Yöntem makalesi

Konak-Patojen Etkileşimlerinin İn Vitro Araştırılması için Organotipik Doku Model Sistemleri

DOI:

10.3791/67487

⸱

28 Mart 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Oral Sciences Research Group, Glasgow Dental School, School of Medicine, College of Medical, Veterinary and Life Sciences, University of Glasgow, 2Glasgow Biofilm Research Network, 3Department of Restorative Dental Sciences, College of Dentistry, Jouf University, 4Department of Biological and Biomedical Sciences, Glasgow Caledonian University, 5Safeguarding Health through Infection Prevention Research Group, Glasgow Caledonian University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, in vitro olarak konak-patojen etkileşimlerini araştırmak için organotipik doku modellerinin uygulanmasını özetlemektedir. Spesifik olarak, açıklanan model sistemi, ağız sağlığına karşı hastalık bağlamında biyofilmlerle (diş plağı) ilişkili mikroorganizmalara maruz kalan çok katmanlı bir ağız epiteli kullanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epitelyal veya mukozal bariyerde konak-patojen arayüzünün in vitro olarak yeniden özetlenmesi, enfeksiyon biyologları için zorlu bir olasılık olmaya devam etmektedir. Kurum içinde yetiştirilen 2D epitelyal tek tabakalar, in vivo durumun gerçek temsilinden yoksun olsa da, ticari olarak temin edilebilen doku modelleri, maliyetleri ve pratiklikleri nedeniyle genellikle göz ardı edilir. Bununla birlikte, dikkatli bir planlama ile bu tür modeller, çok çeşitli farklı uygulamalar için tekrarlanabilir platformlar sağlar. Burada, ağız boşluğu, cilt ve vajinal mukoza gibi çeşitli ekolojik nişlerde konak-patojen etkileşimlerini araştırmak için çok çeşitli deneysel amaçlar için kullanılabilecek epitel modellerinin kullanımını bildiriyoruz. Basit planktonik hücrelerden karmaşık biyofilm ko-kültürüne kadar, epitel modelleri, mikrobiyal uyumu ve istilayı değerlendirmek ve farklı omik yaklaşımlar kullanarak daha ayrıntılı profilleme kapsamı ile konakçı yanıtını transkripsiyonel ve/veya protein düzeyinde değerlendirmek için kullanılır. Ayrıca, bu biyolojik sistemler, in vitro olarak karmaşık bir konak-patojen mikro ortamında geleneksel ve yeni antimikrobiyal aktiviteyi değerlendirmek için daha doğru test yatakları olarak kullanılabilir. Burada açıklanan protokoller, modellerin varışta nasıl ele alındığını ve biyofilm toplulukları ile ko-kültür stimülasyonu için laboratuvarda nasıl hazırlandığını belgelemektedir. Yöntemler, dokunun işlenmesi, ko-kültür kurulumu ve veri üretimi dahil olmak üzere model sistemlerden deneysel çıktıların nasıl elde edildiğini detaylandırır. Bu deneyler, tekli ve multipleks qPCR analizleri yoluyla konakçı gen ekspresyonunu ve ELISA'lar kullanılarak inflamatuar protein tespitini içerir. Sonuç olarak, epitelyal modeller, basit veya karmaşık konak-patojen etkileşimlerine yönelik klinik öncesi araştırma çalışmaları için yararlı in vitro sistemler sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İn vitro model sistemleri, konak-patojen etkileşimlerini araştırmak için mükemmel test yatakları sağlar. Bu organotipik sistemler, mikrobiyal bozulmalara eğilimli farklı ekolojik nişlerin mikro çevresini özetlemeyi amaçlar. Ağız boşluğu 1,2,3,4,5, cilt bariyeri 6,7,8,9,10,11 ve vajinal mukoza 5,12,13 içindeki konak-patojen etkileşimlerini değerlendirmek için EpiSkin (eski adıyla SkinEthic) doku modellerini kullanan bir dizi araştırma makalesi yayınlanmıştır , diğerleri arasında14,15. Mikroorganizmalara maruz kalan epitel hücre dizilerinin tek katmanlarının kullanımına dayanan "iki boyutlu" veya "2D" hücre kültürünün aksine, ticari olarak temin edilebilen bu modeller, bir hava-sıvı arayüzünde büyütülen çok sayıda farklılaşmış hücre katmanından oluşur. Daha ucuz olmasına ve genellikle daha tekrarlanabilir olduğu düşünülmesine rağmen, 2D kültür sistemleri, mikroorganizmalarla kültürlendiğinde hücresel hasara eğilimlidir, bu da in vivo olarak epitel veya mukozal bariyerleri her zaman doğru bir şekilde temsil etmez 16,17.

Son kanıtlar, "üç boyutlu" veya "3D" kültür tekniklerinin kanser bilimleri, kök hücre araştırmaları ve ilaç keşfi dahil olmak üzere çeşitli bilimsel disiplinlerde daha popüler hale geldiğini göstermektedir16,18. Enfeksiyon biyolojisi bağlamında, 3D doku modelleri, in vitro kontrollü bir mikro çevre içinde epitelyal veya mukozal bariyer arayüzünde konakçı-bakteriyel, mantar veya karışık tür etkileşimlerinin araştırılması için kullanılabilir. Bu modeller, 2D kültür sistemlerine göre birçok avantaja sahiptir, bu da doku kolonizasyonunun ve/veya patojenik organizmalar veya karmaşık biyofilm toplulukları tarafından istilasının değerlendirilmesineizin verir 17 ve 2D modellerin bazen transkripsiyonel veya proteomik profilleri tarafından kısıtlandığı farklı biyobelirteçler için konakçı yanıtlarının çok bileşenli bir düzeyde değerlendirilmesine olanak tanır 16,17,18. Sonuç olarak, bu tür 3D sistemlerin klinik öncesi uygulamaları çok geniştir ve in vivo modellere veya klinik çalışmalara götürülebilecek önemli keşif verileri sağlar.

Ağız sağlığı ve hastalığı bağlamında, oral mukozal yüzeyde yer alan inflamatuar yolakları anlamak klinisyenler için önemlidir, çünkü bu tedavi modalitelerini yönlendirebilir. Önceki çalışmalar, "sağlıkla ilişkili" biyofilmlerin minimal inflamatuar yanıtlar ortaya çıkarabileceğini göstermiştir 3,19,20,21. Bu, ağız sağlığı ile ilişkili daha düşük bir mikrobiyal biyolojik yükten veya biyofilmin Streptococcus spp. yaygın olarak bağışıklık düzenleyici olarak kabul edilir22,23. Öte yandan, Fusobacterium nucleatum ve Porphyromonas gingivalis gibi hastalıkla ilişkili mikroorganizmalardan oluşan biyofilmler, doğada proinflamatuardır 3,20,24,25,26,27. Mountcastle ve ark. 2020'de, oral mikro çevre17 için o sırada var olan tüm ilgili ko-kültür modellerini tanımladı. Her ne kadar bu tür organotipik modeller bol olsa da,28,29'dan bu yana birkaç tane üretilmiş, bu tür 3D modellerin oluşturulmasıyla ilgili bir dizi zorlu engel bulunmaktadır. Birkaçını saymak gerekirse, bu modeller önemli ölçüde optimizasyon gerektirir ve üretilmesi oldukça emek ve kaynak yoğundur; Tekrarlanabilirlik, dikkatli bir şekilde kontrol edilmedikçe oldukça değişken olabilir16,17. Ticari olarak mevcut modeller, ağız boşluğu içindeki ve insan vücudundaki diğer ekolojik nişlerdeki konak-patojen etkileşimlerini araştırmak için platformlar sağlayarak bu tür sorunları ortadan kaldırır.

Özetlemek gerekirse, mevcut protokol, ağız sağlığı ve hastalığı bağlamında in vitro olarak konak-patojen etkileşimlerini araştırmak için organotipik doku modellerinin uygulanmasını ana hatlarıyla belirtmeyi amaçlamaktadır. Spesifik olarak, tarif edilen model sistemi, oral inflamatuar hastalık olan gingivitis'i temsil eden tanımlanmış bir biyofilm topluluğuna maruz kalan çok katmanlı, ticari olarak temin edilebilen bir oral epitel kullanır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıdaki protokol, toplam 7 tür (spp.)7,30 içeren, gingivitisi temsil eden çok türlü bir biyofilmin hazırlanmasını içerir. Tükürük pelikülünün ilk kolonizörleri olarak işlev gören ağız sağlığını taklit etmek için üç Streptococcus spp., Streptococcus mitis (NCTC 12261), Streptococcus intermedius (DSM 20753) ve Streptococcus oralis (NTCC 11427) dahil edilmiştir. Daha sonra ağız sağlığından hastalığa geçişle ilişkili dört anaerobik mikroorganizma eklenir: Veillonella dispar (NCTC 11831), Actinomyces naeslundii (DSM 17233) ve iki Fusobacterium spp. Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953) ve Fusobacterium nucleatum alt türü (subspp.) vincentii (DSM 19507). İlgili tüm adımlar, alevde veya sınıf II güvenlik kabininde aseptik olarak gerçekleştirilir. Mikrobiyolojik preparatlar için kullanılan tüm ortam ve fosfat tamponlu salin (PBS) kullanımdan önce otoklavlanır ve protokol sırasında düzenli aralıklarla sterilite değerlendirilir. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Mikrobiyal toplulukların ko-kültür için hazırlanması

NOT: Bu protokol, diş eti iltihabı olarak da bilinen diş eti dokusunun iltihabı ile ilişkili konsorsiyumları temsil eden çok türlü bir biyofilm oluşumunu tasvir eder. Böyle bir model, daha önce tarif edildiği gibi, ağız sağlığı ve hastalığında konak yanıtının değerlendirilmesi için kullanılmıştır3.

  1. -80°C'de depolanan mikroorganizmaları içeren donmuş gözenekli boncuk stoklarından (ticari olarak elde edilen) kanlı agar plakalarında (%5 steril defibrinasyonlu at kanı içeren Columbia Blood Agar tabanı) üç Streptococcus türünü de canlandırın.Bu, bir aşılama halkası ve çizgi plakası tekniği kullanılarak elde edilir.
    1. 37 ° C'de,% 5 CO2'de 24 saat inkübe edin, ardından 10 mL Tripton Soya Suyu ortamına çoğaltmak için 3-4 koloniyi izole edin. Kültür suyu 37 ° C'de 16-18 saat,% 5 CO2.
  2. Ara patojenler için V. dispar, A. naeslundii, F. nucleatum ve F. nucleatum subspp'yi canlandırın. vincentii anaerobik olarak 37 ° C'de 48 saat boyunca% 5 steril defibrine at kanı içeren Titiz Anaerobik Agar tabanı üzerinde, aynı koşullar altında 24-48 saat daha Schaedler'in suyunda kültürden önce.
  3. Büyümeden sonra, pelet hücresi santrifüjleme ile 5 dakika, 3000 x g'da 20 ° C'de süspansiyon haline getirilir, ardından peletleri 10 mL steril PBS'de (pH 7.2-7.6) yıkayın. Pelet hücresi, 3000 x g'da 5 dakika, 20 ° C'de santrifüjleme yoluyla tekrar süspansiyon yapar, ardından yıkama adımlarını ikinci kez tekrarlayın. Standardizasyon için yıkanmış hücreleri 10 mL steril PBS'de yeniden süspanse edin.
  4. Her üç Streptococcus spp.'yi 550 nm'de bir spektrofotometre kullanarak ayrı ayrı standartlaştırın. 0.50'lik absorbans değerleri (0.45-0.55 kabul edilebilir aralık), daha önce Miles ve Misra hücre sayımı tekniği31 kullanılarak belirlendiği gibi, ~ 1 x 108 hücre / mL'lik bir hücre sayısının göstergesidir. Bu absorbans okumasını elde etmek için, steril PBS'de 10 mL yıkanmış hücre süspansiyonunu daha da seyreltin.
  5. Standardizasyonun ardından, tüm Streptococcus spp. 1: 1 Todd Hewitt Broth (THB) ve Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamının 1: 1 karışımında 1: 10 ila 1 x 107 hücre / mL. 13 mm çapında bir hidroksiapatit disk içeren 24 oyuklu bir mikrotitre doku kültürü plakasına pipetleme yoluyla 500 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Biyofilmleri 37 ° C'de,% 5 CO2'de 24 saat olgunlaşmaya bırakın.
    NOT: Çok türlü biyofilmler, mine, dentin32 ve poli (metil metakrilat) protez yüzeyleri 33,34 gibi ağızla ilgili farklı substratlarda büyütülebilir. Bu modeller için yapay veya sentetik tükürük gibi alternatif ortamlar da kullanılabilir, ancak kullanılan mikroorganizma konsorsiyumuna bağlı olarak dikkatli bir değerlendirme yapılmalıdır: çalışmalar, büyüme ortamı seçiminin karma topluluk biyofilm büyümesi için önemli etkileri olduğunu göstermiştir35,36.
  6. Ertesi gün, dört anaerobik mikroorganizmayı yukarıdakine benzer şekilde standardize edin (adım 1.2-1.4). Pelet hücresi süspansiyonları, iki kez yıkayın, daha sonra V. dispar'ı 0.50 absorbansa (0.45-0.55 aralığında) ve kalan üç mikroorganizmayı 0.20 absorbansa (0.18-0.22 aralığında) standardize edin. Standartlaştırıldıktan sonra, tüm süspansiyonları 1: 1 THB ve RPMI karışımında 1: 10 ila 1 x 107 hücre / mL daha da seyreltin.
  7. Yapışmamış hücreleri ve kullanılmış ortamları dikkatlice çıkarın ve pipetleme yoluyla Streptococcus biyofilmlerinden atın. Mikrotitre plaka kuyucuklarını, dört anaerobun 500 μL standartlaştırılmış 1 x 107 hücre / mL süspansiyonları ile değiştirin. 37 ° C'de anaerobik koşullar altında 24 saat boyunca kültür biyofilmleri.
  8. 24 saat sonra, yapışmamış hücreleri ve kullanılmış ortamı 7 tür biyofilmlerden çıkarın ve 500 μL steril 1: 1 THB: RPMI ortamı karışımı ile değiştirin. Biyofilmler anaerobik olarak 37 °C'de 4 gün boyunca olgunlaşmaya bırakılır, besiyeri çıkarılır ve günlük olarak yenilenir (toplam dört besiyeri değişir).
  9. 7. günde, çok türlü biyofilm tamamen olgunlaşır ve sonraki deneyler için hazırdır. Ko-kültürde kullanmak için biyofilmleri 500 μL steril PBS ile iki kez yıkayın.
    NOT: Biyofilmler, daha önce açıklandığı gibi qPCR (bileşimsel değerlendirme için) ve konfokal veya elektron mikroskobu ile mikroskobik profilleme gibi bir dizi biyolojik metodoloji kullanılarak profillenebilir3.

2. Organotipik doku işleme ve deney düzeneği

NOT: Aşağıda açıklanan deney düzeneği, inert bir polikarbonat membran filtre üzerinde yetiştirilen TR146 hücrelerinden oluşan İnsan Oral Epitel (HOE) dokusunu içerir. Epidermis modelleri, mesane, özofagus, kornea, diş eti ve vajinal epitel dahil olmak üzere başka modeller de mevcuttur. Tüm modeller, konak-patojen etkileşimlerini araştırmak için aşağıda tarif edilene benzer bir şekilde ele alınır ve hazırlanır.

  1. Varışta, HOE kağıt mendilini ve ortamını kutusundan çıkarın ve sınıf II güvenlik kabinine aktarın. Doku ile birlikte verilen toplam 1 mL bakım ortamını 12 oyuklu plakalara ekleyin.
  2. Steril cımbızla HOE içeren polikarbonat ekleri 24 oyuklu plakalardan ve nakliye için kullanılan besleyici agardan çıkarın ve bunları ortamı içeren 12 oyuklu plakalara aktarın, böylece dokunun altında hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Eklerin yanlarına veya altına yapışan fazla agarın ek bir cımbız veya kağıt mendil kullanılarak dikkatlice çıkarıldığından emin olun.
  3. Sevkıyattan sonra laboratuvar koşullarına uyum sağlamak için deney kurulumundan önce doku modellerini 37 °C'de %5CO2'de 24 saat inkübe edin. Doku modellerinin daha uzun süre bakımı veya daha fazla olgunlaşması için ek bakım ortamının veya büyüme ortamının mevcut olması dikkat çekicidir.
  4. Ko-kültür deneyleri artık yapılabilir. Burada verilen örnek için, yukarıdaki gibi oluşturulan 7 tür biyofilmleri (adım 1.1-1.9) sonikasyon ile substratlarından çıkarın. Bunu başarmak için, 19 G'lik bir iğne ve cımbız kullanarak 24 oyuklu plakaların altından biyofilm içeren HA disklerini çıkarın, ardından 1 mL steril Dulbecco'nun PBS'sini içeren bir bijuteri aktarın. Sonikasyon su banyosunda 10 dakika boyunca 35 kHz'de sonikate.
  5. Gece boyunca iklimlendirmeden cımbız kullanarak doku modellerini içeren ekleri dikkatlice çıkarın ve pipetleme ile doğrudan dokuya 100 μL biyofilm sonikat süspansiyonu ekleyin. Karşılaştırmalı amaçlar için uyarılmamış kontrol dokuları kullanın. Bu kontrol dokusu ekleri için, biyofilm süspansiyonu olmadan 100 μL steril Dulbecco PBS ekleyin.
    NOT: Planktonik hücreler, dağılmış hücreler içeren harcanmış biyofilm süpernatantları veya tüm biyofilmler, biyofilm sonikat yerine ko-kültür modeli için kullanılabilir. Farklı mikrobiyal uyarıcılar kullanan bu konakçı-patojen modelleri için farklı uygulamalar, 3,5,6,8,13,37,38 başka bir yerde belgelendiği gibi Şekil 1'de şematize edilmiştir.
  6. Eklemenin ardından, ekleri 1 mL taze bakım ortamı içeren başka bir 12 oyuklu plakaya aktarın ve yine eklerin altında hava kabarcığı bulunmadığından emin olun. Doku modelleri içeren plakaları, sonraki uygulamalar için doku işlemeden önce 37 ° C'de% 5 CO2 24 saat inkübe edin.
    NOT: Doku tedarikçileri, sonikasyonlu agregalara veya biyofilmlere maruz kaldıktan sonra dokunun devam eden kültürünü desteklemek için ek ortam sağlayabilir. Bu amaçla, uzun süreli doku biyofilm inokülasyonunu araştıran birkaç önceki model yayınlanmıştır 21,28,39. Mevcut organotipik modeli kullanarak benzer sonuçlar elde etmek için, dokuyu sonikasyon yapın (yukarıdaki gibi, adım 2.6) ve mikroorganizmaları 24 saat boyunca tutunmaya bırakın. Kalan mikrobiyal süspansiyonu atın ve gerekli deneysel zaman seyri için hava-sıvı arayüzünde kültüre devam edin.

3. Deneysel çıktılar için doku işleme

NOT: Ko-kültürü takiben, doku modelleri deneysel çıktılar için işlenir. Aşağıdaki adımlar, transkripsiyonel profil oluşturma için RNA'nın dokudan nasıl çıkarıldığını ve harcanan doku ortamının protein tespiti için nasıl kullanıldığını belgelemektedir. Doku, daha önce tarif edildiği gibi histolojik değerlendirme için formalin, paraformaldehit veya benzer bir fiksatif içinde de sabitlenebilir 3,6.

  1. İlk olarak, %1 β-merkaptoetanol ve ~100 μL eşdeğeri 0,5 mm asitle yıkanmış cam boncuk içeren 2,0 mL vidalı kapaklı O-Ring tüplerinde 350 μL RLT lizis tamponu hazırlayın.
  2. Dokuyu içeren ekleri cımbız kullanarak ortamdan çıkarın ve ek parçadan kalan mikrobiyal süspansiyonu atın. Ardından, kolaylık sağlamak için ters çevrilmiş olarak göz hizasında tutun. 19 G'lik bir iğne kullanarak, dokuyu ve zarı ekin altından dikkatlice dilimleyin ve RLT tamponuna aktarın.
    1. Bir tezgah üstü boncuk çırpıcı homojenizatör kullanarak dokuyu 30 saniyede homojenize edin, ardından üreticinin RNA ekstraksiyon kitinin talimatlarını izleyerek lizattan RNA'yı çıkarın (bkz. Malzeme Tablosu).
      NOT: Ekstrakte edilen RNA, kantitatif PCR (qPCR) veya RNA dizilimi kullanılarak inflamasyon belirteçleri olarak sitokin ve kemokin genlerinin ekspresyonunun profilini çıkarmak için cDNA sentezi için kullanılır. qPCR, belirli genler için hazır primerlere sahip kuyucuklar içeren RT2 PCR profiler dizisi veya kurum içi tasarlanmış primer dizileri ve nükleaz içermeyen ddH2O3 ile SYBR yeşil bazlı reaktif gibi multipleks diziler kullanılarak elde edilir.
  3. ELISA'lar, multipleks immünolojik testler veya multipleks protein biyobelirteç analizi7 gibi düşük ve yüksek verimli metodolojileri kullanarak proteomik analizler için kalan harcanan doku ortamını (~ 850-900 μL) toplayın.
  4. Harcanan doku ortamını kullanarak, protein düzeyinde iltihaplanma ile ilişkili bir dizi belirteci değerlendirin. Kullanılmış ortam yukarıdaki metodolojiler için doğrudan kullanılabilir (adım 3.3) veya -20 °C veya -80 °C'de saklanabilir. Bu tür analizler için ortamın birden fazla donma-çözülme döngüsünden kaçının.
    NOT: ELISA'lar kullanılarak doğru proteomik profilleme için doku uyarıcısına bağlı olarak ortamın 1:10 oranında seyreltilmesi gerekebilir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu deneyde, HOE, ağız sağlığından diş eti iltihabına (diş eti iltihabı olarak bilinir) geçişi temsil eden organizmayı içeren 7 tür biyofilm sonikata maruz bırakıldı. Bu hastalık, diş yüzeyinde diş plağı birikmesinden kaynaklanan mikrobiyal bozulmalara bağlı olarak dişeti veya ağız epitel dokusunun iltihaplanmasından kaynaklanır. Stimülasyonu takiben, doku ve harcanan ortam, yukarıda tartışıldığı gibi transkripsiyonel ve proteomik analizler için kullanılır. Bu deney için, biyofilm sonikat ile stimülasyon sonrası dokuda bir inflamatuar biyobelirteç panelinin gen ekspresyonu tespit edildi (Şekil 2). Bu, 16 farklı gen içeren özel yapım bir RT2 PCR profilleyici dizisi kullanılarak elde edildi ve gen ekspresyonu, temizlik geni GAPDH'ye normalizasyonu takiben uyarılmamış dokuya göre kat değişikliği olarak gösterildi. Mikrobiyal stimülasyon, CXCL5 hariç tüm genlerin ekspresyonunu arttırdı, NFKB, CCL2, CXCL1, CXCL3, CSF2, CSF3, TNF, IL1A, IL1B ve TLR4 için istatistiksel farklılıklar görüldü (Şekil 2A). En büyük kıvrım değişikliği CCL2, CXCL1 ve CSF3 için sırasıyla 16.9, 10.3 ve 15.1'lik artışlarla gözlendi (Şekil 2B).

Kullanılmış HOE ortamı, stimülasyonu takiben doku tarafından üretilen ve salınan proteinleri tespit etmek için proteomik analizler için kullanıldı. Bu, gen ekspresyonunun protein üretimi ile ilişkili olup olmadığını belirlemek için yararlıdır. Bunu yapmak için, kontrol dokusunda ve biyofilm sonikat ile uyarılmış dokuda IL8 gen ekspresyonu ve IL-8 protein salınımı değerlendirildi (Şekil 3). Gen ekspresyonu, daha önce tarif edildiği gibi IL8 ve GAPDH için primerlerle SYBR-green bazlı qPCR kullanılarak değerlendirildi3. HOE'deki IL8 mRNA ekspresyonu, biyofilm sonikat ile stimülasyonu takiben 8.67 kat artmıştır (Şekil 3A). Protein seviyesinde, IL-8 seviyeleri bir IL-8 ELISA kiti kullanılarak ölçüldü. Harcanan ortamdaki IL-8 konsantrasyonu, kontrol dokusunda ~ 1.005 ng / mL'den biyofilm sonikat ile uyarılan dokuda ~ 4.245 ng / mL'ye yükseltildi (Şekil 3B).

figure-results-1
Şekil 1: Organotipik doku ko-kültür modelleri için farklı uygulamalar. Mikroorganizmaların standartlaştırılmış süspansiyonları, tür-konak etkileşimlerini araştırmak için doğrudan dokuya uygulanır (A). Bunlar genellikle kısa bir süre boyunca mikrobiyal kolonizasyonu değerlendirmek için kullanılır (ör., <24 saat). Dağınık hücrelerin veya biyofilm agregatlarının dokular üzerindeki etkilerini araştırmak için kompleks biyofilmler sonikleştirilir (B). Bu önemlidir, çünkü daha önce bu tür hücrelerin planktonik veya biyofilm muadillerine kıyasla benzersiz fenotiplere sahip olduğu gösterilmiştir; bu amaçla, bozulmamış biyofilmler, konakçı (C) ile bitişik pozlama oluşturmak için ek daha küçük ekler kullanılarak doğrudan dokuya eklenebilir. Son olarak, dokudaki mikrobiyal kolonizasyon, biyofilm oluşumu ve büyüme dinamiklerini değerlendirmek için planktonik hücreler uygun kültür ortamında dokuya eklenir (D). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: 7 tür biyofilm sonikat ile stimülasyonu takiben HOE dokusunun gen ekspresyonu. mRNA ekspresyon katlama değişimi, kontrol altındaki HOE dokusunda, uyarılmamış numunelerde ve 100 μL 7 tür biyofilm sonikata (A) maruz kalan, temizlik geni GAPDH'ye normalize edilmiştir. mRNA ekspresyonunda en yüksek değişikliklere sahip üç gen (CCL2, CXCL1, CSF3) (B)'de gösterilmiştir. İstatistiksel analizler parametrik eşleşmemiş T-testi kullanılarak yapıldı ve anlamlı değişiklikler sırasıyla *p < 0.05, **p < 0.01 ve ***p < 0.001 olarak gösterildi. Veriler, istatistiksel ve grafik yazılımları kullanılarak çizildi ve analiz edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: HOE dokusu tarafından üretilen IL8 gen ekspresyonu ve IL-8 protein seviyeleri. SYBR-yeşil bazlı qPCR (A) ve ELISA metodolojisi (B) kullanılarak harcanan doku ortamından ölçülen IL-8 protein seviyeleri ile belirlenen HOE dokusunda IL8'in mRNA ekspresyon kat değişimi. İstatistiksel analizler parametrik eşleşmemiş T-testi kullanılarak yapıldı ve anlamlı değişiklikler sırasıyla *p < 0.05 ve ****p < 0.0001 olarak gösterildi. Veriler, istatistiksel ve grafik yazılımları kullanılarak çizildi ve analiz edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, mikrobiyal stimülasyonu takiben konakçı tepkisini değerlendirmek için HOE dokusu ile birlikte kültürleme için diş eti iltihabını temsil eden karmaşık bir çok tür biyofilm modeli üretmek için metodolojiler açıklanmaktadır. Bu protokol, planktonik hücreler, tek, çift veya karışık tür biyofilmler veya insan vücudundaki farklı ekolojik nişlerden epitel dokusu ile biyofilm dağılmış hücreler arasındaki konak-patojen etkileşimlerinin araştırılmasında kullanılmak üzere uyarlanabilir. Konak-patojen etkileşimlerini araştırmak için doku modellerinin kullanılması, in vivo durumu her zaman tam olarak özetlemeyen 2D tek katmanlarla sınırlı olan önceki ko-kültür sistemlerine önemli bir ilerleme sağlar, bu sayede epitel dokusu birden fazla hücre katmanı içerir 16,17,18. Ayrıca, çok katmanlı doku modellerinin in vitro büyümesi ile ilgili zorluklar, çoklu hücre hatlarının kullanılması ve/veya kontaminasyona eğilimli bir hava-sıvı arayüzünde hücre katmanlarının büyümesi ile çok fazladır. Ticari olarak temin edilebilen dokular, önceki yayınlarda 3,7 gösterildiği gibi, replikasyonlar ve partiler arasında karşılaştırılabilir, tutarlı bir şekilde yüksek kaliteli modellerle tekrarlanabilir bir platform sağlar.

"Ko-kültür için mikrobiyal toplulukların hazırlanması" bölümü için, bu mikroorganizmaların 7 tür diş eti iltihabı modeline dahil edilmesi, ağız sağlığından hastalığa geçişle ilişkili yaygın olarak tanımlanmış kommensallere ve patojenlere dayalı olarak seçilmiştir. İn vitro olarak tüm karmaşık biyofilm model sistemlerinde olduğu gibi, mikroorganizmaların dahil edilmesi, belirli sağlıklı veya hastalıklı ekolojik niş ile ilgili mikrobiyom çalışmaları tarafından yönlendirilir. Bu amaçla, biz ve diğerleri, kommensal mikroorganizmalar (örneğin, Streptococcus ve Rothia spp.) içeren ağız sağlığıyla ilişkili bir biyofilm modelinin kullanıldığını bildirdik.3,40,41. Ayrıca, diğer hastalıklarla ilişkili biyofilmler oluşturmak için bu modellere ek patojenler eklenebilir. Örneğin, periodontitis3 ile ilişkili bir hastalık modeli oluşturmak için burada açıklanan 7 türe üç mikroorganizma eklenebilirken, mantar patojeni Candida albicans polimikrobiyaliteyi arttırmanın yanı sıra bir interkingdom karmaşıklık katmanı eklemek için eklenebilir33. Gerçekten de, mantar-bakteri etkileşimlerinin teşvik edilmesi, yalnızca bakteriyel biyofilmlerle karşılaştırıldığında, in vitro olarak bu tür biyofilm modellerinin kullanıldığı çeşitli deneysel çıktılar üzerinde büyük etkilere sahip olabilir42. Sonuç olarak, bu tür çalışmalar için yeni bir çok türlü biyofilm modeli oluştururken dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi şiddetle tavsiye edilir. Dahil edilen mikroorganizmaların kapsamlı literatür taramalarından kolayca tanımlanabilmesi gerekirken, çoğu niş ve / veya hastalık için, bunlar farklı nedenlerle in vitro karmaşık bir modele iyi entegre olmayabilir. Aşağıda, yapılması gereken diğer bazı olası hususlar gösterilmektedir:

Biyofilm oluşum dinamikleri
İn vivo biyofilm oluşumu genellikle belirli mikroorganizmalar tarafından erken, orta ve geç kolonizasyonu içerir. Supra- ve subgingival dental plak oluşumu, diş minesi üzerinde bulunan tükürük pelikülünün öncü türler (örneğin, Streptococcus türleri) tarafından ilk bağlanması ile yoğun bir şekilde karakterize edilir ve orta ve sonraki patojenler bunları kolonizasyon için bir iskele olarak gerektirir43. Bakteriyel vajinozis sırasında vajinal ortamda da benzer bir fenomen önerilmiştir, bu sayede Gardnerella vaginalis'in ilk kolonizatör olduğuna inanılmaktadır, bunu sonraki anaeroblarizlemektedir 44. Bununla birlikte, bunun diğer ekolojik nişlerdeki diğer hastalıklar için geçerli olmayabileceğine dikkat etmek önemlidir.

Her mikroorganizma için tohumlama yoğunluğu
Mikroorganizmalar, in vitro olarak kültürlendiğinde farklı boyutlara ve / veya büyüme dinamiklerine sahip olacaktır; Bu nedenle, standardizasyon sürecinde bunu göz önünde bulundurmak önemlidir. Örneğin, C. albicans bakteri hücrelerinin 45,46 boyutunun 100-150 katıdır, bu nedenle, bu tür biyofilm modellerine daha düşük bir konsantrasyonda, örneğin 1 x 106 hücre / mL'de eklenmesini gerektirebilir.

Tür antagonizması
Bu modeller için kullanılan bazı mikroorganizmalar (aynı tür ancak farklı izolatlar, laboratuvar ve/veya klinik suşlar dahil) biyofilm oluşumu sırasında diğerleriyle rekabet edebilir ve bu da bazı mikrobiyal türlerin büyümesinin engellenmesine yol açabilir47. Sadiq ve ark. tarafından yapılan bir araştırma, farklı mikroorganizma kombinasyonlarının mikrobiyal sinerjiden (veya antagonizmadan) kaynaklanan biyofilm biyokütlesini nasıl etkileyebileceğini vurguladı48. Bir biyofilm modelinde bu tür etkileşimlerin araştırılması araştırma gruplarının ilgisini çekebilse de (örneğin, ön veya probiyotik tedavisinin test edilmesi), diğerleri modeli oluştururken çoklu tür karmaşıklığını etkileyebilecek bu tür antagonizmayı açıklayamayabilir.

Biyofilm olgunlaşma süresi
Biyofilm olgunlaşma zaman dilimlerini optimize etmek çok önemlidir, çünkü bu, dahil edilen mikroorganizmaların büyüme dinamiklerine ve kültür için kullanılan model sisteme (substrat dahil) bağlı olabilir. Daha uzun olgunlaşma süreleri, daha sonraki patojenler için daha iyi kolonizasyona neden olabilir, ancak modellerde, özellikle de daha önceki kolonizatörlerde daha fazla hücre ölümüne neden olabilir. Tersine, olgunlaşmamış biyofilm modellerinin konakçı üzerindeki etkilerini araştırmak istiyorsanız, daha kısa kuluçka süreleri önemli olabilir. Brown ve ark. tarafından yapılan bir çalışmada, aynı 10 tür yara biyofilm modelinin, 24 saat, 48 saat ve 72 saat olgunlaştığında insan THP-1 hücrelerinde farklı inflamatuar profillere sahip olduğu açıklandı, bu da biyofilm ne kadar az olgunlaşırsa, o kadar proinflamatuar olduğunu düşündürür7. Çok katmanlı doku modellerinde de benzer sonuçlar gözlemlenebilir. Biyofilmde hücre ölümünü en aza indirmek için düzenli günlük ortam değişikliklerinin bir gereklilik olduğuna dikkat etmek de önemlidir, ancak bu, devam eden tedavi rejimlerine bağlı olarak, örneğin uzun süreli antimikrobiyal müdahalelerin etkilerini değerlendiriyorsa değiştirilebilir.

"Organotipik doku işleme, deney düzeneği ve doku işleme" bölümü için inkübasyon zaman dilimleri araştırmacının ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir. Konak-patojen etkileşimleri, araştırma sorusuna bağlı olarak daha erken zaman noktalarında, örneğin 1-12 saat, daha sonraki 48 saat ve 72 saat zaman noktalarında araştırılabilir. İkinci olarak, antibiyotik içeren tüm bakım ortamları sağlanır; Bu nedenle, deney tasarımına bağlı olarak bunların kaldırılması için sipariş üzerine şirkete talepte bulunulması gerekir. Ek parçanın altındaki ortam, dokunun üst çevresi ile doğrudan temas etmese de, model 6,8'de bir yara açılmadıkça, dokuya mikrobiyal invazyon araştırılıyorsa, antibiyotiklerin çıkarılması dikkate alınmayı hak edebilir.

Ko-kültür stimülasyonu için kullanılan mikrobiyal materyal, yukarıda tartışıldığı gibi, planktonik, kullanılmış biyofilm süpernatanları (filtrelenmiş ve filtrelenmemiş), tüm biyofilmler veya doku ile biyofilm sonikat inkübasyonlarını değerlendirmek için kapsam ile de değiştirilebilir. Örneğin, önceki kanıtlar, EpiSkin tarafından sağlananlar gibi doku modellerinin, planktonik mantar-konak etkileşimlerini araştırmak için yararlı modeller sağladığını göstermiştir: C. albicans, Candida auris, Malassezia furfur ve Trichophyton rubrum hücrelerinin HOE, Yeniden Yapılandırılmış İnsan Epidermisi (RHE) veya İnsan Vajinal Epitelinde periferik doku katmanlarına bağlandığı ve bunlarla etkileşime girdiği gösterilmiştir ve bu çalışmalardan bazıları bir konak yanıtının uyarıldığını göstermektedir mantar enfeksiyonunu takiben 1,5,6,11,12,49. Bakteriyel-konak etkileşimleri için de benzer yayınlar mevcuttur, örneğin, kepekte kafa derisi mikrobiyotası ile ilişkili yaygın bir patojen olan Cutibacterium acnes'in biyofilm oluşumu, tek başına ve mantar deri organizması Malassezia restricta10 ile kültürlendiğinde RHE yüzeyinde incelenmiştir. Diğerleri, Staphylococcus spp.'nin RHE'ye bağlanma yeteneğini araştırmış ve bu bakteri-konak etkileşiminin fizikokimyasal ve mikrobiyolojik özelliklerini ölçmüştür50. N'Diaye ve ortak yazarlar, insan kaynaklı nöropeptit olan Kalsitonin Geniyle İlgili Peptit'in RHE doku modeli51'de Staphylococcus aureus virülansını nasıl etkilediğini araştırdılar. Diğerleri, probiyotik müdahalelerin İnsan Kornea Epiteli14'ün Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonu üzerindeki koruyucu etkilerini araştırmıştır. Bu arada, polimikrobiyal bir bakış açısıyla, farklı gruplar karışık tür biyofilmlerin farklı doku substratları üzerindeki etkilerini incelemiştir 2,3,7,13.

Genel olarak, yukarıda atıfta bulunulan bu protokoller ve çalışmalar, konakçı-patojen etkileşimlerini araştırmak için organotipik doku modelleri için çok çeşitli uygulamaları belgelemektedir. Çalışmalar, EpiSkin modellerinin, özellikle RHE cilt modelinin, kozmetik ürünleri korozyon/tahriş açısından test etmek için iyi bir uygulanabilirliğe sahip olduğunu göstermiş olsa da 52,53,54,55, bunlar ile gerçek dünyadaki ex vivo doku eksplantları veya ticari olarak temin edilebilen diğer doku tedarikçileri arasında bazı sınırlamalar mevcuttur 56,57. Bariz bir sınırlama, ticari olarak temin edilebilen tüm doku modellerinin steril, "mikropsuz" bir ortamda hücre hatlarından üretilmesidir, bu da dokunun hiçbir zaman mikrobiyal bozulmalara maruz kalmadığı anlamına gelir: bu, konakçıdaki herhangi bir enflamatuar yanıtı şiddetlendirebilir, in vivo olarak veya ex vivo doku eksplantlarının uyarılmasını takiben görülenin çok ötesinde57. Tersine, bu laboratuvar model sistemleri, in vivo doku ile ilişkilendirilebilecek altta yatan bağ katmanlarını veya vas sistemini, ex vivo doku eksplantasyonu sırasında korunabilecek özellikleri ve inflamatuar yanıtları etkileyen özellikleri içermeyecektir. Nitekim, yakın zamanda yapılan bir sistematik inceleme, biyomalzemeler de dahil olmak üzere çeşitli mühendislik teknolojileri kullanılarak oluşturulan uygun damar sistemine sahip doku modellerinin kullanılması için dikkatli bir değerlendirme yapılması gerektiğini vurgulamıştır58. Örneğin, yakın tarihli bir çalışmada, vaskülarize bir dişeti dokusu eşdeğeri oluşturmak için dişeti fibroblastları ve mikrovasküler endotel hücreleri ile gömülü fibrin bazlı bir matris kullanılmıştır. Yazarlar, sağlığa veya hastalıkla ilişkili mikroorganizmalara maruz kaldıktan sonra modelde farklı bir inflamatuar yanıt tanımladılar59. Ticari bir bakış açısından, epidermis ile kaplanmış fibroblastlardan oluşan bir dermisten oluşan tam kalınlıkta bir doku içeren "T-Skin modeli" gibi daha karmaşık modeller artık mevcuttur. Bu tür karmaşık modellerin sadece epidermis sistemleriyle nasıl karşılaştırıldığını görmek ilginç olurdu.

Hiçbir model mükemmel olmasa da, organotipik doku modelleri, hayvan araştırmalarının yürütülmesinde Değiştirme, Azaltma ve İyileştirme için üç R tarafından belirtilen çerçeve ile uyumlu olarak klinik öncesi testler için umut verici alternatifler sunar. Bu amaçla, hayvan modelleri biyofilm ile ilişkili insan hastalıklarının karmaşık patofizyolojik doğası hakkında önemli bilgiler sağlasa da, bariz dezavantajlara sahiptir. Bu 3B modeller kolayca manipüle edilebilir ve etik onay olmadan soruşturmalarda büyük, ince değişikliklere izin verir. Bu modelleri yukarıda özetlenen mevcut karmaşık biyofilm sistemleriyle birleştirmek, konak-patojen etkileşimleri hakkındaki anlayışımızı büyük ölçüde geliştirebilir ve in vivo araştırmalardan önce yeni tedavilerin başarısını daha iyi tahmin edebilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Saeed Alqahtani'nin tarif edilen doku modelleriyle ilgili projeleri yürütmesi için fon desteği için Haleon'a ve Muhanna Alshehri'nin doktora fonu için Suudi Arabistan Eğitim Bakanlığı'na teşekkür eder.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
13 mm hidroksiapatit (HA) disklerPlasma Biotal Limitedn/a (sipariş üzerine yapılır)Diş yüzeyini taklit eden oral biyofilm oluşumu için substrat
19 G iğne (40 mm) VWR613-2028HA disklerinin plakalardan çıkarılmasına yardımcı olmak ve eklerden dokuyu kesmek için kullanılır
24 iyi TC ile tedavi edilmiş kapaklı düz tabanlı mikrotitre plakaları Bilimsel Laboratuvar Malzemeleri3524 (100'lük paket)Biyofilmlerin kültürlenmesi ve doku ko-kültür deneyleri için plakalar
Asitle yıkanmış cam boncuklar (425-600 & mu; m)Merck: Sigma-AldrichG8772RNA ekstraksiyonunun verimini artırmak için doku lizisi için   
Actinomyces naeslundii DSM 17233 Leibniz Institute DSMZn/aKarmaşık biyofilm modeli için kullanılan mikroorganizmalardan biri
Bead Mill 24 Homojenizatör (veya eşdeğeri) Fisher Scientific15-340-163RNA ekstraksiyonunun verimini artırmak için doku lizisi için   
Bijuteriler  (7 mL)Greiner Bio-One189170 (torba başına 700)Biyofilm sonikasyonu için kullanılır   
cDNA sentez kiti (yüksek kapasiteli)Thermo Fisher Scientific4368814 (200 reaksiyon için)doku RNA'sından cDNA sentezi
Columbia Blood Agar (CBA) bazı Thermo Fisher Scientific CM0331B(500 gram için)Aerobik mikroorganizmaların kültürlenmesi için CBA plakaları hazırlamak için kullanılır
Defibrine at kanıE& Ø LaboratuvarlarDHBAerobik ve anaerobik mikroorganizmaların kültürlenmesi için CBA ve FAA plakalarını desteklemek için kullanılır
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (dPBS: CaCl2< / sub> ve MgCl olmadan 2 < / sub>)Biyofilm sonikat ile hücre ko-kültürü içinSigma-AldrichDB537
Fusobacterium nucleatum ATCC 10953Amerikan Tipi Kültür KoleksiyonuyokKarmaşık biyofilm modeli için kullanılan mikroorganizmalardan biri
Fusobacterium nucleatum subspecies (subspp.) vincentii DSM 19507Leibniz Institute DSMZn/aKarmaşık biyofilm modeli için kullanılan mikroorganizmalardan biri
GraphPad Prism (Sürüm 10)GraphPad Software, Incn/aGrafik oluşturma ve veri analizleri için 
İnsan IL-8 ELISA kiti (plakalı kaplamasız ELISA kiti)Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)88-8086-86 (10 x 96 test için)Harcanan doku ortamının protein değerlendirmesi için ELISA kiti ve plakaları
İnsan Oral Epiteli (HOE) Episkinn/a (sipariş üzerine yapılır)Ko-kültür model sistemi için kullanılan epitel dokusu
Aşılama halkaları (tek kullanımlık, 10 ve mikro; L veya eşdeğeri) Fisher Scientific12870155 (1000'lik paket)Katıve sıvı ortamlarda mikrobiyolojik kültür için
MicroAmp Hızlı Reaksiyon 96 oyuklu qPCR plakaları (0,1 mL) Thermo Fisher Scientific 4346907(10 plaka için)boncuklarının qPCR gen ekspresyonu profili için
Pro-Lab DiagnosticsPL.170Mikroorganizmaların depolanması ve klonoptajı 
Nükleaz içermeyen suThermo Fisher ScientificAM9935 (10 x 1.5 mL)qPCR deneyleri için RT-PCR sınıfı su 
Petri Kapları (90 mm)Fisher Scientific (Sterilin) 11309283 (500'lük paket)Mikrobiyal kültür için agar plakalarının hazırlanmasında kullanılır
Fosfat tamponlu salin (PBS)Thermo Fisher Scientific 18912014 (100 tabletlik paket)Mikroorganizma standardizasyonu ve biyofilm yıkama adımları için PBS
Rneasy mini kitQiagen74106 (250 reaksiyon için)Doku için kolon bazlı RNA ekstraksiyon kiti 
Roswell Park Memorial Institute 1640 orta boyMerck: Sigma-AldrichR7755-10L (10 L için) Biyofilm kültürü için medya 
RT2 profil oluşturucu dizisiQiagen330171 (ısmarlama)gen ekspresyon profili oluşturma için hazır primerler içeren qPCR dizisi
Schaedler anaerob agar tabanıMerck: Sigma-Aldrich (Millipore)91019 (500 g için)Titiz Anaerobik Agar plakaları hazırlamak için kullanılır 
Schaedler anaerob suyuThermo Fisher Scientific CM0497B (500 g için)Anaerobik mikroorganizmaların büyümesi için sıvı ortam
Vidalı kapaklı Boncuk böceği O-Ring tüpü Bilimsel Laboratuvar MalzemeleriZ763837-1000EA (1000'lik paket)Bead Mill 24 homojenizatörde kullanım için, dokuyu parçalamak için
Sonikasyon banyosuFisher Scientific (Fisherbrand)yokHA disklerinden biyofilmlerin sonikasyonu için 
Streptococcus intermedius DSM 20753 Leibniz Enstitüsü DSMZn/aKompleks biyofilm modeli için kullanılan mikroorganizmalardan biri
Streptococcus mitis NCTC 12261Ulusal Tip Kültürleri Koleksiyonun/aKompleks biyofilm modeli için kullanılan mikroorganizmalardan biri
Streptococcus oralis NTCC 11427 Ulusal Tip Kültürleri Koleksiyonun/a Karmaşık biyofilm modeli için kullanılan mikroorganizmalardan biri
SYBR-green (qPCRBIO SyGreen Mix Hi-ROX)PCR BiosystemsPB20.12qPCR için SYBR-green karışımı 
Todd Hewitt suyuMerck: Sigma-AldrichT1438 Biyofilm kültürü için medya 
Tripton soya suyu (TSB) mediumMerck: Sigma-Aldrich22092 (500 g için)Aerobik mikroorganizmaların büyümesi için sıvı ortam
Cımbız (150 mm, Paslanmaz Çelik, Tırtıklı)RS-Pro 545-187HA diskleri ve doku eklerini/doku ekstraktlarını taşımak için kullanılır
Üniversal tüpler ve nbsp; (30 mL)Greiner Bio-One201150 (torba başına 400 adet)Sıvı kültürde mikroorganizmaların kültürlenmesi için kaplar 
Veillonella dispar NCTC 11831Ulusal Tip Kültürleri Koleksiyonun/a'Kompleksbiyofilm modeli için kullanılan mikroorganizmalardan biri
β-metakaptoetanolMerck: Doku örneklerinde Sigma-AldrichM3148RNaz deaktivasyonu
Merck: dPBSDoku Microbank

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moyes, D. L., et al. A biphasic innate immune MAPK response discriminates between the yeast and hyphal forms of candida albicans in epithelial cells. Cell Host Microbe. 8 (3), 225-235 (2010).
  2. Morse, D. J., et al. Denture-associated biofilm infection in three-dimensional oral mucosal tissue models. J Med Microbiol. 67 (3), 364-375 (2018).
  3. Brown, J. L., et al. Biofilm-stimulated epithelium modulates the inflammatory responses in co-cultured immune cells. Sci Rep. 9 (1), 15779(2019).
  4. Yadev, N. P., Murdoch, C., Saville, S. P., Thornhill, M. H. Evaluation of tissue engineered models of the oral mucosa to investigate oral candidiasis. Microb Pathog. 50 (6), 278-285 (2011).
  5. Schaller, M., Zakikhany, K., Naglik, J. R., Weindl, G., Hube, B. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia. Nat Protoc. 1 (6), 2767-2773 (2006).
  6. Brown, J. L., et al. Candida auris phenotypic heterogeneity determines pathogenicity in vitro. mSphere. 5 (3), e00371-e00420 (2020).
  7. Brown, J. L., et al. Assessing the inflammatory response to in vitro polymicrobial wound biofilms in a skin epidermis model. NPJ Biofilms Microbiomes. 8 (1), 19(2022).
  8. Butcher, M. C., et al. Antifungal-loaded calcium sulfate beads as a potential therapeutic in combating candida auris. Antimicrob Agents Chemother. 66 (1), e0171321(2022).
  9. Duckney, P., et al. The role of the skin barrier in modulating the effects of common skin microbial species on the inflammation, differentiation and proliferation status of epidermal keratinocytes. BMC Res Notes. 6, 474(2013).
  10. Meloni, M., Balzaretti, S., Collard, N., Desaint, S., Laperdrix, C. Reproducing the scalp microbiota community: Co-colonization of a 3D reconstructed human epidermis with c. Acnes and m. Restricta. Int J Cosmet Sci. 43 (2), 235-245 (2021).
  11. Pedrosa, A. F., et al. Malassezia colonisation on a reconstructed human epidermis: Imaging studies. Mycoses. 62 (12), 1194-1201 (2019).
  12. Schaller, M., Weindl, G. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia for the study of host-pathogen interactions. Methods Mol Biol. 470, 327-345 (2009).
  13. Rosca, A. S., et al. Six bacterial vaginosis-associated species can form an in vitro and ex vivo polymicrobial biofilm that is susceptible to thymbra capitata essential oil. Front Cell Infect Microbiol. 12, 824860(2022).
  14. Paterniti, I., et al. Protective effect of probiotics against pseudomonas aeruginosa infection of human corneal epithelial cells. Int J Mol Sci. 25 (3), 1770(2024).
  15. Pellegatta, G., et al. Evaluation of human esophageal epithelium permeability in presence of different formulations containing hyaluronic acid and chondroitin sulphate. Med Devices (Auckl). 13, 57-66 (2020).
  16. Jensen, C., Teng, Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, (2020).
  17. Mountcastle, S. E., et al. A review of co-culture models to study the oral microenvironment and disease. J Oral Microbiol. 12 (1), 1773122(2020).
  18. Cacciamali, A., Villa, R., Dotti, S. 3D cell cultures: Evolution of an ancient tool for new applications. Front Physiol. 13, 836480(2022).
  19. Langfeldt, D., et al. Health- and disease-associated species clusters in complex natural biofilms determine the innate immune response in oral epithelial cells during biofilm maturation. FEMS Microbiol Lett. 360 (2), 137-143 (2014).
  20. Ramage, G., et al. The epithelial cell response to health and disease associated oral biofilm models. J Periodontal Res. 52 (3), 325-333 (2017).
  21. Shang, L., et al. Multi-species oral biofilm promotes reconstructed human gingiva epithelial barrier function. Sci Rep. 8 (1), 16061(2018).
  22. Myers, S., et al. Immunomodulatory streptococci that inhibit cxcl8 secretion and NF-kappaB activation are common members of the oral microbiota. J Med Microbiol. 70 (3), 001329(2021).
  23. Tang, Y. L., Sim, T. S., Tan, K. S. Oral streptococci subvert the host innate immune response through hydrogen peroxide. Sci Rep. 12 (1), 656(2022).
  24. Peyyala, R., Kirakodu, S. S., Novak, K. F., Ebersole, J. L. Oral microbial biofilm stimulation of epithelial cell responses. Cytokine. 58 (1), 65-72 (2012).
  25. Yee, M., Kim, S., Sethi, P., Duzgunes, N., Konopka, K. Porphyromonas gingivalis stimulates il-6 and il-8 secretion in gsm-k, hsc-3 and h413 oral epithelial cells. Anaerobe. 28, 62-67 (2014).
  26. Groeger, S., Jarzina, F., Domann, E., Meyle, J. Porphyromonas gingivalis activates NF-kappaB and MAPK pathways in human oral epithelial cells. BMC Immunol. 18 (1), 1(2017).
  27. Groeger, S., Zhou, Y., Ruf, S., Meyle, J. Pathogenic mechanisms of fusobacterium nucleatum on oral epithelial cells. Front Oral Health. 3, 831607(2022).
  28. Li, X., et al. Saliva-derived microcosm biofilms grown on different oral surfaces in vitro. NPJ Biofilms Microbiomes. 7 (1), 74(2021).
  29. Krishnamoorthy, A. L., Lemus, A. A., Solomon, A. P., Valm, A. M., Neelakantan, P. Interactions between Candida albicans and Enterococcus faecalis in an organotypic oral epithelial model. Microorganisms. 8 (11), 1771(2020).
  30. Brown, J. L., et al. Generation of multi-species oral bacteria biofilm models. Methods Mol Biol. 2588, 187-199 (2023).
  31. Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. The estimation of the bactericidal power of the blood. J Hyg (Lond). 38 (6), 732-749 (1938).
  32. Lukic, D., Karygianni, L., Flury, M., Attin, T., Thurnheer, T. Endodontic-like oral biofilms as models for multi-species interactions in endodontic diseases. Microorganisms. 8 (5), 674(2020).
  33. Sherry, L., et al. Viable compositional analysis of an eleven-species oral polymicrobial biofilm. Front Microbiol. 7, 912(2016).
  34. Brown, J. L., et al. An in vitro evaluation of denture cleansing regimens against a polymicrobial denture biofilm model. Antibiotics (Basel). 11 (1), 113(2022).
  35. Ammann, T. W., Gmur, R., Thurnheer, T. Advancement of the 10-species subgingival zurich biofilm model by examining different nutritional conditions and defining the structure of the in vitro biofilms. BMC Microbiol. 12, 227(2012).
  36. Montelongo-Jauregui, D., Srinivasan, A., Ramasubramanian, A. K., Lopez-Ribot, J. L. An in vitro model for oral mixed biofilms of candida albicans and streptococcus gordonii in synthetic saliva. Front Microbiol. 7, 686(2016).
  37. Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nat Rev Microbiol. 18 (10), 571-586 (2020).
  38. Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nat Commun. 5, 4462(2014).
  39. Buskermolen, J. K., Janus, M. M., Roffel, S., Krom, B. P., Gibbs, S. Saliva-derived commensal and pathogenic biofilms in a human gingiva model. J Dent Res. 97 (2), 201-208 (2018).
  40. Rosier, B. T., Buetas, E., Moya-Gonzalvez, E. M., Artacho, A., Mira, A. Nitrate as a potential prebiotic for the oral microbiome. Sci Rep. 10 (1), 12895(2020).
  41. Rosier, B. T., Moya-Gonzalvez, E. M., Corell-Escuin, P., Mira, A. Isolation and characterization of nitrate-reducing bacteria as potential probiotics for oral and systemic health. Front Microbiol. 11, 555465(2020).
  42. Young, T., et al. Candida albicans as an essential "keystone" component within polymicrobial oral biofilm models. Microorganisms. 9 (1), 59(2020).
  43. Marsh, P. D., Lewis, M. A., Rogers, H., Williams, D., Wilson, M. Marsh and Martin's oral microbiology-e-book: Marsh and Martin's oral microbiology-e-book. , Elsevier Health Sciences. (2016).
  44. Johnston, W., et al. In vitro bacterial vaginosis biofilm community manipulation using endolysin therapy. Biofilm. 5, 100101(2023).
  45. Janus, M. M., Willems, H. M., Krom, B. P. Candida albicans in multi-species oral communities; a keystone commensal. Adv Exp Med Biol. 931, 13-20 (2016).
  46. Delaney, C., et al. Fungi at the scene of the crime: Innocent bystanders or accomplices in oral infections. Curr Clin Microbiol Rep. 5, 190-200 (2018).
  47. Luo, A., Wang, F., Sun, D., Liu, X., Xin, B. Formation, development, and cross-species interactions in biofilms. Front Microbiol. 12, 757327(2021).
  48. Sadiq, F. A., De Reu, K., Burmolle, M., Maes, S., Heyndrickx, M. Synergistic interactions in multi-species biofilm combinations of bacterial isolates recovered from diverse food processing industries. Front Microbiol. 14, 1159434(2023).
  49. Liang, P. P., et al. A trichophyton rubrum infection model based on the reconstructed human epidermis - EpiSkin(r). Chin Med J (Engl). 129 (1), 54-58 (2016).
  50. Lerebour, G., Cupferman, S., Bellon-Fontaine, M. N. Adhesion of staphylococcus aureus and staphylococcus epidermidis to the EpiSkin reconstructed epidermis model and to an inert 304 stainless steel substrate. J Appl Microbiol. 97 (1), 7-16 (2004).
  51. N'diaye, A. R., et al. Skin-bacteria communication: Involvement of the neurohormone calcitonin gene-related peptide (cgrp) in the regulation of staphylococcus epidermidis virulence. Sci Rep. 6, 35379(2016).
  52. Géniès, C., et al. Comparison of the metabolism of 10 cosmetics-relevant chemicals in EpiSkin s9 subcellular fractions and in vitro human skin explants. J Appl Toxicol. 40 (2), 313-326 (2020).
  53. Alépée, N., Grandidier, M. -H., Cotovio, J. Usefulness of the EpiSkin reconstructed human epidermis model within integrated approaches on testing and assessment (IATA) for skin corrosion and irritation. Toxicol Vitro. 54, 147-167 (2019).
  54. Spielmann, H., et al. The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: Report on the validity of the EpiSkin and epiderm assays and on the skin integrity function test. Alternatives to Laboratory Animals. 35 (6), 559-601 (2007).
  55. Cotovio, J., Grandidier, M. -H., Portes, P., Roguet, R., Rubinstenn, G. The in vitro acute skin irritation of chemicals: Optimisation of the EpiSkin prediction model within the framework of the ECVAM validation process. Alt Lab Anim. 33 (4), 329-349 (2005).
  56. Netzlaff, F., Lehr, C. M., Wertz, P. W., Schaefer, U. F. The human epidermis models EpiSkin, SkinEthic and epiderm: An evaluation of morphology and their suitability for testing phototoxicity, irritancy, corrosivity, and substance transport. Eur J Pharm Biopharm. 60 (2), 167-178 (2005).
  57. Larson, P. J., Chong, D., Fleming, E., Oh, J. Challenges in developing a human model system for skin microbiome research. J Invest Dermatol. 141 (1), 228-231.e4 (2021).
  58. Dechelette, C., Smirani, R., Medina, C., Naveau, A. Cellularized biomaterials used as gingival connective tissue substitutes in vivo: A systematic review. Tissue Eng Part B Rev. , (2024).
  59. Makkar, H., Lim, C. T., Tan, K. S., Sriram, G. Modeling periodontal host-microbe interactions using vascularized gingival connective tissue equivalents. Biofabrication. 15 (4), (2023).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Organotipik Doku ModelleriEpitel ModelleriBiyofilm Ko K lt rIn Vitro EnfeksiyonMikrobiyal AdhezyonGen Ekspresyon AnaliziProteomik ProfillemeMultiplex qPCRnflamatuar Biyobelirte ler

İlgili makaleler