Bu çalışma, hücreleri yerçekimi kullanarak düşük yapışma koşulları altında sferoidler halinde toplayarak ve ardından elde edilen sferoidleri mini biyoreaktörlerde kültürleyerek kondrositik sferoidlerin üretilmesi için bir yöntemi açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yerçekimi ve Ev Yapımı Mini Biyoreaktörler Altında Düşük Yapışkan Koşullar Kullanılarak Çeşitli Kondrositlerden Sferoidlerin Üretilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Kronik eklem hastalıklarında kıkırdak onarımı, hasarlı dokuları etkili bir şekilde yenilemek için gelişmiş hücre bazlı tedaviler gerektirir. Bu protokol, indüklenmiş pluripotent kök hücreleri (iPSC'ler) kondrosit bazlı sferoidlere ayırmak için adım adım bir yöntem sağlayarak doku mühendisliği ve hücre tedavisi uygulamalarını destekler. Farklılaşma süreci, hücreleri farklılaşmanın kritik aşamaları boyunca sırayla yönlendiren belirli ortamlarda kültürlenen iPSC'lerden başlayarak, kondrojenik soy bağlılığını teşvik etmek için dikkatli bir şekilde yapılandırılmıştır. Başlangıçta, iPSC'ler, bir dizi tanımlanmış ortam değişikliği kullanılarak kondrojenik soylara doğru indüksiyondan önce optimal birleşmeye ulaşmak için genişletilir. 10. günde, hücreler, olgun kondrositlerin temel belirteçlerini ifade eden kondrosit benzeri hücrelerin oluşumunu artıran kondrogenezi teşvik eden bir ortama geçirilir. 96 oyuklu agaroz kaplı plakalarda daha fazla agregasyon, daha sonra hücre dışı matris (ECM) birikimini teşvik eden bir mikro ortamı simüle etmek için tasarlanmış özel mini biyoreaktörlerde kültürlenen üç boyutlu sferoidlerin oluşumuna yol açar. Bu yaklaşım, doğal kıkırdak özelliklerini taklit eden kondrosit sferoidlerinin ölçeklenebilir üretimini mümkün kılarak, kıkırdak defektleri için hücre bazlı tedaviler geliştirmek için umut verici, tekrarlanabilir bir çözüm sunar ve kas-iskelet sistemi rejeneratif tıbbında klinik ve araştırma uygulamaları için geniş fayda sağlar.
Giriş
Eklem hastalığının yaygınlığı, artan engelli hasta sayısı ve bakımları ile ilgili maliyetler nedeniyle önemli ekonomik yüklere yol açmaktadır. Hiyalin kıkırdak, sınırlı rejeneratif potansiyele sahip bir bağ avasküler dokusudur1. Bazı steroid olmayan antienflamatuar ilaçların (NSAID'ler), glukokortikoidlerin ve kemoterapi veya radyoterapinin uzun süreli kullanımı, kıkırdağın rejeneratif kapasitesini daha da azaltabilir ve iyileşme yeteneğini neredeyse ortadan kaldırabilir2. Bu, hücresel tedavi için otolog kıkırdak hücrelerinin elde edilmesini zorlaştırır.
Kondr....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Çalışma, LOPUKHIN FRCC PCM Etik Kurulu tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (9 Nisan 2019 tarihli 2019/02 sayılı protokol). Tüm donör örnekleri Helsinki Bildirgesi ilkelerine uygun olarak elde edildi. Tüm katılımcılardan ve/veya yasal vasilerinden bilgilendirilmiş onam alındı.
NOT: Protokol boyunca steril tekniği koruyun. Tüm kültür ortamlarını ve çözeltilerini hücrelere veya sferoidlere uygulamadan önce 37 °C'ye ısıtın. Hücreleri bir CO2 inkübatöründe 37 ° C'de,% 5 CO2 % 80 nem ile yetiştirin. Protokol şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Belirtilen protokol Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu metodoloji, iPSC'lerin en az 1 aylık bir süre boyunca kondrosit sferoidlerine farklılaşmasını sağlamak için iki farklı kültür ortamı kullanır (Şekil 2
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
iPSC'ler, rejeneratif tıpta dönüştürücü bir araçtır ve kıkırdak onarımı için hastaya özgü kondrositler üretme potansiyeli sunar. Mevcut protokoller, kondrositik soy bağlılığını destekleyen TGF-β ve BMP-2 gibi anahtar sinyal molekülleri ile mezodermal yollar yoluyla yönlendirilmiş farklılaşmadan yararlanır. Bu yöntemler, fonksiyonel kıkırdak dokusu için gerekli olan kollajen tip II ve agrekan gibi hücre dışı matriks bileşenlerinin üretimini sağlayarak embriyonik kıkırdak gelişimini çoğalt.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan ederler.
Teşekkürler
Araştırma, Rusya Bilim Vakfı tarafından #22-15-00250 nolu tahsisat ile desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 0.05 Tripsin çözeltisi | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 | |
| 0.25 Tripsin çözeltisi | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| Gelişmiş DMEM / F12 Eagle'ın orta | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| Aggrekan Monoklonal Antikor | İnvitrojen | AHP0022 | Ev sahibi: Fare; Seyreltme: 1/500 |
| Askorbik asit | Sigma | A4544 | 50 μ g/mL |
| B-27 takviyesi | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | 1x veya %2 |
| Beta-merkaptoetanol | Serva | 28625 | 90 mM |
| BMP2 | Miltenyi biotec | 130-110-922 | 10 ng/mL |
| Chir 99021 | Miltenyi biotec | 130-103-926 | 10 μ M |
| COL1A1 (E6A8E) Monoklonal antikor | CellSignalling | 39952 | Konakçı: Tavşan; Seyreltme: 1/800 |
| COL2A1 (M2139) Monoklonal antikor | Santa Cruz | sc-52658 | Ana bilgisayar: Fare; Seyreltme: 1/50 |
| Kollajenaz tip II çözelti | PanEco | P011-2 | %0.01 |
| DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) | Sigma-Aldrich | D9542-5MG | 1 & mu; g/mL |
| DMEM ortamı, glutamin | PanEco | ?420 olmadan? | |
| Fetal sığır serumu | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | %10 |
| Hanks'in solüsyonu | PanEco | ?020? | |
| Hybris 8 medium | PanEco | ?780?/?780 | |
| İnsülin-Transferrin-Selenyum çözeltisi | PanEco | ?065 | 1x çözeltisi aşağıdaki konsantrasyonlara sahiptir: İnsülin: 10 & mikro; g/mL; Transferrin: 5.5 ve mikro; g/mL; Selenyum 5 ng/mL |
| L-alanil-L-glutamin | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | 2 mM |
| Matrigel Matris | BD | 354277 | 300 & mu; g/mL |
| Penisilin-Streptomisin çözeltisi | PanEco | ?063? | 100 U/mL |
| Retinoik asit | Miltenyi biotec | 130-117-339 | 10 nM |
| Rho kinaz inhibitörü Y27632 | Miltenyi biotec | 130-103-922 | 10 milyon |
| İkincil Antikor Keçi Anti-Fare IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş, Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | Ana bilgisayar: Keçi; Seyreltme: 1/500 |
| İkincil Antikor Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher Scientific | ?32732 | Ev sahibi: Keçi; Seyreltme: 1/500 |
| Sox9 (D8G8H) Monoklonal antikor | CellSignalling | 82630 | Konakçı: Rb; Seyreltme: 1/400 |
| TeSR-1 orta | KÖK HÜCRE teknolojileri | 85850 | |
| TGF-β 1 | Miltenyi biotec | 130-095-067 | 10 ng/mL |
Kaynaklar
- Cieza, A., Causey, K., Kamenov, K., Hanson, S. W., Chatterji, S., Vos, T. Global estimates of the need for rehabilitation based on the Global Burden of Disease study 2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet. 396, e10267(2021).
- Hua, C., Buttgereit, F., Combe, B.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
