Bu çalışma, hücreleri yerçekimi kullanarak düşük yapışma koşulları altında sferoidler halinde toplayarak ve ardından elde edilen sferoidleri mini biyoreaktörlerde kültürleyerek kondrositik sferoidlerin üretilmesi için bir yöntemi açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yerçekimi ve Ev Yapımı Mini Biyoreaktörler Altında Düşük Yapışkan Koşullar Kullanılarak Çeşitli Kondrositlerden Sferoidlerin Üretilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Kronik eklem hastalıklarında kıkırdak onarımı, hasarlı dokuları etkili bir şekilde yenilemek için gelişmiş hücre bazlı tedaviler gerektirir. Bu protokol, indüklenmiş pluripotent kök hücreleri (iPSC'ler) kondrosit bazlı sferoidlere ayırmak için adım adım bir yöntem sağlayarak doku mühendisliği ve hücre tedavisi uygulamalarını destekler. Farklılaşma süreci, hücreleri farklılaşmanın kritik aşamaları boyunca sırayla yönlendiren belirli ortamlarda kültürlenen iPSC'lerden başlayarak, kondrojenik soy bağlılığını teşvik etmek için dikkatli bir şekilde yapılandırılmıştır. Başlangıçta, iPSC'ler, bir dizi tanımlanmış ortam değişikliği kullanılarak kondrojenik soylara doğru indüksiyondan önce optimal birleşmeye ulaşmak için genişletilir. 10. günde, hücreler, olgun kondrositlerin temel belirteçlerini ifade eden kondrosit benzeri hücrelerin oluşumunu artıran kondrogenezi teşvik eden bir ortama geçirilir. 96 oyuklu agaroz kaplı plakalarda daha fazla agregasyon, daha sonra hücre dışı matris (ECM) birikimini teşvik eden bir mikro ortamı simüle etmek için tasarlanmış özel mini biyoreaktörlerde kültürlenen üç boyutlu sferoidlerin oluşumuna yol açar. Bu yaklaşım, doğal kıkırdak özelliklerini taklit eden kondrosit sferoidlerinin ölçeklenebilir üretimini mümkün kılarak, kıkırdak defektleri için hücre bazlı tedaviler geliştirmek için umut verici, tekrarlanabilir bir çözüm sunar ve kas-iskelet sistemi rejeneratif tıbbında klinik ve araştırma uygulamaları için geniş fayda sağlar.
Giriş
Eklem hastalığının yaygınlığı, artan engelli hasta sayısı ve bakımları ile ilgili maliyetler nedeniyle önemli ekonomik yüklere yol açmaktadır. Hiyalin kıkırdak, sınırlı rejeneratif potansiyele sahip bir bağ avasküler dokusudur1. Bazı steroid olmayan antienflamatuar ilaçların (NSAID'ler), glukokortikoidlerin ve kemoterapi veya radyoterapinin uzun süreli kullanımı, kıkırdağın rejeneratif kapasitesini daha da azaltabilir ve iyileşme yeteneğini neredeyse ortadan kaldırabilir2. Bu, hücresel tedavi için otolog kıkırdak hücrelerinin elde edilmesini zorlaştırır.
Kondrositler de dahil olmak üzere üç boyutlu (3D) hücre yetiştirme teknolojisi, uzun zamandır önemli potansiyele sahip, gelişmekte olan bir araştırma alanı olarak kabul edilmektedir. Bu 3D yapılar hem temel biyolojik araştırmalar hem de rejeneratif tıptaki uygulamalar için incelenmektedir. Otolog kondrositlerden türetilen sferoidler, şu anda küresel olarak önemli ölçüde dikkat çeken bir durum olan kıkırdak dokusu dejenerasyonunu ele almak için terapötik vaatlerde bulunmaktadır3.
iPSC'lerden farklılaşan kondrositlerden türetilen sferoidler, kıkırdak onarımı için önemli avantajlar sunan primer kondrositlere umut verici bir alternatif oluşturur. iPSC'ler, kendini yenileme için neredeyse sınırsız bir kapasite sağlar ve geniş bir farklılaşma potansiyeline sahiptir, bu da hücre toplama için invaziv prosedürler olmadan klinik uygulamalar için yeterli miktarlarda kondrositlerin üretilmesine izin verir4. Ayrıca, geleneksel iki boyutlu (2B) kondrosit kültürlerinden kondrosferler gibi 3B kültür sistemlerine geçiş, fizyolojik olarak daha ilgili bir ortam yaratarak bu hücrelerin canlılığını ve işlevselliğini daha da artırır. Çalışmalar, 3D sferoidlerde kültürlenen kondrositlerin fenotiplerini daha iyi koruduğunu, daha düşük farklılaşma oranları ve kollajen tip II ve agrekan5 gibi temel hiyalin kıkırdak belirteçlerinin daha yüksek ekspresyon seviyeleri gösterdiğini göstermektedir.
iPSC'den türetilmiş kondrosferlerin potansiyeline rağmen, yüksek kaliteli kondrosferler üretmek için standartlaştırılmış protokoller sınırlı kalmaktadır. Çalışmalar arasındaki protokollerdeki değişkenlik genellikle kondrosit kalitesinde ve hücre dışı matriks bileşiminde tutarsızlıklara yol açar ve bu da terapötik kullanım için etkinliklerini etkiler6. Burada, uygun fiyatlı, özel yapım mini biyoreaktörler kullanarak iPSC'den türetilmiş kondrositlerden sferoid üretimini standartlaştıran rafine bir protokol sunulmaktadır. Mini biyoreaktör kültür fazı, besin dağılımını, ECM olgunlaşmasını ve küresel sıkıştırmayı7 optimize eden kontrollü, düşük yapışma ayarı sağladığı için çok önemlidir. Bu faz, doğal kıkırdağa çok benzeyen bir ECM bileşimi ile birlikte kollajen tip II, agrekan ve SOX9 dahil olmak üzere temel kondrosit belirteçlerinin sağlam ekspresyonunu destekler. Düzenli ortam değişiklikleri ve çevresel koşulların dikkatli bir şekilde kontrol edilmesi - sıcaklık, CO2 ve dönme hızı - kondrosit sferoidlerinin canlılığını ve olgunlaşmasını daha da sağlar. Bu protokol, kıkırdak onarımında araştırma ve klinik uygulamalar için uygun, uygun maliyetli ve ölçeklenebilir bir şekilde hiyalin kıkırdak belirteçlerinin güçlü ifadesine sahip yüksek kaliteli kondrosferler oluşturmak için optimize edilmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Çalışma, LOPUKHIN FRCC PCM Etik Kurulu tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (9 Nisan 2019 tarihli 2019/02 sayılı protokol). Tüm donör örnekleri Helsinki Bildirgesi ilkelerine uygun olarak elde edildi. Tüm katılımcılardan ve/veya yasal vasilerinden bilgilendirilmiş onam alındı.
NOT: Protokol boyunca steril tekniği koruyun. Tüm kültür ortamlarını ve çözeltilerini hücrelere veya sferoidlere uygulamadan önce 37 °C'ye ısıtın. Hücreleri bir CO2 inkübatöründe 37 ° C'de,% 5 CO2 % 80 nem ile yetiştirin. Protokol şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
Şekil 1: iPSC hattından kondrosfer üretme protokolü IPSRG4S. (A) Başlangıçta, iPSC'ler% 80 birleşmeye ulaşılana kadar pluripotent kök hücre ortamında kültürlenir. (B) Kondrositik çizgiye doğru farklılaşmayı indüklemek için, iPSC'ler daha sonra 2 gün boyunca ortam A'da kültürlenir. Ortam daha sonra Chir 99021 ve Rho kinaz inhibitörü içermeyen bir formülasyonla değiştirilir ve hücreler her 2 günde bir orta değişikliklerle 6 gün daha kültürlenir. (C) Hücreler daha sonra sonraki 10 gün boyunca kondrogenezi teşvik etmek için B ortamına aktarılır. (D) Yeterli hücre sayısı elde edildiğinde, süreç sferoidlerin üretim aşamasına ilerler. (E) Hücreler, yerçekimi altında düşük yapışkan koşullarda sferoidler halinde toplanır. (F) Elde edilen sferoidler, orta B ile mini biyoreaktörlerde kültürlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
1. Petri kaplarının mini biyoreaktörlere dönüştürülmesi
NOT: Ayrıntılar bir önceki makaledeyer almaktadır 5.
- Steril otoklav makası kullanarak santrifüj tüplerini 7-8 mm yüksekliğinde halkalar halinde dilimleyin (otoklav ayarları: 15 psi'de 121 °C (250 °F), 30 dakika ve otoklav sonrası 20 dakika kurutma).
- Düşük yapışma özelliğine sahip, işlenmemiş veya mikrobiyolojik Petri kaplarını küçük parçalara ayırın. Sıvı bir plastik çözelti oluşturmak için yaklaşık 1 g plastik parçacığı gece boyunca 10 mL kloroformda çözün. Bu prosedürü bir çeker ocakta gerçekleştirin.
- Sıvı plastiğin pipetleme için yeterince viskoz olduğunu doğrulayın. Damlacıkların yüzeye yayılmak yerine küresel bir şekli koruduğundan emin olun. Çözelti çok inceyse, genellikle 1-3 g gerektiren daha fazla plastik parçacık ekleyin. Çok kalınsa, genellikle 5 mL'ye kadar gerektiren ek kloroform ekleyin.
- Aşağıda özetlenen iki etkili yöntemden birini kullanarak steril, ultra düşük yapışma özelliğine sahip 60 mm'lik bir Petri kabının ortasında plastik bir düğme oluşturun.
- Seçenek 1: Otoklavlanmış plastik halkayı Petri kabının ortasına yerleştirin, ardından halkanın içine sıvı plastik uygulayın; bir damla yaklaşık 100-200 μL damla sıvı plastik gerektirecektir.
- Seçenek 2: Plastik halkayı kullanmadan aynı sayıda sıvı plastik damlasını doğrudan Petri kabının ortasına uygulayın.
- Bulaşıkların laminer akış başlığında 2-3 saat üstü açık olarak kurumasına izin verin. Kuruduktan sonra bulaşıkları 20-30 dakika ultraviyole radyasyona maruz bırakın.
2. Kültür yemeklerinin jelatin ile işlenmesi
- Toz jelatini 95 °C'de damıtılmış suda çözerek %0.1'lik bir jelatin çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi sırayla 0.45 μm ve 0.25 μm membran filtrelerden geçirin, ardından süzüntüyü 4 °C'de saklayın.
- Kondrosit yeniden tohumlamadan hemen önce, 3 mL jelatin solüsyonunu 25 cm2'lik şişeye uygulayın (T25 şişesi başına 15 g'a kadar kıkırdak dokusu önerilir). Oda sıcaklığında (RT) 30 dakika inkübe edin, jelatini çıkarın, PBS ile iki kez durulayın ve hücre tohumlamaya devam edin.
3. Kondrositlerin izolasyonu ve yetiştirilmesi
NOT: Kondrositler, total diz protezi yapılan hastalardan ağırlık taşımayan kıkırdak bölgelerinden izole edilir. Tüm örnekleri steril koşullar altında hasat edin ve 200 U / mL penisilin / streptomisin çözeltisi içeren DMEM ile doldurulmuş steril tüplerde saklayın. Kıkırdak dokusunu buzdolabında 2-8 °C'de saklayın.
- Kıkırdak alımından sonraki 2 gün içinde enzimatik tedaviye başlayın. 60 mm Petri kapları kullanarak Hankıç parçalarını Hanks solüsyonunda yıkayın, ardından kıkırdağı otoklavlanmış makas kullanarak yaklaşık 1-2 mm çapında parçalar halinde kesin.
- Kıkırdak parçalarını 15 mL'lik tüplere aktarın ve DMEM'de% 0.01 kollajenaz tip II çözeltisinde, 1 g kıkırdak başına yaklaşık 1 mL, 8-12 saat içinde% 5 CO2,% 100 nem ile 37 ° C'ye ayarlanmış bir CO2 inkübatörinde, 150-200 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde sürekli çalkalama altında sindirin.
- Sindirimden sonra, kıkırdak parçalarını 15 mL'lik bir tüpe DMEM ekleyerek yıkayın, ardından 300 × g'da 10 dakika santrifüjleyin. Parçaları bir kondrosit kültür ortamında (Ek Tablo 1) yeniden süspanse edin ve bunları% 0.1 jelatin çözeltisi ile önceden kaplanmış yapışkan bir T25 şişesi üzerine tohumlayın.
- % 80'lik bir birleşik yoğunluk elde edildiğinde geçiş kondrositleri.
- Geçiş için, kondrositleri Hanks solüsyonu ile yıkayın, daha sonra hücreleri% 0.25 tripsin solüsyonu ile 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
- Tripsini etkisiz hale getirmek için eşit miktarda DMEM +% 10 FBS ekleyin. Kondrositleri taze kültür ortamında yeniden süspanse edin, daha sonra 1cm2'de 20.000-30.000 hücre tohumlayarak 1: 3 oranında dağıtın.
- Kültür şişesini 37 °C'de, %5 CO2 ve 0 nem oranına sahip bir inkübatöre yerleştirin.
4. Pluripotent kök hücrelerin yetiştirilmesi
NOT: Moleküler Beyin Araştırma Grubu, Nörobiyoloji Anabilim Dalı Kök Hücre Laboratuvarı ile işbirliği içinde, A.I. Virtanen Enstitüsü, Doğu Finlandiya Üniversitesi, Kuopio, Finlandiya, bir iPSC hattı IPSRG4S, önceki bir çalışmada başarıyla oluşturulmuştur8.
- iPSC'leri, hücre dışı proteinler içeren bir matris ile önceden kaplanmış 6 oyuklu plakalarda yetiştirin ( Şekil 1A). Pluripotent kök hücreler için bir ortam kullanın (Ek Tablo 1).
- 1:4 oranını koruyarak (1cm2
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Belirtilen protokol Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu metodoloji, iPSC'lerin en az 1 aylık bir süre boyunca kondrosit sferoidlerine farklılaşmasını sağlamak için iki farklı kültür ortamı kullanır (Şekil 2
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
iPSC'ler, rejeneratif tıpta dönüştürücü bir araçtır ve kıkırdak onarımı için hastaya özgü kondrositler üretme potansiyeli sunar. Mevcut protokoller, kondrositik soy bağlılığını destekleyen TGF-β ve BMP-2 gibi anahtar sinyal molekülleri ile mezodermal yollar yoluyla yönlendirilmiş farklılaşmadan yararlanır. Bu yöntemler, fonksiyonel kıkırdak dokusu için gerekli olan kollajen tip II ve agrekan gibi hücre dışı matriks bileşenlerinin üretimini sağlayarak embriyonik kıkırdak gelişimini çoğalt...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan ederler.
Teşekkürler
Araştırma, Rusya Bilim Vakfı tarafından #22-15-00250 nolu tahsisat ile desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 0.05 Tripsin çözeltisi | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 | |
| 0.25 Tripsin çözeltisi | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| Gelişmiş DMEM / F12 Eagle'ın orta | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| Aggrekan Monoklonal Antikor | İnvitrojen | AHP0022 | Ev sahibi: Fare; Seyreltme: 1/500 |
| Askorbik asit | Sigma | A4544 | 50 μ g/mL |
| B-27 takviyesi | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | 1x veya %2 |
| Beta-merkaptoetanol | Serva | 28625 | 90 mM |
| BMP2 | Miltenyi biotec | 130-110-922 | 10 ng/mL |
| Chir 99021 | Miltenyi biotec | 130-103-926 | 10 μ M |
| COL1A1 (E6A8E) Monoklonal antikor | CellSignalling | 39952 | Konakçı: Tavşan; Seyreltme: 1/800 |
| COL2A1 (M2139) Monoklonal antikor | Santa Cruz | sc-52658 | Ana bilgisayar: Fare; Seyreltme: 1/50 |
| Kollajenaz tip II çözelti | PanEco | P011-2 | %0.01 |
| DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) | Sigma-Aldrich | D9542-5MG | 1 & mu; g/mL |
| DMEM ortamı, glutamin | PanEco | ?420 olmadan? | |
| Fetal sığır serumu | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | %10 |
| Hanks'in solüsyonu | PanEco | ?020? | |
| Hybris 8 medium | PanEco | ?780?/?780 | |
| İnsülin-Transferrin-Selenyum çözeltisi | PanEco | ?065 | 1x çözeltisi aşağıdaki konsantrasyonlara sahiptir: İnsülin: 10 & mikro; g/mL; Transferrin: 5.5 ve mikro; g/mL; Selenyum 5 ng/mL |
| L-alanil-L-glutamin | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | 2 mM |
| Matrigel Matris | BD | 354277 | 300 & mu; g/mL |
| Penisilin-Streptomisin çözeltisi | PanEco | ?063? | 100 U/mL |
| Retinoik asit | Miltenyi biotec | 130-117-339 | 10 nM |
| Rho kinaz inhibitörü Y27632 | Miltenyi biotec | 130-103-922 | 10 milyon |
| İkincil Antikor Keçi Anti-Fare IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş, Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | Ana bilgisayar: Keçi; Seyreltme: 1/500 |
| İkincil Antikor Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher Scientific | ?32732 | Ev sahibi: Keçi; Seyreltme: 1/500 |
| Sox9 (D8G8H) Monoklonal antikor | CellSignalling | 82630 | Konakçı: Rb; Seyreltme: 1/400 |
| TeSR-1 orta | KÖK HÜCRE teknolojileri | 85850 | |
| TGF-β 1 | Miltenyi biotec | 130-095-067 | 10 ng/mL |
Kaynaklar
- Cieza, A., Causey, K., Kamenov, K., Hanson, S. W., Chatterji, S., Vos, T. Global estimates of the need for rehabilitation based on the Global Burden of Disease study 2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet. 396, e10267(2021).
- Hua, C., Buttgereit, F., Combe, B. Glucocorticoids in rheumatoid arthritis: Current status and future studies. RMD Open. 6 (1), e000536(2020).
- Wang, M., et al. Articular cartilage repair biomaterials: Strategies and applications. Materials Today Bio. 24, e100948(2024).
- Lee, N., Bayaraa, O., Zechu, Z., Kim, H. Biomaterials-assisted spheroid engineering for regenerative therapy. BMB Rep. 54 (7), 356-367 (2021).
- Eremeev, A., Pikina, A., Ruchko, E., Sidorov, V., Ragozin, A. Fabrication of cartilage tissue substitutes from cells with induced pluripotency. Med Extrem Situat. 4, 30-41 (2022).
- Rodríguez Ruiz, A., et al. Cartilage from human-induced pluripotent stem cells: comparison with neo-cartilage from chondrocytes and bone marrow mesenchymal stromal cells. Cell Tissue Res. 386, 309-320 (2021).
- Eremeev, A., et al. Brain organoid generation from induced pluripotent stem cells in homemade mini bioreactors. J Vis Exp. 178, e62987(2021).
- Holmqvist, S., et al. Creation of a library of induced pluripotent stem cells from Parkinsonian patients. NPJ Parkinsons Dis. 2, e16009(2016).
- Livak, K., Schmittgen, T. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25 (40), 402-408 (2001).
- De Kinderen, P., et al. Differentiation of induced pluripotent stem cells into chondrocytes: Methods and applications for disease modeling and drug discovery. J Bone Miner Res. 37 (3), 397-410 (2022).
- Ali, E., et al. iPSCs chondrogenic differentiation for personalized regenerative medicine: a literature review. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 185(2024).
- Reina-Mahecha, A., Beers, M., van der Veen, H., Zuhorn, I., van Kooten, T., Sharma, P. A Review of the role of bioreactors for iPSCs-based tissue-engineered articular cartilage. Tissue Eng Regen Med. 20 (7), 1041-1052 (2023).
- Fu, L., et al. The application of bioreactors for cartilage tissue engineering: Advances, limitations, and future perspectives. Stem Cells Int. 2021, 6621806(2021).
- Castro-Viñuelas, R., et al. Tips and tricks for successfully culturing and adapting human induced pluripotent stem cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 23, 569-581 (2021).
- Endo, K., Fujita, N., Nakagawa, T., Nishimura, R. Effect of fibroblast growth factor-2 and serum on canine mesenchymal stem cell chondrogenesis. Tissue Eng Part A. 25 (11-12), 901-910 (2019).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
