklu mikrotitre plakasının kuyucuklarına 14.2 μL PAO1 aşısı ekleyin, bu da PAO1'in son aşısının 1 x 104 CFU / mL olmasına neden olur.
    NOT: Farklı türler arasındaki aşı konsantrasyonundaki bu değişiklik, S. aureus ve C. albicans'ın P. aeruginosa tarafından geride bırakılmamasını ve tümünün antibiyotiğin bulunmadığı 24 saatlik biyofilmden nokta kaplama ile geri kazanılabilir olmasını sağlamak içindir.
  8. Polimikrobiyal biyofilmlerin 24 saatten fazla oluşmasına izin verin, 37 ° C'de inkübe edin ve 75 rpm'de çalkalayın.

3. Tek tür ve çok tür biyofilmlerin DNaz ve antibiyotik tedavisi

  1. 50 μg/mL'lik nihai konsantrasyonda biyofilmleri içeren kuyucuklara doğrudan 2 μL DNaz I ekleyin, 37 °C'de 1 saat inkübe edin ve 75 rpm'de çalkalayın.
    NOT: Bu, antimikrobiyallerin daha iyi nüfuz etmesini sağlamak için viskoz biyofilmleri inceltmek için eklenir ve kistik fibrozisli birçok kişi tarafından pulmoner alevlenmeler için bir yönetim stratejisi olarak alınan rhDNaz (rekombinant insan DNaz) dozajını yansıtır.
  2. Seyreltici olarak damıtılmış su kullanarak 2.56 mg / mL'ye kadar bir antibiyotik meropenem stoğu hazırlayın. 0.01 mg / mL - 2.56 mg / mL konsantrasyonlara ulaşmak için seri olarak 2 faktörü ile seyreltin.
  3. 1 μg / mL - 256 μg / mL'lik bir dozaj aralığı elde etmek için biyofilmlere her bir meropenem seyreltmesinden 20 μL ekleyin. Antibiyotik yerine negatif kontrol biyofilmlerine 20 μL damıtılmış su ekleyin.
  4. 96 oyuklu mikrotitre plakasını şeffaf filmle kapatın ve 75 rpm'de çalkalayarak 37 °C'de 24 saat inkübe edin.

4. Canlı hücrelerin ve metabolik aktivitenin sayımı

NOT: Aşağıdaki adımlar yalnızca CFU miktar tayini için hedeflenen biyofilmler içindir.

  1. Biyofilmlere 10 μL selülaz (100 mg / mL, 0.05 M sitrat tamponu) ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin, 140 rpm'de çalkalayın. Selülaz, biyofilms19,20,21 içindeki selüloz iskeletlerini parçalamak için düzenli olarak kullanılır. Gerekirse, görünür topaklar kalmayana kadar yukarı ve aşağı pipetleyerek biyofilmleri daha da bozun.
  2. Test biyofilmlerinin metabolik aktivitesini değerlendirmek ve biyofilmleri kontrol etmek için 10 μL% 0.02 resazurin çözeltisi ekleyin ve 140 rpm'de çalkalayarak 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
  3. Mikroplaka okuyucuda 540 nm'lik bir uyarma dalga boyu ve 590 nm'lik bir emisyon dalga boyu kullanarak her bir kuyucuğun floresansını ölçün.
  4. Boş ortam örneklerinden floresan değerlerini çıkararak arka plan floresansını düzeltin ve azalma yüzdesini (Fantibiyotikle tedavi edilmiş biyofilmlerin ortalaması/ortalama Fnegatif kontrol) x %100 olarak hesaplayın.
  5. Hem bozulmuş biyofilmleri hem de planktonik hücreleri içeren kuyucukların içeriğini, seçici agar üzerine seri olarak seyrelterek ve nokta kaplamayı aşağıdaki gibi numaralandırın:
    P. aeruginosa
    sayımı için% 1 gliserol ve CN takviyesi ile desteklenmiş Pseudomonas seçici agar S. aureus sayımı için Mannitol tuzu agar|
    Penisilin (250 U/mL), streptomisin (250 μg/mL, gentamisin sülfat (30 μg/mL) ve vankomisin (3 μg/mL) ile takviye edilmiş Maya Pepton Dekstroz agar, C. albicans sayımı için.
    NOT: Kuyuların tüm içeriği, serbest yüzen agrega biyofilmini planktonik hücrelerden ayırmanın zorlukları nedeniyle numaralandırılmıştır. Bununla birlikte, bu yaklaşım kistik fibroz akciğerinde bulunan koşulları daha doğru bir şekilde yansıtır. İnkübasyondan sonra kapakta yoğuşma olabilir. Kuyular arasında kontaminasyon olmamasını sağlamak için, steril kontrolleri seçici agar üzerine yerleştirin.
  6. Seçici agar üzerine nokta kaplamadan sonra, numaralandırmadan önce plakaları 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.

5. RNA ekstraksiyonu için biyofilmlerin hazırlanması

NOT: Bu noktadan sonraki tüm adımlar, yalnızca RT-qPCR analizine yönelik biyofilmler içindir.

  1. Biyofilmleri içeren 96 oyuklu mikrotitre plakasını 37 °C inkübatörden çıkarın ve bunları 1 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Aktarırken, gerçekleştirilen her biyolojik tekrar için biyofilm replikalarının bir araya getirildiğinden emin olun. Bu, RNA ekstraksiyonu için yeterli biyokütle olmasını sağlar.
  2. Biyofilmleri içeren 1.5 mL'lik tüpleri 16.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. RNA ekstraksiyonunu aynı gün yapıyorsanız, adım 6.2.1'e geçin. RNA ekstraksiyonu aynı gün yapılmazsa, süpernatanı çıkarın ve peleti -20 °C'de 250 μL RNA stabilizasyon solüsyonunda saklayın. Bu çözelti, çeşitli çalışmalarda bakteri peletlerini depolamak için kullanılmıştır22,23.

6. RNA ekstraksiyonu

  1. Ticari bir kit kullanarak bakteriyel RNA, tek tür ve çok tür biyofilmleri çıkarın. Tamponları üreticinin yönergelerinde belirtildiği gibi hazırlayın.
  2. Kültür ortamı süpernatantını çıkarın ve atın. Pelet bir stabilizasyon solüsyonunda saklandıysa, oda sıcaklığına kadar çözdürün ve 16.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Peleti 600 μL RNA ekstraksiyon reaktifi içinde yeniden süspanse edin, ardından 2 mL'lik bir şırıngaya bağlı 0,2 mm'lik bir iğne kullanarak manuel olarak parçalayın (5x-10x veya pelet tamamen bozulana kadar aspire edin).
  3. RNA saflaştırma adımlarını, üreticinin yönergelerinde belirtildiği gibi gerçekleştirin.
  4. Bir UV spektroskopu, bir RNA BR Test Kiti ve tüpler kullanarak RNA'yı ölçün. Test kiti kullanılarak saptanabilir RNA limitleri 10 - 1200 ng/μL'dir, bu nedenle bu protokol için kabul edilebilir minimum RNA verimi 10 ng/μL'dir.
    1. Numuneler ve standartlar için gerekli sayıda tüp ayarlayın (2 standart gereklidir).
    2. Numune sayısı başına 199 μL tampon ve 1 μL reaktif ekleyerek çalışma çözeltisini hazırlayın (+ 2 standart ve hata için 2).
    3. Ayrı tüplere 190 μL çalışma solüsyonu ve 10 μL Standart 1 ve Standart 2 ekleyin.
    4. Ayrı tüplere 199 μL çalışma çözeltisi ve 1 μL RNA örneği ekleyin. 30 saniye boyunca girdap yapın ve ardından 5 dakika boyunca karanlık bir yerde saklayın.
    5. Florometrede RNA > Geniş aralıklı RNA'yı seçin ve talimatları izleyin.
    6. Bir spektrofotometre kullanarak RNA'nın kalitesini değerlendirin. Spektrofotometrenin üzerine 1 μL DNase/RNase İçermeyen Su pipetleyerek spektrofotometreyi boşaltın. Tüy bırakmayan bir mendil kullanarak suyu silin ve emme oranını 260/280 nM'ye ayarlayın. Spektrofotometreye 1 μL RNA pipetleyin. RNA saf ise, 260 ile 280 nM arasında tek bir tepe gözlenecek ve ~ 2.0'lık bir oran gösterilecektir.
  5. Bir cDNA Sentez Kiti kullanarak ekstrakte edilen RNA'yı tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) dönüştürün. 50 ng/μL'yi aşan herhangi bir RNA örneği için, önce DNase/RNaz İçermeyen Su kullanarak 50 ng/μL'ye seyreltin.
    1. Tüpleri kullanarak cDNA reaksiyon karışımını Tablo 1'e göre hazırlayın.
    2. Aşağıdaki koşulları kullanarak tüpleri bir Termal Döngüleyiciye yerleştirin: 25 °C 5 dakika, 42 °C 30 dakika, 85 °C 5 dakika. Ya cDNA'yı hemen kullanın ya da -20 °C'de donmuş olarak saklayın.

7. qPCR

  1. qPCR'yi bir qPCR Master Mix kullanarak gerçekleştirin. Aşağıdaki algD ve temizlik geni (16S) primerlerini kullanın (Tablo 2).
    NOT: Primerler, P. aeruginosa'nın tüm genom dizisine atıfta bulunularak NCBI-primer Blast çevrimiçi aracı kullanılarak tasarlandı ve daha sonra ticari bir satıcı aracılığıyla sentezlendi. Primerler, NCBI-primer Blast aracı kullanılarak dizi eşleştirme yoluyla polimikrobiyal biyofilmlerdeki özgüllük açısından doğrulandı.
  2. 20 μL astarı 480 μL DNase/RNaz İçermeyen Su içinde seyrelterek primerleri 4 μM'ye (4 pm/μL) seyreltin. Bunlar birden fazla kullanım için dondurulabilir.
  3. qPCR ana karışımının çalışma solüsyonunu Tablo 3.
    'daki talimatlara göre hazırlayın NOT: algD çalışma çözümü, meropenem konsantrasyonu başına 3x biyolojik tekrar ve 3x teknik tekrar, 6x negatif kontrol ve 2x hata için yeterli çözelti içerir. 16S çalışma solüsyonları, bilinen RNA konsantrasyonunun 2 katı standartlar ve 2 kat hata için yeterli çözelti içerir.
  4. Uygun qPCR reaksiyon tüplerine 18 μL algD çalışma solüsyonu ekleyin. Bu, algD ekspresyon analizi için toplam 36 tüp ve negatif kontroller için 6 tüp içerecektir.
  5. qPCR reaksiyon tüplerinin her birine 2 μL RNA veya negatif kontrollere 2 μL DNaz/RNaz İçermeyen Su ekleyin.
  6. Uygun qPCR reaksiyon tüplerine 18 μL 16S çalışma solüsyonu ekleyin. Bu toplam 2 tüp içerecektir. qPCR reaksiyon tüplerine konsantrasyonu bilinen 2 μL RNA ekleyin.
  7. qPCR'yi aşağıdaki koşullara göre gerçekleştirin: 95 °C'de 2 dakika, 95 °C'de 15 saniye (40 döngü), 60 °C'de 1 dakika.
  8. qPCR sonuçlarını, daha önce açıklandığı gibi 2-ΔΔCt yöntemini kullanarak analiz edin24. algD ekspresyonunu analiz ederken, ilgili biyofilm bileşimleri için kontrol olarak 0 μg/mL'de algD ekspresyonunu kullanın ve işlenmemiş kültürlerle ilgili kıvrım değişikliği ifadesini dikkate alın

Sonuçlar

Şekil 1A'da gösterilen sonuçlar, test edilen hiçbir dozajda anlamlı bir azalma gözlemlenmediğinden, tek türlü Pseudomonas biyofilmlerinin meropenem tedavisine karşı gösterdiği direnci vurgulamaktadır. Meropeneme maruz bırakılmayan negatif kontrol 8,31 ± 0,07 Log10CFU/mL'lik bir geri kazanım gösterirken, canlı hücrelerdeki en büyük azalma 16 µg/mL'de gerçekleşmiş ve 8,06 ± 0,10 Log10CFU/mL'lik bir geri kazanım ile sonuçlanmıştır. Ancak, literatürde P. aeruginosa biyofilmlerinin, MIC değeri 2 µg/mL olan planktonik hücrelerin aksine, meropeneme karşı çok daha dirençli olduğu ve biyofilmlere karşı bakterisidal etki için >256 µg/mL konsantrasyon gerektiği gösterildiğinden, bu direnç seviyesi beklenmektedir25,26.

Şekil 1B, meropeneme maruz bırakılmayan kontrol biyofilmi ile karşılaştırıldığında, her bir antibiyotik konsantrasyonundaki mono-kültür P. aeruginosa biyofilmlerinin metabolik aktivitesindeki ortalama yüzde azalmayı göstermektedir. Floresan azalması, canlı hücrelerdeki azalmanın bir göstergesi olarak kabul edilen, gerçekleşen metabolik aktivitenin daha düşük olduğu anlamına gelir. Meropenem ile tedavi edilen kültürler, (negatif yüzde azalma ile belirtilen) artmış metabolik aktivite göstermiştir; bu durum, bakterisidal aktivitenin olmadığını (veya çok sınırlı olduğunu) göstermektedir.

CFU geri kazanımında artış olmaksızın metabolik aktivitenin artması, bakterilerin antibiyotik maruziyetine verdiği metabolik yanıtı gösterebilir. Tek türlü ve çok türlü biyofilmler arasında (Şekil 2), P. aeruginosa'nın genel büyümesi sadece hafifçe farklılık göstermiştir; antibiyotik bulunmadığında tek türlü biyofilmlerden geri kazanılan canlı hücre miktarı, polimikrobiyal biyofilmlerde görülenden 0,74 ± 0,17 Log10CFU/mL daha yüksekti. Polimikrobiyal biyofilmlerden 6,95 ± 0,11 Log10CFU/mL oranında S. aureus ve 1,66 ± 2,88 Log10CFU/mL oranında C. albicans geri kazanılmıştır. Bununla birlikte, C. albicans yalnızca meropenem eklenmemiş örneklerde mevcut olup, antibiyotiğin uygulandığı hiçbir biyofilmden geri kazanılmamıştır. Meropenemin Candida üzerinde doğrudan bir etkisi olmadığı, C. albicans monokültürü ile laboratuvarda gerçekleştirilen önceki MIC analizlerinde meropenemin MIC değerinin >256 µg/mL olduğunun gösterilmesi nedeniyle, mantar için elverişsiz koşulların oluşmasına neden olan durumun, birlikte yaşayan diğer türler olan S. aureus ve P. aeruginosa'nın antibiyotik maruziyetine karşı verdiği bakteriyel stres yanıtı olması muhtemeldir.

Hem monokültürde hem de birlikte kolonize olan patojenlerle birlikte P. aeruginosa biyofilmlerinin 256 µg/mL'ye kadar olan meropenem konsantrasyonlarında canlı hücre geri kazanımında herhangi bir azalma göstermemesi, klinik ortamdaki bu tür kronik enfeksiyonlarla mücadele etmek için, bakteriyel yükü etkili bir şekilde azaltmak amacıyla antimikrobiyallerle birlikte çalışabilecek anti-virülans tedavileri gibi alternatif terapötiklere duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır.

algD ifadesi/ekspresyonu P. aeruginosa PAO1 tek tür biyofilmleri
ifadesi/ekspresyonu algD Lütfen çevirmemi istediğiniz metni sağlayın. P. aeruginosa Farklı meropenem konsantrasyonlarına (1, 16 ve 256 µg/mLSCFM2 içerisinde büyütülenlerin durumu, SYBR-Green RT-qPCR kullanılarak değerlendirilmiştir. İfade düzeyi daha sonra, şu yöntemle 2-ΔΔCt yöntemi kullanılarak analiz edilmiştir: 16S kontrol geni olarak kullanılan (Şekil 3). ... ifadesi algD kullanılan meropenem konsantrasyonları arasında anlamlı bir farklılık göstermedi; bu durum, tek tür biyofilmi olarak büyütüldüğünde PAO1'in algD ekspresyon, meropenem varlığından önemli ölçüde etkilenmemektedir.

algD ifadesi / ekspresyonu P. aeruginosa PAO1 çok türlü biyofilmleri
ifadesi algD ayrıca şu durumda da değerlendirilmiştir: P. aeruginosa şunlardan oluşan biyofilmlerde büyütülen PAO1 S. aureus SH100 ve C. albicans Birlikte kolonize olan organizmaların varlığının, ... ifadesini etkileyip etkilemediğini değerlendirmek için CAF2.1 algD veya PAO1'deki meropenem yanıtı. Şunlarda anlamlı farklar görülmemiştir: algD 0- arasında ekspresyon gözlemlenmiştir16 µg/mL meropenem maruziyeti. Ancak, 256 µg/mL, ... ifadesi/ekspresyonu algD diğer antibiyotik konsantrasyonlarına kıyasla anlamlı derecede daha yüksekti (0 µg/mL karşısında 256 µg/mLp = 0.0075, 1 µg/mL karşı 256 µg/mL p = 0,035, 16 µg/mL karşı 256 µg/mL (p = 0,0048) kontrol grubundan yaklaşık 7 kat daha yüksek (Şekil 4). Bu durum, ... varlığında büyütüldüklerinde S. aureus ve C. albicans, şunların ekspresyonunda artış vardır: algD meropenem'in en yüksek konsantrasyonunda, ... durumuna kıyasla P. aeruginosa yalnız yetiştirildiğinde, polimikrobiyal ortamda alginat üretiminin arttığını göstermektedir. ...'da farklılıklar göstermesine rağmen algD tek türlü ve çok türlü biyofilmler arasındaki ekspresyon farkı göz önüne alındığında, ekspresyondaki bu artışın belirli bir türün varlığından kaynaklanıp kaynaklanmadığı belirsizdir (S. aureus veya C. albicans) veya her iki mikroorganizmanın yer aldığı etkileşimlerin bu gen ekspresyon değişimine yol açıp açmadığına.

Bu sonuçlar, özellikle virülans hedefli terapötiklerin gelecekteki testleri bağlamında, terapötiklerin ve çevrenin gen ekspresyonu üzerindeki etkisini anlamanın önemini vurgulamaktadır.

P. aeruginosa, S. aureus ve C. albicans için konsantrasyona karşı bakteriyel büyüme inhibisyonu sütun grafikleri.
Şekil 1... ile oluşan tek türlü biyofilmler Pseudomonas aeruginosa PAO1Biyofilmler, SCFM2 içerisinde 24 saat boyunca kültüre edilmiş ve şunlarla işlem görmüştür: 50 µg/mL 1 saat boyunca DNase I ile ve ardından 24 saat boyunca çeşitli konsantrasyonlarda meropenem ile işleme tabi tutuldu.A) Ortalama Log10CFU/mL. Kesikli çizgi, ...'da 2 logluk bir azalmayı (%99 azalmaya eşdeğer) belirtmektedir. P. aeruginosa negatif kontrolden geri kazanım. (B) Göreceli floresan birimlerindeki yüzde azalma. Kesikli çizgi, floresansta %50'lik azalmayı belirtir; bu çizginin üzerindeki ilk nokta MIC50 değeri olarak kabul edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Graflarda meropenem konsantrasyonuna karşı bakteriyel büyüme (A) ve floresans azalması (B).
Şekil 2...den oluşan çok türlü biyofilmler Pseudomonas aeruginosa PAO1, Staphylococcus aureus SH1000 ve Candida albicans CAF2.1Biyofilmler SCFM2 içerisinde 24 saat boyunca kültüre edilmiş ve şu şekilde işlem görmüştür: 50 µg/mL 1 saat boyunca DNase I ile ve ardından 24 saat daha çeşitli konsantrasyonlarda meropenem ile işleme tabi tutulmuştur. Kesikli çizgi, şunlarda 2-logluk bir azalmayı ( %99 azalmaya eşdeğer) belirtmektedir: P. aeruginosa negatif kontrolden geri kazanım. Anlamlılık, **** p değerinin olduğu iki yönlü ANOVA ile belirlenmiştir. < 0.0001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Göreli ekspresyon ile konsantrasyon (µg/ml) arasındaki ilişkiyi gösteren ve istatistiksel analiz sonucunu (ns) belirten sütun grafiği.
Şekil 3: Sadece P. aeruginosa PAO1'den oluşan tek türden ekstrakte edilen algD ekspresyonu. Biyofilmler SCFM2 içinde 24 sa boyunca kültüre edilmiş, 1 saat boyunca 50 µg/mL DNase I ilele işlem görmüş ve farklı meropenem konsantrasyonlarına (0, 1, 16, 256 µg/mL) maruz bırakılmıştır. Gen ekspresyonu 2-ΔΔCt yöntemi kullanılarak analiz edilmiştir. Analizde housekeeping geni olarak 16S kullanılmıştır. Anlamlılık Tukey çoklu karşılaştırma testi ile belirlenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Göreli ekspresyon ile konsantrasyonu gösteren sütun grafiği; istatistiksel anlamlılık; gen ekspresyon analizi.
Şekil 4: İfadesi algD ...den oluşan çok türlü biyofilmlerden ekstrakte edilen P. aeruginosa PAO1, S. aureus SH1000 ve C. albicans CAF2.1Biyofilmler SCFM2 içerisinde kültüre edilmiş ve ... ile işlem görmüştür 50 µg/mL 1 saat boyunca DNase I ile ve çeşitli konsantrasyonlarda (0, 1, 16, meropenem ile işlem yapıldı 256 µg/mL) 24 saat daha bekletildi. Gen ekspresyonu, 2-ΔΔCt yöntemi kullanılarak analiz edildi. Housekeeping geni 16S analizde kullanılmıştır. **p < Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi ile belirlenen 0,01. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

cDNA reaksiyonu başına hacim (μL)
5X iscript Reaksiyon karışımı4
iscript Ters Transkriptaz1
DNaz/RNaz-Free Su14
2.5ng RNA1
Toplam reaksiyon hacmi20

Tablo 1: cDNA master mix çalışma çözeltileri. cDNA reaksiyonu başına gerekli bileşenler ve hacimler.

Genİleri primerTers primer
algDCGCCGAGATGATCAAGTACATGTAGTAGCGCGACAGGTTG
16SACCGCATACGTCCTACGGCGAAGACCTTCTTCACACACG

Tablo 2: algD ve 16S ileri ve geri qPCR primerleri.

Reaksiyon başına hacim (µL)algD çalışma hacmi (µL)16S çalışma hacmi (µL)
GoTaq qPCR Master Mix (2X)1044040
İleri primer1444
Ters primer1444
DNase/RNase İçermeyen Su626424
Toplam 1879272

Tablo 3: qPCR master mix çalışma çözeltileri. algD ve 16S qPCR master mix çözeltileri için gerekli bileşenler ve hacimler.

Ek Şekil 1: Pseudomonas aeruginosa LESB58, Staphylococcus aureus SH1000 ve Candida albicans CAF2.1'den oluşan çok türlü biyofilmler. Biyofilmler SCFM2 içerisinde 24 sa boyunca kültüre edilmiş (n = 3), 1 sa boyunca 50 µg/mL DNase I ile işleme tabi tutulmuş ve ardından 24 sa daha çeşitli konsantrasyonlarda meropenem ile işleme tabi tutulmuştur. Kesikli çizgi, negatif kontrole göre P. aeruginsoa geri kazanımında 2-log'luk bir azalmayı ( %99 azalmaya eşdeğer) belirtir. İstatistiksel analiz iki yönlü ANOVA ile gerçekleştirilmiştir. *p=0.0242, ** p=0.0013, **** p <0.0001. Bu şekli indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu sonuçlar, KF'li kişilerde pulmoner alevlenmelerin tedavisinde sık kullanılmasına rağmen, meropenemin, tek tür veya çok tür biyofilm modelinde P. aeruginosa'nın büyümesini önemli ölçüde etkilemediğini göstermektedir. Hafif bir artış P . aeruginosa 128 μg/mL ve 256 μg/mL meropenem ile muameleyi takiben her iki modelde de geri kazanım gözlendi, çok türlü biyofilmde S. aureus için de görüldüğü gibi; ancak bu artışlar önemsizdi. Meropenem'e maruz kaldığında C. albicans'taki azalma, antimikrobiyalin stresine yanıt olarak bakteriler tarafından mantar için yaratılan düşmanca koşullardan kaynaklanıyor olabilir. Alg'de önemli bir fark gözlenmediD P . aeruginosa tek tür bir biyofilm olarak büyütüldüğünde meropenem konsantrasyonları arasında ekspresyon. Bununla birlikte, 256 μg/mL meropenem ile muamele edildiğinde çok türlü biyofilmlerde algD ekspresyonu önemli ölçüde daha yüksekti, bu da bu koşullar altında aljinat üretiminin artabileceğini düşündürdü. Biyofilm bileşimleri ve meropenem konsantrasyonları arasında gözlemlenen algD ekspresyonundaki farklılıklar, ilgili faktörlerin varlığının enfeksiyonla ilgili gen ekspresyonunu nasıl etkileyebileceğini gösterir ve antibiyotik alternatifleri geliştirirken ve test ederken antimikrobiyal kullanımı ve polimikrobiyal enfeksiyon durumunu dikkate almanın önemini vurgular.

Modellerin kullanışlılığına rağmen, başarılı bir uygulama sağlamak için birkaç husus vardır. S. aureus ve C. albicans'ın biyofilmler içinde kurulması, S. aureus ve C. albicans'ın Gram negatif tarafından geride bırakılma riskleri nedeniyle, P. aeruginosa ile enfeksiyondan önce gereklidir. Bu biyofilm modelinde, C. albicans, antibiyotik yokluğunda bile S. aureus ve P. aeruginosa'ya kıyasla önemli ölçüde daha düşük hayatta kalma oranları nedeniyle zayıf bir ortak gibi görünmektedir. Bu, mayanın ya kaynaklar için rekabette geride kaldığını ya da biyofilm27,28 içindeki türler arası etkileşimlerden olumsuz etkilendiğini göstermektedir. Antibiyotiğin doğrudan antifungal aktivitesi olmamasına rağmen, meropenem varlığında C. albicans'ın bulunmaması, S. aureus'un meropenem'e verdiği stres tepkisinin C. albicans29,30 için elverişsiz bir ortam yaratabileceği fikrini desteklemektedir. Bununla birlikte, suş seçiminin polimikrobiyal biyofilm modelinden geri kazanılabilen C. albicans miktarı üzerinde bir etkisi olabileceğine dikkat etmek önemlidir. PAO1 yerine P. aeruginosa LESB58 kullanıldığında farklı eğilimler gözlenir (Ek Şekil 1). LESB58 ile C. albicans, tüm meropenem konsantrasyonlarında geri kazanılabilir ve aslında antimikrobiyalin bir sonucu olarak P. aeruginosa konsantrasyonu azaldıkça hafif bir artış göstererek topluluk kompozisyonunun değişmesine izin verir. Bununla birlikte, bu farklılıklara rağmen, karşılaştırmalı çalışmalar için tutarlı ve iyi karakterize edilmiş bir temel sağlayan bir laboratuvar referans suşu olması nedeniyle bu modelde PAO1 kullanılmaktadır. Bu tutarlılık, tekrarlanabilirlik ve biyofilm içindeki etkileşimler hakkında güvenilir sonuçlar çıkarmak için çok önemlidir.

Ortamın viskoz doğası nedeniyle SCFM2'de yetiştirilen bakterilerden yüksek miktarlarda RNA çıkarmak zor olabilir. Bu nedenle, RNA ekstraksiyonundan önce biyofilmin 0.2 mm'lik iğnelerle bozulması, RNA verimini artırmak ve RT-qPCR için yeterli konsantrasyonların (≥10 ng/μL) ekstrakte edilmesini sağlamak için önemli bir adımdır. RNA, bozunmaya31 karşı oldukça hassastır, bu nedenle ekstraksiyonun ardından, RNA kullanan tüm aşağı akış aktivitelerinin buz üzerinde gerçekleştirildiğinden emin olun. RNA, cDNA ve qPCR primerlerinin düzenli olarak dondurularak çözülmesi, ürünün bozulma olasılığını artırabilir. Bu nedenle mümkün olduğunca sınırlandırılmalıdır. Bu modellerin uygulanmasındaki diğer bir yaygın zorluk, RNA ekstraksiyonu veya qPCR testi sırasında kontaminasyon riskidir. Bu risk, RNA ekstraksiyonundan önce ekipmana DNA bozunma solüsyonu püskürtülerek ve prosedür boyunca DNase/RNase içermeyen pipet uçları kullanılarak en aza indirilebilir. DNase/RNase-Free suyun düzenli olarak değiştirilmesi, qPCR testi içinde kontaminasyon riskini azaltmaya da yardımcı olacaktır.

Bu protokol, hem akut hem de kronik enfeksiyonlar sırasında P. aeruginosa'nın önemli bir virülans faktörü olarak tanımlanan aljinat üretimindeki gerekliliği nedeniyle ilgilenilen gen olarak algD'ye odaklanmayı seçmiştir32. Bu nedenle, aljinat, anti-virülans terapötikleri için bir hedef olarak giderek daha fazla çalışılmaktadır33,34. Bu model algD ekspresyonunu değerlendirmek için kullanılmış olsa da, farklı anti-virülans ilaç hedefleri için diğer P. aeruginosa genlerinin ekspresyonunu değerlendirmek için uygulanabilir. Meropenem, antibiyotiğin, özellikle P. aeruginosa, C. albicans35 varlığında büyütüldüğünde, aljinat biyosentez genlerinin ekspresyonunu etkilediğini gösteren kanıtlar nedeniyle bu çalışmada kullanılmıştır. Ayrıca, meropenem genellikle P. aeruginosa solunum yolu enfeksiyonlarını tedavi etmek ve yönetmek için klinik olarak reçete edilir ve bu model36 içindeki ilgili kullanımını vurgular. Ancak bu modellerle farklı antibiyotiklerin eklenmesi, hatta ikili tedaviler de mümkündür. Antibiyotiklerin bu modele dahil edilmesi, bu modelin, P. aeruginosa'nın karbapenemlere37 karşı porin aracılı direncinin gelişmesi gibi bakteriyel direnç mekanizmalarındaki evrimsel değişiklikleri incelemek için kullanılmasına da izin verecektir. Bu polimikrobiyal biyofilm modeli, örneğin Rothia sp. ve Streptococcus sp. gibi kommensal bakteriler gibi diğer ilgili türleri içerecek şekilde uyarlanabilir veya incelenen ilaç adayının gereksinimlerini yansıtmak için Aspergillus sp. gibi enfeksiyona neden olan diğer mikroplarla ikame edilebilir.

KF akciğerini taklit eden polimikrobiyal biyofilm modelleri daha önce geliştirilmiştir38. Burada açıklanan model, küçük hacimli mikrobiyal kültürlere uygun bir kurulum kullanarak verimi artırmak amacıyla önceki çalışmalara dayanmaktadır. Bu, mevcut malzemenin sınırlı olabileceği yeni bileşiklerin test edilmesi için avantajlıdır. Model küçük ölçekli ve statik olduğundan, akciğerlerdeki mikroaerofilik ortamı daha yakından yansıtmak için biyofilmleri farklı oksijen mevcudiyetinde büyütmek mümkündür39,40. Tekrarlanabilirlik kolaylığı ve maliyet etkinliği nedenleriyle, bu çalışmada bildirilen biyofilmler aerobik olarak büyütüldü.

Bu çalışmadan elde edilen değerli bilgilere rağmen, bazı sınırlamaların kabul edilmesi gerekmektedir. İlk olarak, konakçı hücrelerin yokluğu, doğrudan memeli hücresel hedefi olan virülans faktörlerinin incelenmesi için faydasını sınırlar. Bu, virülans faktörlerinin incelenmesi için uygun in vitro modeller oluşturmanın zorluklarını özetlemekte ve kronik enfeksiyonların düşmanca ortamını kopyalayan modellerin daha da geliştirilmesi ihtiyacını vurgulamaktadır. Ayrıca, bir virülans faktörü olarak kabul edilmesine rağmen, aljinat biyofilmlerin önemli bir özelliğidir ve P. aeruginosa tarafından hem laboratuvarda hem de çevrede üretilir. Antibiyofilm ajanlarını incelemek için in vitro modellerin kullanılması, hedefin ökaryotik hücreler üzerinde doğrudan etkiye sahip olduğu anti-ekzotoksin ajanları gibi diğer anti-virülans tedavilerini incelemek için modelleri kullanmaktan daha az zor olabilir41.

PAO1'in P. aeruginosa suşunun seçimi, in vitro modelin tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu için uygun olsa da, kronik enfeksiyondan izolatların dahil edilmesi istenebilir. Antimikrobiyallerin solunum nişine adapte edilmiş suşlar üzerindeki etkisini gözlemlemek için hasta örneklerinden izole edilen bir suş ile bu modeli kullanan gelecekteki deneyler yapılacaktır.

SCFM2'nin bu in vitro modelde balgam taklidi olarak kullanılması, antibiyotik tedavisi sırasında hava yolu ile ilgili bir ortamda kültürlenen agrega biyofilmlerin davranış değişikliklerinin standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir şekilde gözlemlenmesine izin verir. SCFM2, biyofilm oluşumunu desteklemede önemli faktörler olan hücre dışı DNA (eDNA) ve müsinin dahil edilmesi nedeniyle SCFM'nin orijinal versiyonu yerine seçilmiştir. Bununla birlikte, p-aminobenzoik asit, NAD+, adenin, guanin, ksantin ve hipoksantin42 içeren SCFM3 ve demir eksikliği olan bir versiyon olan SCFM4 gibi sentetik balgam ortamının diğer varyantlarının da mevcut olduğuna dikkat etmek önemlidir. Ayrıca, Ruhluel ve meslektaşları43 tarafından geliştirilen kistik fibroz akciğer ortamı (CFLM) ve kistik fibroz sinüs ortamı (CFSM) gibi sentetik balgam ortamının kullanımı, anti-virülans terapötiklerinin farklı ortamlarda polimikrobiyal biyofilmler üzerindeki davranışını ve etkisini görselleştirmek için hava yollarının bölümlere ayrılmasına izin verecektir.

AlgD, aljinatın biyosentetik yolunda anahtar bir enzim olsa da, ekspresyon seviyesi tek başına aljinat üretiminin bir göstergesi olarak alınmamalıdır. Transkripsiyon sonrası ve translasyon sonrası modifikasyonların yanı sıra düzenleyici mekanizmalar gibi diğer faktörler, üretilen aljinat miktarını etkileyerek biyofilm oluşumunun azalmasına, çevresel strese karşı duyarlılığın artmasına ve aljinat üretiminin azaldığı yerlerde antibiyotik duyarlılığının artmasına neden olabilir12,14. Aljinat proteinini hedef alan, bu modelin etkinliklerini belirlemek için uygun olmayacağı ve aljinat üretimini veya fonksiyonel bir okumayı doğrudan ölçmenin daha faydalı olacağı geliştirilmekte olan birkaç anti-virülans terapötikleri vardır44. Ayrıca, bazı anti-virülans tedavileri, aljinat biyosentezinin veya regülasyonunun farklı aşamalarını hedefleyebilir, bu nedenle aljinat üretiminin ölçülmesi, tedavinin virülans faktörü44 üzerindeki net etkisini doğrudan yakalar. Bununla birlikte, mevcut çalışmalardaki anti-virülans tedavilerinin birçoğu anahtar aljinat genlerini hedeflemektedir ve bunlar gibi gen ekspresyon modelleri, bu tür tedavilerin etkilerini incelemek için uygun olacaktır13,14. Bunun gibi teknikler aynı zamanda yüksek verimli taramaya da kolayca uyarlanabilir ve birden fazla numunenin veya koşulun hızlı bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır ve bu, potansiyel anti-virülans bileşiklerinin ilk taramasını içeren büyük ölçekli çalışmalarda faydalıdır.

Genel olarak, tek tür ve çok tür biyofilm modelleri, CF'ye uygun koşullar altında P. aeruginosa'nın enfeksiyonla ilgili genlerinin ekspresyonunu incelemek için değerli araçları temsil eder. Modülatör tedavisinin geniş çapta kullanıma sunulması, KF sağlık hizmetlerinin manzarasında devrim yarattı. Bununla birlikte, KF modülatörlerinin bir dizi klinik faydasına rağmen, çalışmalar Pseudomonas'ın klonal soylarınındolaşıma girene kadar olduğunu göstermiş ve P. aeruginosa akciğer enfeksiyonlarını yönetmek için yeni tedavilerin hala gerekli olduğunu vurgulamıştır45,46. Tartışılan sınırlamalara rağmen, bu modellerin uygulanması, KF akciğer nişindeki bileşiklerin etkinliğini ve bu ortamda bilinen antibiyotiklerle yeni anti-virülans bileşiklerinin etkileşimlerini değerlendirmek için ilaç geliştirme hattının keşif aşamasında faydalı olabilir.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

HL, DN ve JF, Stratejik Araştırma Merkezi (SRC) için hibe desteği aldı Kistik fibrozda antimikrobiyal terapötiklerin geliştirilmesi için kanıta dayalı bir klinik öncesi çerçeve (PIPE-CF; Proje No. SRC 022) UK Cystic Fibrozis Trust ve US Cystic Fibrozis Foundation'dan. TH, bir MRC Discovery Medicine North Doktora Eğitim Ortaklığı Doktora öğrenciliği tarafından desteklenmektedir. Finansman için CF Trust ve CF Foundation'a (SRC022) ve MRC DiMEN DTP planına teşekkür ediyoruz

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Çok kuyulu plakalar için nefes almayı kolaylaştıran sızdırmazlık membranı Sigma Aldrich 
Bunsen brülör
Selülaz (100 mg / mL)Cambridge Bioscience HY-B2220-5g
CN takviyesi Sigma Aldrich 1.07624
Direct-zol RNA Miniprep kitiZymo ResearchR2050
Dnase I Thermo Fisher ScientificEN0521
DNase/Rnaz İçermeyen suVWRJ60610. XC
Gentamisin sülfat (30 & mikro; g/mL)Sigma Aldrich G3632
Gliserol (%1)Thermo Fisher Scientific15514029
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6101
iScript Cdna Sentez Kiti Bio-Rad1708890
Penisilin (250 U/mL)Bilimsel Laboratuvar MalzemeleriP3032-10MU
Qubit 4 FlorometreThermo Fisher ScientificQ33238
Qubit RNA BR Test Kiti Thermo Fisher ScientificQ10210
Qubit tüpleriThermo Fisher ScientificQ32856
Resazurin çözeltisi (%0,02)Thermo Fisher ScientificR12204
RNAlater SolnInvitrogenAM7021
Streptomisin (250 & mikro; g/mL)Sigma Aldrich S9137
Termal döngüleyici (T100 Termal Döngüleyici kullandık)Biorad1861096
TRIzol Reaktifi İnvitrojen15596026
Vankomisin (3 & mikro; g/mL)Sigma Aldrich 
Z7636241709007

Kaynaklar

  1. Blanchard, A. C., Waters, V. J. Opportunistic pathogens in Cystic Fibrosis: Epidemiology and pathogenesis of lung infection. J Pediatric Infect Dis Societ. 11 (Supplement_2), S3-S12 (2022).
  2. Kordes, A., et al. Genetically diverse Pseudomonas aeruginosa populations display similar transcriptomic profiles in a cystic fibrosis explanted lung. Nat Comm. 10 (1), 3397(2019).
  3. Chotirmall, S. H., Greene, C. M., McElvaney, N. G. Candida species in cystic fibrosis: A road less travelled. Med Mycol. 48 (Supplement_1), S114-S124 (2010).
  4. Françoise, A., Héry-Arnaud, G. The microbiome in Cystic fibrosis pulmonary disease. Genes (Basel). 11 (5), 536(2020).
  5. Haiko, J., Saeedi, B., Bagger, G., Karpati, F., Özenci, V. Coexistence of Candida species and bacteria in patients with cystic fibrosis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 38 (6), 1071-1077 (2019).
  6. Filkins, L. M., O’Toole, G. A. Cystic fibrosis lung infections: polymicrobial, complex, and hard to treat. PLoS pathogens. 11 (12), e1005258(2015).
  7. Barton, T. E., Frost, F., Fothergill, J. L., Neill, D. R. Challenges and opportunities in the development of novel antimicrobial therapeutics for cystic fibrosis. J Med Microbiol. 71 (12), (2022).
  8. Akkerman-Nijland, A. M., et al. The pharmacokinetics of antibiotics in cystic fibrosis. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 17 (1), 53-68 (2021).
  9. Lindgren, N. R., McDaniel, M. S., Novak, L., Swords, W. E. Acute polymicrobial airway infections: analysis in cystic fibrosis mice. Microbiology (Reading). 169 (1), 001290(2023).
  10. Hurley, M. N., Ariff, A. H. A., Bertenshaw, C., Bhatt, J., Smyth, A. R. Results of antibiotic susceptibility testing do not influence clinical outcome in children with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 11 (4), 288-292 (2012).
  11. Totsika, M. Benefits and challenges of antivirulence antimicrobials at the dawn of the post-antibiotic era. Curr Med Chem. 6 (1), 30-37 (2016).
  12. Davarzani, F., et al. Evaluation of antibiotic resistance pattern, alginate and biofilm production in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Iran J Public Health. 50 (2), 341-349 (2021).
  13. Ambutsi, M., Okoth, P. Comparative genomic analysis of gene clusters of Pseudomonas aeruginosa that define specific biofilm formation in deciphering target regions for novel treatment options. Sci African. 13, e00910(2021).
  14. Dai, J., Luo, W., Hu, F., Li, S. In vitro inhibition of Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm formation by DZ2002 through regulation of extracellular DNA and alginate production. Front Cell Infect Microbiol. 13, 1333773(2024).
  15. Olson, M. E., Ceri, H., Morck, D. W., Buret, A. G., Read, R. R. Biofilm bacteria: formation and comparative susceptibility to antibiotics. Can J Vet Res. 66 (2), 86-92 (2002).
  16. Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. J Bacteriol. 189 (22), 8079-8087 (2007).
  17. Pascoe, B., et al. Dormant cells of Staphylococcus aureus are resuscitated by spent culture supernatant. PLoS One. 9 (2), e85998(2014).
  18. Caldeira, J., Almeida, G., Macedo, A. L., Silva, J. P. M., Albergaria, H. Saccharomycin, a biocide from S. cerevisiae that kill-off other yeasts. Ann Med. 51 (Suppl 1), 94-95 (2019).
  19. Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Assessing biofilm dispersal in murine wounds. J Vis Exp. (174), e62136(2021).
  20. Zhang, J., et al. Cellulase promotes mycobacterial biofilm dispersal in response to a decrease in the bacterial metabolite gamma-aminobutyric acid. Int J Mol Sci. 25 (2), 1051(2024).
  21. Kamali, E., Jamali, A., Izanloo, A., Ardebili, A. In vitro activities of cellulase and ceftazidime, alone and in combination against Pseudomonas aeruginosa biofilms. BMC Microbiol. 21 (1), 347(2021).
  22. Cao, P., et al. A Pseudomonas aeruginosa small RNA regulates chronic and acute infection. Nature. 618 (7964), 358-364 (2023).
  23. Tremblay, J., Déziel, E. Gene expression in Pseudomonas aeruginosa swarming motility. BMC Genom. 11 (1), 587(2010).
  24. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  25. Aaron, S. D., et al. Single and combination antibiotic susceptibilities of planktonic, adherent, and biofilm-grown Pseudomonas aeruginosa isolates cultured from sputa of adults with cystic fibrosis. J Clin Microbiol. 40 (11), 4172-4179 (2002).
  26. Haagensen, J., et al. Spatiotemporal pharmacodynamics of meropenem- and tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms. J Antimicrob Chemother. 72 (12), 3357-3365 (2017).
  27. Jing, Q., et al. Staphylococcus aureus wraps around Candida albicans and synergistically escapes from Neutrophil extracellular traps. Front Immunol. 15, 1422440(2024).
  28. Wu, Y. M., et al. Enhanced virulence of Candida albicans by Staphylococcus aureus: Evidence in clinical bloodstream infections and infected Zebrafish embryos. J Fungi. 7 (12), 1099(2021).
  29. Ruiz-Sorribas, A., Poilvache, H., Van Bambeke, F. Pharmacodynamics of Moxifloxacin, Meropenem, Caspofungin, and their combinations against in vitro polymicrobial interkingdom biofilms. Antimicro Agents Chemother. 66 (2), e02149-e02121 (2022).
  30. Pohl, C. H. Recent advances and opportunities in the study of Candida albicans polymicrobial biofilms. Front Cell Infect Microbiol. 12, 836379(2022).
  31. Aburayyan, W. S. High-throughput RNA extraction method for P. aeruginosa and S. pyogenes biofilms. J Appl Pharma Sci. 13 (3), 97-105 (2023).
  32. Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis. Mol Microbiol. 56 (2), 309-322 (2005).
  33. Kim, S. K., et al. Inhibition of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis by Ebselen oxide and its analogues. ACS Infectious Diseases. 7 (6), 1713-1726 (2021).
  34. Gao, F., et al. Protective effects of anti-alginate monoclonal antibody against Pseudomonas aeruginosa infection of HeLa cells. Micro Pathogen. 145, 104240(2020).
  35. Alam, F., Blair, J. M. A., Hall, R. A. Transcriptional profiling of Pseudomonas aeruginosa mature single- and dual-species biofilms in response to meropenem. Microbiology (Reading). 169 (1), 001271(2023).
  36. Farrington, N., et al. Molecular pharmacodynamics of meropenem for nosocomial pneumonia caused by Pseudomonas aeruginosa. mBio. 15 (2), e03165-e03123 (2024).
  37. Meletis, G., Exindari, M., Vavatsi, N., Sofianou, D., Diza, E. Mechanisms responsible for the emergence of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa. Hippokratia. 16 (4), 303-307 (2012).
  38. O'Brien, T. J., Hassan, M. M., Harrison, F., Welch, M. An in vitro model for the cultivation of polymicrobial biofilms under continuous-flow conditions. F1000Res. 10, 801(2021).
  39. Guss, A. M., et al. Phylogenetic and metabolic diversity of bacteria associated with cystic fibrosis. ISME J. 5 (1), 20-29 (2011).
  40. Vandeplassche, E., et al. Antibiotic susceptibility of cystic fibrosis lung microbiome members in a multispecies biofilm. Biofilm. 2, 100031(2020).
  41. Hibbert, T. M., Whiteley, M., Renshaw, S. A., Neill, D. R., Fothergill, J. L. Emerging strategies to target virulence in Pseudomonas aeruginosa respiratory infections. Crit Rev Microbiol. , 1-16 (2023).
  42. Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proc Natl Acad Sci. 112 (13), 4110-4115 (2015).
  43. Ruhluel, D., O'Brien, S., Fothergill, J. L., Neill, D. R. Development of liquid culture media mimicking the conditions of sinuses and lungs in cystic fibrosis and health. F1000Res. 11, 1007(2022).
  44. Yin, R., Cheng, J., Wang, J., Li, P., Lin, J. Treatment of Pseudomonas aeruginosa infectious biofilms: Challenges and strategies. Front Microbiol. 13, 955286(2022).
  45. Ledger, E. L., et al. Impact of CFTR modulation on Pseudomonas aeruginosa infection in people with Cystic Fibrosis. J Infect Dis. 230 (3), e536-e547 (2024).
  46. Armbruster, C. R., et al. Persistence and evolution of Pseudomonas aeruginosa following initiation of highly effective modulator therapy in cystic fibrosis. mBio. 15 (5), e00519-e00524 (2024).

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Pseudomonas AeruginosaPolimikrobiyal BiyofilmAntimikrobiyal TestlerMeropenem TedavisiRNA EkstraksiyonuKoloni Oluşturan BirimlerAnti-Virülans Terapötikleri
Enfeksiyonla İlgili Gen Ekspresyonunu İncelemek için Kistik Fibroz Agregat Biyofilm Modeli
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.