Enfeksiyonla İlgili Gen Ekspresyonunu İncelemek için Kistik Fibroz Agregat Biyofilm Modeli

Kistik fibrozis (KF), Kafkas popülasyonlarında en sık görülen otozomal resesif geçişli bozukluktur¹. Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü (CFTR) genindeki mutasyonlar, solunum yollarında aşırı mukoza üretimi de dahil olmak üzere bir dizi klinik semptomla sonuçlanır. Bozulmuş iyon taşınması, bu mukozanın susuz kalmasına neden olur, bunun sonucunda mukoziliyer sistem tarafından yeterince temizlenmez ve kronik akciğer enfeksiyonlarına karşı duyarlılığı artırır¹. KF akciğerinin mikrobiyolojisi, Haemophilus influenzae ve Staphylococcus aureus'un KF'li bebeklerin ve çocukların akciğerlerini enfekte eden birincil organizmalar olarak kabul edildiği, ardından bu organizmaların azalması ve ardından yetişkinlik döneminde Burkholderia spp. veya Pseudomonas aeruginosa ile kolonizasyon ile ayrı bir fırsatçı patojen grubundan oluşur<>sup class="xref"1^,2,3,4. Bakteri türlerine ek olarak, mantar mikroorganizmaları da KF akciğer ortamında yaygındır ve Candida spp ve Aspergillus spp en sık izole edilen mantar türleri arasındadır^3,4,5. Bu organizmalar KF akciğer enfeksiyonlarında önemli roller oynamasına rağmen, kültür tekniklerindeki ve kültürden bağımsız yöntemlerdeki ilerlemeler, KF akciğer enfeksiyonlarının nadiren tek bir bakteri türüyle sınırlı olduğunu göstermiştir, bu nedenle KF akciğer^{1,6'nın karmaşık, polimikrobiyal yapısını vurgulamaktadır}.

Bu bilgiye rağmen, kronik akciğer enfeksiyonlarında kullanılmak üzere antibiyotiklerin geliştirilmesi ve test edilmesi için mevcut in vitro ve in vivo yöntemler, KF akciğer nişi^{7 ile tam benzerlik göstermemektedir} ve tek tür kültürlere karşı ilacın minimum inhibitör konsantrasyonunu (MIC) belirlemeye odaklanılmaktadır. Bu, KF akciğer patolojisinin önemli bir bileşeni olan enfeksiyöz mikro çevrenin sınırlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar⁸. Bu nedenle, yöntemler tipik olarak bakterilerin planktonik kültürler olarak büyümesini içerir, bu da muhtemelen KF akciğerindeki bakterilerinkini yansıtmayan bir büyüme durumudur. Bu, tipik olarak diğer bakteri ve mantar türlerini de içeren biyofilm agregaları olarak ortaya çıkan P. aeruginosa için özellikle önemlidir⁹. Bu tür faktörler, kronik akciğer enfeksiyonları için antibiyotiklerin test edilmesinde zorluklar ortaya çıkarmakta ve antibiyotik duyarlılık test yöntemleri ile KF akciğer ortamı içindeki antimikrobiyal aktivite arasındaki eşitsizliği vurgulamaktadır^9,10. Bu zorluklar, MIC testlerinin aktivitenin bir göstergesi olmadığı ve konakçı-patojen etkileşimlerinin anlaşılmasını sağlamadığı anti-virülans terapötikleri gibi antibiyotik alternatifleri taranırken daha da kötüleşir¹¹.

Hücre dışı bir polisakkarit olan aljinat, akciğer nişi içindeki P. aeruginosa biyofilmlerinin önemli bir bileşenidir ve antibiyotiklere ve bağışıklık ajanlarına karşı bakteriyel toleransı arttırır, ayrıca yüzey yapışmasını arttırır¹². Aljinat, anti-virülans tedavisi gelişimi için çekici bir hedeftir ve aljinat biyosentezinde anahtar bir gen olan algD'yi hedefleyenler gibi aljinat biyosentezini hedefleyen çeşitli terapötikler geliştirilmiştir^13,14. Bu tür terapötikler, KF'li kişilerde antibiyotik tedavileri ile birlikte P. aeruginosa biyofilmlerini bozmak ve bakterileri planktonik bir duruma dönüştürmek için kullanılabilir. Bu, antibiyotiğin etkinliğini artırır, çünkü biyofilm hücre dışı matrisin bozulması, antibiyotiğin bakteriyel hedefe ulaşma yeteneğinin artmasına izin verir¹⁵. Bununla birlikte, in vitro aktivite kanıtlarına rağmen, bu terapötiklerin KF akciğer nişi içindeki etkisi belirsizliğini korumaktadır.

Burada sunulan agrega biyofilm modeli, CF akciğeri içinde P. aeruginosa ile ortak kolonizatörler olan S. aureus ve C. albicans'ın eklenmesi yoluyla bu sorunları ele almak için hareket eder. Ayrıca P. aeruginosa'nın solunum ortamında görüldüğü gibi biyofilm agregatlarında büyümesine izin verir. Büyüme için beslenme ortamı olarak balgam taklit eden Sentetik Kistik Fibrozis Ortamı 2'nin (SCFM2) kullanılması, müsin, hücre dışı (e)DNA ve CF akciğeri^{16 içinde görülenleri kopyalayan bir amino asit profili dahil olmak üzere konakçı etkilerinin eklenmesine izin verir}.

KF akciğerinin koşullarını daha iyi yakalamak için biyofilmler, pulmoner alevlenme dönemlerinde KF'li kişilere sıklıkla reçete edilen bir antibiyotik olan meropenem'e maruz bırakılır. Bu model içinde bir antibiyotiğin kullanılması, bir anti-virülans ajanının reçete edilebileceği klinik durumları çoğaltmanın bir yolu olarak önerilmektedir, ör., alevlenme sırasında solunum semptomlarını yönetmek için antibiyotik tedavisi ile birleştirilmiş bir kombinasyon tedavisi olarak. Ayrıca, meropenemin dahil edilmesi, enfeksiyonla ilgili koşullar altında antibiyotik maruziyetine P. aeruginosa transkripsiyonel yanıtının değerlendirilmesine izin verir. Bu model, KF akciğerinde hangi faktörlerin uygun ilaç hedefleri olacağı hakkında bilgi sağlamak için kullanılabilir. Model ayrıca, tobramisin gibi diğer ilgili antibiyotikleri içerecek ve diğer ilgili genlerin ekspresyonunu değerlendirecek şekilde değiştirilebilir.

Burada, bu agrega polimikrobiyal model, Staphylococcus aureus ve Candida albicans varlığının ve değişen meropenem konsantrasyonlarının (1, 16 ve 256 μg/mL) P. aeruginosa tarafından algD ekspresyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılmıştır.Meropenem, esas olarak P. aeruginosa akciğer enfeksiyonlarını tedavi etmek için reçete edilir ve S. aureus veya C. albicans üzerinde doğrudan bir etkisi yoktur, burada bu birlikte yaşayan türlerin her ikisi için MIC >256 μg / mL'dir.

Bu çalışma, SCFM2 içindeki konak faktörleri ve birlikte kolonize olan mikroorganizmalar gibi ilgili faktörlerin P. aeruginosa enfeksiyonu ile ilgili genlerin ekspresyonunu nasıl etkileyebileceğinin anlaşılmasını artıracak ve kronik KF solunum yolu enfeksiyonlarında kullanılmak üzere anti-virülans terapötiklerinin geliştirilmesi ve test edilmesi için temeller sağlayacaktır.

1. Tek tür biyofilmlerin hazırlanması

1. Dondurulmuş boncuk stok kültürlerinden P. aeruginosa PAO1'i, Lizojeni Et Suyu (LB) agar üzerine tek bir boncuk çizerek ve 37 ° C'de 24 saat inkübe ederek canlandırın.
2. Çizgi plakasından tek bir koloni alarak ve 5 mL LB ortamına ekleyerek gece boyunca PAO1 kültürlerini hazırlayın. Gece boyunca (18 saat) inkübe edin, daha sonra 0.05 OD_600'e (1 x 10⁸ CFU / mL'ye eşdeğer) seyreltin ve Palmer ve ark.^{16'ya göre hazırlanan SCFM2'de 1:100 oranında seyreltin}.
3. Yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir mikrotitre plakasının kuyucuklarına 180 μL aşı ekleyin. Koloni oluşturan birimler (CFU'lar) ile sayım için biyolojik üçlü biyofilmler hazırlayın. Sadece qPCR için biyolojik replikat başına toplam 3 replikasyon gerçekleştirilir. 3 ayrı kuyucuğa, medya kontrolleri için kullanılmak üzere 180 μL steril SCFM2 ekleyin.
   NOT: Yuvarlak tabanlı plakalar, tüm biyofilmin çevredeki büyüme ortamına homojen bir şekilde maruz kalmasına izin vermedeki üstünlükleri nedeniyle geleneksel düz tabanlı plakaların aksine seçilmiştir¹⁷.
4. Biyofilmlerin 24 saatten fazla oluşmasına izin verin, 37 ° C'de inkübe edin ve 75 rpm'de çalkalayın.

2. Çok türlü biyofilmlerin hazırlanması

1. P. aeruginosa PAO1 ve S. aureus SH1000'i yukarıda tarif edildiği gibi donmuş boncuk stok kültürlerinden canlandırın. Dondurulmuş boncuk stok kültürlerinden C. albicans CAF2.1'i, Saboraud dekstroz agar üzerine tek bir boncuk çizerek ve 37 ° C'de 24 saat inkübe ederek canlandırın.
2. Çizgi plakasından tek bir koloni alarak ve 5 mL LB (her organizma için ayrı gece kültürleri) ekleyerek SH1000 ve CAF2.1'in gece boyunca kültürlerini hazırlayın. Gece boyunca 18 saat inkübe edin. S. aureus SH1000 ve C. albicans CAF2.1'in gece kültürlerini LB'de OD₆₀₀ değerine standartlaştırın, bu da sırasıyla 1 x 10⁹ ve 1.2 x 10⁷ CFU/mL'ye eşittir^17,18.
3. SCFM2'de sırasıyla 1 x 10⁶ ve 1 x 10⁵ CFU / mL konsantrasyonlarda her iki türü içeren tek bir aşı oluşturmak için S. aureus ve C. albicans'ı seyreltin.
4. 96 oyuklu bir mikrotitre plakasının kuyucuklarına 162 μL aşı ekleyin. Biyofilmleri, koloni oluşturan birimler (CFU'lar) ile sayım için biyolojik üçlü olarak aşılayın. Sadece qPCR için biyolojik replikat başına toplam 3 replikasyon gerçekleştirilir. 3 ayrı kuyuya, medya kontrolleri için kullanılmak üzere 180 μL steril SCFM2 ekleyin.
5. Biyofilmlerin 24 saat boyunca oluşmasına izin verin, 37 ° C'de inkübe edin ve 75 rpm'de çalkalayın.
6. Çizgi plakasından tek bir koloni alarak ve 5 mL LB ortamına ekleyerek bir gece boyunca PAO1 kültürü hazırlayın. Gece boyunca (18 saat) inkübe edin, daha sonra 0.05 OD_600'de (1 x 10⁸ CFU / mL'ye eşdeğer) ekleyin ve SCFM2'de 1 x 10⁵ CFU / mL'ye seyreltin.
7. 96 oyuklu mikrotitre plakasının kuyucuklarına 14.2 μL PAO1 aşısı ekleyin, bu da PAO1'in son aşısının 1 x 10⁴ CFU / mL olmasına neden olur.
   NOT: Farklı türler arasındaki aşı konsantrasyonundaki bu değişiklik, S. aureus ve C. albicans'ın P. aeruginosa tarafından geride bırakılmamasını ve tümünün antibiyotiğin bulunmadığı 24 saatlik biyofilmden nokta kaplama ile geri kazanılabilir olmasını sağlamak içindir.
8. Polimikrobiyal biyofilmlerin 24 saatten fazla oluşmasına izin verin, 37 ° C'de inkübe edin ve 75 rpm'de çalkalayın.

3. Tek tür ve çok tür biyofilmlerin DNaz ve antibiyotik tedavisi

1. 50 μg/mL'lik nihai konsantrasyonda biyofilmleri içeren kuyucuklara doğrudan 2 μL DNaz I ekleyin, 37 °C'de 1 saat inkübe edin ve 75 rpm'de çalkalayın.
   NOT: Bu, antimikrobiyallerin daha iyi nüfuz etmesini sağlamak için viskoz biyofilmleri inceltmek için eklenir ve kistik fibrozisli birçok kişi tarafından pulmoner alevlenmeler için bir yönetim stratejisi olarak alınan rhDNaz (rekombinant insan DNaz) dozajını yansıtır.
2. Seyreltici olarak damıtılmış su kullanarak 2.56 mg / mL'ye kadar bir antibiyotik meropenem stoğu hazırlayın. 0.01 mg / mL - 2.56 mg / mL konsantrasyonlara ulaşmak için seri olarak 2 faktörü ile seyreltin.
3. 1 μg / mL - 256 μg / mL'lik bir dozaj aralığı elde etmek için biyofilmlere her bir meropenem seyreltmesinden 20 μL ekleyin. Antibiyotik yerine negatif kontrol biyofilmlerine 20 μL damıtılmış su ekleyin.
4. 96 oyuklu mikrotitre plakasını şeffaf filmle kapatın ve 75 rpm'de çalkalayarak 37 °C'de 24 saat inkübe edin.

4. Canlı hücrelerin ve metabolik aktivitenin sayımı

NOT: Aşağıdaki adımlar yalnızca CFU miktar tayini için hedeflenen biyofilmler içindir.

1. Biyofilmlere 10 μL selülaz (100 mg / mL, 0.05 M sitrat tamponu) ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin, 140 rpm'de çalkalayın. Selülaz, biyofilms^{19,20,21 içindeki selüloz iskeletlerini parçalamak için düzenli olarak kullanılır}. Gerekirse, görünür topaklar kalmayana kadar yukarı ve aşağı pipetleyerek biyofilmleri daha da bozun.
2. Test biyofilmlerinin metabolik aktivitesini değerlendirmek ve biyofilmleri kontrol etmek için 10 μL% 0.02 resazurin çözeltisi ekleyin ve 140 rpm'de çalkalayarak 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
3. Mikroplaka okuyucuda 540 nm'lik bir uyarma dalga boyu ve 590 nm'lik bir emisyon dalga boyu kullanarak her bir kuyucuğun floresansını ölçün.
4. Boş ortam örneklerinden floresan değerlerini çıkararak arka plan floresansını düzeltin ve azalma yüzdesini (F_{antibiyotikle tedavi edilmiş biyofilmlerin} ortalaması/ortalama F_{negatif kontrol}) x %100 olarak hesaplayın.
5. Hem bozulmuş biyofilmleri hem de planktonik hücreleri içeren kuyucukların içeriğini, seçici agar üzerine seri olarak seyrelterek ve nokta kaplamayı aşağıdaki gibi numaralandırın:
   P. aeruginosa
   sayımı için% 1 gliserol ve CN takviyesi ile desteklenmiş Pseudomonas seçici agar S. aureus sayımı için Mannitol tuzu agar|
   Penisilin (250 U/mL), streptomisin (250 μg/mL, gentamisin sülfat (30 μg/mL) ve vankomisin (3 μg/mL) ile takviye edilmiş Maya Pepton Dekstroz agar, C. albicans sayımı için.
   NOT: Kuyuların tüm içeriği, serbest yüzen agrega biyofilmini planktonik hücrelerden ayırmanın zorlukları nedeniyle numaralandırılmıştır. Bununla birlikte, bu yaklaşım kistik fibroz akciğerinde bulunan koşulları daha doğru bir şekilde yansıtır. İnkübasyondan sonra kapakta yoğuşma olabilir. Kuyular arasında kontaminasyon olmamasını sağlamak için, steril kontrolleri seçici agar üzerine yerleştirin.
6. Seçici agar üzerine nokta kaplamadan sonra, numaralandırmadan önce plakaları 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.

5. RNA ekstraksiyonu için biyofilmlerin hazırlanması

NOT: Bu noktadan sonraki tüm adımlar, yalnızca RT-qPCR analizine yönelik biyofilmler içindir.

1. Biyofilmleri içeren 96 oyuklu mikrotitre plakasını 37 °C inkübatörden çıkarın ve bunları 1 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Aktarırken, gerçekleştirilen her biyolojik tekrar için biyofilm replikalarının bir araya getirildiğinden emin olun. Bu, RNA ekstraksiyonu için yeterli biyokütle olmasını sağlar.
2. Biyofilmleri içeren 1.5 mL'lik tüpleri 16.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. RNA ekstraksiyonunu aynı gün yapıyorsanız, adım 6.2.1'e geçin. RNA ekstraksiyonu aynı gün yapılmazsa, süpernatanı çıkarın ve peleti -20 °C'de 250 μL RNA stabilizasyon solüsyonunda saklayın. Bu çözelti, çeşitli çalışmalarda bakteri peletlerini depolamak için kullanılmıştır^22,23.

6. RNA ekstraksiyonu

1. Ticari bir kit kullanarak bakteriyel RNA, tek tür ve çok tür biyofilmleri çıkarın. Tamponları üreticinin yönergelerinde belirtildiği gibi hazırlayın.
2. Kültür ortamı süpernatantını çıkarın ve atın. Pelet bir stabilizasyon solüsyonunda saklandıysa, oda sıcaklığına kadar çözdürün ve 16.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Peleti 600 μL RNA ekstraksiyon reaktifi içinde yeniden süspanse edin, ardından 2 mL'lik bir şırıngaya bağlı 0,2 mm'lik bir iğne kullanarak manuel olarak parçalayın (5x-10x veya pelet tamamen bozulana kadar aspire edin).
3. RNA saflaştırma adımlarını, üreticinin yönergelerinde belirtildiği gibi gerçekleştirin.
4. Bir UV spektroskopu, bir RNA BR Test Kiti ve tüpler kullanarak RNA'yı ölçün. Test kiti kullanılarak saptanabilir RNA limitleri 10 - 1200 ng/μL'dir, bu nedenle bu protokol için kabul edilebilir minimum RNA verimi 10 ng/μL'dir.
   1. Numuneler ve standartlar için gerekli sayıda tüp ayarlayın (2 standart gereklidir).
   2. Numune sayısı başına 199 μL tampon ve 1 μL reaktif ekleyerek çalışma çözeltisini hazırlayın (+ 2 standart ve hata için 2).
   3. Ayrı tüplere 190 μL çalışma solüsyonu ve 10 μL Standart 1 ve Standart 2 ekleyin.
   4. Ayrı tüplere 199 μL çalışma çözeltisi ve 1 μL RNA örneği ekleyin. 30 saniye boyunca girdap yapın ve ardından 5 dakika boyunca karanlık bir yerde saklayın.
   5. Florometrede RNA > Geniş aralıklı RNA'yı seçin ve talimatları izleyin.
   6. Bir spektrofotometre kullanarak RNA'nın kalitesini değerlendirin. Spektrofotometrenin üzerine 1 μL DNase/RNase İçermeyen Su pipetleyerek spektrofotometreyi boşaltın. Tüy bırakmayan bir mendil kullanarak suyu silin ve emme oranını 260/280 nM'ye ayarlayın. Spektrofotometreye 1 μL RNA pipetleyin. RNA saf ise, 260 ile 280 nM arasında tek bir tepe gözlenecek ve ~ 2.0'lık bir oran gösterilecektir.
5. Bir cDNA Sentez Kiti kullanarak ekstrakte edilen RNA'yı tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) dönüştürün. 50 ng/μL'yi aşan herhangi bir RNA örneği için, önce DNase/RNaz İçermeyen Su kullanarak 50 ng/μL'ye seyreltin.
   1. Tüpleri kullanarak cDNA reaksiyon karışımını Tablo 1'e göre hazırlayın.
   2. Aşağıdaki koşulları kullanarak tüpleri bir Termal Döngüleyiciye yerleştirin: 25 °C 5 dakika, 42 °C 30 dakika, 85 °C 5 dakika. Ya cDNA'yı hemen kullanın ya da -20 °C'de donmuş olarak saklayın.

7. qPCR

1. qPCR'yi bir qPCR Master Mix kullanarak gerçekleştirin. Aşağıdaki algD ve temizlik geni (16S) primerlerini kullanın (Tablo 2).
   NOT: Primerler, P. aeruginosa'nın tüm genom dizisine atıfta bulunularak NCBI-primer Blast çevrimiçi aracı kullanılarak tasarlandı ve daha sonra ticari bir satıcı aracılığıyla sentezlendi. Primerler, NCBI-primer Blast aracı kullanılarak dizi eşleştirme yoluyla polimikrobiyal biyofilmlerdeki özgüllük açısından doğrulandı.
2. 20 μL astarı 480 μL DNase/RNaz İçermeyen Su içinde seyrelterek primerleri 4 μM'ye (4 pm/μL) seyreltin. Bunlar birden fazla kullanım için dondurulabilir.
3. qPCR ana karışımının çalışma solüsyonunu Tablo 3.
   'daki talimatlara göre hazırlayın NOT: algD çalışma çözümü, meropenem konsantrasyonu başına 3x biyolojik tekrar ve 3x teknik tekrar, 6x negatif kontrol ve 2x hata için yeterli çözelti içerir. 16S çalışma solüsyonları, bilinen RNA konsantrasyonunun 2 katı standartlar ve 2 kat hata için yeterli çözelti içerir.
4. Uygun qPCR reaksiyon tüplerine 18 μL algD çalışma solüsyonu ekleyin. Bu, algD ekspresyon analizi için toplam 36 tüp ve negatif kontroller için 6 tüp içerecektir.
5. qPCR reaksiyon tüplerinin her birine 2 μL RNA veya negatif kontrollere 2 μL DNaz/RNaz İçermeyen Su ekleyin.
6. Uygun qPCR reaksiyon tüplerine 18 μL 16S çalışma solüsyonu ekleyin. Bu toplam 2 tüp içerecektir. qPCR reaksiyon tüplerine konsantrasyonu bilinen 2 μL RNA ekleyin.
7. qPCR'yi aşağıdaki koşullara göre gerçekleştirin: 95 °C'de 2 dakika, 95 °C'de 15 saniye (40 döngü), 60 °C'de 1 dakika.
8. qPCR sonuçlarını, daha önce açıklandığı gibi 2-ΔΔCt yöntemini kullanarak analiz edin²⁴. algD ekspresyonunu analiz ederken, ilgili biyofilm bileşimleri için kontrol olarak 0 μg/mL'de algD ekspresyonunu kullanın ve işlenmemiş kültürlerle ilgili kıvrım değişikliği ifadesini dikkate alın

Şekil 1A'da gösterilen sonuçlar, test edilen herhangi bir dozda önemli bir azalma gözlenmediğinden, meropenem ile tedaviye tabi tutulduğunda tek tür Pseudomonas biyofilmlerinin direncini vurgulamaktadır. Meropeneme maruz kalmayan negatif kontrol, 0.07 Log10CFU / mL'± 8.31'lik bir iyileşme gösterirken, canlı hücrelerin en büyük azalması 16 μg / mL'de meydana geldi ve 8.06 ± 0.10 Log10CFU / mL'lik bir iyileşme ile sonuçlandı. Bununla birlikte, literatürde P. aeruginosa biyofilmlerinin meropeneme planktonik muadillerine göre çok daha dirençli olduğu ve konsantrasyonun biyofilmlere karşı bakterisidal olması için >256 μg/mL gerektirdiği gösterildiği için bu direnç seviyesi beklenmektedir.25,26, 2 μg/mL'lik bir MIC'ye sahip planktonik hücrelere kıyasla.

Şekil 1B, meropenem'e maruz kalmayan kontrol biyofilmine kıyasla her bir antibiyotik konsantrasyonunun mono-kültür P. aeruginosa biyofilmlerinin metabolik aktivitesindeki ortalama yüzde azalmayı göstermektedir. Floresanstaki bir azalma, canlı hücrelerdeki bir azalma için bir vekil olarak alınan daha az metabolik aktivitenin meydana gelmesi anlamına gelir. Meropenem ile muamele edilen kültürler, bakterisidal aktivitenin olmadığını (veya çok sınırlı) olduğunu gösteren artmış metabolik aktivite (negatif yüzde azalma ile gösterilir) gösterdi.

CFU geri kazanımı artmadan artan metabolik aktivite, bakterilerin antibiyotik maruziyetine metabolik tepkisini gösterebilir. Tek tür ve çok tür biyofilmler arasında (Şekil 2), P. aeruginosa'nın genel büyümesi sadece biraz farklılık göstermiştir, tek tür biyofilmden canlı hücrelerin geri kazanımı, antibiyotik bulunmadığında polimikrobiyal biyofilmde görülenden 0.74 ± 0.17 Log10CFU/mL daha yüksektir. Polimikrobiyal biyofilmden 6.95 ± 0.11 Log10CFU/mL'de S. aureus ve 1.66 ± 2.88 Log10CFU/mL'de C. albicans geri kazanıldı. Bununla birlikte, C. albicans, yalnızca meropenem eklenmediği ve antibiyotiğin uygulandığı herhangi bir biyofilmden geri kazanılmadığı durumlarda mevcuttur. Meropenem'in Candida üzerinde doğrudan bir etkisi olmadığından, meropenemin MIC değerinin >256 μg / mL olduğu C. albicans monokültürü üzerinde laboratuvarda yapılan önceki MIC testlerinde gösterilmiştir, bunun diğer birlikte yaşayan türler olan S. aureus ve P. aeruginosa'nın bakteriyel stres tepkisi olması muhtemeldir. mantar için düşmanca koşullara neden olan antibiyotik maruziyetine.

P. aeruginosa biyofilmleri, hem monokültürde hem de ko-kolonize patojenlerde, 256 μg/mL'ye kadar meropenem konsantrasyonlarında canlı hücre geri kazanımında azalma göstermediğinden, bu, klinikte bu tür kronik enfeksiyonlarla mücadele etmek için anti-virülans tedavileri gibi alternatif terapötiklere olan ihtiyacı vurgulamaktadır, bu da bakteri yükünü etkili bir şekilde azaltmak için antimikrobiyallerle birlikte çalışabilir.

P. aeruginosa PAO1 tek tür biyofilmlerinde algD ifadesi
SCFM2'de yetiştirilen farklı meropenem konsantrasyonlarına (1, 16 ve 256 μg/mL) maruz kalan P. aeruginosa PAO1'deki algD ekspresyonu SYBR-Green RT-qPCR kullanılarak değerlendirildi. İfade daha sonra kontrol geni olarak 16S kullanılarak 2-ΔΔCt yöntemi kullanılarak analiz edildi (Şekil 3). AlgD ekspresyonu, kullanılan meropenem konsantrasyonları arasında önemli ölçüde farklılık göstermedi, bu da tek tür bir biyofilm olarak büyütüldüğünde, PAO1 algD ekspresyonunun meropenem varlığından büyük ölçüde etkilenmediğini düşündürdü.

P . aeruginosa PAO1 çok türlü biyofilmler
AlgD ekspresyonu, S. aureus SH100 ve C. albicans CAF2.1'den oluşan biyofilmlerde yetiştirilen P. aeruginosa PAO1'de de değerlendirildi ve birlikte kolonize olan organizmaların varlığının algD'nin ekspresyonunu veya PAO1'deki meropeneme yanıtı etkileyip etkilemediğini değerlendirmek için. 0-16 μg/mL meropenem maruziyeti arasında algD ekspresyonunda anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Bununla birlikte, 256 μg / mL'de, algD ekspresyonu diğer antibiyotik konsantrasyonlarına kıyasla önemli ölçüde daha yüksekti (0 μg / mL'ye karşı 256 μg / mLp = 0.0075, 1 μg / mL'ye karşı 256 μg / mL p = 0.035, 16 μg / mL'ye karşı 256 μg / mL p = 0.0048) kontrol durumundan yaklaşık 7 kat daha yüksekti (Şekil 4). Bu, S. aureus ve C. albicans varlığında büyütüldüğünde, P. aeruginosa'nın tek başına yetiştirildiği zamana kıyasla, en yüksek meropenem konsantrasyonunda artmış bir algD ekspresyonunun olduğunu vurgulamaktadır, bu da polimikrobiyal ortamda aljinat üretiminde bir artış olduğunu düşündürmektedir. Tek ve çok tür biyofilmler arasındaki algD ekspresyonunda farklılıklar göstermesine rağmen, ekspresyondaki bu artışın belirli bir türün (S. aureus veya C. albicans) varlığından mı kaynaklandığı yoksa her iki mikroorganizmayı içeren etkileşimlerin mi bu gen ekspresyonu değişikliğini tetiklediği açık değildir.

Bu sonuçlar, özellikle virülans hedefleyen terapötiklerin gelecekteki testleri bağlamında, terapötiklerin ve çevrenin gen ekspresyonu üzerindeki etkisini anlamanın önemini vurgulamaktadır.

Şekil 1: Pseudomonas aeruginosa PAO1'den oluşan tek tür biyofilmler. Biyofilmler SCFM2'de 24 saat kültürlendi, 1 saat boyunca 50 μg / mL DNaz I ile muamele edildi ve 24 saat daha çeşitli konsantrasyonlarda meropenem ile muamele edildi. (A) Ortalama Log10CFU / mL. Noktalı çizgi, negatif kontrolden P. aeruginosa geri kazanımında 2 log'luk bir azalmayı (% 99 azalmaya eşdeğer) gösterir. (B) Bağıl floresan birimlerinde yüzde azalma. Noktalı çizgi, floresanda P'lik bir azalmayı gösterir ve üzerindeki ilk nokta MIC50 değeri olarak kabul edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Pseudomonas aeruginosa PAO1, Staphylococcus aureus SH1000 ve Candida albicans CAF2.1'den oluşan çok türlü biyofilmler. Biyofilmler SCFM2'de 24 saat kültürlendi, 1 saat boyunca 50 μg / mL DNaz I ile muamele edildi ve 24 saat daha çeşitli konsantrasyonlarda meropenem ile muamele edildi. Noktalı çizgi, negatif kontrolden P. aeruginosa geri kazanımında 2 log'luk bir azalmayı (% 99 azalmaya eşdeğer) gösterir. Anlamlılık iki yönlü ANOVA ile belirlendi, burada **** p < 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: P. aeruginosa PAO1'den oluşan tek türden elde edilen algD ekspresyonu. Biyofilmler SCFM2'de 24 saat kültürlendi, 1 saat boyunca 50 μg / mL DNaz I ile muamele edildi ve değişen konsantrasyonlarda meropenem'e (0, 1, 16, 256 μg / mL) maruz bırakıldı. Gen ekspresyonu 2-ΔΔCt yöntemi kullanılarak analiz edildi. Analizde temizlik geni 16S kullanıldı. Anlamlılık Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile belirlenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: P. aeruginosa PAO1, S. aureus SH1000 ve C. albicans CAF2.1'den oluşan çok türlü biyofilmlerden ekstrakte edilen algD ekspresyonu . Biyofilmler SCFM2'de kültürlendi, 1 saat boyunca 50 μg / mL DNaz I ile muamele edildi ve 24 saat boyunca çeşitli konsantrasyonlarda (0, 1, 16, 256 μg / mL) meropenem ile muamele edildi. Gen ekspresyonu 2-ΔΔCt yöntemi kullanılarak analiz edildi. Analizde temizlik geni 16S kullanıldı. **p < 0.01, Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile belirlendiği gibi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: cDNA ana karışımının çalışma çözümleri. cDNA reaksiyonu başına gereken bileşenler ve hacimler.

Tablo 2: algD ve 16S ileri ve geri qPCR primerleri.

Tablo 3: qPCR ana karışımının çalışma çözümleri. algD ve 1 6S qPCR ana karışım çözümleri için gerekli bileşenler vehacimler.

Tamamlayıcı Şekil 1: Pseudomonas aeruginosa LESB58, Staphylococcus aureus SH1000 ve Candida albicans CAF2.1'den oluşan çok türlü biyofilmler.Biyofilmler SCFM2'de 24 saat (n = 3) kültürlendi, 1 saat boyunca 50 μg / mL DNaz I ile muamele edildi ve 24 saat daha çeşitli konsantrasyonlarda meropenem ile muamele edildi. Noktalı çizgi, negatif kontrolden P. aeruginsoa

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.