Yöntem makalesi

Sıvı Kromatografisi Tuzaklı İyon Hareketlilik Spektrometresi-Uçuş Süresi Kütle Spektrometresi ile Gıda Matrislerinde Düzenlenmiş Ergot Alkaloidlerinin Tespiti

1.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67484

⸱

22 Kasım 2024

 ,  ,  , 
1Department of Analytical Chemistry, Faculty of Sciences, University of Granada, 2Department of Preventive Medicine and Public Health, Food Science, Toxicology and Forensic Medicine, Faculty of Pharmacy and Food Science, University of Valencia

Bu makalede

Özet

Bu protokol, yakın zamanda yayınlanan Komisyon Yönetmeliği (AB) 2023/915'e uygun olarak gıdalarda ergot alkaloidlerinin varlığını belirlemek için doğrulanmış bir sıvı kromatografisi-iyon hareketliliği-yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi yöntemi sunar.

Özet

İyon hareketlilik kütle spektrometresi (IMS), sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (LC-MS) iş akışlarına entegre edildiğinde ek bir ayırma boyutu görevi görür. LC-IMS-MS yöntemleri, geleneksel LC-MS yöntemlerine kıyasla daha yüksek tepe çözünürlüğü, izobarik ve izomerik bileşiklerin gelişmiş ayrımı ve gelişmiş sinyal-gürültü oranı (S/N) sağlar. IMS, analitlerin tanımlanması için başka bir moleküler özellik sağlar, yani çarpışma kesiti (CCS) parametresi, yanlış pozitif sonuçları azaltır. Bu nedenle, LC-IMS-MS yöntemleri, gıda güvenliği alanındaki önemli analitik zorlukları ele almaktadır (yani, karmaşık gıda matrislerinde eser seviyelerde bileşiklerin tespiti ve izobarik ve izomerik moleküllerin kesin olarak tanımlanması).

Ergot alkaloidleri (EA'lar), çavdar, tritikale, buğday, arpa, darı ve yulaf gibi küçük taneler de dahil olmak üzere çok çeşitli çim türlerine saldıran mantarlar tarafından üretilen bir mikotoksin ailesidir. EC/2023/915 sayılı Komisyon Tüzüğü'nde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, çeşitli gıda maddelerinde bu mikotoksinlerin maksimum seviyeleri (ML'ler) belirlenmiştir. Bu yeni mevzuat, altı ana EA'yı ve bunlara karşılık gelen epimerleri içerir, bu nedenle bu izomerik molekülleri birlikte oluşumlarını göz önünde bulundurarak uygun şekilde ayırt etmek için etkili bir metodoloji gereklidir.

Bu nedenle, bu protokolün amacı, IMS'nin LC-MS iş akışlarına entegrasyonunun, analitik yöntemin seçiciliğini artırarak izomerik EA'ların ayrılmasına nasıl katkıda bulunduğunu göstermektir. Ek olarak, analitik standartların karakterizasyonu yoluyla CCS kütüphanelerinin oluşturulmasının mikotoksinlerin tanımlanması için nasıl daha yüksek güven sağladığını göstermektedir. Bu protokol, tahıllardaki EA'ların belirlenmesini örnek alarak, gıda güvenliğinde EYS'nin uygulanmasının faydalarını net bir şekilde açıklamak için tasarlanmıştır. QuEChERS tabanlı bir ekstraksiyon ve ardından bir LC tuzaklı iyon hareketlilik spektrometresi (TIMS)-MS analizi, ML'nin 1.5x, 1x ve 0.5x'inde kabul edilebilir doğrulukla (ergotaminin için düşük geri kazanım olmasına rağmen) 0.65 ila 2.6 ng/g arasında değişen nicelik sınırları sağladı ve ihmal edilebilir bir matris etkisi sergiledi.

Giriş

İyon hareketlilik kütle spektrometresi (IMS), giderek daha fazla kullanılan bir analitik teknik haline geliyor ve genellikle MS iş akışlarına bağlı olarak geleneksel sıvı/gaz kromatografisine (LC/GC) entegre edilmiş ek bir ayırma boyutu olarak sunuluyor. IMS, moleküllerin bir hareketlilik hücresi boyunca, bir tampon gazla doldurulmuş, bir elektrik alanı altında ve atmosferik basınçta1 ayrılmasından oluşur. Kütle-yük oranına (m/z) ve geometrik konformasyona bağlı olarak, iyonize bir molekül, hareketlilik hücresi boyunca hareket ederken tampon gaz ile etkileşime girecektir, bu da iyon hareketliliği (K) parametresi2'ye yansıtılır ve aşağıdaki denklem aracılığıyla hesaplanır:

figure-introduction-1

burada D toplam sürüklenme uzunluğunu, td  toplam sürüklenme süresini ve E  elektrik alanını temsil eder. Bu nedenle, K m2 V − 1 s − 1 olarak ölçülür, ancak pratik nedenlerden dolayı genellikle cm2 V − 1 s − 1 olarak ifade edilir. Hareketlilik hücresi boyunca hareket etme içsel yeteneği, sürüklenme süresi ile ölçülebilir ve daha sonra IMS cihazı3'ten bağımsız olarak her molekül için oldukça tekrarlanabilir bir parametre olan çarpışma kesiti (CCS) değerine dönüştürülebilir. CCS, aşağıdaki denklemi takip eden hareketlilikten türetilebilir:

figure-introduction-2

Q iyonun yüküdür; N tampon gaz sayısı yoğunluğu; μ çarpışma ortaklarının indirgenmiş kütlesi gaz iyonunu tamponlar; kB Boltzmann sabiti; ve T tampon gaz sıcaklığı. Bu nedenle IMS, kromatografi ve MS analizlerinden elde edilen analitik verileri tamamlayıcı ek bilgiler sağlar.

IMS'nin LC-MS platformlarında uygulanmasının, özellikle eser konsantrasyonlarda olan bileşiklerle çalışırken, analitik belirlemelerin güvenilirliğini artırdığı gösterilmiştir. Birkaç çalışma, LC-IMS-MS yöntemlerinin, sonuçta yöntemin hassasiyetini etkileyen arka plan gürültüsünü azaltarak kütle spektrumlarının kalitesini iyileştirdiğini ve çok kalıntılı LC-MS metodolojileritarafından sağlanan yanlış pozitiflerin ve negatiflerin oranını azalttığını bildirmiştir 4,5,6. Ayrıca, CCS değerlerinin tekrarlanabilirliği, yalnızca aynı teknolojiyi kullanan farklı cihazlar arasında değil, aynı zamanda en sıkkullanılan sistemler olan hareketli dalga iyon hareketlilik spektrometrisi (TWIMS), sıkışmış iyon hareketlilik spektrometrisi (TIMS) ve sürüklenme tüplü iyon hareketlilik spektrometrisi (DTIMS)2,7 gibi farklı iyon hareketlilik teknolojileri arasında da karşılaştırmaya olanak tanır. Bu nedenle, CCS'nin bir tanımlama parametresi olarak potansiyelinin dikkate değer bir sonucu, metabolomik çalışmalardauygulanabilirliğine yansıyan CCS kütüphaneleri oluşturma olasılığında yatmaktadır 8. Bununla birlikte, IMS'nin en güçlü özelliklerinden biri, LC-MS yöntemleriyle yeterince çözülemeyen izomerik ve izobarik bileşikleri ayırma yeteneğidir. Bu, çevre ve gıda analizlerinde yaygın bir durum olan karmaşık matrislerde ilgilenilen büyük analit setleriyle çalışırken söz konusu olabilir. Bu bağlamda, pestisitlerin ve daha az ölçüde de gıdalardaki veteriner ilaçlarının ve mikotoksinlerin izlenmesi için LC-IMS-MS yöntemleri önerilmiştir9.

Yüksek çözme gücü ve seçiciliği nedeniyle, LC/GC-IMS-MS platformları, özellikle izomerik karışımlarla ilgili olanlar olmak üzere, gıda güvenliğindeki mevcut zorlukların bazılarını ele almak için en kullanışlı araçlar olarak ortaya çıkmaktadır. Gıda kontaminantları olarak izomerik karışımlarla ilgili sağlık sorunu, örneğin, çeşitli gıda ürünlerinde altı ana ergot alkaloidinin (EA) ve bunlara karşılık gelen altı epimerin maksimum konsantrasyonunu sınırlayan mevcut Avrupa mevzuatına yansıtılmıştır10.

EA'lar, başta Clavicipitaceae familyasından olmak üzere çok çeşitli mantarlar tarafından üretilen bir toksik ikincil metabolitler ailesini oluşturur (örneğin, geniş konakçı yelpazesi nedeniyle en önemli EA üreticisi olan Claviceps purpurea), aynı zamanda çiçeklenme zamanında canlı bitkilerin (çavdar, arpa, buğday ve yulaf gibi) tohum başını parazitleştirebilen Trichocomaceae 11, 12. Belirli koşullar altında, özellikle sıcaklık ve su aktivitesi altında, Claviceps mantarları, konukçu mahsulde sklerotia veya ergot olarak bilinen meyve veren gövdelerde biriken EA'lar üretebilir. Bir dereceye kadar, EA'lar nihai ürüne ulaşana kadar hammaddenin işlenmesine dayanabilir; bu nedenle, besin zincirine girmek. Kontamine gıdaların yutulması, karın ağrısı, kusma, ciltte yanma hissi, uykusuzluk ve halüsinasyonlar gibi akut semptomlarla ortaya çıkan ergotizm olarak bilinen EA zehirlenmesine yol açabilir13. EA'ların insan sağlığı üzerindeki etkisini azaltmak için, Avrupa Komisyonu, ana EA'ların toplamı için çeşitli gıdalarda maksimum seviyeler (ML'ler) belirlemiştir: R-epimerleri ergometrin (Em), ergotamin (Et), ergosin (Es), ergokristin (Ecr), ergokriptin (Ekr) ve ergocornin (Eco) ve bunlara karşılık gelen S-epimerleri: ergometrinin (Emn), ergosinin (Esn), ergotaminin (Etn), ergocorninin (Econ), ergokryptinine (Ekrn), ve ergokristinin (Ecrn). Bu bileşikler, özellikle güçlü ışığa maruz kalma, uzun süreli depolama veya yüksek veya düşük pH 12'de bazı çözücülerle temas altında, R'den S formlarına epimerize olabilir ve bunun tersi de geçerlidir. R ve S formlarının oranı farklı koşullar altında değişebilse de, EFSA CONTAM Paneli, gıda ürünlerindeki EA'lar hakkında mevcut literatürü inceledikten sonra S formlarından daha yüksek bir R formu oluşumu bildirmiştir14. Bu nedenle, ML'ler, mahsulün duyarlılığı, işleme derecesi veya tüketim sıklığı gibi çeşitli faktörlere bağlı olarak değişir. AB çerçevesinde, arpa, buğday, kavuzlu buğday ve yulafın öğütülmüş ürünleri için ML'ler 50 veya 150 μg/kg olarak belirlenmiştir (sırasıyla 900 mg/100 g'dan daha düşük veya daha yüksek kül içeriğine bağlı olarak), buna karşın doğrudan insan tüketimine yönelik tahıllar, tahıl bazlı bebek maması hariç olmak üzere 150 μg/kg'lık bir ML'ye tabidir, ML'nin 20 μg / kg'a düşürüldüğü10.

Bu sıkı mevzuat, eser konsantrasyon (μg/kg) seviyelerini belirlemek için yeterince hassas analitik metodolojiler gerektirirken, düzenlenmiş EA'ları ve bunlara karşılık gelen epimerleri uygun şekilde tanımlar, çünkü her iki form, R ve S-izomerleri kontamine numunelerde birlikte bulunabilir. Bu görev, her bir toksin-epimer çifti aynı tam kütle ve parçalanma modelini paylaştığı için büyük bir zorluğu temsil eder. Ek olarak, her iki bileşik arasında uygun bir kromatografik ayrım karmaşık olabilir. Bu nedenle, EA epimerleri gıda numunelerinde birlikte ortaya çıktığında yanlış miktar tayinini önlemek için iyi optimize edilmiş LC gradyanları gereklidir. Birkaç çalışma, EA'ların 15,16,17,18'in kesin olarak belirlenmesi için LC-MS yöntemlerini bildirmiş olsa da, EA'ları kesin olarak tanımlamak için kromatografik piklerin yeterli şekilde ayrılmasını sağlamak için kromatografik yöntem kapsamlı bir şekilde incelenmelidir. Bununla birlikte, bu genellikle farklı kimyasal ailelere ait kirleticilerin aynı anda belirlendiği çok sınıflı yöntemler için mümkün değildir. Bu bağlamda, Carbonell-Rozas, Hernández-Mesa ve ark.19 tarafından yakın zamanda yürütülen bir çalışmada, buğday ve arpa numunelerindeki EA'ların miktar tayini için, mevcut mevzuata uygun olarak herhangi bir uyumsuzluğu tespit etmek için tekrarlanabilir CCS değerleri ve düşük miktar belirleme limitleri (LOW'lar) sağlayan iki farklı TWIMS cihazı kullanılarak bir LC-IMS-MS yöntemi bildirilmiştir. Bu nedenle, bu protokolün amacı, IMS'nin LC-MS iş akışlarına entegrasyonunun, analitik yöntemin seçiciliğini artırarak izomerik EA'ların ayrılmasına nasıl katkıda bulunduğunu göstermektir. Ek olarak, analitik standartların karakterizasyonu yoluyla CCS kütüphanelerinin oluşturulmasının mikotoksin tanımlaması için nasıl daha yüksek güven sağladığını göstermektedir. Bu protokol, tahıllardaki EA'ların belirlenmesini örnek alarak, gıda güvenliği analizinde EYS'nin uygulanmasının faydalarını net bir şekilde açıklamak için tasarlanmıştır. Bu protokol, bir QuEChERS prosedürüne, LC-TIMS-MS ile numune analizine ve IMS veri çıkarma ve yorumlamaya dayalı numune işlemeyi ele alır.

Protokol

1. Stok, ara ve çalışma standardı çözeltilerinin hazırlanması

NOT: Nitril eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük kullanın.

  1. Asetonitril kullanarak 4 mL amber cam şişelerde 10.000 ng / mL'de 12 EA'nın ( Malzeme Tablosuna bakınız) bireysel stok çözeltilerini hazırlayın. R-formları (-ine) daha önce 25.000 ng'lik porsiyonlarda alikote edilirken, S-formları (-inine) 10.000 ng'lik porsiyonlarda dağıtılmıştı. Bu çalışma, bu alikotlarla başladı, R ve S formlarını sırasıyla 2.5 ve 1 mL asetonitrilde seyrelterek 10.000 ng / mL konsantrasyonlara ulaştı ve ardından 2 dakika girdaplama yaptı.
  2. Her bir alkaloid çözeltisinden 65 μL ve 7.02 mL asetonitril ekleyerek 12 mL'lik amber cam şişede 1.000 ng / mL toplam EA'da (her biri 83.33 ng / mL) bir ara stok çözeltisi hazırlayın.
    NOT: Ara stok çözeltisi hazırlandıktan sonra, epimerizasyonu önlemek için bireysel stok çözeltileri kurutulmalı ve -20 °C'de alüminyum folyo ile kaplanarak saklanmalıdır.
  3. 4 mL amber cam tüplerde 2,7, 1,8 ve 0,9 mL pipetleyerek ara stok solüsyonundan çalışma standardı solüsyonları hazırlayın. Hafif nitrojen akışı altında kurumaya bırakın ve 600 μL asetonitril içinde yeniden süspanse edin.
    NOT: Elde edilen konsantrasyonlar, numunenin 1.5 μL'sine 1.5 μL eklenirken mL'nin 0.5 katına (150 ng / g) (50 ng / g) ulaşacak şekilde belirlenmiştir. Bunlar, doğrulama çalışmaları için konsantrasyon seviyeleri olarak seçilir (yani, geri kazanımlar, tekrarlanabilirlik, vb.).
  4. Her bir çalışma standart çözeltisinin 600 μL'sini 200 μL'lik pipetleyerek üç adet 2 mL'lik amber cam şişeye bölün ve kurumaya bırakın.
    NOT: 1.2 ila 1.4 arasındaki adımlar Şekil 1'de şematik olarak açıklanmıştır. Çalışma standardı çözeltilerinin bölünmesi ve kurutulmasıyla, EA'ların kimyasal bütünlüğünü kaybetmeden, validasyon çalışmasının gerektirdiği şekilde üç farklı günde üç kopya halinde takviye etmek mümkündür.
  5. Her doğrulama gününde, her bir takviye seviyesinin 2 mL'lik amber cam şişesini 200 μL asetonitril içinde yeniden süspanse edin.
    NOT: Her bir zenginleştirme seviyesi, numune başına 50 μL kullanılarak üç kopya halinde değerlendirilecektir; bu nedenle toplam 150 μL çözelti kullanılacaktır.

2. Reaktiflerin ve çözeltilerin hazırlanması

NOT: Nitril eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük kullanın.

  1. 24.02 mg amonyum karbonatı tartarak ve 50 mL suda çözerek 5 mM'lik bir amonyum karbonat çözeltisi hazırlayın. 24.02 mg amonyum karbonatı bir behere tartın ve yaklaşık 5 mL su ekleyin. Çözeltiyi manuel olarak hafifçe çalkalayarak amonyum karbonatı çözün, ardından 50 mL'lik hacimsel bir şişeye aktarın. 50 mL'lik son hacme ulaşmak için, kabı ilave su ile durulayın ve kabarıklığı hacimsel şişeye aktarın.
  2. Adım 2.1'de hazırlanan 212.5 mL asetonitril ve 37.5 mL amonyum çözeltisini karıştırarak 250 mL ekstraksiyon çözeltisi [asetonitril: 5 mM amonyum karbonat (85:15, h/h)] hazırlayın.
  3. Numune ekstraktlarını yeniden süspanse etmek için 100 mL metanol: su karışımı (1: 1, v / v) hazırlayın (adım 8.8.).
  4. Her numune için, dağıtıcı temizleme aşaması için 15 mL santrifüj tüplerine 150 mg dağıtıcı katı faz malzemesi C18: zirkonya bazlı sorbent karışımını (1: 1, a / a) tartın (adım 8.5.).
  5. Çözücüleri, her ikisi de %0,3 (h/h) formik asit içeren 1 L ultra saf su (çözücü A) ve metanol (çözücü B) olmak üzere iki farklı şişede kromatografik ayırma için hazırlayın. Bu konsantrasyonu elde etmek için şişelere 3.03 mL formik asit (%99 saflıkta) ilave edildi.
    NOT: Mobil faz için çözücüler, LC-IMS-MS analizlerini çalıştırmadan hemen önce hazırlanmalıdır.

3. Enstrümantal parametrelerin ayarlanması

NOT: Bu LC-IMS-MS çalışmasını gerçekleştirmek için kullanılan cihaz, vakum yalıtımlı prob ısıtmalı elektrosprey iyonizasyon (VIP-HESI) kaynağı ile donatılmış, bir IM-HRMS ile birleştirilmiş bir UHPLC idi. Cihaz pozitif modda çalıştırıldı.

  1. Aşağıdaki elüsyon gradyanını ayarlayarak analitlerin ayrılması için edinim yazılımını kullanarak bir kromatografik yöntem oluşturun: 0 dk, %10 B; 2 dk, %10 B; 4,5 dk, %40 B; 9 dk, %45 B; 11 dk, %95 B; 12 dk, %95 B; 13 dk, %10 B; 16 dk, %10 B.
  2. Mobil faz akış hızını 0,4 mL/dk'ya, kolon sıcaklığını 35 °C'ye ve enjeksiyon hacmini 5 μL'ye ayarlayın. Mümkünse, otomatik numune alma cihazının içinde 10 °C'lik sabit bir sıcaklık tutun.
  3. IMS parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: hareketlilik değerleri (1/K0), 0,1 ila 1,5 V·s/cm2; rampa süresi, 100 ms; doğruluk süresi, 10 ms; görev döngüsü, %10; ve rampa hızı, 9.05 Hz.
  4. MS tespiti için iyon kaynağı parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: kılcal gerilim, 2.500 V; nebulizatör basıncı, 2,5 bar; kuru gaz akış hızı, 8 L/dak; kuru gaz sıcaklığı, 200 °C; kılıf gazı sıcaklığı, 450 °C; kılıf gazı akış hızı, 4 L/dak. MS alımı için, iki tarama olayını dikkate alarak aşağıdaki parametreleri seçin: 20 ila 1.300 arasında bir m/z ile tüm kütle spektrumunun tam taraması ve ardından 24, 36 ve 50 eV'lik üç sabit çarpışma enerjisinde herhangi bir öncüden ürün iyonları üreten bbCID (geniş bant çarpışma kaynaklı ayrışma). Pozitif polarite modunda iyonizasyon ve veri toplama gerçekleştirin.
  5. Bu alma yöntemi dosyasını daha sonra kullanmak üzere kaydedin.

4. EA'nın analitik standartlarından veri toplama

NOT: Yalnızca adım 4.1 için nitril eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük kullanın.

  1. 1.000 ng / mL'de 500 μL ara çözelti içeren iki adet 1.5 mL amber şişesi ve yıkama çözeltisi olarak çözücü A ve B (1: 1, v / v) karışımı içeren başka bir şişe hazırlayın.
  2. timsTOF cihazını üretici tarafından belirtildiği gibi kalibre edin ve hem IMS hem de MS alımları için pozitif polariteyi seçin.
  3. C18 sütununu ( Malzeme Tablosuna bakın), edinme yönteminde belirtildiği gibi sıcaklık 35 °C'ye ayarlanmış olarak LC fırının içine yerleştirin file adım 3.5'te kaydedildi.
    NOT: Her iki ucun da iyice sıkıldığından emin olun; Aksi takdirde mobil faz kaçağı gözlenecektir.
  4. LC kolonunu 0,1 mL/dk'lık bir mobil faz akış hızına izin verecek şekilde koşullandırın ve ilk mobil faz bileşim oranı olarak 90:10 (%) bir çözücü A ve B karışım oranı seçin.
  5. Kolon basıncı sabit olana kadar bekleyin (~130 bar).
  6. Mobil faz akış hızını 0,2 mL/dk'ya yükseltin, basınç dengelenene kadar bekleyin ve tekrar 0,3 mL/dk'ya yükseltin.
  7. Basınç tekrar stabilize olduğunda, akış hızını 0.4 mL'ye ayarlayın, bu da adım 3.5'te kaydedilen edinme yöntemi dosyasında ayrıntılı olarak açıklandığı gibi çalışma akış hızı olacaktır ve basınç 350 bar civarında stabilize olana kadar bekleyin.
    NOT: Akışı doğrudan 0,2'den 0,4 mL/dk'ya çıkarmamak önemlidir. Akıştaki güçlü bir değişiklik, kromatografi kolonuna zarar verebilecek yüksek basınçlı tepe noktalarına neden olur.
  8. Sütun şartlandırılırken, adım 4.1'de belirtildiği gibi 1.000 ng/mL'de EA'nın ara çözeltisini içeren iki şişeye karşılık gelen iki numune ve yıkama şişesi dahil olmak üzere çalışma listesini yazın. Yıkama şişesini, numune partisinin başında ve sonunda olmak üzere iki kez analiz edin.
  9. İş listesinin Yöntem dosyası sütununda, daha önce adım 3.5'te kaydedilen edinme yöntemi dosyasını yükleyin.
  10. Alınan tüm veri dosyalarını kaydetmek için bir klasör oluşturun ve Örnek yolu sütunundaki klasörü seçerek tüm örnekleri yönlendirin.
    NOT: Doğrulama etüdü sırasında oluşturulan tüm dosyaları daha sonraki işlemler üzere kaydetmek için aynı klasörü kullandığınızdan emin olun. Kolon koşullandırma sırasında, basıncın dengelendiği değerler biraz değişebilir. Bununla birlikte, kolon bütünlüğünü korumak için akış hızını tekrar artırmadan önce basıncın sabit olduğundan emin olun. Ayrıca, çalışma akış hızına ulaşıldığında, tekrarlanabilir kromatografik ayırma elde etmek için basıncın da sabit olması gerekir.
  11. Yazılımın üst araç çubuğuna gidin ve iş listesini çalıştırın.

5. Bir niceleme yönteminin oluşturulması için veri işleme

  1. İş listesi yürütüldükten sonra, kalitatif yazılımı açın.
  2. Analiz edilen tüm örnekleri Dosya | İş listesini açın.
  3. 1.000 ng/mL'de EA'nın ara çözeltisine karşılık gelen bir numuneye sağ tıklayın, Kromatogramı düzenle'ye gidin ve ardından Tür | Ekstrakte edilen iyon kromatogramı ve her EA ile ilgili protonlanmış iyonun teorik moleküler kütlesine girin. Ardından, Ekle'ye ve son olarak Tamam'a tıklayın. Analit seti, aynı tam kütleyi paylaşan altı EA ve bunlarla ilgili epimerler tarafından oluşturulduğundan, ekstrakte edilmiş altı iyon kromatogramı görünecektir.
    NOT: Genişlik parametresi m/z penceresinin ne kadar dar olacağını değiştirir. İlgilenilen analitin kromatografik tepe noktasını bulmada zorluk yaşanması durumunda, yeterince geniş bir m/z penceresinin seçilmesi önerilir. Bununla birlikte, olası parazitleri önlemek için (0,05 birimin altında) dar m/z pencerelerin ayarlanması tavsiye edilir.
  4. Ekstrakte edilen her iyon kromatogramında, ana EA ve epimeri ile ilgili iki kromatografik tepe görünecektir. Bir tepenin tüm alanını seçerken sağ tıklayın. Sonuç olarak, iyon hareketlilik spektrumu hemen aşağıda ortaya çıkacaktır.
  5. İyon hareketlilik spektrumunun x eksenine gidin, sağ tıklayın ve ardından Çarpışma Kesiti'ne tıklayın. CCS değerini not edin.
    NOT: CCS değerleri otomatik olarak görünmezse, üst araç çubuğunda Kalibre Et'e , ardından Mobilite hesaplayıcı'ya gidin ve karşılık gelen CCS'yi almak için mobilite değerini manuel olarak yazın.
  6. Aynı iyon kromatogramı içindeki diğer kromatografik tepe noktasına karşılık gelen alanı seçin ve 5.4 adımlarını tekrarlayın. ve 5.5.
  7. Benzer şekilde, parçalanma modeli de adım 5.4'ten sonra görünecektir. Literatürde ve veri tabanlarında bildirilen parçalanma modeline dayanarak, tamamlayıcı bir tanımlama noktası olarak en yoğun ürün iyonunu karşılaştırın ve seçin.
  8. Bir kantitasyon yöntemi oluşturmak için her EA'nın alıkonma süresini, CCS değerini ve ana iyon eklentisinin (genellikle protonlanmış iyon) tam kütlesini yazın.
  9. 5.4 ile 5.8 arasındaki adımları tekrarlayın. kalan analitler için.
  10. Ctrl tuşuna basarken üzerlerine tıklayarak adım 5.3'te oluşturulan tüm moleküler kütleleri seçin. Ardından, sağ tıklayın ve Kopyala'yı seçin. EA'nın ara çözümüne karşılık gelen diğer örneğe gidin, üzerine sağ tıklayın ve Yapıştır'ı seçin. İyon kromatogramları ve hareketlilik spektrumları otomatik olarak çıkarılacaktır.
  11. Bu ikinci numunedeki tüm analitler için tanımlama parametrelerini iki kez kontrol edin.

6. Ergot alkaloitlerinin rutin tayini için bir veri işleme yönteminin oluşturulması

  1. Yazılımı açın ve Yöntem Yönetimi sekmesine tıklayın.
  2. Analit ayarları'na tıklayın ve her EA'nın adını, tutma süresi, CCS değeri ve adım 5.4'te toplanan protonlanmış eklentilerin kütlesi ile birlikte girin. 5.9'a kadar. Bu protokolün uygulanması için varsayılan ayarlar önerilse de, her bir tanımlama noktasının toleransını gerektiği gibi değiştirin.
    NOT: Ayarlanan tolerans değerleri ne kadar yüksek olursa, teorik değerlerden daha büyük bir sapma kabul edildiğinden, yanlış pozitiflerle başa çıkma olasılığı o kadar yüksek olur. Benzer şekilde, çok katı tolerans değerleri yanlış negatiflere yol açabilir. Bu, teorik değerden sapma yalnızca cihazın performansından kaynaklandığında meydana gelir.
  3. Niceleme yöntemini daha fazla kullanım için kaydedin.

7. Örnekleme

  1. Süpermarketlerde, tercihen 1 kg'lık kaplarda, Avrupa Komisyonu20 tarafından belirlenen numune alma yönergelerini izleyerek buğday ve yulaf numuneleri alın. 1 kg'lık paketler mevcut değilse, tüm analizi tamamlamak için en az 50 g numuneye sahip olduğunuzdan emin olun.
  2. Numuneleri bir öğütücü kullanarak öğütün. Bu çalışmada, paketlerin tüm içeriğini öğütmek için bir bıçaklı öğütücü kullanıldı ve daha sonra homojenizasyon için orijinal paketlerine geri gönderildi.
    NOT: Çapraz kontaminasyonu önlemek için öğütücüyü numuneler arasında iyice temizleyin. Laboratuvar önlüğü kullanın.
  3. Homojenize edilmiş numuneleri 50 mL'lik santrifüj tüplerinde ayırın ve serin ve kuru koşullarda saklayın.

8. Numune hazırlama

  1. Doğrulama çalışmasını ardışık olmayan üç gün boyunca gerçekleştirmek için bir program hazırlayın (kurum içi tekrarlanabilirliği değerlendirmek için). Her gün için, numuneleri 225 ng / g (1.5 mL), 150 ng / g (ML) ve 75 ng / g (0.5 mL) 'de güçlendirerek üç konsantrasyon seviyesini test edin. Her seviyeyi, dokuz çivili örneği ve günde üç boş örneği temsil eden üç kopya halinde inceleyin.
    NOT: 3 doğrulama günü göz önüne alındığında, matris eşleştirilmiş kalibrasyon eğrisini hazırlamak için amaçlanan 36 boş numunenin yanı sıra toplam 8 numune gerekecektir. Protokolün tüm bu bölümü için nitril eldivenler, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlükler kullanın.
  2. 1 g numuneyi 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne tartın.
    NOT: Doğrulama etüdünü gerçekleştirirken, numuneleri tarttıktan hemen sonra, adım 1.3'te ayrıntıları verilen ilgili çalışma standardı çözeltisinden 50 μL ile güçlendirin. ve 1.5.
  3. 4 mL ekstraksiyon çözeltisi [asetonitril: 5 mM amonyum karbonat sulu çözeltisi (85:15, h / v)] ekleyin. Numuneyi 1 dakika boyunca vorteksleyin.
  4. Numuneyi 9.750 × g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
    NOT: Santrifüjün kapasitesi prosedürde sınırlayıcı bir faktör olabilir, bu nedenle aynı anda yalnızca santrifüje sığacak tam sayıda numunenin çıkarılması önerilir.
  5. Tüm süpernatanı, 150 mg temizleme sorbent (1: 1, a / a) karışımı içeren 15 mL santrifüj tüpüne aktarın. Numuneyi 1 dakika boyunca vorteksleyin.
  6. Tüpü 9.750 × g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  7. Süpernatanı toplayın ve 4 mL'lik amber cam şişeye koyun. Ekstraktı hafif bir nitrojen akışı altında buharlaştırın.
    NOT: Numuneler aynı gün analiz edilmediği takdirde -20 °C'de kuru tutulmalıdır.
  8. Numuneyi 750 μL'lik metanol:su (1:1, h/v) karışımında sulandırın.
  9. Ekstraktı 2 mL'lik bir şırıngaya aktarın ve 0.22 μm'lik bir naylon filtreden 1.5 mL'lik bir amber kromatografik şişeye süzün.
  10. Matris eşleştirilmiş kalibrasyon eğrisi için amaçlanan sekiz boş numunenin sulandırılmış ekstraktlarını 12 mL'lik amber cam bir şişede toplayın (her numune 750 μL'de yeniden süspanse edilir, bu da toplam 6 mL'lik bir hacmi temsil eder).
  11. 1.000 ng / mL'de (her ergot alkaloidi için 83.33 ng / mL) (adım 1.2) 1 mL ara çözeltiyi 2 mL'lik amber cam şişeye pipetleyin, çözücüyü hafif bir nitrojen akışı altında kurutun ve önceden toplanan boş numune ekstraktının 1 mL'sinde yeniden süspanse edin.
    NOT: 1.000 ng/mL (her EA için 83.33 ng/mL) konsantrasyondaki bu karışım, matris uyumlu kalibrasyon eğrisini hazırlamak için kullanılacaktır.
  12. On adet 2 mL'lik amber cam şişe hazırlayın ve her birine 450 μL boş numune özütü (adım 8.10) yerleştirin ve bunları 1'den 10'a kadar sayılarla işaretleyin. Her flakon, kalibrasyon eğrisinin bir noktası olacaktır.
    NOT: Bu protokolde 450 μL kullanılmıştır çünkü LC cihazının insert kullanmadan flakon içerisinde ulaşabileceği en düşük değer olmuştur. İğne şişenin içine o kadar uzağa ulaşmazsa, hacmi artırın ve sonuç olarak, her birinin 750 μL metanol:su (1/1, v:v) karışımında yeniden süspanse edildiğini göz önünde bulundurarak kaç tane ekstra boş numunenin çıkarılması gerektiğini hesaplayın.
  13. Seri seyreltme ile kalibrasyon eğrisini oluşturun. Adım 8.11'de hazırlanan karışımın 450 μL'sini aktarın. 41.67 ng/mL'lik (en yüksek kalibrasyon noktası) bir konsantrasyon elde etmek için halihazırda 450 μL boş numune özütü içeren şişe 1'e. Şişeyi 2 dakika boyunca vorteksleyin.
    NOT: Karışımın hacmi, her adımda iki kez seyreltmek için boş numune ekstraktının hacmiyle eşleşmelidir.
  14. 20.83 ng/mL'lik bir konsantrasyona (ikinci en yüksek kalibrasyon noktası) ulaşmak için 450 μL'yi flakon 1'den, halihazırda 450 μL boş numune özütü içeren flakon 2'ye aktarın.
  15. Adım 8.14'ü tekrarlayın (yani, flakon 2'den flakon 3'e vb.) ve ardından on kalibrasyon noktası elde edilene kadar devam edin. Her EA için konsantrasyon aralığı daha sonra şöyle olacaktır: 41.67, 20.83, 10.42, 5.21, 2.60, 1.30, 0.65, 0.33, 0.16 ve 0.08 ng / mL.
  16. Adım 8.11'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi 1.000 ng/mL'de (her EA için 83.33 ng/mL) standart bir karışım hazırlayın, ancak 1 mL metanol: su (1: 1, h / v) karışımı kullanın.
  17. 8.13 ila 8.15 adımlarında ayrıntılı olarak açıklandığı gibi standart bir kalibrasyon eğrisi hazırlayın, ancak seri seyreltmeler için 450 μL metanol:su (1:1, h/v) karışımı kullanın. Bu kalibrasyon eğrisi, matris etkisini, matris eşleşen kalibrasyon eğrisi ile karşılaştırarak değerlendirmek için kullanılacaktır.

9. Nicel veri işleme

  1. Adım 4.1'de açıklanan talimatları izleyerek cihazı başlatın ve çalıştırın. 4.11'e kadar. Bu protokolde kullanılan iş listesi için Şekil 2'ye bakın.
    NOT: Kalibrasyon eğrileri için çalışma listesini yazarken, bunları en düşükten en yüksek konsantrasyona kadar standart kalibrasyon eğrisinden, metanol:su (1:1, v/v) içeren bir yıkama şişesinden ve en düşükten en yüksek konsantrasyona doğru matris uyumlu kalibrasyon eğrisinden başlayarak güçlendirilmiş numunelerden önce enjekte edin.
  2. Kantitatif yazılımı açın ve TASQ Hızlı sekmesine gidin | Sol alttaki toplu ithalat .
  3. Adım 4.10'da oluşturulan klasörü seçin. tüm ham verileri içeren (iş listesine dahil edilen tüm numuneler için LC-IMS-MS analizinden sonra elde edilen bilgilerle ilgili dosyalar).
  4. Yazılıma aktarıldıktan sonra, Toplu işlemi içe aktar'ın hemen altındaki Toplu işlemi işle'ye gidin.
  5. İşlenecek numuneleri (yani, 27 çivili numune, 9 işlenmemiş numune ve her iki kalibrasyon eğrisi) ve daha önce adım 6.1'de oluşturulan veri işleme yöntemini seçin. 6.3'e kadar. Ayarlanacak farklı parametrelerin bulunduğu bir pencere açılacaktır (yani, diğerlerinin yanı sıra kromatografik tepe noktalarını değerlendirmek için entegratör türü veya dikkate alınması gereken analitik sinyal türü). Varsayılan değerler bu protokolün yürütülmesi için uygun olsa da, bu parametreleri istediğiniz gibi değiştirin.
  6. Veri işleme tamamlandıktan sonra Taramayı gözden geçir bölümüne gidin ve otomatik entegrasyonla ilgili, birbirine çok yakın olabilecek yanlış kromatografik tepe noktalarının seçimi gibi herhangi bir sorun olup olmadığını kontrol edin. Eğer öyleyse, başlangıçta nicel yöntem dosyasında belirlenen tutma süresi toleransı, CCS değerleri toleransı ve/veya kütle hatasına atıfta bulunan değerleri daraltın ve verileri yeniden işleyin. Otomatik tepe entegrasyonu hala yanlış tepe noktalarını seçiyorsa, kromatogramda Taramayı Gözden Geçir penceresinde görünen alanı seçerek tepe noktasını manuel olarak entegre edin (bunu yapmak için, bölüm 5'teki EA standartları için elde edilen analitik parametreleri dikkate alın).
    NOT: Bazı ana EA-epimer çiftleri çok benzer alıkonma sürelerine sahip olduğundan ve yazılım tarafından yanlış tanımlanabileceğinden, her bir numuneyi gözden geçirmek çok önemlidir.
  7. Tüm numuneler için tüm tepe noktaları başarıyla entegre edildiğinde, sol üst köşedeki Parti yönetimi sekmesine tıklayın ve her analizle ilişkili numune türünü belirtin: çözücü, işlenmemiş, kalite kontrol, numune veya kalibrasyon noktası. İkinci durumda, her kalibrasyon noktasını bir sayı ile bir seviyeye atayın.
  8. Aynı Parti yönetimi sekmesinde, Parti konsantrasyonu adlı alt pencereye gidin ve önceki adımda belirlenen her seviye için bir konsantrasyon değeri belirtin. Bu yapıldıktan sonra, Konsantrasyonları kaydet'e tıklayın.
  9. Partiyi Ölç'e tıklayın ve parametreleri istediğiniz gibi değiştirin (yani, kalibrasyon verilerine uyacak şekilde model, ağırlıklandırma, modelin sıfırı geçmeye zorlanıp zorlanmadığı vb.). Varsayılan değerler, 1/x olarak değiştirilen kalibrasyon eğrilerinin ağırlıklandırılması dışında bu protokolün yürütülmesi için uygundur.
    NOT: Yazılım bir seferde yalnızca bir kalibrasyon eğrisini dikkate alabildiğinden, standart ve matris eşleştirilmiş kalibrasyon eğrileri hakkında bilgi sahibi olmak için adım 9.9'u iki kez tekrarlamak gerekir. Bu protokolde, analitlerin miktar tayini için matris eşleştirilmiş kalibrasyon eğrileri kullanılmıştır, bu nedenle önce çözücü kalibrasyon eğrileri değerlendirilmiş, kalibrasyon verileri daha sonra adım 9.13'te açıklandığı gibi çıkarılmış ve son olarak, numunelerin miktar tayinini gerçekleştirmek için matris eşleştirilmiş kalibrasyon eğrileri seçilmiştir.
  10. Ergot alkaloidlerinin miktar tayini, kantifikasyon yöntemi dosyasına göre gerçekleştirildikten sonra, ekranın üst kısmındaki Kantitasyon sekmesine tıklayın.
  11. Adım 9.9'da ayarlanan varsayılan parametreler iyi bir doğrusallık ve hassasiyet sağlamıyorsa, her kalibrasyon seviyesinde yeterli hassasiyetle (%20'nin altındaki sapma) iyi bir doğrusal modele (R2 > 0,99) sahip olmak amacıyla grafiğe sağ tıklayarak bağlantı parçasını ve ağırlığı değiştirerek kalibrasyon eğrilerini ayarlayın.
    NOT: Yazılım, uygun hassasiyet sağlamayan kalibrasyon seviyelerindeki hücreleri kırmızı renkle işaretleyecektir.
  12. Bitirdikten sonra, ekranın en solundaki toplu iş klasörüne sağ tıklayın ve Rapor oluştur'u seçin. Ardından, raporu istenen formata aktarmak için Analit nicelikleme'yi seçin.

Sonuçlar

İlk olarak, burada analiz edilen her EA'nın tüm tanımlama özelliklerini (yani, tutma süresi, CCS ve kütle spektrumları) elde etmek için LC-IMS-MS cihazına çalışan standart çözeltiler enjekte edildi. Kesin kütle dışındaki tanımlama parametreleri başlangıçta bilinmediğinden, elde etme yöntemi, tüm kütle spektrumunun tam taraması ve ardından bir bbCID ile başlayan iki tarama olayına dayanıyordu. Bu çalışmaya retrospektif olarak yaklaşmanın yolu, analitler hakkında herhangi bir girdi veya önceden bilgi olmadan veri toplayan ve üreten Q-TOF yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi tarafından sağlanmaktadır. Her bir çift ana EA-epimerin tam kütlesi, numune veri işleme için nicel bir yöntem oluşturmak için kullanılacak olan diğer tanımlama özelliklerini (yani, tutma süreleri ve CCS değerleri) elde etmek için elde edilen veriler içinde arandı. Analiz sonrası elde edilen deneysel parametreler Tablo 1'de detaylandırılmıştır.

Kromatografik ayırma, Et ve Etn hariç her bir ana EA-epimer çifti için net ve iyi çözülmüş zirveler sağladı (Şekil 3). Et (6.85 dk) ve Etn'nin (6.98 dk) kromatografik piklerinin alıkonma süreleri arasındaki benzerlikler, aralarında yetersiz çözünürlük sağlamıştır, bu da hafif bir örtüşme gösterir ve sonuç olarak, alıkonma sürelerinin koşular boyunca kayabileceği düşünüldüğünde yanlış nicelemeye yol açabilir. Bununla birlikte, iyon hareketlilik spektrumlarında (Şekil 4) bu aynı molekül çiftinin temel bir ayrımı gözlenir ve her analit için ayırt edilebilir CCS değerleri elde edilir; bu nedenle, yapısal olarak benzer bir dizi bileşikle çalışırken IMS'nin uygulanmasının avantajlarını göstermek.

Her bir EA için tanımlama parametreleri oluşturulduktan sonra, numune seti, analitik metodolojilerin doğrulanması için mevcut Avrupa mevzuatına uygun olarak hazırlanmıştır20. Avrupa makamları tarafından belirlenen ML'ye dayalı olarak üç kalibrasyon seviyesi seçilmiştir: limitin kendisi (150 μg/kg), ML'nin 1,5 katı (225 μg/kg) ve ML'nin 0,5'i (75 μg/kg). Bu ML'nin 12 EA'nın toplamına karşılık geldiğini akılda tutmak çok önemlidir. Doğrulama amacıyla, makine öğrenimi için eşit bir katkı düşünüldü; bu nedenle, test edilen konsantrasyon seviyeleri, her EA için sırasıyla 12.50, 18.75 ve 6.25 μg/kg ile ilişkilendirildi. Ayrıca, matris eşleştirilmiş bir kalibrasyon eğrisi ile birlikte saf çözücüde (standart kalibrasyon eğrisi) sekiz boş numune seti ve iki kalibrasyon eğrisi hazırlandı ve aynı analitik parti içinde analiz edildi. Doğrusal aralık, 0.08 ila 41.6 ng / L konsantrasyon aralığında (her EA için enstrümantal konsantrasyon seviyeleri) yedi noktada değerlendirildi. Yöntem performansı Tablo 2'de gösterilmiştir.

İlk olarak, her bir bileşik için kalibrasyon eğrileri kantitatif yazılımda oluşturuldu ve doğrusal aralık, analit konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak tepe alanı kullanılarak değerlendirildi. Her konsantrasyon seviyesi için hassasiyet açısından 'den daha düşük bir nispi standart sapma sağlarken iyi bir doğrusal uyum (R2 > 0.99) elde etmek önemlidir. Bunu yapmak için, eğrinin ağırlığı "1/x" olarak değiştirilebilir. 2.6-41.3 ng/mL (numunelerde 1.95-31.2 g/kg) lineer aralığındaki tüm analitler için iyi bir doğrusallık gözlenmiştir; bazı analitler için doğrusal aralık, 10'un üzerinde bir sinyal-gürültü oranını korurken 0.65 ng/mL'lik bir alt sınırla daha da genişti. Şekil 5 , Econ için (a) standart ve (b) matris uyumlu kalibrasyon eğrisinin bir örneğini göstermektedir.

Standart ve matris eşleştirilmiş kalibrasyon eğrilerinin eğimleri arasındaki karşılaştırma, matristen gelen potansiyel eş elütantların analizi nasıl etkileyebileceği hakkında bilgi sağlar. Bu bozulma, sinyal bastırma/geliştirme etkisi (SSE) olarak bilinir ve her iki kalibrasyon eğrisinin eğimleri karşılaştırılarak ve aşağıdaki denklem uygulanarak değerlendirilebilir:

figure-results-1

Tablo 2'de gösterildiği gibi, SSE -# ila arasında değişmiştir, bu da matrisin varlığının analitlerin iyonlaşması üzerinde neredeyse hiçbir etkisi olmadığını gösterir; Bu nedenle, niceliklerinin belirlenmesi standart kalibrasyon eğrisi kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Daha sonra, matrisin etkisini bilerek, bir sonraki adım, ekstraksiyon işleminden sonra ilk EA'nın ne kadarının geri kazanıldığını değerlendirmek için kalibrasyon eğrileri kullanılarak, daha önce bahsedilen üç konsantrasyon seviyesinde çivili numunelerin miktarının belirlenmesinden oluşur. Gösterilen düşük SSE nedeniyle, çivili numunelerin konsantrasyonunu otomatik olarak belirlemek için kantitatif yazılımda çözücüde hazırlanan kalibrasyon eğrileri kullanılmıştır. Geri kazanımı hesaplamak için, ölçülen konsantrasyon daha sonra bu denklemi takiben teorik konsantrasyon ile karşılaştırıldı:

figure-results-2

Tüm analitler, tüm konsantrasyon seviyeleri için r-117 aralığında geri kazanım değerleri gösterdi. Bu, yöntemin, çivili numunelerdeki konsantrasyonun teorik değerlere yeterince yakın ölçümlerini sağladığı ve dolayısıyla uygun doğruluğu gösterdiği anlamına gelir. Bununla birlikte, yöntem, teorik tahkimat seviyelerine atıfta bulunarak% 43 ile% 45 arasında değişen konsantrasyon değerleri olan Etn için sınırlı bir doğruluk sergiledi. Ölçümlerin kesinliği, aynı gün içinde (RSDr, n = 3) ve tüm çalışma boyunca (RSDWR, n = 9) elde edilen her bir takviye seviyesi için geri kazanımların nispi standart sapması (RSD) hesaplanarak test edildi. Tüm değerlerin 'nin altında değiştiği göz önüne alındığında kabul edilebilir bir hassasiyet gözlenmiştir.

Son olarak, önerilen yöntemin duyarlılığını değerlendirmek için, matris eşleştirilmiş kalibrasyon eğrisine dayalı olarak LOQ'lar tahmin edildi. Bu protokolde bu değerler, teorik değerden 'nin altında bir sapma ve 10'un üzerinde bir sinyal-gürültü oranı gösteren eğrinin doğrusal aralığı içindeki en düşük konsantrasyon olarak belirlenmiştir. Tablo 2'de gösterildiği gibi, LOW'lar 0.65 ila 2.60 ng / mL (numunelerde 0.49 ila 1.95 μg / kg) arasında değişmektedir.

figure-results-3
Şekil 1: Ara ve çalışma standardı çözeltilerinin hazırlanması için şematik iş akışı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 2: Havuzlanmış tahıl numunelerinin validasyon çalışmasında LC-IMS-MS analizi için tasarlanmış iş listesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 3: Analiz edilen EA'ların üst üste binen ekstrakte edilmiş iyon kromatogramları. Kısaltmalar: EA'lar = ergot alkaloidleri; Eko = Ergocornin; Econ = Ergocorninin; Ecr = Ergokristin; Ecrn = Ergokristin; Ekr = Ergokriptin; Ekrn = Ergokryptinine; Emn = Ergometrinin; Es = Ergosin; Esn = Ergosinin; Et = Ergotamin; Etn = Ergotaminin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 4: Et ve Etn'nin ekstrakte edilmiş iyon kromatogramı (üstte) ve iyon hareketlilik spektrumları (altta). Kısaltmalar: Et = Ergotamin; Etn = Ergotaminin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 5: Econ'un kalibrasyon eğrileri. (A) Saf çözücü ve (B) matris uyumlu. Kısaltma: Econ = Ergocorninin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

AnalitlerRt (dk)CCS (Å2)[E+Y]+ (e/z)
Eko6.95231.67562.3029
Econ8.21229.96562.3029
Ecr8.61237.74610.3029
Ercn Bilişim Teknolojileri9.85235.56610.3029
Ekr8.15233.61576.3185
Ekrn (İngilizce)9.38229.93576.3185
Em3.57179.35326.1668
Emn4.48179.01326.1668
Es6.41229.29548.2872
Esn6.54226.65548.2872
Et6.85230.33582.2716
Etn6.98228.3582.2716

Tablo 1: Bu protokolde açıklanan yöntemi uygulayarak ergot alkaloidlerinin kesin olarak tanımlanması için karakterize edilmiş LC-IMS-MS parametreleri. Kısaltmalar: Rt = Kalıcılık süresi; CCS = Çarpışma kesiti; LC-IMS-MS = sıvı kromatografisi-iyon hareketliliği-kütle spektrometresi.

Kurtarma (%)Hassasiyet (%) [RSDr, (RSDWR)]
AnalitlerDoğrusallık (R2)SSE (%)0,5 MLML1,5 ML0,5 MLML1,5 MLNumunede LOQ (μg/kg)
Eko0.9937-231141111006 (15)4 (19)13 (17)0.49
Econ0.9915-121051171246 (10)7 (18)8 (14)0.49
Ecr0.9965187910711013 (19)13 (18)6 (18)0.49
Ercn Bilişim Teknolojileri0.9906-209911010410 (15)11 (10)12 (10)0.49
Ekr0.992-10106101936 (9)7 (7)10 (9)0.49
Ekrn (İngilizce)0.9925-16971181145 (11)7 (4)9 (9)0.98
Em0.9947-97279747 (8)6 (5)9 (9)0.98
Emn0.9909-328387846 (5)11 (10)7 (9)1.95
Es0.9953-16891121115 (7)8 (5)15 (8)0.98
Esn0.9971-138690813 (6)14 (12)10 (10)0.49
Et0.9953-1679888112 (15)19 (18)11 (20)0.98
Etn0.9997-14543449 (12)5 (13)12 (17)0.98

Tablo 2: Doğrusallık, matris etkisi, geri kazanım, kesinlik ve niceleme sınırları açısından EA'ların yöntem performansı. Kısaltmalar: Eco = Ergocornine; Econ = Ergocorninin; Ecr = Ergokristin; Ecrn = Ergokristin; Ergokriptin = Ekr; Ergokryptinine = Ekrn; Emn = Ergometrinin; Es = Ergosin; Esn = Ergosinin; Et = Ergotamin; Etn = Ergotaminin; LOQ = Nicelik sınırı; ML = Maksimum seviye; RSDr = tekrarlanabilirlik bağıl standart sapma; RSDWR = laboratuvar bağıl standart sapması içinde; SEE = bastırma/artırma etkisi.

Tartışma

Bu protokolün başarılı kullanımı, daha önce arpa ve buğday gibi karmaşık gıda matrislerinden EA'ları ekstrakte etmek için yeterince etkili bir ekstraksiyon çözücüsünün kullanımını uygulayan Carbonell-Rozas ve ark.17 tarafından gerçekleştirilen ekstraksiyon prosedürünün optimizasyonuna ve nispeten düşük SSE değerleri sağlayan bir temizlemeye dayanmaktadır. Ekstraksiyon çözücüsünün seçimi, analitlerin kimyasal özellikleri ve EA'ların ayrışma ve epimerizasyona karşı kararsızlığı göz önüne alındığında, aynı zamanda analize tabi tutulan matrisin bileşimi göz önüne alındığında kritik bir adımı temsil eder. Bu durumda, EA'lar (ve genel olarak mikotoksinler), asetonitril (epimerizasyonu önleyebilen protik olmayan bir çözücü) seçilen çözücü 21,22,23,24 olduğunda çok iyi verim sağlar. Ayrıca, EA'lar söz konusu olduğunda, amonyum karbonat ilavesi, bazik bir pH25 sağlayarak ekstraksiyon verimliliğini artırır. Ek olarak, düşük hacimlerde çözücü kullanılması doygunluğa26 neden olabileceğinden ve bu da zayıf geri kazanım değerlerine yansıyabileceğinden, çözücü/numune oranı dikkate alınması gereken bir şeydir. Ayrıca, yüksek çözücü hacimleri, analit çözeltilerinin daha fazla seyreltilmesi anlamına gelir, bu da bunların saptanmasını engeller ve/veya bunların belirlenmesine müdahale edebilecek matris bileşiklerinin ekstraksiyonunu destekler. Bu ekstraksiyon metodolojisindeki bir sonraki adım olan temizleme adımı, matrisin bileşimi göz önünde bulundurularak amaca uygun bir perspektiften tasarlanmalıdır. Bu, nihai olarak ekstraktların ne kadar temiz olduğunu ve matrisin analitik belirlemeyi ne kadar güçlü bir şekilde etkilediğini belirleyecektir. Bu protokolde, bir C18:Z-Sep+ karışımı (1:1, a/a), bildirilen nispeten düşük SSE tarafından yansıtıldığı gibi, dağıtıcı bir katı faz sorbenti olarak başarıyla kullanıldı. EA'ların asetonitril ile iyi ekstrakte edildiği dikkate alındığında, ekstraktta diğer zayıf veya polar olmayan ko-elutantlar da beklenebilir. Bu bağlamda, C18, geleneksel olarak genel amaçlar için kullanılan, matristen polar olmayan bileşikleri tutan bir temizleme sorbentidir, Z-Sep + ise genellikle yüksek oranda yağ veya pigment27 içeren matrisler için önerilir. Çoğu sorbentin, ayrıca yaygın olarak kullanılan birincil-ikincil amin (PSA) veya grafitleştirilmiş karbon siyahı (GCB) dahil olmak üzere, analitlerle etkileşime girebileceğini, bunların katı fazda tutulmasına ve daha sonraki bir analitik belirleme için kayıplarına neden olabileceğini not etmek önemlidir28. Analitler ve sorbentler arasındaki olası etkileşimler de temizleme adımını optimize ederken bir çalışma konusu olabilir, bu nedenle tipolojiyi veya daha da önemlisi sorbent miktarını değiştirmek optimizasyon için iyi bir başlangıç noktası olabilir. Bu protokolde, daha önce geliştirilen bir ekstraksiyon yöntemi, Etn için burada gözlemlenen gerçekliğe rağmen, önceki çalışmada elde edilen değerlerden çok farklı olmasına rağmen uygulanmıştır. Et/Etn çifti kimyasal olarak kararlı29 olarak bildirilmiş olsa da, daha önce uzun süreli depolamadan30 sonra tutarsızlıklar gözlemlenmiştir. Bu protokol, analizin yapıldığı gün kurutularak, depolanarak ve ardından yeniden askıya alınarak analitik standartların bütünlüğünü korumak için tasarlanmıştır; bununla birlikte, deney kısmına başlamadan önce EA'ların analitik standartlarının bütünlüğü kontrol edilmelidir.

Bu protokol, aynı EA'ların belirlenmesini içeren geleneksel LC-MS yaklaşımlarına kıyasla uygulanabilirliğini ve geliştirilmiş performansını göstermek için analitik platform olarak LC-IMS-MS'yi seçer. Şekil 3'te gösterildiği gibi, incelenen EA'ların kromatografik ayrımı, altı ana EA-epimer çiftinden beşi için optimaldir, bu da daha da optimize edilmiş bir kromatografik yöntemin, tepe noktalarının tam olarak ayrılmasına neden olabileceği anlamına gelir. Bununla birlikte, IMS boyutu LC'de gösterilen düşük çözünürlüğü düzeltebildiğinden, kromatografik ayrımı iyileştirmek için ekstra çaba gerekmedi. Kromatografik ayırmada azaltılmış optimizasyonun dezavantajı, başka bir boyut ekleyen ek bir ayırma aşamasının tanıtılması nedeniyle veri işlemenin artan karmaşıklığıdır. Bu protokol teorik olarak EA'ların spesifik belirlenmesi için hedeflenmiş bir yöntem olarak tasarlanmış olsa da, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresinde (HRMS) veri toplama, hedefsiz bir tarama olarak gerçekleştirilmiştir. Bu, cihazın numuneden gelen her özelliği sürekli olarak taradığı ve geriye dönük olarak EA'ların tanımlandığı ve nicelleştirildiği anlamına gelir. Bu yaklaşımın yöntemin hassasiyetini azalttığı bilinmektedir, ancak tam tersine bilinmeyen bileşiklerin tanımlanmasına izin verir. Bununla birlikte, Tablo 2'de rapor edilen LOW'lar [0.65 - 2.6 ng/mL (numunelerde 0.49 - 1.95 μg/kg)] hedeflenen edinimler yoluyla çalışan EA'ların belirlenmesi için geleneksel LC-MS yöntemleriyle bildirilenlerle karşılaştırılabilir31. Bu, IMS'nin uygulanmasının, yöntemin hassasiyetini doğrudan etkileyen, arka plan gürültüsünden daha iyi ayrım yapılmasına izin veren gelişmiş bir analitik sinyal sağladığı anlamına gelebilir. Analitik sinyalin yoğunluğunu da etkileyen çok önemli bir faktör, kaynaktaki iyonlaşmanın verimliliğine dayanır. Kaynak, esas olarak voltaj, gaz koşulları ve sıcaklık açısından en uygun koşulları sağlayamıyorsa, tüm analit molekülleri iyonize olmayacak ve tespit edilmeyecektir; bu nedenle, mutlak yoğunluk kaybına neden olur. Sonuç olarak, gelişmiş bir analitik sinyal için iyon kaynağı parametrelerinin araştırılması önerilir.

Bu protokolün amacı, EA tayinini bir vaka çalışması olarak kullanarak, gıda güvenliği analizinde LC-IMS-MS kullanmanın avantajlarını göstermektir. İyon hareketlilik spektrometrisinin sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi iş akışlarına entegrasyonu, düzenlenmiş ergot alkaloidlerinin izomerizmi göz önüne alındığında özellikle karmaşık hale gelebilen bu bileşikleri ayırmak için daha fazla hassasiyet ve daha iyi çözünürlük sağlar. Gösterildiği gibi, bu analitik platform, kromatografik piklerin epimerlerden kısmen ayrılmasının neden olduğu kromatografik zorlukların üstesinden başarıyla gelirken, aynı zamanda hedeflenmemiş edinim, hedeflenen yöntemlerle bildirilenlerle karşılaştırılabilir LOQ'lar sağladı. Kanıtlanmış performansına dayanarak, LC-IMS-MS, hedeflenmemiş yaklaşımlar kullanarak gıda kontaminantları için çoklu kalıntı metodolojileri geliştirmek için güçlü bir analitik platform olduğunu kanıtlamaktadır.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu araştırma, Consejería de Universidad, Investigación e Innovación - Junta de Andalucía (PROYEXCEL_00195) ve Generalitat Valenciana ve Avrupa Sosyal Fonu+ (CIAPOS/2022/049) tarafından verilen doktora sonrası hibe tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar, bu protokolde kullanılan analitik enstrümantasyona erişim sağladığı için Granada Üniversitesi'ndeki "Centro de Instrumentación Científica (CIC)" a teşekkür eder.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AsetonitrilVWR83640.32
Amber cam tüpler 4 mLVWR548-0052
Amber cam tüpler 12 mLVWR548-0903
Amber şişeler 1.5 mLAgilent5190-9063
Amonyum karbonatFluka9716
Analitik terazi BAS 31 Boeco4400519
Terazisi CP 323 S Sartorius23-84182
C18Supelco52604-U
Santrifüj tüpleri, 15 mLVWR525-1082
Santrifüj tüpleri, 50 mLVWR525-0155
Santrifüj Üniversal 320 RHettich1406
Pusula HyStar BrukerAcquisition software
DataAnalysisBrukerQualitative software
Elute PLUS  UHPLCBruker
EVA EC-S evaporatörVLMV830.012.12
Analiz için formik asit GR ACS, Reag. Ph EurMerck100264
Öğütücü TitanMill300Cecotec1559
MetanolVWR83638.32
Milli-Q su arıtma sistemi (18.2 M & Omega; cm)MilliporeZD5211584
Pipet uçları 1- 5 mLLabortecnic162005
Pipet uçları 100 - 1000 &mikro; LLabortecnic 1622222
Pipet uçları 5 - 200 & mikro; LLabortecnic 162001
Pippette Transferpette S değişken, DE-M 10 - 100 &mikro; LMARKA704774
Pippette Transferpette S değişken, DE-M 100 - 1000 &mikro; LMARKA704780
Pippette Transferpette S değişken, DE-M 500 - 5000 & LMARKA704782
Şırınga 2 mLVWR613-2003
Şırınga Filtresi 13 mm, 0.22 ve mikro; mPhenomenexAF-8-7707-12
TASQBrukerKantitatif yazılım
timsTOFPro2 IM-HRMSBruker
Vortex Genie 2Scientific Industries15547335
Zorbax Eclipse Plus RRHD C18 sütunu (50  x  2,1 mm, 1,8 ve mikro; m parçacık boyutu)Agilent 959757-902
Z-Sep +Supelco55299-UZirkonya bazlı sorbent
Ergot alkaloidleri< / em > <güçlü >CAS kayıt sorbenti < / güçlü >
Ergocornine (Eco)Techno SpecE178564-36-3
Ergocorninin (Econ)Techno SpecE130564-37-4
Ergocristine (Ecr)Techno SpecE180511-08-0
Ergokristinin (Ecrn)Techno SpecE188511-07-9
Ergokriptin (Ekr)Techno SpecE198511-09-1
Ergopkryptinine (Ekrn)Techno SpecE190511-10-4
Ergometrin (Em)Romer Labs"002067"60-79-7
Ergometrinin (Emn)Romer LabsLMY-090-5ML479-00-5
Ergosin (Es)Techno SpecE184561-94-4
Ergosinin (Esn)Techno SpecE194596-88-3
Ergotamin (Et)Romer Labs"002069"113-15-5
Ergotamin (Etn)Romer Labs"002075"639-81-6

Kaynaklar

  1. Kanu, A. B., Dwivedi, P., Tam, M., Matz, L., Hill, H. H. Jr Ion mobility-mass spectrometry. J Mass Spectrom. 43 (1), 1-22 (2008).
  2. Gabelica, V., et al. Recommendations for reporting ion mobility Mass spectrometry measurements. Mass Spectrom Rev. 38 (3), 291-320 (2019).
  3. Feuerstein, M. L., et al. Comparability of steroid collision cross sections using three different IM-HRMS technologies: An interplatform study. J Am Soc Mass Spectrom. 33 (10), 1951-1959 (2022).
  4. Regueiro, J., Negreira, N., Berntssen, M. H. G. Ion-mobility-derived collision cross section as an additional identification point for multiresidue screening of pesticides in fish feed. Anal Chem. 88 (22), 11169-11177 (2016).
  5. Regueiro, J., Negreira, N., Hannisdal, R., Berntssen, M. H. G. Targeted approach for qualitative screening of pesticides in salmon feed by liquid chromatography coupled to traveling-wave ion mobility/quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Food Control. 78, 116-125 (2017).
  6. Hernández-Mesa, M., Monteau, F., Le Bizec, B., Dervilly-Pinel, G. Potential of ion mobility-mass spectrometry for both targeted and non-targeted analysis of phase II steroid metabolites in urine. Anal Chim Acta: X. 1, 100006(2019).
  7. George, A. C., et al. Interplatform comparison between three ion mobility techniques for human plasma lipid collision cross sections. Anal Chim Acta. 1304, 342535(2024).
  8. Mairinger, T., Causon, T. J., Hann, S. The potential of ion mobility-mass spectrometry for non-targeted metabolomics. Curr Opin Chem Biol. 42, 9-15 (2018).
  9. Hernández-Mesa, M., Escourrou, A., Monteau, F., Le Bizec, B., Dervilly-Pinel, G. Current applications and perspectives of ion mobility spectrometry to answer chemical food safety issues. TrAC Trend Anal Chem. 94, 39-53 (2017).
  10. European, C. Commission Regulation (EU) 2023/915 of 25 April 2023 on maximum levels for certain contaminants in food and repealing Regulation (EC) No 1881/2006. Off J Eur Union. 119, 103-157 (2023).
  11. Carbonell-Rozas, L., et al. Occurrence of egot alkaloids in major and minor cereals from Northern Italy: A three harvesting years scenario. J Agricl Food Chem. 71 (42), 15821-15828 (2023).
  12. Arroyo-Manzanares, N., Gámiz-Gracia, L., García-Campaña, A. M., Diana Di Mavungu, J., De Saeger, S. Fungal Metabolites. Jean-Michel Mérillon, J. -M., Ramawat, K. G. , Springer International Publishing. (2016).
  13. van Dongen, P., de Groot, A. History of ergot alkaloids from ergotism to ergometrine. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 60 (2), 109-116 (1995).
  14. European Food Safety Authority. Human and animal dietary exposure to ergot alkaloids. EFSA J. 15 (7), e04902(2017).
  15. Nam, M., Kim, D., Kim, M. -S. Simultaneous determination of total ergot alkaloids in wheat flour by Orbitrap mass spectrometry. Food Chem. 441, 138363(2024).
  16. García-Juan, A., León, N., Armenta, S., Pardo, O. Development and validation of an analytical method for the simultaneous determination of 12 ergot, 2 tropane, and 28 pyrrolizidine alkaloids in cereal-based food by LC-MS/MS. Food Res Int. 174 (Pt 1), 113614(2023).
  17. Carbonell-Rozas, L., Mahdjoubi, C. K., Arroyo-Manzanares, N., García-Campaña, A. M., Gámiz-Gracia, L. Occurrence of ergot alkaloids in barley and wheat from Algeria. Toxins. 13 (5), 316(2021).
  18. Carbonell-Rozas, L., Gámiz-Gracia, L., Lara, F. J., García-Campaña, A. M. Determination of the main ergot alkaloids and their epimers in oat-based functional foods by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Molecules. 26 (12), 3717(2021).
  19. Carbonell-Rozas, L., et al. Ion mobility-mass spectrometry to extend analytical performance in the determination of ergot alkaloids in cereal samples. J Chromatogr A. 1682, 463502(2022).
  20. European Commission. Commission Implementing Regulation (EU) 2023/2782 of 14 December 2023 laying down the methods of sampling and analysis for the control of the levels of mycotoxins in food and repealing Regulation (EC) No 401/2006. Off J Eur Union. , (2023).
  21. Carbonell-Rozas, L., Vander Cruyssen, L., Dall'Asta, C., Leggieri, M. C., Battilani, P. Fit-for-purpose method development to determine co-occurring multiclass mycotoxins in apple and apple puree samples. Food Anal Methods. 16 (8), 1403-1412 (2023).
  22. Laouni, C., et al. Emerging mycotoxin occurrence in chicken feed and eggs from Algeria. Mycotoxin Res. 40, 447-456 (2024).
  23. Ben Hassouna, K., et al. Mycotoxin occurrence in milk and durum wheat samples from Tunisia using dispersive liquid-liquid microextraction and liquid chromatography with fluorescence detection. Toxins. 15 (11), 633(2023).
  24. Narváez, A., et al. Occurrence and exposure assessment of mycotoxins in ready-to-eat tree nut products through ultra-high performance liquid chromatography coupled with high resolution Q-orbitrap mass spectrometry. Metabolites. 10 (9), 344(2020).
  25. Arroyo-Manzanares, N., Rodríguez-Estévez, V., García-Campaña, A. M., Castellón-Rendón, E., Gámiz-Gracia, L. Determination of principal ergot alkaloids in swine feeding. J Sci Food Agric. 101 (12), 5214-5224 (2021).
  26. Pereira, V. L., Fernandes, J. O., Cunha, S. C. Comparative assessment of three cleanup procedures after QuEChERS extraction for determination of trichothecenes (type A and type B) in processed cereal-based baby foods by GC-MS. Food Chem. 182, 143-149 (2015).
  27. Tuzimski, T., Szubartowski, S. Method development for selected bisphenols analysis in sweetened condensed milk from a can and breast milk samples by HPLC-DAD and HPLC-QqQ-MS: Comparison of sorbents (Z-SEP, Z-SEP Plus, PSA, C18, chitin and EMR-lipid) for clean-up of QuEChERS extract. Molecules. 24 (11), 2093(2019).
  28. Łozowicka, B., Rutkowska, E., Jankowska, M. Influence of QuEChERS modifications on recovery and matrix effect during the multi-residue pesticide analysis in soil by GC/MS/MS and GC/ECD/NPD. Environ Sci Pollut Res. 24 (8), 7124-7138 (2017).
  29. Schummer, C., Xandonella, I., van Nieuwenhuyse, A., Moris, G. Epimerization of ergot alkaloids in feed. Heliyon. 6 (6), e04336(2020).
  30. Cherewyk, J. E., Grusie-Ogilvie, T. J., Parker, S. E., Blakley, B. R., Al-Dissi, A. M. The impact of storage temperature and time on ergot alkaloid concentrations. Toxins. 15 (8), 497(2023).
  31. Silva, Â, Mateus, A. R., Barros, S. C., Silva, A. S. Ergot alkaloids on cereals and seeds: Analytical methods, occurrence, and future perspectives. Molecules. 28 (20), 7233(2023).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Ergot Alkaloid TespitiS v Kromatografisi K tle SpektrometrisiG da G venli i AnaliziMikotoksin Kantifikasyonuarp ma Kesit AlanKromatografik Ay r mMatriksle E le tirilmi KalibrasyonQuEChERS EkstraksiyonuEpimer Ay r m
Sıvı Kromatografisi Tuzaklı İyon Hareketlilik Spektrometresi-Uçuş Süresi Kütle Spektrometresi ile Gıda Matrislerinde Düzenlenmiş Ergot Alkaloidlerinin Tespiti
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.