Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kemirgenlerde Alkol Tüketiminin İki Şişe Seçenekli Ev Kafesi İçme Yöntemi Kullanılarak Modellenmesi ve Mikroyapısal Analiz

1.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67486

⸱

8 Kasım 2024

 ,  , 
1Center for Alcohol Research in Epigenetics, Department of Psychiatry, University of Illinois Chicago

Bu makalede

Özet

Bu protokol, sıçanlarda alkol tüketimini modellemek için standart bir aralıklı erişimli iki şişe seçimli ev kafesi içme paradigmasını tanımlar. Ek olarak, içme davranışının mikroyapısal analizini sağlayan bir DIY yalama algılama sistemi ile standart protokolü güçlendirmek için adım adım talimatlar sağlar.

Özet

İki şişe seçenekli evde kafes içme, kemirgenlerde etanol tüketimini incelemek için en yaygın kullanılan paradigmalardan biridir. En basit haliyle, hayvanlara, biri normal musluk suyu ve diğeri etanol içeren iki içme şişesine erişim sağlanır ve günlük alım, 24 saatlik süre boyunca şişe ağırlığındaki değişiklikle ölçülür. Sonuç olarak, bu yaklaşım özel bir laboratuvar ekipmanı gerektirmez. Bu tür bir uygulama kolaylığı, klinik öncesi alkol araştırmacıları tarafından yaygın olarak benimsenmesine en büyük katkıda bulunan şey olsa da, bu yaklaşım kullanılarak elde edilen içme verilerinin çözünürlüğü, araştırmacının şişe ağırlığını ölçme sayısı ile sınırlıdır (örneğin, günde bir kez). Bununla birlikte, genel alım, farmakolojik müdahaleler ve nöronal manipülasyonlar bağlamında içme modellerini inceleme arzusu, bireysel yalamalar düzeyinde veri elde edebilen ev kafesi yalama tespit sistemlerinin geliştirilmesine yol açmıştır. Son zamanlarda bu sistemlerden bir dizi geliştirilmiş olsa da, açık kaynaklı sistem olan LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device), satın alınabilirliği ve kullanıcı dostu olması nedeniyle bu alanda büyük ilgi görmüştür. Heyecan verici olmasına rağmen, bu sistem farelerde kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Burada, standart ve likkometre donanımlı iki şişe seçenekli evde kafes içme için uygun prosedürleri gözden geçiriyoruz. Ayrıca, daha büyük kafes boyutuna uyum sağlamak için donanım modifikasyonları ve standart kullanıma hazır içme şişeleriyle uyumlu, yeniden tasarlanmış bir 3D baskılı şişe tutucu da dahil olmak üzere, LIQ HD sistemini farelere uyarlamak için yöntemler sunuyoruz. Bu yaklaşımı kullanarak, araştırmacılar birçok sıçanda alım seviyelerine paralel olarak günlük içme modellerini inceleyebilir ve böylece ek kaynaklara minimum yatırımla elde edilen verilerin çözünürlüğünü artırabilirler. Bu yöntemler, araştırmacılara, kesin deneysel ihtiyaçlarına bağlı olarak alkol içmenin altında yatan nörobiyolojik mekanizmaları sorgulamak için standart şişeler veya likkometre donanımlı bir cihaz kullanma esnekliği sağlar.

Giriş

Orta düzeyde alkol kullanımı tarihsel olarak orta düzeyde sağlık yararları ile ilişkilendirilmiş olsa da, son zamanlarda yapılan büyük ölçekli kapsamlı çalışmalar, hiçbir miktarda alkol tüketiminin güvenli olmadığını ortaya koymuştur1,2. Aslında, alkol kullanımı küresel olarak ölüm ve sakatlık için 7. önde gelen risk faktörüdür1 ve az miktarda alkol içen bireylerin kanser, bulaşıcı hastalıklar ve yaralanma riski artar1,3. Amerika Birleşik Devletleri'nde alkol kullanımından kaynaklanan ölümler 2016 ile 2021 yılları arasında neredeyse %30 arttı4. Daha da önemlisi, ölüm ve sakatlık riski, artan tüketim1 ile monoton olarak artar.

İnsanlarda yapılan çalışmalar, alkol kullanımı ve kötüye kullanımının nörobiyolojisi hakkında değerli bilgiler sağlamış olsa da, hayvan modelleri tarafından sağlanan deneysel kontrol, içme davranışının altında yatan mekanizmaların ve ağır içme riskinin derinlemesine anlaşılması için çok önemlidir. Bu modeller aynı zamanda kontrolsüz tüketimi azaltmayı amaçlayan tedavilerin geliştirilmesi için değerli araçlardır. İki şişe seçenekli ev kafesi içme, kemirgenlerde alkol tüketimini incelemek için en yaygın kullanılan klinik öncesi paradigmalardan biridir. Bu, büyük ölçüde, özel araştırma ekipmanına veya karmaşık analizlere ihtiyaç duymadan toplam gönüllü alkol içme ve tercihinin ölçülmesine izin verdiği için uygulama kolaylığından kaynaklanmaktadır. Bu yaklaşımı kullanarak, araştırmacılar bir içme seansının başından sonuna kadar şişe ağırlığındaki değişimi hesaplayarak istedikleri aralıklarla (örneğin saatler, günler, haftalar) ölçümler toplayabilirler. Bu temel yöntemdeki varyasyonlar, hem kısa hem de uzun süreler boyunca düşük ila orta ila aşırı alkol alımını kolaylaştırmak için alandaki birçok kişi tarafından kullanılmıştır. Örneğin, hem farelerde düşük ve orta düzeyde alkol alımını kolaylaştırmak için sürekli ve aralıklı iki şişe seçim prosedürleri kullanılmıştır5 ve rats6,7,8. Aynı paradigmalar, alkol tercih eden suşlarda yüksek düzeyde alımı teşvik edebilir7,9. Alternatif olarak, karanlık döngünün başlamasından yaklaşık 2 saat sonra başlayarak alkol erişimini günde 4-3 saat ile sınırlayan bu yöntemin bir uyarlamasının, farelerde aşırı içmeye neden olduğu gösterilmiştir (yani, Karanlıkta İçme)10,11. Bu yöntemlerin ek varyasyonları, yoksunluk sırasında gönüllü alkol içmenin artışını incelemek için alkol bağımlılığını kolaylaştıran yöntemlerle (yani, kronik aralıklı etanol buharına maruz kalma) birlikte kullanılmıştır12,13,14,15,16,17,18,19.

Alan tarafından yaygın olarak benimsenmesine rağmen, şişe ağırlığındaki değişiklikle alkol alımını ölçmenin standart yaklaşımı, içme seansı başına toplam tüketime göre çözünürlük açısından sınırlıdır. Sonuç olarak, bu yaklaşım, alkol kullanım bozukluğunun (AUD) hem riskini hem de şiddetini etkilediği iyi bilinen içme alışkanlıklarını yakalayamaz)20,21,22. Gerçekten de, bir bireyin zaman içindeki ortalama alımı, her biri nispeten düşük tüketimle ilişkili birkaç ağır içme olayının veya birçok içme bölümünün bir sonucu olabilir ve tüketim içme seansı başına toplam alım olarak ölçüldüğünde bu nüanslar tespit edilmez. Daha da önemlisi, sağlıklı kontrollere göre AUD'li bireylerde büyük içme nöbetleri (yani yutkunma) ile ilişkili önemli ölçüde daha fazla içme olayı gözlenmiştir23 ve insan olmayan primatlardaki veriler, içme geçmişlerinin erken dönemlerinde büyük içme nöbetlerini içeren bir alkol tüketimi modeli oluşturan bireylerin AUD22 için önemli risk altında olduğunu göstermektedir. Ayrıca, büyük tüketim nöbetleri içeren içme atakları, AUD tanısından bağımsız olarak morbidite ve mortalite riskini önemli ölçüde artırır21. Toplamda, bu veriler, klinik öncesi modellerde genel alım seviyelerine ek olarak içme kalıplarının incelenmesine olan ilginin artmasına yol açmış ve bireysel yalamalar düzeyinde içme verilerini yakalayabilen çeşitli karmaşıklıkta bir dizi sistemin geliştirilmesine yol açmıştır.

Bunlardan ilki, farelerde24'te kullanılmak üzere tasarlanmış fotobeam yalama algılama ile donatılmış iki şişeli bir sistemin geliştirilmesiydi. Bu sistem daha sonra ayrı bir grup tarafından rats25'te kullanılmak üzere uyarlandı. O zamandan bu yana, bu temanın varyasyonları, sosyal olarak barındırılan bireysel hayvanların yalama tespitine izin veren özel kemirgen barınağı26 içinde yer alan benzer sistemler geliştirmek için kullanılmıştır27,28 ve hem beslenme hem de içme davranışını yakalayan29. Bunlar arasında, LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home cage Device)30, Godnyuck ve ark.24 tarafından geliştirilen sistemin uygulama kolaylığı ve satın alınabilirliğine paralel olarak farelerde kullanım için bir sistem sunmasıyla büyük ilgi gördü. Bu sistem, foto ışın algılama sistemi kullanılarak sağlanan yudumlayıcı yaklaşımı veya etkileşim gibi dolaylı önlemlerin aksine, dil ile iletken metal yudum borusu arasındaki teması doğrudan algılamak için kapasitif algılamayı kullanır. Yazarlar, kapasitif algılama sistemlerinin, yalama tespitinde önemli ölçüde daha fazla hassasiyet ve hassasiyet sağladığını ve yalama sayısı ile şişe ağırlığındaki değişiklik arasında fotobeam algılamadan daha güçlü korelasyonlar ürettiğini gösteren veriler sunmaktadır. Yazarlar ayrıca, bu sistemi, genel günlük alım30 ölçümlerine ek olarak alkol içme mikro yapısı önlemlerini yakalamak için sürekli erişimli iki şişe seçimli ev kafesi içme paradigması ile birlikte kullanma becerisini göstermektedir.

Burada, standart bir yaklaşım kullanarak iki şişe seçimli ev kafesinde alkol içme prosedürlerinin yanı sıra yalama tespitini sağlayan yöntemleri açıklıyoruz (Şekil 1). Ayrıca, daha büyük kafes boyutlarına uyum sağlamak için donanım modifikasyonları ve standart kullanıma hazır şişelerle uyumlu yeniden tasarlanmış bir 3D baskılı şişe tutucu içeren, sıçanlarda kullanım için LIQ HD30'un bir uyarlaması olan LIQ HDR'yi oluşturmak ve uygulamak için yöntemler sunuyoruz. Bu yöntemler, araştırmacılara deneysel kaynaklarına ve veri toplama ihtiyaçlarına bağlı olarak standart veya likkometre donanımlı bir yaklaşım kullanma esnekliği sağlar.

Aşağıda, Simms et al.7'den uyarlanan aralıklı erişimli iki şişe seçenekli içme prosedürünü kullanarak evde kafes içme işlemini yakalamak için gerekli malzemelerin bir açıklaması ve adım adım talimatlar bulunmaktadır. Bu prosedürde, sıçanlara haftanın 7 günü iki içme şişesine 24 saat erişim sağlanır. Pazartesi, çarşamba ve cuma günleri (MWF), sıçanlara su içeren bir şişe (H2O) ve etanol (EtOH) içeren başka bir şişe verilir. Bu şişeler Salı, Perşembe ve Cumartesi günleri (TRS) çıkarılır ve iki şişe su ile değiştirilir. Fareler cumartesi ve pazar günleri aynı iki şişe sudan içerler. Bu yöntemlerin, istenirse alternatif etanol erişim programları (örneğin, sürekli, tıkınırcasına vb.) için kolayca ayarlanabileceğini unutmayın. Standart ve likkometre donanımlı yaklaşımlar için ayrı talimatlar verilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm temsili veriler, University of Illinois Chicago Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin onayıyla ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzları'na uygun olarak, tekli barındurulan yetişkin Long-Evans sıçanlar kullanılarak toplanmıştır. Her deneğin sıvı tüketimini doğru şekilde izleyebilmek için tekli barındurma gereklidir. Varışta P50-80 günlerinde olan yetişkin erkek (n = 38) ve dişi (n = 22) Long-Evans sıçanların, deney başlamadan önce bir hafta boyunca vivaryuma adapte olmalarına izin verilmiştir. Aksi belirtilmedikçe, sıçanların standart yeme (Teklad 7912, Envigo) ve suya ad libitum erişimi vardı.

1. Deney öncesi hazırlık

  1. İçme şişelerini H2O veya EtOH olarak etiketleyin. Ardından, her bir sıçan için benzersiz bir tanımlayıcı ile MWF için bir H2O ve bir EtOH şişesi, TRS için ise iki H2O şişesi etiketleyin.
    NOT: Şişe değişimi sırasında olası hataları önlemeye yardımcı olmak için H2O ve EtOH şişelerini ayırt etmek amacıyla isteğe bağlı olarak farklı renklerde bantlar kullanın.
  2. Deney başlangıç tarihinden 1 gün önce H2O şişelerini içme suyuyla doldurun. Deney başlangıç tarihinden 1 gün önce 190 proof EtOH ile içme suyunu birleştirerek (%20 v/v) EtOH çözeltisini hazırlayın.
    UYARI: Denatüre EtOH zehirli olduğundan, kullanılan EtOH'nin denatüre edilmemiş olması kritik öneme sahiptir.
  3. Deneye katılan sıçanlarla aynı rafta boş bir kafes hazırlayın. Bu kafes, dökülme miktarını hesaplamak için kullanılacaktır.
  4. Kullanılıyorsa kafesleri LIQ HDR sistemi ile donatın (bkz. adım 3, Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5, Şekil 6 ve Ek Şekil 1).
  5. Çalışma başlamadan önce şişe değişimi için günün kesin saatini belirleyin. 24 saatlik alımın doğru bir ölçümünü elde etmek için şişeler her gün aynı saatte değiştirilmelidir.
    NOT: Önceki araştırmalar, kemirgenlerin tüketimin en yüksek düzeyini karanlık döngüsünün başlangıcından kısa süre sonra sergilediğini göstermiştir10,31. Bu nedenle, bu oldukça aktif dönemdeki alımı yakalamak için (binge-benzeri içimi yakalamak için bkz. adım 2.3.1), şişe değişiminin ışıklar kapatıldıktan 30-60 dk sonra yapılması önerilir. Işık-karanlık döngüsünü bozmadan görselleştirme sağlamak için şişe değişimi sırasında kırmızı lambalar kullanın.

2. Günlük prosedürler ve bakım

  1. Deneyin birinci gününde şunları yapın.
    1. Standart su şişelerini kafeslerden çıkarın.
    2. İsteğe bağlı: Sıçratma kafesi tarafından düzeltilemeyen dökülmelere yol açabilen, sıçanların yiyecek ararken kafes üstünü sıklıkla sarsması durumuna karşı, kafes içinde yem kapları kullanılarak bu sorun giderilebilir. Kullanılacaksa, yiyecekleri şu an kafes üstünden kaldırın, kafesin içine bir yem kabı ekleyin ve içini yemle doldurun. Sıçana ayrılan taban alanının, sıçan kafesinin boyutu ve yem kabının boyutu temelinde kurum kılavuzlarına hala uygun olduğundan emin olun.
    3. Uygun olduğu durumlarda, bakım ve yetiştirme personeline, deney süresince yiyecek ve suyun araştırma personeli tarafından sağlanacağını bildirin.
    4. Kafes değişimleri veri toplama sürecini bozabilir. Kafes değişimlerini, vücut ağırlığı ölçümlerinin alınmasıyla eş zamanlı olarak gerçekleştirin. Bunu yapmayı tercih eden araştırmacılar, bakım ve yetiştirme personelini buna göre bilgilendirmelidir.
  2. Sonraki günlerde, aşağıda belirtilen prosedürleri izleyin.
    NOT: Kafeslerin ve şişelerin herhangi bir hareketinin dökülmeye neden olabileceğini unutmayın. Bu nedenle, hareketlerde nazik olmak ve şişelerin sıçratma kafesine uygulanması ve çıkarılması için sıçan kafeslerinde kullanılan yöntemlerin aynısını kullanmak önemlidir.
    1. Şişe değişim saatinden önce odaya girin, aşağıdaki adımları gerçekleştirmek için yeterli zaman olduğundan emin olun ve uygun seans başlangıç saatinde yeni şişeleri kafeslerin üzerine yerleştirin.
    2. Filtre kapaklarını kafeslerden çıkarın. MWF ise adım 2.2.3'e geçin. TRS ise adım 2.2.4'e geçin.
    3. Pazartesi, Çarşamba ve Cuma günleri TRS şişelerini kafes üstlerinden çıkarın. MWF şişelerini (bir EtOH ve bir H2O) tartın. Bugünün içme seansı için şişenin başlangıç ağırlığını kaydedin. Gerekiyorsa kafes üstüne veya yem kaplarına ek yiyecek sağlayın. Belirlenen seans başlangıç saatinde, sıçanların şişe etiketini kemirmemesi için bant kısmı yukarı bakacak şekilde şişeleri her sıçanın kafes üstüne yerleştirin.
      NOT: Genellikle TRS için su tüketimi kaydedilmez veya raporlanmaz, ancak araştırmacılar isterlerse aşağıda adım 2.2.3 ve adım 2.2.4'te açıklandığı gibi şişe başlangıç ve bitiş ağırlıklarını alarak bu verileri isteğe bağlı olarak toplayabilirler. Tüketim verilerini farkında olmadan saptırabilecek potansiyel bir taraf tercihinin gelişmesini önlemek için, EtOH şişesinin tarafı her içme seansından sonra değiştirilmelidir.
      1. İsteğe bağlı: Önceki çalışmalar, birçok sıçanın içme seansının başlangıcında aşırı içme (binge-like drinking) sergilediğini göstermiştir8,32,33. Bu süre zarfındaki aşırı içmeyi kaydeden çoğu araştırmacı, içme seansının ilk 30-60 dakikasındaki alımı raporlamaktadır. Bu potansiyel aşırı içme atağı sırasındaki alım verilerini elde etmek için aşağıdaki adımları izleyin.
      2. Şişeler son kafese uygulandıktan sonra bir zamanlayıcı ayarlayın. Zamanlanmış süre boyunca odadan ayrılın ve rahatsız etmeyin.
      3. Zamanlayıcı çaldığında odaya tekrar girin. EtOH ve H2O şişelerini çıkarın ve şişe ağırlıklarını kaydedin. EtOH ve H2O şişelerini kafeslere geri takın.
        NOT: Yalama tespiti (lick detection) için donatılmış bir sistem kullanıldığında, aşırı içme ataklarını yakalamak için bu adıma gerek yoktur.
    4. Salı, Perşembe ve Cumartesi günleri, başlangıç saatinden 24 saat sonrasına tekabül eden belirlenen seans bitiş saatinde MWF şişelerini kafeslerden çıkarın. Her şişeyi tartın ve MWF içme seansı için şişe bitiş ağırlığını kaydedin. Her sıçanın vücut ağırlığını ölçün ve kaydedin. Gerekiyorsa kafes üstüne veya yem kaplarına ek yiyecek sağlayın. TRS H2O şişelerini, sıçanların şişe etiketini kemirmemesi için bant kısmı yukarı bakacak şekilde her sıçanın kafes üstüne yerleştirin.
    5. Filtre kapaklarını kafeslere geri takın ve hayvan odasından ayrılın.
      NOT: Buharlaşmayı önlemek için EtOH şişesi emzikleri isteğe bağlı olarak kapatılabilir. Kafes değişimleri araştırma personeli tarafından yapılıyorsa, bu görevi yerine getirmek için TRS görevleri sırasında haftada 1 gün belirleyin. Vücut ağırlığı alındıktan sonra her sıçanı temiz bir kafese yerleştirin.
  3. Şişeleri yıkayın ve sıvıları, kurumun hayvan bakımı ve yetiştirme prosedürlerine uygun olarak düzenli haftalık veya iki haftalık periyotlarla yenileyin. Bu görevleri içme seanslarını bölmeyecek şekilde gerçekleştirmeye dikkat edin. Örneğin, TRS H2O şişeleri MWF gününde çıkarıldıktan sonra yıkanabilir ve yeniden doldurulabilir. Benzer şekilde, MWF H2O ve EtOH şişeleri TRS gününde çıkarıldıktan sonra yıkanabilir ve yeniden doldurulabilir.

3. İki şişeli seçim deneyleri sırasında yalama tespiti

NOT: Yüksek çözünürlüklü içme verileri elde etmek isteyen araştırmacılar, şişelere yalama tespit özellikleri ekleyerek yukarıdaki prosedürü modifiye edebilirler. LIQ HD30, farelerde bu tür veri toplama işlemlerine olanak tanıyan düşük maliyetli, kendi başına yap (DIY) bir sistemdir. Aşağıda belirtilen prosedürler, LIQ HD'nin sıçanlarda kullanımı için gerekli olan modifikasyonları (LIQ HDR olarak adlandırılır) tanımlamaktadır. 18 sıçana kadar iki şişeli seçim verilerini toplayabilen bir yalama tespit sistemi kurmak için gerekli olan tüm ticari ve özel 3D baskı parçaların listesi için Materyal Tablosuna bakınız. 3D baskı .stl dosyaları ve talimatlar yazarın web sitesinde (www.ejgloverlab.com/3dprints) bulunabilir.

  1. Kapasitif sensör ünitelerinin kurulumu
    NOT: Her bir LIQ HDR sistemi, 18 tek başına barındırılan sıçana karşılık gelen 36 şişeden yalama verilerini paralel olarak toplayan üç kapasitif sensör ünitesinden oluşur. Her sensör ünitesi, bir diferansiyel I2C iletişim çıkış kartı ve her bir yalama ölçer için renk kodlu altı çift 2 pinli kablo aracılığıyla altı ayrı kafesteki yalama ölçerlere bağlanacak olan bir adet 12 tuşlu kapasitif sensör kartı,Şekil 2A).
    1. Her üç kapasitif sensör ünitesinin inşası için gerekli malzemeleri, gösterildiği üzere toplayın Şekil 2Bve gerekli lehimleme aletleri ile birlikte.
    2. Sensör ünitesi A'nın kurulumuna başlamak için, 2 pinli dişi konnektör kablosunu 7 inç uzunluğundaki kırmızı ısı ile daralan makaronla kaplayın; kablonun kırmızı ve siyah uçlarını sensör kartı üzerindeki 0 ve 1 numaralı pinlere yerleştirin (Şekil 2C-1), ve yerine lehimleyin (Şekil 2C-2). Kabloların üst üste binerek kayıt işlemini potansiyel olarak aksatmaması ve kafeslerin vivaryumda soldan sağa doğru sayısal sırayla düzenlenebilmesi için, kablonun gösterildiği gibi sensör kartının ön kısmında olduğundan emin olun (bkz. adım 3.6 ve Şekil 6).
    3. Beş kabloyu daha belirgin renkli ısı ile daralan makaronlarla kaplayın ve gösterildiği gibi 2-11 numaralı pinlere lehimleyin (Şekil 2C-3). Tüm kırmızı kabloların, sol taraftaki tüm şişelere bağlanacak olan çift numaralı pinlere; tüm siyah kabloların ise sağ taraftaki tüm şişelere bağlanacak olan tek numaralı pinlere lehimlendiğinden emin olun.
    4. Koruma amacıyla tüm lehim bağlantı noktalarını her yönden sıcak silikonla kaplayın (Şekil 2C-4). Konnektörleri sayısal sırayla etiketleyerek her bir yalama ölçer (lickometer) için benzersiz bir kimlik (ID) tanımlayın (Şekil 2C-4).
    5. Sensör ünitesi A'yı monte etmek için, sensör kartı A'yı 50 mm'lik 4 pinli bir kablo ile bir iletişim breakout EndPoint'ine bağlayın ve ardından EndPoint'i 100 mm'lik 4 pinli bir kablo ile 5V-3V seviye dönüştürücünün 3,3 V çıkışına bağlayın (Şekil 2D-1). Hem sensör kartı hem de iletişim dağıtım kartı iki adet özdeş 4 pinli konnektöre sahip olsa da, kabloların tam olarak gösterildiği şekilde olduğundan emin olmak önemlidir (Şekil 2D-1 ve Şekil 2F) 3B yazıcıyla üretilmiş sensör kasalarını ve önerilen vivaryum kurulumunu kullanmak için (bkz. adım 3.6 ve Şekil 6). Sensör ünitesini A, 3B yazıcıyla basılmış kasanın içine yerleştirin (Şekil 2D-2). Seviye kaydırıcı kablosunu sıkıştırmamaya dikkat ederek üst kısmı nazikçe kapatın (Şekil 2D-3).
    6. I'yı değiştirin2jumper telini belirtildiği gibi ADDR pininden 3Vo veya SDA pinine lehimleyerek B ve C sensör kartlarının C adreslerini belirleyin (Şekil 2E).
    7. Altı adet renk kodlu dişi konnektör kablosunu, board A için kullanılanla aynı sırayı takip ederek sensör board B ve C'ye lehimleyin. Her konnektörü ilgili lickometer kimlik numarasıyla etiketleyin. Board B'yi iletişim dağıtım noktası MidPoint'e ve C'yi 50 mm'lik 4 pinli kablolarla bir EndPoint'e bağlayın (Şekil 2F).
    8. B ve C sensör ünitelerini ilgili 3D yazıcıyla basılmış kutularına yerleştirin. Sensör kurulumunu tamamlamak için üç sensör ünitesini de Ethernet kabloları ile birbirine seri bağlayın (Şekil 2G).
  2. Mikrokontrolcü arayüzünün kurulumu
    NOT: LIQ HDR mikrodenetleyici arayüzü (Ek Şekil 1A) LIQ HD için açıklananla aynıdır30 çok küçük modifikasyonlarla. Aşağıda özetlenen prosedürler, adım 3.2.6 ve 3.2.8'de açıklanan modifikasyonlarla birlikte arayüzü kurmak için gerekli adımlara genel bir bakış sunmaktadır. Araştırmacıların, daha ayrıntılı adım adım talimatlar için orijinal protokole ve yazarın GitHub sayfasında sunulan video eğitimine başvurması önerilir30.
    1. Mikrokontrolcü arayüzünü oluşturmak için gerekli malzemeleri ve lehimleme araçlarını toplayın (Ek Şekil 1B). Dokunmatik kalkanın arka tarafında (Ek Şekil 1C-1), arka ışık lehim pedleri arasında bir lehim köprüsü oluşturun (Ek Şekil 1C-2).
    2. Veri günlükleme shield'ının arka yüzünde, CS pininin jumper ped yolunu kesin (Ek Şekil 1D-1). Veri kaydedicinin ön yüzünde, CS pininden 7 numaralı pine kısa bir jumper kablo lehimleyin (Ek Şekil 1D-2).
    3. Shield istifleme başlıklarını monte etmek için, önce bunları dokunmatik ekran shield'ının arkasına istifleyin (Ek Şekil 1E-1). Veri kaydediciyi dokunmatik ekrana üst üste yerleştirin, sabitlemek için bant kullanın ve tüm başlık pinlerini veri kaydediciye lehimleyin (Ek Şekil 1E-2). Ardından dokunmatik ekranı çıkarın.
    4. Kalan 2 x 3 pinli başlığı mikrodenetleyiciye takın (Ek Şekil 1F-1), ardından header pinlerini lehimlemeden önce veri kaydediciyi mikrodenetleyicinin üzerine yerleştirin (Ek Şekil 1F-2).
    5. Düğme pili veri kaydediciye yerleştirin (Ek Şekil 1G-1). Dokunmatik ekranı veri kaydedicinin üzerine yerleştirin (Ek Şekil 1G-1). microSD kartı, adaptörüyle birlikte veri kaydediciye yerleştirin (Ek Şekil 1G-2).
    6. Ek topraklama telini hazırlamak için, bir ara bağlantı telinden bir erkek konnektörü kesin ve ucunu yaklaşık 1/4 inç (~6 mm) boyunca soyun.Ek Şekil 1H-1). Soyulmuş tek damarlı katı telin bir ucunu ara bağlantı telini lehimleyin ve lehim noktasını ısı ile daralan makaronla kaplayın (Ek Şekil 1H-2).
    7. 4 pinli jumper kabloları ve ekstra topraklama kablosunu mikrodenetleyiciye takın (Siyah - GND, Kırmızı - 5V, Sarı - pin #21, Mavi - pin #20, Ek Şekil 1I-1). Bağlantıları sıcak silikonla sabitleyin (Ek Şekil 1I-2). İsteğe bağlı olarak, jumper kabloları ısı ile daralan makaronla sarın (Ek Şekil 1I-2).
    8. Tamamen monte edilmiş mikrodenetleyici arayüzünü, 4 pinli jumper kablolar ve topraklama kablosu üstteki açıklıktan geçecek şekilde 3 boyutlu yazıcıyla basılmış kasaya yerleştirin (Ek Şekil 1J).
    9. Mikrokontrolcü arayüz yazılımı kurulumu için orijinal protokolü izleyin30.
  3. LIQ HDR yalama ölçerlerin yapımı
    NOT: Şişeleri tutan özel 3D baskı, 8 mm emici uç boru çapına sahip standart bir kemirgen içme şişesi ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır (bakınız Materyaller Tablosu, Şekil 3A). Bu şişe tutucu, küçük modifikasyonlarla veya hiç modifikasyon yapılmadan benzer şişeler ve emici tüplerle kullanıma kolayca uyarlanabilir.
    1. Bir adet lickometre oluşturmak için gerekli olan malzemeleri, 3D baskıları ve lehimleme araçlarını, gösterildiği üzere toplayın Şekil 3BHer bir LIQ HDR sisteminin 36 şişe için maksimum 18 yalama ölçer (lickometer) kapasitesine sahip olduğunu unutmayın.
    2. Erkek konnektör kablosunu uzatmak için, hem kablonun her iki ucunu hem de uzatma kablosunun siyah ve kırmızı tellerini yaklaşık 1/4 inç uzunluğunda soyun (Şekil 3C-1).
    3. Uzatma kablolarını konnektör kablosuna lehimleyin (Şekil 3C-2) ve lehim bağlantılarını ısı ile daralan makaronla kaplayın (Şekil 3C-3). Erkek konnektör kablosunu, sensör ünitesindeki karşılık gelen dişi konnektör kablosuyla renk uyumlu olan ısı ile daralan makaronla kaplayın (Şekil 3C-4).
    4. sensör kartı kablolamasıyla tutarlı olması için (Şekil 2), kırmızı ve siyah kabloları sırasıyla şişe tutucunun sol ve sağ dahili kablo geçişlerinden geçirin (Şekil 3D-1).
    5. Her bir teli 1'in en uç kısmına lehimleyin ¾ inç iletken bakır bant (Şekil 3D-2) ve bakır bantları ikiye katlayın (Şekil 3D-3).
    6. Bakır bandı soyun ve bir pens yardımıyla dikkatlice emici destek aparatının içine yerleştirin (Şekil 3E-1) ardından, sipper braketinin iç duvarlarına sıkıca yapıştırmadan önce (Şekil 3E-2). Bakır bandın lehim tarafının, belirtildiği gibi şişe tutucunun orta hattına daha yakın olan duvara yapıştırıldığından emin olun (Şekil 3E-2). Bandı duvara sıkıca bastırmak ve braketi hazırlamak için braketin içinden bir emici tüp itin.
    7. Yapışkanlığı daha düşük olan ve soyulma eğilimi gösteren bakır bandın lehim tarafını güçlendirmek için, lehim bağlantı noktasına bir miktar sıcak silikon uygulayın (Şekil 3E-3). Yapıştırıcıyı, hem bakır bandı hem de 3D baskının bitişiğindeki açıkta kalan kısımları kapatacak şekilde sürün (Şekil 3E-4).
    8. Kabloyu, kablo koruyucusunun iç pasajından geçirin (Şekil 3F). Önerilen vivarium düzenini kullanmak için her bir yalama ölçer (lickometer) için uygun kablo koruyucuyu (sola veya sağa bakan) seçtiğinizden emin olun (bkz. adım 3.6 ve Şekil 6)."NOT: Mevcut kurulumda mavi veya mor renkli kablolarla gösterilen 5-6, 11-12 ve 17-18 numaralı yalama ölçerler, sola bakan bir kablo koruyucu gerektirir (Şekil 4D-1), diğer tüm yalama ölçerlerin ise sağa bakan bir kablo koruyucuya ihtiyacı vardır (Şekil 4D-2).
    9. Kablo klipsini takmak için, öncelikle bir teli kablo klipsinin bir yarısının kanalına yerleştirin (Şekil 3G-1), ardından diğer yarısını ikinci telin üzerine yerleştirin ve sonra her iki yarısını somunla sıkıca kapatın (Şekil 3G-2).
    10. Erkek konnektörü ilgili likometre kimlik numarasıyla etiketleyin (Şekil 3H). Tüm 18 yalama ölçer (lickometer) yapılana kadar bu adımları tekrarlayın.
  4. LIQ HDR yalama ölçerlerin kurulumu
    NOT: LIQ HDR, metal telli üst kısmı olan standart bir ayakkabı kutusu sıçan kafesine kurulum için tasarlanmıştır (Şekil 4A-1).
    1. Şişe tutucuyu yerleştirmek için tel kafes üst kısmında merkezden merkeze uzaklığı ~75 mm olan iki çift çubuk belirleyin. Yudumlama uçlarının (sipper) açıklıkları etrafındaki metal çubukları hafifçe açmak için bir pense kullanın. Yudumlama uçları ile kafes üstü arasında metal-metale teması önlemek için bu çubukları elektrik bandıyla izole edin.Şekil 4A-2).
      NOT: Elektrik bandı sıçanların erişebileceği bir yerde olmasa ve bu nedenle kemirilme riskine açık olmasa da, bandın çalışma sonunda atılmasını ve çalışmalar arasında yeniden kullanılmamasını öneririz.
    2. Liko-metreyi ve 1/8 inç kalınlığındaki lazer kesim akrilik paneli, iki set M5 vida ve somun kullanarak kafes üstüne monte edin (Şekil 4B). Lickometre ve akrilik panel üzerindeki emme uçlarının (sipper) hizalı olduğundan ve emme uçlarının kafes üst kısmının herhangi bir bölümüyle temas etmediğinden emin olun.
    3. Kablo klipsini, tel kafes üst kısmının en dıştaki çubuğuna (~4 mm çapında) sabitleyin (Şekil 4C). Kafes üst kısmının kafes alt kısmına tam olarak oturduğundan ve kablonun çok fazla gerilmediğinden veya bükülmediğinden emin olmak için gerekirse kablo klipsini ayarlayın. Her likometre için doğru kablo koruyucunun kullanıldığından emin olun (Şekil 4D ve bkz. adım 3.8.8).
    4. Sipir tüplerini, kapağın dışına yalnızca ~2 cm kadar çıkacak şekilde gerektiği gibi ayarlayın (Şekil 4E-1). Şişeleri yerleştirmek için, emici tüpü şişe tutucunun emici braketinden tüp durana kadar içeri itin (Şekil 4E-2). Akrilik panelin dışına sadece emici tüpün en uç kısmı uzanmalıdır (Şekil 4E-3). Sıçanların emici tüpe dokunması veya onunla oynaması gibi tüketim dışı davranışlardan kaynaklanan yanlış pozitif yalama kayıtlarını önlemek için, emici tüpün başka hiçbir kısmının açıkta kalmaması kritik önem taşır. Bir filtre kapağı, kablonun kendisine müdahale etmeden tel kafes üstüne ve kablo klipsine sıkıca oturabilmelidir (Şekil 4F).
      NOT: Kısa emici tüplere ulaşmakta zorlanabilecek genç sıçanlarda su tüketiminin ölçülmesi gibi, emici tüplerin kafesin içine daha fazla uzanmasını gerektiren deneyler için, daha uzun emici tüpleri tamamen çevrelemek amacıyla daha kalın bir akrilik panel veya üst üste dizilmiş birden fazla 1/8 inçlik panel kullanılabilir.
  5. Sipir bloklayıcıların kurulumu ve kullanımı
    ​NOT: emici uç engelleyici (Şekil 5A), şişe değişimleri sırasında sıçaresinin emzikle olan erişimini kısıtlamak ve her içme seansının başlangıcında yalama ölçerin (lickometer) doğru şekilde kalibre edilmesini sağlamak için tasarlanmıştır.
    1. Görselde gösterildiği gibi, bir adet yudumlama engelleyici (sipper blocker) için 3B yazıcıyla basılmış parçaları ve bir adet M5 vida, somun ve pulu bir araya getirin Şekil 5B.
    2. SIPPER_Gear'ı SIPPER_Base'e yerleştirin (Şekil 5C-1). SIPPER_Gear'ın, 3D render ekinde gösterildiği şekilde tam olarak yönlendirildiğinden emin olun. SIPPER_Worm'u, SIPPER_Base'in üst kısmındaki açıklığa yerleştirin. Baş kısım tabanla aynı hizaya gelene kadar, yerleştirirken worm'u saat yönünde çevirin (Şekil 5C-2).
    3. SIPPER_Somunu, Taban'ın altından başlayarak Sonsuz Vidanın ucuna vidalayın (Şekil 5C-3). Sonsuz vida kadranını çevirirken somunu sıkmak için pens kullanın. SIPPER_Blocker'ların yuvarlak, dar boyunlarını Dişli'nin yuvalarına yerleştirin (Şekil 5C-4).
    4. Montajı tamamlanmış sipper engelleyiciyi, M5 vida setini kullanarak kafes üstüne monte edin (Şekil 5D). Her iki sipper engelleyicinin sipper açıklıklarıyla hizalandığından emin olun.
    5. Sipere erişimi engellemek için, engelleyiciler sipere açıklıklarını tamamen kapatana kadar sonsuz vidayı saat yönünde çevirerek engelleyicileri aşağı indirin (Şekil 5E).
    6. Suluklara erişim sağlamak için, engelleyiciler kafes üstüne dik olacak şekilde dikey konuma gelene kadar çevirme düğmesini saat yönünün tersine döndürün (Şekil 5F-1). Her bir bloklayıcı kolu, başlıklar tel kafes tepesinin hemen altına gelene kadar manuel olarak yukarı çekin. Bloklayıcıları döndürün 90° böylece başlıklar kafes üstündeki metal çubuklara paralel hale gelir ve kollar yerlerine sabitlenir (Şekil 5F-2). Her iki bloklayıcı kafesin üst kısmının üzerine çıkana kadar kadranı saat yönünün tersine çevirmeye devam edin (Şekil 5F-3) ve suluklar tamamen erişilebilir (Şekil 5F-4).
  6. Vivaryumda LIQ HDR sisteminin kullanımı
    NOT: Aşağıdaki vivaryum kurulumu, 18 standart ayakkabı kutusu tipi sıçan kafesine bağlı tek bir mikrodenetleyici arayüzü kullanılarak iki şişe seçimli içme davranışını kaydetmek için optimize edilmiştir. Mikrodenetleyici arayüzü, sensör üniteleri ve çeşitli kablolar dahil olmak üzere tüm elektronik bileşenler, kafesleri taşıyan duvara monte metal tel raflara sabitlenmiştir (Şekil 6A). Hayvan tesislerine ve kullanıcı ihtiyaçlarına uyarlanması için bazı modifikasyonlar gerekebilir.
    1. Her bir sensör ünitesini, özel olarak 3D yazıcıyla basılmış montaj vidasını kullanarak vivaryum rafına monte edin (Şekil 6B). Gereksiz kablo gerginliğini önlemek için her bir sensör ünitesinin, sarı renkli yalamaölçer (lickometer) ile birlikte doğrudan kafesin altına monte edildiğinden emin olun (Şekil 6A).
    2. Her bir dişi konnektör kablosunu, birbirlerinin üzerine binmediklerinden ve lehim uçlarında aşırı bükülme olmadıklarından emin olarak düzenleyin ve sabitleyin; aksi takdirde sızıntı tespiti yetersiz olabilir (Şekil 6B). Metal tel raflar kullanılıyorsa, bu durum, gösterildiği gibi bağlantı kablolarının raf üzerindeki ayrı tellere kablo bağlarıyla sabitlenmesiyle kolayca sağlanabilir.
    3. Mikrokontrolcü arayüzünü, aynı 3B yazıcıyla üretilmiş montaj vidasını kullanarak sensör ünitesi A'nın yanına monte edin ve 4 pinli konnektörünü, sensör ünitesi A'ya bağlı olan 5V'dan 3V'a seviye dönüştürücünün 5 V giriş portuna takın (Şekil 6C).
    4. Ekstra toprak kablosunu, metal raf gibi bir topraklama kaynağına elektrik bandı kullanarak sabitleyin (Şekil 6D).
    5. Her bir kafesi, kurulu olan yalama ölçerin rengine ve kimliğine göre şu şekilde düzenleyin: Şekil 6A kablo örtüşmesini ve gerilmesini minimize etmek amacıyla tasvir edilmiştir.
    6. Tüm erkek yalamaölçer (lickometer) konnektör kablolarını, uygun dişi sensör konnektör kablolarına güvenli bir şekilde bağlayın (Şekil 6E). Mikrodenetleyici arayüzünü açmak için güç kaynağını takın (Şekil 6F).
    7. Ana GUI (grafik kullanıcı arayüzü) sayfasında (Şekil 6G), dokunun Ayarlar Sembolü Ayarlar sayfasını açmak için. Kullanıcılar, karanlık döngüsü başladığında arayüz ekranının otomatik olarak kararmasını sağlamak için vivaryum programına göre Işıklar AÇIK ve KAPALI zamanlarını değiştirebilirler (Şekil 6H-1).
    8. Musluk Sensör Ayarlarını Düzenle (Şekil 6H-1) mevcut kurulumu kullanan sıçanlar için en tutarlı yalama tespitini sağladığını belirlediğimiz Dokunma Eşiği'ni (Touch Threshold) 8'e ve Bırakma Eşiği'ni (Release Threshold) 2'ye ayarlamak için (Şekil 6H-2). Ancak, mevcut sistemde herhangi bir değişiklik yapılması durumunda, kullanıcıların farklı ayarlar denemeleri gerekebileceği unutulmamalıdır.
    9. İşareti kaldırın Otomatik Kalibre Et veriler yalnızca 24 saatlik veya daha kısa bir süre boyunca toplanmışsa (Şekil 6H-2).

4. Yalama deteksiyonu kullanılarak iki şişeli seçimli ev kafesi içirme işlemi için günlük prosedürler

  1. Standart iki şişe seçimi prosedürleri için adım 2'de belirtilen adımları aşağıdaki modifikasyonlarla takip edin.
  2. Pazartesi, Çarşamba ve Cuma günleri, MWF şişelerini yerleştirmeden önce tüm kafeslerdeki sipper açıklıklarını kapatmak için sipper engelleyicileri kullanın (bkz. adım 3.5.5 ve Şekil 5E).
  3. Kayda başlamadan önce, ana GUI sayfasından o gün için EtOH şişesinin bulunduğu taraf olan doğru Experimental Side (Deneysel Taraf) seçeneğini belirleyin (Şekil 6G).
  4. Tüm MWF şişelerini yerleştirdikten sonra, sensörlerin kalibrasyonunu başlatmak için ana sayfadaki START! butonuna dokunun (Şekil 6G); bu sırada kullanıcıların sistemden bir adım uzaklaşmaları ve farelerin sipperları yalamadığından emin olmaları önerilir (Şekil 6I-1). Kalibrasyonun tamamlanması birkaç saniye sürer, ardından sistem her lickometer için her şişedeki kümülatif yalama sayılarını gösteren ana kayıt sayfasına geçer (Şekil 6I-2).
  5. Sipperlara erişim sağlamak için tüm sipper engelleyicilerini kafes üstünün üzerine kaldırın (bkz. adım 3.5.6 ve Şekil 5F) ve tüm filtre kapaklarını açıklandığı şekilde nazikçe geri yerleştirin (bkz. adım 3.4.4 ve Şekil 4F).
  6. Ekrandaki yalama sayılarını güncellemek için Refresh butonuna dokunun; bu sayılar kendi başlarına gerçek zamanlı olarak güncellenmez (Şekil 6I-2).
  7. Salı, Perşembe ve Cumartesi günleri, MWF şişelerini çıkarmadan önce kaydı durdurup ana sayfaya dönmek için Save & Quit butonuna dokunun (Şekil 6I-2).
  8. Veri transferi için SD kartı çıkarmak amacıyla, kartı yerinden çıkarmadan önce Eject SD butonuna dokunun (Şekil 6G). SD kartı herhangi bir bilgisayara takın ve şişe açılış tarihine göre adlandırılmış .csv veri dosyasını o bilgisayara kopyalayıp yapıştırın (Şekil 6K). Bir sonraki kayıt için SD kartı tekrar bağlamak üzere, kartı arayüze takın ve Mount SD butonuna dokunun (Şekil 6J).
    NOT: Veri dosyalarının günlük olarak yedeklenmesini öneririz.
  9. Hayvan modeli ve hayvan kullanım protokolü ile uyumlu olduğu durumlarda, vücut ağırlığı ölçümlerinin haftada bir ile sınırlandırılması ve lickometerlar ile sensörlere yönelik gereksiz rahatsızlıkları en aza indirmek için bu işlemin kafes değişim günü yapılması tavsiye edilir. Kafesleri taşımadan önce tüm erkek lickometer kablolarını eşleşen dişi sensör kablolarından ayırın. Her fareyi tarttıktan sonra fareyi temiz bir kafese geri koyun. Lickometer'ı yeni bir kafes üstüne aktarın ve gerektiğinde her lickometer'ı ilgili sensöre yeniden bağlayın.
  10. Bir müdahalenin (örneğin ilaç enjeksiyonu) EtOH alımı ve içme mikro yapısı üzerindeki etkisini test eden deneyler için, bu tür müdahaleleri mümkün olduğunca içme seansı başlamadan önce planlayın. Bunun mümkün olmadığı durumlarda araştırmacılar, Pause butonuna dokunarak (Şekil 6I-2) yalama tespitini durdurabilir ve müdahale tamamlandıktan sonra Resume butonuna dokunarak veri yakalamaya devam edebilirler. Müdahale öncesi ve sonrası EtOH alımındaki değişiklikleri yakalamak ve ayrıca hayvana erişmek için kafes üstü çıkarılırken meydana gelebilecek dökülmeleri hesaba katmak amacıyla, içme seansındaki her duraklama sırasında şişe ağırlıklarının toplanmasını öneririz.
  11. Çalışmanın sonunda, hayvanlar arasındaki kontaminan iletimini sınırlamak için kafes içindeki tüm bileşenler yeni hayvanlarla kullanılmadan önce iyice dezenfekte edilmelidir. Dahili elektrik bileşenlerini bozmadığınızdan emin olarak, lickometer'ı %70 EtOH çözeltisi ile nazikçe püskürterek silmenizi öneririz. Sipper engelleyici ve akrilik panel ılık sabunlu su ile yıkanabilir.

5. Veri analizi

  1. Bağımlı değişkenleri değerlendirmeden önce, şişelerin her gün değiştirilmesi sonucunda kaçınılmaz olarak meydana gelen dökülmeler için alım verilerini düzeltin. Bunu yapmak için, tüm çalışma süresi boyunca dökülme kafesindeki EtOH ve H2O şişelerinin ağırlık değişiminin ortalamasını alın.
  2. Her şişe için ortalamadan iki standart sapmadan daha büyük olan tüm değerleri hariç tutun. Bu aykırı değerleri çıkardıktan sonra, hesaplanan ortalamaları hayvan içeren kafeslerdeki şişelerden elde edilen EtOH ve H2O şişesi ağırlık değişimlerinden çıkarın. Bu miktar çıkarılarak, araştırmacılar belirli bir solüsyonun dökülmesinden kaynaklanan ortalama kaybın tüketim ölçümlerine dahil edilmediğinden emin olabilirler. Ortalama dökülme miktarının çıkarılması, bazı hayvanlar için bazı durumlarda negatif bir değere yol açabilir. Bunları sıfıra dönüştürün ve söz konusu solüsyon için herhangi bir alımın olmadığını şeklinde yorumlayın.
  3. İki şişeli seçimli içme deneyleri için temel bağımlı değişkenler EtOH alımı (g/kg) ve tercih (%) değerleridir. Alımı, EtOH şişesi ağırlığındaki değişimden (g) hesaplayın ve aşağıdaki adımları kullanarak vücut ağırlığına (kg) göre normalize edin.
    1. Şişe ağırlığındaki değişimi (g), aşağıdaki denklemi kullanarak hacim değişimine (mL) dönüştürün:
      figure-protocol-1
      Saf etanolin yoğunluğu 0,789 g/mL'dir. Bu nedenle, %20'lik EtOH'nun katkı yoğunluğu 0,1578 g/mL'dir. H2O'nun ağırlığı 1 g/mL'dir. Dolayısıyla, %80'lik H2O'nun katkı yoğunluğu = 0,80 g/mL'dir. Sonuç olarak, %20'lik EtOH solüsyonunun (v/v) her mL'si, 0,1578 (EtOH) + 0,80 (H2O) = 0,9578 g/mL'den oluşur. Bu nedenle, %20 (v/v) EtOH konsantrasyonu kullanıldığında nihai denklem şöyledir:
      figure-protocol-2
    2. Tüketilen etanol dozunu aşağıdaki denklemi kullanarak hesaplayın. Tüketilen etanolü hayvan vücut ağırlığı cinsinden hesaplamak için alım verileriyle aynı hafta içinde elde edilen vücut ağırlıklarını kullanın.
      figure-protocol-3
    3. Tercihi aşağıdaki denklemi kullanarak hesaplayın:
      figure-protocol-4
  4. Farelerdeki karşılığı30 gibi, LIQ HDR; yalama süresi, but sayısı, but süresi, but yalama sayısı ve but yalama süresi dahil olmak üzere çeşitli içme mikro yapı değişkenlerini yakalar (Şekil 6K). Bir içme butu, 1 saniyenin altında gerçekleştirilen en az 3 yalama ile başlayan ve ek yalama olmaksızın 3 saniye geçtikten sonra sona eren bir yalama serisi olarak tanımlanır. Bu ölçümler daha sonra ortalama bireysel yalama süresini, ortalama bireysel but süresini, but başına ortalama yalama sayısını, ortalama yalama frekansını, tahmini yalamalar arası aralığı ve tahmini butlar arası aralığı hesaplamak için kullanılabilir.
    NOT: Mikrodenetleyici arayüzü, bu mikro yapı verilerini bir .csv dosyasında 1 dakikalık çözünürlükte sağlar (Şekil 6K). Araştırmacılar, verileri araştırma ihtiyaçlarına göre derlemek ve özetlemek için orijinal LIQ HD protokolüyle30 birlikte sağlanan analiz uygulamasını veya tercih ettikleri işlem sonrası platformu kullanabilirler. Mikro yapı verileri tipik olarak, ortalama farkları makro düzeyde karşılaştırmak için tüm 24 saatlik süre boyunca veya bir ışık-karanlık döngüsü boyunca içme modeli varyasyonlarını incelemek için 30 dakikalık ile 1 saatlik aralıklarla toplanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Standart aralıklı iki şişeli seçim ev kafesi EtOH tüketim verileri
Standart prosedür kullanılarak (Şekil 7A), araştırmacılar 24 saatlik tüketimi (Şekil 7B-D) ve şişe ağırlıkları tüketim oturumunun başlangıcından kısa bir süre sonra toplandığında binge benzeri tüketimi (Şekil 7E-F) belirleyebilirler. Etanol tüketimi su tüketimine oranla hesaplanarak, araştırmacılar ölçülen tüm ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Mevcut protokol, aralıklı erişimli iki şişe seçimli ev kafesi prosedürünü kullanarak etanol içme verilerini yakalamak için adım adım talimatlar sağlar. Bu yöntem nispeten kolaylıkla ve çok az maliyetle veya hiç maliyet gerektirmeden veya özel araştırma ekipmanına ihtiyaç duymadan uygulanabilir. Araştırmacılar, sıçanlarda kullanım için bir yalama algılama sistemi olan LIQ HDR'yi oluşturmak ve uygulamak için burada sağlanan prosedürleri kullanarak, standart alım ve tercih ölçümlerine ek olarak yüksek çözünürlüklü içme mikr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Yazarlar, LIQ HDR geliştirme sırasındaki teknik yardımları için Joseph Pitock ve Dr. Katie Przybysz'e teşekkür eder. Ayrıca, LIQ HDR'nin geliştirilmesi sırasındaki birçok yararlı konuşma için Nicholas Petersen ve Marie Doyle, PhD'ye teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'ndeki Ulusal Alkol Suistimali ve Alkolizm Enstitüsü (EJG'ye AA029130 P50 AA022538 ve R01) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ticari Olarak Mevcut BileşenlerQuantity
12 tuşlu kapasitif dokunmatik sensör koparma (MPR121)Adafruit19823
2 Pimli kablo eşleştirme çifti (JST XH 2,5 mm aralık)Adafruit487218
4 Pimli breadboard jumper (Qwiic)SparkFunPRT-179121
4 Pimli kablo (100 mm Qwiic)SparkFunPRT-172591
4 Pimli kablo (50 mm Qwiic)SparkFunPRT-172603
5V'den 3V'ye seviye değiştirici koparmaAdafruit56371
Kapasitif dokunmatik kalkan (2,8 inç)Adafruit19471
Bakır iletken bant (1/4 inç)DigiKey4393-CFT-1/4-ND1
Veri günlük kalkanıAdafruit11411
Diferansiyel I2C iletişim koparma kiti (QwiicBus)SparkFunKIT-172501
Elektrik bandıDigiKey3M156004-ND1
Isıyla daralan makaron (3/16 inç çeşitli renkler)Kablo Bağları ve Daha FazlasıHS357-S106
Isıyla daralan makaron kiti (4 inç siyah)Jameco20959631
Lityum düğme pil (3V 12,5 mm)DigiKey1908-CR1220JAUCHSB-ND1
M5 düz yıkayıcıGrainger54FN661
M5 altıgen somunGrainger6CA721
M5 makine vidası (12mm)Grainger6GU881
M5 makine Vidası (25mm)Grainger  6GU912
Erkek/erkek jumper telAdafruit19571
Mikrodenetleyici kartı (Arduino Mega 2560 Rev3)DigiKey1050-1018-ND1
PETG filament (2,85 mm gümüş)MatterHackersM-DDH-UZR22
PLA filament (2,85 mm siyah)MatterHackersM-SEW-RUAW2
PLA filament (2,85 mm gümüş)MatterHackersM-66P-6CLE1
Güç kaynağı (DC 9V 1A)Newegg9SIBPPKJYR59911
SD/microSD hafıza kartı (8GB)Adafruit12941
Kalkan istifleme başlıklarıAdafruit851
Katı çekirdekli tel (22AWG kırmızı)Adafruit2881
Örgülü damarlı tel (22AWG siyah)Adafruit29761
Örgülü çekirdekli tel (22AWG kırmızı)Adafruit30681
Bilyalı Büküm kapaklı yudum tüpüAlternatif TasarımTCCN8.5-ST2.5SB38
Su şişesi (8oz)Alternatif TasarımWB8FS38
Özel 3D Baskılı BileşenlerMiktar
>3D baskılı Arduino kasa altıN/AARDUINO_Bottom.stl1
3D baskılı Arduino kasa üstüN/AARDUINO_Top.stl1
3D baskılı kablo klipsi LN/ACLIP_L.stl18
3D baskılı kablo klipsi somunuN/ACLIP_Nut.stl18
3D baskılı kablo klipsi RN/ACLIP_R.stl18
3D baskılı lickometer şişe tutucuN/ALICKOMETER_Bottle Holder.stl19
3D baskılı yakometre kablo koruyucusu LN/ALICKOMETER_Cable Protector_L.stl6
3D baskılı lickometer kablo koruyucusu RN/ALICKOMETER_Cable Protector_R.stl12
3D baskılı lickometer harfleriN/ALICKOMETER_Letters.stl19
3D baskılı montaj vidasıN/AMontaj Vidası.stl4
3D baskılı sensör kutusu A altN/ASENSOR_A_Bottom.stl1
3D baskılı sensör kutusu A üstN/ASENSOR_A_Top.stl1
3D baskılı sensör kutusu B altN/ASENSOR_B_Bottom.stl1
3D baskılı sensör kutusu B üstN/ASENSOR_B_Top.stl1
3D baskılı sensör kutusu C altN/ASENSOR_C_Bottom.stl1
3D baskılı sensör kutusu C üstN/ASENSOR_B_Top.stl1
3D baskılı sensör kutusu harfleriN/ASENSOR_Letters.stl1
3D baskılı yudum engelleyiciN/ASIPPER_Blocker.stl36
3D baskılı yudum engelleyici tabanıN/ASIPPER_Base.stl18
3D baskılı yudum engelleyici dişliN/ASIPPER_Gear.stl18
3D baskılı yudum engelleyici somunN/ASIPPER_Nut.stl18
3D baskılı yudum engelleyici solucanN/ASIPPER_Worm.stl18
Lazer kesim lickometer akrilik panelN/ALICKOMETER_Acrylic Panel_Sketch.dxf19

Kaynaklar

  1. GBD 2016 Alcohol Collaborators. Alcohol use and burden for 195 countries and territories, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 392 (10152), 1015-1035 (2018).
  2. Fillmore, K. M., Stockwell, T., Chikritzhs, T., Bostrom, A., Kerr, W. Moderate alcohol use and reduced mortality risk: systematic error in prospective studies and new hypotheses. Annals Epidemiol. 17 (5 Suppl), S16-S23 (2007).
  3. GBD 2020 Alcohol Collaborators. Population-level risks of alcohol consumption by amount, geography, age, sex, and year: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2020. Lancet. 400 (10347), 185-235 (2020).
  4. Esser, M. B., Sherk, A., Liu, Y., Naimi, T. S. Deaths from excessive alcohol use - United States, 2016-2021. Morbidity Mortality Weekly Rep. 73, 154-161 (2024).
  5. Melendez, R. I. Intermittent (every-other-day) drinking induces rapid escalation of ethanol intake and preference in adolescent and adult C57BL/6J mice. Alcohol Clin Exp Res. 35 (4), 652-658 (2011).
  6. Wise, R. A. Voluntary ethanol intake in rats following exposure to ethanol on various schedules. Psychopharmacologia. 29 (3), 203-210 (1973).
  7. Simms, J. A., et al. Intermittent access to 20% ethanol induces high ethanol consumption in Long-Evans and Wistar rats. Alcohol Clin Exp Res. 32 (10), 1816-1823 (2008).
  8. Carnicella, S., Ron, D., Barak, S. Intermittent ethanol access schedule in rats as a preclinical model of alcohol abuse. Alcohol. 48 (3), 243-252 (2014).
  9. Loi, B., et al. Increase in alcohol intake, reduced flexibility of alcohol drinking, and evidence of signs of alcohol intoxication in Sardinian alcohol-preferring rats exposed to intermittent access to 20% alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34 (12), 2147-2154 (2010).
  10. Rhodes, J. S., Best, K., Belknap, J. K., Finn, D. A., Crabbe, J. C. Evaluation of a simple model of ethanol drinking to intoxication in C57BL/6J mice. Physiol Behavior. 84 (1), 53-63 (2005).
  11. Thiele, T. E., Navarro, M. "Drinking in the dark" (DID) procedures: a model of binge-like ethanol drinking in non-dependent mice. Alcohol. 48 (3), 235-241 (2014).
  12. Rimondini, R., Sommer, W., Heilig, M. A temporal threshold for induction of persistent alcohol preference: behavioral evidence in a rat model of intermittent intoxication. J Studies Alcohol. 64 (4), 445-449 (2003).
  13. Sommer, W. H., et al. Upregulation of voluntary alcohol intake, behavioral sensitivity to stress, and amygdala crhr1 expression following a history of dependence. Biol Psychiatry. 63 (2), 139-145 (2008).
  14. Nentwig, T. B., et al. The lateral habenula is not required for ethanol dependence-induced escalation of drinking. Neuropsychopharmacol. 47 (12), 2123-2131 (2022).
  15. Becker, H. C., Lopez, M. F. Increased ethanol drinking after repeated chronic ethanol exposure and withdrawal experience in C57BL/6 mice. Alcohol Clin Exp Res. 28 (12), 1829-1838 (2004).
  16. Lopez, M. F., Becker, H. C. Effect of pattern and number of chronic ethanol exposures on subsequent voluntary ethanol intake in C57BL/6J mice. Psychopharmacology. 181 (4), 688-696 (2005).
  17. Griffin, W. C., Lopez, M. F., Becker, H. C. Intensity and duration of chronic ethanol exposure is critical for subsequent escalation of voluntary ethanol drinking in mice. Alcohol Clin Exp Res. 33 (11), 1893-1900 (2009).
  18. Hwa, L. S., et al. Persistent escalation of alcohol drinking in C57BL/6J mice with intermittent access to 20% ethanol. Alcohol Clin Exp Res. 35 (11), 1938-1947 (2011).
  19. Vierkant, V., Xie, X., Wang, X., Wang, J. Experimental models of alcohol use disorder and their application for pathophysiological investigations. Curr Prot. 3 (6), e831(2023).
  20. Greenfield, T. K., et al. Risks of alcohol use disorders related to drinking patterns in the U.S. general population. J Studies Alcohol Drugs. 75 (2), 319-327 (2014).
  21. Rehm, J., Greenfield, T. K., Rogers, J. D. Average volume of alcohol consumption, patterns of drinking, and all-cause mortality: results from the US National Alcohol Survey. Am J Epidemiol. 153 (1), 64-71 (2001).
  22. Grant, K. A., et al. Drinking typography established by scheduled induction predicts chronic heavy drinking in a monkey model of ethanol self-administration. Alcohol Clin Exp Res. 32 (10), 1824-1838 (2008).
  23. Nathan, P. E., O'Brien, J. S. An experimental analysis of the behavior of alcoholics and nonalcoholics during prolonged experimental drinking: A necessary precursor of behavior therapy. Behav Ther. 2 (4), 455-476 (1971).
  24. Godynyuk, E., Bluitt, M. N., Tooley, J. R., Kravitz, A. V., Creed, M. C. An open-source, automated home-cage sipper device for monitoring liquid ingestive behavior in rodents. eNeuro. 6 (5), (2019).
  25. Frie, J. A., Khokhar, J. Y. An open source automated two-bottle choice test apparatus for rats. HardwareX. 5, e00061(2019).
  26. Melo, M. C., Alves, P. E., Cecyn, M. N., Eduardo, P. M. C., Abrahao, K. P. Development of eight wireless automated cages system with two lick-o-meters each for rodents. eNeuro. 9 (4), (2022).
  27. Wong, K., et al. Socially integrated polysubstance (SIP) system: An open-source solution for continuous monitoring of polysubstance fluid intake in group housed mice. Addiction Neurosci. , (2023).
  28. Frie, J. A., Khokhar, J. Y. FARESHARE: An open-source apparatus for assessing drinking microstructure in socially housed rats. NPP-Digit Psychiatry Neurosci. 2 (1), 1-7 (2024).
  29. Zhao, Z., et al. INGEsT: An open-source behavioral setup for studying self-motivated ingestive behavior and learned operant behavior. bioRxiv. , (2024).
  30. Petersen, N., Adank, D. N., Raghavan, R., Winder, D. G., Doyle, M. A. LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home Cage Device): An open-source tool for recording undisturbed two-bottle drinking behavior in a home cage environment. eNeuro. 10 (4), (2023).
  31. Trujillo, J. L., Roberts, A. J., Gorman, M. R. Circadian timing of ethanol exposure exerts enduring effects on subsequent ad libitum consumption in C57 mice. Alcohol Clin Exp Res. 33 (7), 1286-1293 (2009).
  32. Nentwig, T. B., Margaret Starr, E., Judson Chandler, L., Glover, E. J. Absence of compulsive drinking phenotype in adult male rats exposed to ethanol in a binge-like pattern during adolescence. Alcohol. 79, 93-103 (2019).
  33. Patwell, R., Yang, H., Pandey, S. C., Glover, E. J. An operant ethanol self-administration paradigm that discriminates between appetitive and consummatory behaviors reveals distinct behavioral phenotypes in commonly used rat strains. Neuropharmacology. 201, 108836(2021).
  34. Bito-Onon, J. J., Simms, J. A., Chatterjee, S., Holgate, J., Bartlett, S. E. Varenicline, a partial agonist at neuronal nicotinic acetylcholine receptors, reduces nicotine-induced increases in 20% ethanol operant self-administration in Sprague-Dawley rats. Addict Biol. 16 (3), 440-449 (2011).
  35. Mill, D. J., Bito-Onon, J. J., Simms, J. A., Li, R., Bartlett, S. E. Fischer rats consume 20% ethanol in a long-term intermittent-access two-bottle-choice paradigm. PloS One. 8 (11), e79824(2013).
  36. Carnicella, S., Amamoto, R., Ron, D. Excessive alcohol consumption is blocked by glial cell line-derived neurotrophic factor. Alcohol. 43 (1), 35-43 (2009).
  37. Moore, C. F., Lynch, W. J. Alcohol preferring (P) rats as a model for examining sex differences in alcohol use disorder and its treatment. Pharmacol Biochem Behav. 132, 1-9 (2015).
  38. Pitock, J. R., et al. Presence of distinct operant phenotypes and transient withdrawal-induced escalation of operant ethanol intake in female rats. bioRxiv. , (2024).
  39. Carnicella, S., Yowell, Q. V., Ron, D. Regulation of operant oral ethanol self-administration: a dose-response curve study in rats. Alcohol Clin Exp Res. 35 (1), 116-125 (2011).
  40. De Oliveira Sergio, T., et al. Sex- and estrous-related response patterns for alcohol depend critically on the level of compulsion-like challenge. Prog Neuro-Psychopharmacol Biol Psychiatry. 133, 111008(2024).
  41. Foo, J. C., Skorodumov, I., Spanagel, R., Meinhardt, M. W. Sex- and age-specific effects on the development of addiction and compulsive-like drinking in rats. Biol Sex Diff. 14 (1), 44(2023).
  42. Moolten, M., Kornetsky, C. Oral self-administration of ethanol and not experimenter-administered ethanol facilitates rewarding electrical brain stimulation. Alcohol. 7 (3), 221-225 (1990).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Kemirgenlerde Alkol Tüketimiİçme MikroyapısıYalama Ölçer SistemiSıçanlarda Etanol Alımıİçme ModelleriKan Etanol KonsantrasyonuBinge benzeri (aşırı) İçme
Kemirgenlerde Alkol Tüketiminin İki Şişe Seçenekli Ev Kafesi İçme Yöntemi Kullanılarak Modellenmesi ve Mikroyapısal Analiz
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.