Yöntem makalesi

Harici yetişkin Drosophila yapılarının miktarının belirlenmesi için hızlı ve basit bir iş akışı

DOI:

10.3791/67485

⸱

8 Kasım 2024

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, San José State University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, desenlenme ve büyüme kusurlarını ölçmek için yetişkin Drosophila gözlerinin yüksek çözünürlüklü görüntülemesi için hızlı, düşük maliyetli bir iş akışı sunuyoruz. Nokta montajı, yüksek çözünürlüklü görüntü elde etme ve görüntü analizi ile numune hazırlama protokolümüzü açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila bileşik göz, morfogenezi yönlendiren moleküler mekanizmaları ve biyolojik süreçleri ortaya çıkaran hassas bir şekilde desenlenmiş bir dokudur. Genetik etkileşimleri ve gen fonksiyonlarını karakterize etmek için kullanılan, ommatidia olarak adlandırılan, tekrarlayan birim gözlerin basit bir yapısıdır. Göz mimarisini etkileyen mutasyonlar kolayca tespit edilebilir ve analiz edilebilir; Bu nedenle, bu sistem yetersiz kaynaklara sahip kurumlarda sıklıkla kullanılmaktadır. Daha fazla fenotipik analiz, kantitatif analize uygun yüksek büyütmeli görüntüler oluşturmak için genellikle bir Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) içerir. Bununla birlikte, SEM'ler pahalıdır ve maliyetli reaktifler gerektirir; Numune hazırlama günlere yayılır; Ve çoğu zaman, numune hazırlama ve cihaz bakımı için tam zamanlı personele ihtiyaç duyarlar. Bu, yetersiz kaynaklara sahip kurumlarda veya bütçe kemer sıkma sırasında faydalarını sınırlar. Entomolojide, türlerin tanımlanması ve karakterizasyonu için yüksek çözünürlüklü dijital görüntüleme teknolojisinin kullanılması yaygın bir uygulamadır. Bu makale, stratejileri birleştiren ve yetişkin Drosophila yapılarının yüksek çözünürlüklü dijital görüntülemesine ve açık yazılım ImageJ kullanılarak kantitatif analize izin veren bir yöntemi açıklamaktadır. İş akışı, kantitatif fenotipik analize uygun maliyetli ve hızlı bir yaklaşımla, yetersiz finanse edilen ve yetersiz kaynaklara sahip araştırma tesislerinin sınırlamalarını gideren hızlı ve öğrenci dostu bir alternatiftir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster, moleküler sinyal yollarını ve hücresel davranışları aydınlatmak için onlarca yıldır kullanılan güçlü bir genetik model organizmadır. Çok hücreli gelişim için gerekli olan evrimsel olarak korunmuş sinyal yollarının çoğu ilk olarak Drosophila'da tanımlanmış ve etki mekanizmaları tanımlanmıştır. İnsan hastalığıyla ilişkili tüm genlerin yaklaşık% 65-75'i Drosophila 1,2'de ortologlara sahiptir. Yetişkin Drosophila gözü, kanser 3,4, nörodejenerasyon5 ve metabolik bozukluklar6 dahil olmak üzere insan hastalıklarında rol oynayan önemli korunmuş genlerin keşfedilmesini kolaylaştıran tarafsız genetik taramalara izin veren önemli bir modeldir.

Drosophila gözü, yetişkin gözünün7 yüzeyi boyunca altıgen bir desende hassas bir şekilde dizilmiş, ommatidia adı verilen ~ 800 birim gözden oluşur. Her ommatidium, asimetrik bir yamuk içinde ayrı bir yer işgal eden sekiz fotoreseptör nöronundan oluşur. Bunlar, ışığı fotoreseptör nöronlarının ışığa duyarlı rabdomerelerine odaklamak için lens ve yalancı koni salgılayan dört nöral olmayan koni hücresi ve iki birincil pigment hücresi tarafından desteklenir. Komşu ommatidia, ikincil pigment hücreleri, üçüncül pigment hücreleri ve mekanosensoriyel kıl komplekslerinden oluşan tek bir sıra interommatidiyal kafes hücresi ile ayrılır 8,9,10.

Göz gelişimindeki bozulmalar, yetişkin gözlerde artmış veya azalmış göz boyutu, lenslerin veya kılların anormal bolluğu veya yapısı veya normalde değişmez altıgen desenin bozulduğu ve bir dizi ommatidianın artık göz yüzeyi boyunca takip edilemediği "pürüzlü bir göz" olarak görülebilir. Bu fenotipler, diseksiyon mikroskopları kullanılarak brüt doku düzeyinde skorlanabilir. Fenotiplerin ayrıntılı analizi geleneksel olarak taramalı elektron mikroskobunu ve ardından kantitatif görüntü analizini içerir11. Bununla birlikte, taramalı elektron mikroskobu pahalı enstrümantasyon, pahalı reaktifler, günlere yayılan numune hazırlama ve genellikle bakımı için tam zamanlı personel gerektirir.

figure-introduction-1
Şekil 1: Yetişkin Drosophila yapılarını görüntülemek için iş akışı. (A) Yetişkin Drosophila'yı p etanol içinde toplayın ve sabitleyin. (B) Nokta montajı ve pimlere yapıştırma yoluyla görüntüleme için numuneler hazırlayın. (C) Odak istifleme ve entegrasyon yoluyla yüksek çözünürlüklü görüntüler elde edin. (D) FIJI kullanarak görüntüleri nicelleştirin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu makale, nispeten ucuz olan, kısa bir numune hazırlama süresine sahip, 3 metrelik bir laboratuvar tezgahında kolayca kurulabilen, tehlikeli maddeler gerektirmeyen ve Drosophila araştırma laboratuvarlarına uzun ömürlü bir katkı olabilecek bir iş akışı sunmaktadır (Şekil 1). Nokta montajı, Drosophila12 gibi küçük, yumuşak gövdeli böcekleri havada kurutmak ve korumak için kullanılan entomolojik bir tekniktir. Bu yöntem, 10x ila 1.000x arasında etkili büyütmeler için mikroskop objektiflerini yüksek çözünürlüklü DSLR kameralarla birleştirmeye dayanır. Makro fotoğrafçılığın doğasında bulunan sınırlı alan derinliği, odak istifleme ile aşılır: odak düzlemi ilgilenilen örnekte hareket ederken bir dizi görüntüyü bir araya getirmek13. Bu yöntem, fenotiplerin nicelleştirilmesi için uygun yüksek çözünürlüklü görüntüler verir ve kanat, bacak, göğüs kafesi ve karın gibi diğer ilgili yapılar için kolayca uyarlanabilir. Görüntü analizi iş akışı, ücretsiz görüntü analiz programı FIJI'yi (NIH ImageJ) kullanır. Bu metodoloji, numune hazırlama, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve analizi, yetersiz kaynaklara sahip kurumlardaki lisans öğrencileri ve bilim adamları için erişilebilir hale getirir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Yetişkin Drosophila toplanması ve fiksasyonu

  1. Drosophila haçlarını ayarlayın veya suşları seçin ve bunları sinek yemi içeren şişelere yerleştirin. Sinekler gelişene ve yetişkinler kapanana kadar (25 ° C'de ~ 10-14 gün) şişeleri istenen sıcaklıkta (genellikle 25 ° C) inkübe edin.
  2. Sinekleri CO2 ile uyuşturun ve bir CO2 pedine yerleştirin.
  3. Sinekleri bir tüyle sıralayın ve istenen fenotipe sahip bireyleri seçin (örneğin, düz kanatlar). Bir kaz tüyünü 1 mL'lik bir serolojik pipetin konik ucuna sığacak şekilde keserek bir tüy sineği sıralayıcı yapın.
  4. 1 mL p etanol içeren 1.7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü hazırlayın. Seçilen sinekleri mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve buzun üzerine koyun. Mikrosantrifüj tüplerini gece boyunca 4 °C'de saklayın (Şekil 2A).
    NOT: Sinekleri etanolde 24 saatten fazla tutmayın. Sineklerin p etanol içinde uzun süreli depolanması göz ve vücut pigmenti kaybına neden olur.

2. Nokta montaj ile numune hazırlama

NOT: Drosophila , havada kurutulduğunda kırılgan hale gelen ve çöken yumuşak gövdeli böceklerdir; Bu nedenle, bu protokol, numunelerin monte edildikleri gün görüntülenmesini gerektirir. Numune kaybını önlemek için bir seferde ~ 5 sinekten oluşan küçük setler halinde çalışın. Verimliliğe bağlı olarak bir setteki numune sayısını artırın. Görüntülemeden önce daha fazla zamana ihtiyaç duyan numuneler, artan bir konsantrasyon serisi heksametildisilazan (HMDS) ile kurutulabilir14.

  1. Özel bir uç zımba kullanarak arşiv 65 lb kart stoğundan küçük üçgen uçları (7,1 mm x 2,7 mm) kesin. Dumont #5 ince uçlu forseps ile ucu (en dar %) 90°'lik bir açıyla bükerek noktaları hazırlayın (Şekil 2B).
  2. Dumont #5 ince uçlu forseps kullanarak, sinekleri mikrosantrifüj tüplerinden çıkarın (adım 1.4). Fazla etanolü çıkarmak için sinekleri tüy bırakmayan laboratuvar dokusuyla nazikçe kurulayın. Her sineği diseksiyon mikroskobu altında bir indeks kartına sol tarafına yerleştirin.
    NOT: İlgi alanı olmayan anatomik bir yapıya tutunarak sinekleri tüpten çıkarın - kafayı görüntülerken, örnekleri kanat veya bacaktan tutuyoruz. Numuneleri karın tarafından tutmayın, çünkü bu yapı sineği kart noktasına yapıştırmak için kullanılır.
  3. Deri tutkalını hazırlayın, kıvamını istenen viskoziteye ayarlayın. 1-2 damla deri yapıştırıcısını 1-2 damla deiyonize (DI) su ile karıştırın ve bir indeks kartı üzerinde bir transfer pipeti ile karıştırın. Forseps ile geniş ucundan hazırlanmış bir kart noktası alın ve az miktarda seyreltilmiş yapıştırıcıyı, tutkal-su karışımına batırarak noktanın bükülmüş ucuna yerleştirin (Şekil 2C).
    NOT: Yapıştırıcı sürülebilir olmalı ancak akıcı olmamalıdır.
  4. Noktanın bükülmüş ucunu sağ karın ön tarafına, abdominal segment 2-3 civarına uygulayın (Şekil 2C). Tutkal kurumadan önce, sineğin ön-arka ekseni noktanın bükülmüş ucuna dik olacak şekilde sineğe hafif ayarlamalar yapın.
  5. Kart ucunun geniş ucuna 3 No'lu bir montaj pimi yerleştirin (Şekil 2D) ve bir böcek sabitleme bloğuna sabitleyin (Şekil 2E). Her bir pimi veya pim sırasını karşılık gelen genotiple etiketleyin.

figure-protocol-1
Şekil 2: Numune hazırlama. (A) Yetişkin Drosophila , fenotipik belirteçlere göre sıralanır ve buz üzerinde% 70 etanol içeren etiketli mikrosantrifüj tüplerine toplanır. Sinekler gece boyunca 4 ° C'de saklanır. (B) Kağıt kart noktaları, bir çift #5 forseps kullanılarak dar ucun kartın geri kalanından 90° bükülmesiyle hazırlanır. (C) Sinekler tüplerden geri kazanılır ve kısa bir süre havada kurumaya bırakılır. Deri tutkalı, hazırlanan kart noktasının küçük, katlanmış ucuna uygulanır ve 2-3 karın segmentlerinde yetişkin sineğe yapıştırılır. (D) Numuneler, bir tanımlama etiketi ile #3 paslanmaz çelik böcek pimine monte edilir. (E) Sabitlenmiş numuneler, görüntü elde etmeye hazır olana kadar bir numune panosunda saklanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Yüksek çözünürlüklü odak istifleme görüntüleme edinimi

  1. Bir araya getirilmiş ve özelleştirilmiş, monte edilmiş ve özelleştirilmiş bir odak istifleme görüntüleme sistemi ile sinek gözlerinin yüksek çözünürlüklü fotoğraflarını elde edin.
    1. 77 mm lens adaptörü ile 20x Apo Mikroskop Objektifine bağlı 70-200 mm telefoto lensli bir DSLR Kamera Gövdesi ile fotoğraf çekin.
    2. Numunenin bir difüzör aracılığıyla bir flaşla aydınlatıldığından emin olun (Şekil 3).
    3. Bir Stackshot Denetleyicisi ve Makro Rayı kullanarak Z konumunu kontrol edin.
    4. Kamerayı, flaşı ve motorlu s'yi bağlayıntage, ağır hizmet tipi anodize alüminyum tripoda.
  2. Noktaya monte edilmiş her bir sözü, göz merceğe bakacak şekilde baş yönlendirilmiş olarak evrensel bir s'ye yerleştirin.tage. Forseps ile başı hafifçe hareket ettirerek baş pozisyonu ayarlamaları yapın.
    DİKKAT: Büyük ve hızlı ayarlamalar, kazara kafa kesilmesine neden olabilir.
  3. Kamera bir dizüstü bilgisayara bağlıyken, yazılımdaki edinme ayarlarını yapın. Şu ayarlarla örnekleri 20x büyütmede fotoğraflayın: Flaş Gücü 1/32, Deklanşör Hızı 1/200, Diyafram F2.8 ve ISO 400. Otomatik Odaklama ve Görüntü Sabitleme özelliklerinin kapalı olduğundan emin olun.
    NOT: Bu ayarlar optimum flaş aydınlatmasını, deklanşör hızını ve alan derinliğini dengeler. Diğer büyütmeler ve/veya lens kombinasyonları için ayarlanmaları gerekir.
  4. Elde edilen görüntü yığınını (10-50 görüntü) istediğiniz dosya klasörüne kaydetmek için konumu ayarlayın. Görüntüler için yeterli depolama kapasitesi olduğundan emin olun (görüntü başına ~8,5 MB).
  5. Otomatik Mesafe modunda Stackshot kontrol ünitesindeki odak yığını ayarlarını yapın.
    1. Adım boyutunu 5 μm olarak ayarlayın ve odak yığınının başlangıç ve bitiş konumlarını ayarlayarak adım sayısını hesaplayın.
    2. Başlangıç ve bitiş konumlarını belirlemek için numuneyi LiveView Modunda ve fotoğraf makinesi Otomatik Çekim Modundayken görüntüleyin.
    3. Rayı, numunenin en yakın kısmı odakta olacak şekilde hareket ettirin ( başlangıç konumunu ayarlayın), ardından ilgilenilen en uzak özelliğin odakta olduğu yere hareket ettirin ( bitiş konumunu ayarlayın).
  6. Fotoğraf makinesini Manuel Çekim Moduna geri getirin ve Stackshot kontrol ünitesinden görüntü alımını başlatın.
    NOT: Görüntü alma süresi, numunenin boyutuna bağlıdır. Büyük numuneler için gerekli alan derinliği ne kadar büyük olursa, görüntü yığınına o kadar fazla dilim dahil edilir ve bu da genel alım süresini uzatır.
  7. Dosyaları referans verilen odak istifleme yazılımında açın. Yığın | Tümünü Hizala ve Yığ (PMax).
  8. Son görüntüyü bilgisayarın sabit diskine .tif dosyası olarak kaydetmek için Dosya | Çıktı görüntüsünü kaydedin.
    NOT: Yığılmış görüntü dosyasının çözünürlüğüne ve görüntülenen örnek sayısına bağlı olarak, görüntü yedekleme için büyük harici sabit sürücüler (1 TB) gerekebilir. Bu protokolde, yığılmış görüntüler sıkıştırılmadan önce her biri yaklaşık 100 MB'dir.

figure-protocol-2
Şekil 3: Görüntü elde etme. (A) Aşağıdaki gibi etiketlenmiş parçalara sahip görüntüleme cihazı: a) DSLR Fotoğraf Makinesi Gövdesi; b) telefoto lens; c) 20x Apo Mikroskop Objektifi ve Adaptörü; d) Flaş; e) Lens ve Dome Difüzörler; f) Stackshot Kontrol Cihazı, Makro Ray ve Döner Aşama; g) Evrensel Sahne Gimbal; h) Sehpa (tripod). (B) Yerinde ışık difüzörü bulunan görüntüleme cihazı. (C) Görüntüleme için monte edilmiş numunenin yakın çekimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Yetişkin göz alanını hesaplamak için FIJI analiz iş akışı

  1. Görüntü analizi için ImageJ.net web sitesinden FIJI yazılımını15 edinin.
  2. Analiz için gözün ortalandığı ve yeterli aydınlatma ve minimum çevresel bulanıklık ile hizalandığı görüntüleri seçin, bu da kamerayla doğru hizalamayı gösterir.
  3. Görüntü ölçeğini kalibre edin.
    1. 500 μm'ye karşılık gelen 20x büyütme için ölçek çubuğu görüntüsünü indirin. Alternatif olarak, görüntü alma sırasında, aynı ayarları kullanarak bir cetvelin fotoğrafını çekin. Görüntüyü FIJI Yazılımında açın.
    2. Ölçek çubuğunun uzunluğunu ölçün (Şekil 4A). Çizgiyi tam olarak izlemek için Düz Çizgi Aracını kullanın. Analiz Et | Ölçün. Bu piksel mesafesi 500 μm'ye eşdeğerdir (Şekil 4B).
    3. Mikron başına pikselleri hesaplayın. Piksel ölçümlerini mikrometre ölçümlerine dönüştürmek için bunu kullanın.
  4. Yığılmış görüntü dosyasını FIJI'de açın (Şekil 4C).
  5. Odak alanını büyütmek için araç çubuğundan Büyüteç'i seçin. Ekranı göz ve hemen çevresindeki kafa kütikülü ile doldurmaya çalışın (Şekil 4D).
  6. Araç çubuğundan Freehand Select Tool'u seçin. En dıştaki ommatidia sırasının dış hatlarını takip ederek retina alanını mümkün olduğunca yakın bir şekilde ana hatlarıyla belirtin (Şekil 4E). Seçimin bir kısmını kaldırmak için seçenek düğmesini basılı tutun ve kaldırılacak pikselleri seçin. Seçime eklemek için seçenek ve shift düğmelerini basılı tutun ve eklenecek pikselleri seçin.
  7. Alanı hesaplamak için Analiz | Üst menüden ölçün (Şekil 4F). Alan, ortalama, minimum ve maksimum parametreleri içeren yeni bir pencere açılacaktır. Dokümantasyon ve piksellerden mikrometre ölçümlerine dönüştürme için bu verileri kopyalayıp bir elektronik tabloya yapıştırın.
  8. Uygun istatistiksel analizler yapın.

figure-protocol-3
Şekil 4: FIJI'de görüntü analizi. (A) Orijinal görüntüyü ölçeklendirin. Kalibrasyon görüntüsünü indirin ve 500 μm'lik çubuğun uzunluğunu ölçün. (B) Ölçek Ayarla işlevini kullanarak ölçeklendirmeyi ayarlayın. (C) Yığılmış görüntüyü açın. (D) Görüntüyü, göz ortalanacak ve neredeyse tam ekran olacak şekilde büyütün. (E) En dıştaki ommatidia sırası ile onu çevreleyen kütikül arasındaki sınırda gözün ana hatlarını çizmek için Serbest El Seçimi aracını kullanın. (F) Seçilen bölge içindeki alanı ölçmek, Analiz Et | Ölçün | Alan. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila gözü, doku örüntüsü, büyüme kontrolü ve hücre ölümünü incelemek için mükemmel bir model sistemdir. Yakın zamanda hücre içi pH'ın (pHi) doku büyümesini nasıl etkilediğini araştıran bir çalışma yayınladık. İlk olarak, gelişmekte olan gözde sodyum-proton değiştirici DNhe2'nin (memeli NHE1'in ortoloğu) aşırı ekspresyonunun desen bozukluklarına ve artmış proliferasyona neden olduğu bir genetik sistem kurduk16. Mayalardan memelilere kadar türler arasında daha yüksek pHi ile artan proliferasyon gözlenir17. Bununla birlikte, artan phHi ile yetişkin gözünün kontrollere kıyasla boyut olarak daha küçük göründüğünü de gözlemledik.

Drosophila gözünde yüksek DNhe2 ekspresyonunun doku boyutunu nasıl azalttığını belirlemek için erişkin göz alanının kantitatif analizi yapıldı. İlk olarak oküler insert mikroskobu kullanarak düşük çözünürlüklü görüntüler elde ettik (Şekil 5A), ancak bunlar kantitatif ölçümler yapmak için yetersiz kalitedeydi. Spesifik olarak, gözün kenarları odakta değildir, bu nedenle göz çevresinin doğru bir şekilde ölçülmesini engeller.

Erişkin Drosophila gözlerinin yüksek çözünürlüklü görüntülerinde her bir gözün alanını ölçtük (Şekil 5B). GMR>DNhe2 eksprese eden sinekler, genetik arka plan kontrolü w1118 sineklerden (ortalama 125.83 μm2) veya sürücü kontrolü GMRGAL4 heterozigot sineklerden (ortalama 142.49 μm2) önemli ölçüde daha küçük gözlere (ortalama 74.28 μm2) sahipti, bu da alanda sırasıyla% 41 ve% 48'lik bir azalmadır (Şekil 5C). Göz boyutundaki bu azalma, artan proliferasyona rağmen, yüksek hücre ölümü seviyelerine bağlanabilir.

Fagofor oluşumunu indükleyen Atg1 de dahil olmak üzere bilinen otofaji genleri, genetik etkileşim çalışmalarında kullanılmıştır (Şekil 5). Yetişkin göz boyutu üzerindeki etkiler, yüksek çözünürlüklü fotoğrafçılık ve alan analizi kullanılarak ölçüldü (Şekil 5B). GMR>DNhe2 sineklerinde, tek başına GMR>DNhe2'ye kıyasla Atg13 için heterozigot olan göz boyutu restore edildi (129.9 μm2'ye karşı 74.28 μm2) ve kontrollere benzerdi (Şekil 5C). Moleküler belirteç analizi ile birleştirildiğinde, sonuçlarımız daha yüksek pHi'de artmış otofajik hücre ölümünü desteklemektedir.

figure-results-1
Şekil 5: Azalmış otofaji ile artmış hücre içi pH ile ilişkili azalmış retina boyutunun kurtarılması. (A) Oküler uçlu mikroskop ile çekilmiş yetişkin sinek gözlerinin düşük çözünürlüklü görüntüleri. (B) Aşağıdaki genotipler için göz boyutu ölçümü için kullanılan yetişkin sinek gözlerinin yüksek çözünürlüklü görüntüleri: w1118; GMRGAL4; GMR>DNhe2; GMRGAL4; Atg13; GMR>DNhe2; Atg13. (C) Ölçülen ortalama yetişkin göz boyutları: w1118 (125.83 μm2, N = 7); GMRGAL4 (142.49 μm2, N = 9) ve GMR>DNhe2 (74.28 μm2, N = 6), GMRGAL4; Atg13 (146.4 μm2, N = 15); GMR>DNhe2; Atg13 (129.9 μm2, N = 19) ve çeyrekler arası aralıklarla medyan değerler gösterilerek gösterilir. İstatistiksel anlamlılık, Welch düzeltmesi ile eşleşmemiş t-testleri ile belirlendi. B ve C'deki veriler daha önce yayınlanmıştı18. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlarımız, numune hazırlama, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve burada açıklanan analizlerle güçlendirilmiştir. Bu yöntemler, çeşitli genotiplere sahip yetişkin Drosophila gözlerinin boyutunun kesin ve nicel bir tanımına izin verdi. Bu yaklaşımı, pH'a bağlı büyüme kontrolünün mekanizmalarını aydınlatacak diğer genetik etkileşimleri değerlendirmek için kullanmaya devam ediyoruz.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, yetişkin Drosophila yapılarının numune hazırlama, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve analizi için bir yöntem açıklıyoruz. Drosophila gözü, kanser 19, nörodejenerasyon20 ve metabolik hastalıklar21 dahil olmak üzere hastalıkların altında yatan moleküler mekanizmalar hakkında kritik bilgiler sağlayan, genetik olarak izlenebilir bir model sistemdir. Özellikle, onkojenik mutasyonlar taşıyan transgenik Drosophila'nın üretildiği kanser hastası "avatarları" üretilir ve yüksek verimli ilaç taraması için kullanılabilir22. Yetişkin gözüne odaklanmamıza rağmen, bu protokol kanat, bacak, göğüs kafesi ve karın gibi diğer ilgi alanlarını analiz etmek için uyarlanabilir.

Bu protokolün birkaç kritik adımında ince motor beceriler gereklidir. Yetişkin Drosophila'nın noktasal montaj ile numune hazırlanması sabır ve pratik gerektirir. Yeni başlayanlara, nadir veya değerli numuneler hazırlamadan önce nokta montajı alıştırması yapmalarını tavsiye ederiz. İnce motor becerilerin uygulanmasını ve dikkatli dikkati gerektirecek birkaç kritik adım vardır.

Protokoldeki ilk kritik adımlar, kart noktalarının hazırlanması ve kart noktasının karın bölgesine yapıştırılması için yapıştırıcı uygulanmasıdır (protokol adımı 2.4-2.5). Doğru miktarda yapıştırıcı uygulamak önemlidir, çünkü çok fazla uygulanırsa veya doğru kıvamda değilse hedef anatomik yapılar (yani kafa) yapıştırıcı ile kaplanabilir. Numune ayrıca, ön-arka eksen montaj pimine dik olacak şekilde uygun bir konumda yapıştırılmalıdır. İkinci kritik adım, kafanın yüksek çözünürlüklü görüntüleme için konumlandırılmasıdır (protokol adımı 3.2). Başın, göz kamera merceğine bakacak şekilde yönlendirilmesi çok önemlidir. Kafayı ayarlamak için forseps kullanılarak küçük ayarlamalar yapılır. Nazik ve artımlı hareketler çok önemlidir, çünkü büyük veya güçlü ayarlamalarla kazara kafa kesilmesi meydana gelebilir. İnce motor becerilerin gerekli olduğu ek bir adım, FIJI araç çubuğundan Serbest El Seçim Aracını kullanmaktır (protokol adımı 4.6). Burada, gözün ommatidia'nın dış sırasına mümkün olduğunca yakın bir şekilde izlemek çok önemlidir. Bu hassasiyet, gözün titiz ve tekrarlanabilir alan ölçümleri için anahtardır (Şekil 4E).

Taramalı elektron mikroskobu (SEM) gibi görüntüleme yöntemleri, dış yapıları görselleştirmek ve analiz etmek için birincil yaklaşım olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, SEM protokolleri, kullanıcının tehlikeli kimyasalları işlemesini ve kritik nokta kurutucular, püskürtme kaplama aparatları ve SEM'in kendisi dahil olmak üzere birden fazla cihazı çalıştırmasını gerektirir. Numune hazırlama birkaç gün sürer ve yoğun eğitim ve beceri gerektirir. Akademik kurumların karşılaştığı önemli bir zorluk, enstrümanın bakımına yönelik finansal yatırım ve taahhüttür ve deneyimlerimize göre, bu ekipmanın bakımı ve işletilmesi konusunda uzmanlığa sahip personel genellikle kurumsal düzeyde desteklenmemektedir. Protokolümüz, SEM'e kıyasla daha düşük çözünürlüklü görüntüleme pahasına maliyeti düşürür ve tehlikeli kimyasal maruziyeti ortadan kaldırır.

Bu çalışmada açıklanan sistem önceden monte edilmiş bir paketti, ancak modüler yapısı, tek tek bileşenlerin şirket içinde üretilen ekipmanlarla (örneğin, numune aşamaları, flaş difüzörler), alternatif markalar veya modeller veya laboratuvarda zaten mevcut olabilecek ekipmanlarla değiştirilmesiyle maliyetin düşürülmesine izin veriyor. Mikroskop objektiflerini makro kameralara bağlamak, hobiler ve profesyonel fotoğrafçılar arasında popülerlik kazanırken, farklı objektif ve lens kombinasyonları için biraz deneme yanılma gerekebilir. Burada açıklanan sistemi çoğaltmak için, sonsuzluk düzeltmeli bir mikroskop objektifi, uygun şekilde dişli bir adaptörle bir tüp merceğe (burada telefoto lens) bağlanmalıdır. Bileşenleri değiştirirken göz önünde bulundurulması gereken bir diğer husus, lensin çalışma mesafesinin kamera yuvasının, numune yuvasının ve makro odaklama rayının boyutlarıyla uyumlu olmasını sağlamaktır. Son olarak, burada seçilen odak istifleme yazılımı ticaridir, ancak ImageJ eklentileri de dahil olmak üzere birçok düşük maliyetli veya ücretsiz işlem sonrası odak istifleme çözümü mevcuttur.

Bu protokol, numune işleme tekniklerine hakim olmak için pratik gerektirse de, ayrıntılı fenotipik analiz için yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde etmek ve analiz etmek için tasarlanmıştır. Burada sunulan prosedürler, geleneksel görüntüleme metodolojilerine hızlı ve düşük maliyetli bir alternatif oluşturmaktadır. Kantitatif analiz için ücretsiz yazılım tabanlı dijital görüntüleme tekniklerini kullanarak, metodolojimize erişilebilir ve maliyetli yazılım satın alımları veya güncellemeleri gerektirmez. Görüntüleme kurulumu biraz maliyet ve çaba gerektirir, ancak bir kez kurulduktan sonra Drosophila laboratuvarlarına uzun ömürlü bir katkı olmalıdır. Bu yöntem, fenotiplerin nicelleştirilmesi için uygun yüksek çözünürlüklü görüntüler verir ve kanat, bacak, göğüs kafesi ve karın gibi diğer ilgili yapılar için kolayca uyarlanabilir. Bu metodoloji, numune hazırlama, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve analizi, yetersiz kaynaklara sahip kurumlardaki lisans öğrencileri ve bilim adamları için erişilebilir hale getirir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, tartışmalar ve destek için Grillo-Hill pHly laboratuvarı üyelerine teşekkür eder. Mükemmel teknik destek için Tim Andriese, Randy Kirschner, Kitty (Ngoc-Huong) Nguyen, Marco Parent, Jonny Shaloub ve Librado Veliz'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIH SC3GM132049 ve 1R16GM153640 ödülleri (BKGH), CSU Biyoteknoloji Fakülte-Öğrenci Araştırma Ödülü (LM ve BKGH) ve San José Eyalet Üniversitesi (FJL) Fen Fakültesi ve Biyolojik Bilimler Bölümü'nden başlangıç fonları tarafından desteklenmiştir. Bu süreçteki becerikliliği ve yardımları için Bernd Becker'e özel bir övgü gidiyor. Figürlerimiz için yüksek kaliteli simgeler sağladığı için BioIcons (https://bioicons.com/) topluluğuna ve özellikle pipet simgesi için Serviere'ye ve Şekil 1 ve Şekil 2'de kullanılan Drosophila, forseps ve masaüstü elektron mikroskobu simgeleri için DBCLS'ye teşekkür ederiz. Ayrıca, Creative Commons 4.0 lisansı (CC-BY) altında lisanslı olan Diogo Losch De Oliveira (doi.org/10.5281/zenodo.3925953) başta olmak üzere figürlerimiz için yüksek kaliteli simgeler sağladıkları için SciDraw (https://scidraw.io/) topluluğuna teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 mL serolojik pipetThermoFisher Scientific170353N
1.7 mL mikrosantrifüj tüpleriGenesee Scientific 24-282LR
20x Apo Mikroskop ObjektifMitutoyo Corp.378-804-3
Arşiv 65 lb kart stoğu Neenah, Inc.91901
Canon EF 70-200 mm USM II telefoto lensCanon3044C002
Canon EOS 6D Mark II DSLR Fotoğraf Makinesi GövdesiCanon1897C002
Difüzör KubbeMakroskopik Çözümler PA-DIF-GIM-SM
Difüzör APO HedefleriMakroskopik Çözümler mitutoyo-difüzörler
Drosophila şişeler ve tapalarGenesee Scientific 32-117BF
Dumont #5 ince uçlu forsepsFisher ScientificNC9889584
Kaz tüyleriAmazonB01CMMJI6U
Ağır Hizmet Tipi Eloksallı Alüminyum TripodGerçekten Doğru Şeyler, LLCTFA-32G
KimwipesFisher Scientific06-666Atüy bırakmayan laboratuvar
kağıdı Levenhuk M1000 Plus Dijital Fotoğraf MakinesiLevenhuk70358
No. 3 montaj pimiIndigo Instruments33414-3
Nutri-Fly Bloomington Drosophila mediaGenesee Scientific 66-113sinek gıda
Point-PunchMC Mieth İmalat, Inc.448 Detay
Vida Topuzu KelepçesiGerçekten Doğru Şeyler, LLCSK-KelepçeMakro rayını tripoda takmak için
Stackshot Controller ve Macro RailCognisys Inc.
Düşürücü Halka Adaptörü RAF Kamera763461174207Mikroskop objektifini kamera merceğine bağlamak için lens adaptörü
Titebond TutkalFranklin International5013
Yongnuo YN-24-EX Makro İkiz Lite FlaşShenzhen Yongnuo Fotoğraf Ekipmanları Co.YN-24EX
Software
Canon EOS Utility (v. 3.16.1). Canonsatın alma yazılımı
FIJINational Institutes of HealthFiji, GNU Genel Kamu Lisansı altında açık kaynak olarak yayınlanmıştır. FIJI Sürüm 2.14.0/1.54f 
GraphPad PrizmaGraphPad Yazılımı, Boston, Massachusetts ABDPrizma Sürüm 10.3.1
Zerene İstifleyici (v.1.04)Zerene Systems, LLCOdak İstifleme Yazılımı
Mitutoyo M Planı için ST3X_100_BUNDLE

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
  2. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
  3. Hodgson, J. A., Parvy, J. -P., Yu, Y., Vidal, M., Cordero, J. B. Drosophila larval models of invasive tumorigenesis for in vivo studies on tumour/peripheral host tssue interactions during cancer cachexia. Int J Mol Sci. 22 (15), 8317(2021).
  4. Lam Wong, K. K., Verheyen, E. M. Metabolic reprogramming in cancer: mechanistic insights from Drosophila. Dis Model Mech. 14 (7), dmm048934(2021).
  5. Bonini, N. M. A perspective on Drosophila genetics and its insight into human neurodegenerative disease. Front Mol Biosci. 9, e1060796(2022).
  6. Drummond-Barbosa, D., Tennessen, J. M. Reclaiming Warburg: using developmental biology to gain insight into human metabolic diseases. Development. 147 (11), dev189340(2020).
  7. Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
  8. Johnson, R. I. Hexagonal patterning of the Drosophila eye. Dev Biol. 478, 173-182 (2021).
  9. Weasner, B. P., Kumar, J. P. The early history of the eye-antennal disc of Drosophila melanogaster. Genetics. 221 (1), iyac041(2022).
  10. Pichaud, F., Casares, F. Shaping an optical dome: The size and shape of the insect compound eye. Semin Cell Dev Biol. 130, 37-44 (2022).
  11. Oster, I. I., Crang, R. E. Scanning electron microscopy of Drosophila mutant and wild type eyes. Trans Am Microsc Soc. 91 (4), 600-602 (1972).
  12. Gibb, T. J., Oseto, C. Insect collection and identification: Techniques for the field and laboratory. , Academic Press. (2019).
  13. Mertens, J., Roie, M. V., Merckx, J., Dekoninck, W. The use of low cost compact cameras with focus stacking functionality in entomological digitization projects. ZooKeys. 712, 141-154 (2017).
  14. Brown, B. V. A further chemical alternative to critical-point-drying for preparing small (or large) flies. Fly Times. 11, 10(1993).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Method. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression. eLife. 4, e03270(2015).
  17. White, K. A., Grillo-Hill, B. K., Barber, D. L. Cancer cell behaviors mediated by dysregulated pH dynamics at a glance. J Cell Sci. 130 (4), 663-669 (2017).
  18. Peralta, J., et al. Drosophila Nhe2 overexpression induces autophagic cell death. Mol Biol Cell. 35 (7), br13(2024).
  19. Munnik, C., Xaba, M. P., Malindisa, S. T., Russell, B. L., Sooklal, S. A. Drosophila melanogaster: A platform for anticancer drug discovery and personalized therapies. Front Genet. 13, 949241(2022).
  20. Nitta, Y., Sugie, A. Studies of neurodegenerative diseases using Drosophila and the development of novel approaches for their analysis. Fly. 16 (1), 275-298 (2022).
  21. Pletcher, R. C., et al. A genetic screen using the Drosophila melanogaster TRiP RNAi collection to identify metabolic enzymes required for eye development. G3: Genes|Genomes|Genetics. 9 (7), 2061-2070 (2019).
  22. Bangi, E., et al. A personalized platform identifies trametinib plus zoledronate for a patient with KRAS-mutant metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 5 (5), eaav6528(2019).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Drosophila G zFenotipik AnalizY ksek z n rl kl G r nt lemeImageJ KantifikasyonuOdak stiflemeOmmatidya l mDijital MikroskopiEntomoloji TeknikleriTaramal Elektron Mikroskobu Alternatifi

İlgili makaleler