Bu el yazması, optimal nötrofil canlılığını ve yüksek kütüphane kalitesini garanti etmeyi amaçlayan, murin kemik iliğinden nötrofillerden oluşan bir ATAC-seq kütüphanesi hazırlamak için bir protokolün ana hatlarını çizmektedir. BMC hazırlama, immünomanyetik sıralama ve kütüphane yapımı hakkında adım adım talimatlar sunarak, özellikle nötrofilleri incelemeye yeni başlayanlar için değerli bir rehber görevi görür.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Murin Kemik İliği Kaynaklı Nötrofillerin ATAC-Seq Kütüphanesi Hazırlanması
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Dizileme ile Transpozaz Erişilebilir Kromatin Testi (ATAC-seq), kromatin erişilebilirliğini değerlendirmek ve epigenomik regülasyonu anlamak için güçlü, yüksek verimli bir tekniktir. İmmün yanıtlarda çok önemli bir lökosit türü olan nötrofiller, farklılaşma ve aktivasyon sırasında önemli kromatin mimari değişikliklerine uğrar ve bu da işlevleri için gerekli gen ekspresyonunu önemli ölçüde etkiler. ATAC-seq, nötrofil olgunlaşmasında anahtar transkripsiyon faktörlerini ortaya çıkarmada, patojene özgü epigenomik imzaları ortaya çıkarmada ve otoimmün hastalıklar için terapötik hedefleri belirlemede etkili olmuştur. Bununla birlikte, nötrofillerin dış ortama duyarlılığı, yüksek kaliteli ATAC-seq veri üretimini zorlaştırır. Burada, kemirgen kemik iliği türevi nötrofillerden ATAC-seq kütüphaneleri hazırlamak için, optimum hücre canlılığı ve yüksek kaliteli kütüphaneler sağlamak için geliştirilmiş immünomanyetik ayırma özelliğine sahip ölçeklenebilir bir protokol öneriyoruz. Kütüphane kalitesini etkileyen hayati unsurlar ve metodolojik genişleme için optimizasyon ilkeleri ayrıntılı olarak tartışılmaktadır. Bu protokol, nötrofillerin kromatin mimarisini ve epigenomik yeniden programlamasını incelemek, temel ve klinik immünoloji alanındaki çalışmaları ilerletmek isteyen araştırmacıları destekleyecektir.
Giriş
Nötrofiller, omurgalılarda en bol bulunan ve en önemli bağışıklık hücresi tiplerinden biridir ve insan lökositlerinin %50-70'ini oluşturur1. Nötrofiller, konakçılardaki mikroorganizmaların tespit edilmesinde ve ortadan kaldırılmasında merkezi bir rol oynar. Sepsis sırasında, olgun nötrofiller ilk yanıt verenler arasındadır2. Kemotaksis3 yoluyla enfeksiyon bölgelerine hızla harekete geçerler, burada mikroorganizmaları yutarak (fagositoz), NADPH oksidaza bağımlı reaktif oksijen türleri üreterek (solunum patlamaları), granüller salgılayarak (degranülasyon) ve iltihap....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Aşağıda sunulan tüm hayvan prosedürleri, Pekin, Çin'deki Başkent Tıp Üniversitesi Hayvan Bakımı Araştırma Etik Komitesi tarafından onaylanan ulusal etik ve hayvan refahı yönergelerine ve düzenlemelerine uygundur (sjtkl11-1x-2022(060)).
1. Kemik iliği hücresi (BMC) süspansiyonlarının hazırlanması
- 19-21 g ağırlığında 6-8 haftalık erkek C57BL/6J fareleri seçin. Fareleri bir CO2 odası kullanarak ötenazi yapın, ardından derin refleks kaybolduktan sonra servikal çıkık yapın. Bir diseksiyon matı üzerinde% 70 etanol spreyi ile dezenfekte edin.
- Femuru kalça eklemi ve....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Ana hatlarıyla belirtilen protokol, nötrofilleri C57BL / 6 farelerinin kemik iliğinden izole etmek ve ATAC-seq yoluyla kromatin erişilebilirliği öncesi ve sonrası lipopolisakkarit (LPS) stimülasyonundaki ilgili varyanslarını karşılaştırmak için kullanıldı. Tipik olarak, 6-8 haftalık bir C57BL / 6 farenin her iki uyluk kemiğinden 2 x 107 BMC toplanabilir ve daha sonra 2-5 x 106 nötrofil izole edilebilir. Bunlar arasında, ATAC-seq için 1 x 105 hücre kullanılırken, fazla hücreler kapsamlı nö.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu el yazması, kemirgen kemik iliği örneklerinden türetilen nötrofiller için optimize edilmiş ATAC-seq kütüphanelerinin hazırlanması için deneysel bir protokol bildirmektedir. Nötrofillerin oldukça duyarlı ve kolayca aktive edilmiş bağışıklık hücreleri olması nedeniyle, optimizasyon çabaları izole nötrofillerin canlılığını korumaya öncelik verdi. Yanlış tedavi, NETosis ve diğer hücre ölümü biçimlerine yol açarak önemli miktarlarda kromatinize edilmemiş DNA'nın salınmasına neden olabilir .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma, Pekin Belediye Eğitim Komisyonu (KZ202010025041) Ar-Ge Programı ve Pekin Çin Tıbbi Araştırma Enstitüleri'nden (Hibe No. CX24PY29).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 0.4 Tripan Mavi | Bilimsel | T10282 | |
| 1x fosfat tamponlu tuzlu su | Biosharp | BL302A | |
| 20 bp– 5000 bp Hizalama işaretleyici | Bioptik | C109102-100A | DNA fragman analizörü destekleyici ürünler |
| 5k Boyut işaretleyici (Standart 50 bp Merdiven) | Bioptik | C109101-100A | DNA fragman analizörü destekleyici ürünler |
| Amplikon Arıtma Boncukları | Beckman | A63881 | Amplikon Arıtma Boncukları, yüksek kaliteli DNA ürünleri elde etmek için bir nükleik asit saflaştırma kitidir. |
| Anti-Ly6G MicroBeads Ultrapure, fare | miltenyi | 130-120-337 | Anti-Ly-6G MicroBeads UltraPure, fare, fare kemik iliğinin tek hücreli süspansiyonlarından fare nötrofillerinin pozitif seçimi veya tükenmesi için geliştirilmiştir. |
| Anti-fare CD11b-BV605 (1:200) | BD | Kedi # 563015 | |
| Anti-fare CD48-PE-Cy7 (1:400) | BD | Kedi # 560731 | |
| Anti-fare Ly6G-BV510 (1:200) | BD | Kedi # 740157 | |
| C57BL / 6J fareler, vahşi tip, 8 haftalık, erkek | Laboratuvar Hayvanları Bilimi Enstitüsü, Çin Tıp Bilimleri Akademisi | Laboratuvar Hayvanları Bilimi Enstitüsü, Çin Tıp Akademisi Bilimler | |
| DNA Ayırma Tamponu | Bioptik | C104406 | DNA fragman analizörü destekleyici ürünler |
| E. coli türevi ultra saf LPS (serotype0111: B4) | Sigma-Aldrich | Cat # L-2630 | |
| DNA Kantitatif Reaktif | vazim | EQ111 | DNA Kantitatif Reaktif, basit, hassas ve doğru bir çift sarmallı DNA (dsDNA) floresan kantitatif tahlil kitidir. |
| Eritrosit lizis tamponu (10x) | BioLegend | Cat#420301 | |
| Fetal sığır serumu | Gibco | Cat#10099141C | |
| MS Ayırma kolonları | miltenyi | 130-042-201 | MS Kolonları, hücrelerin pozitif seçimi için tasarlanmıştır. |
| RPMI 1640 orta | Gibco | C11875500BT | |
| S2 Jel elektroforez iğnesi | Bioptik | C105101 | DNA fragman analizörü destekleyici ürünler |
| Cerrahi aletler: neşter, diseksiyon makası, mikrodiseksiyon makası, ince forseps, künt anatomik forseps, iğne tutucu | Fisher Scientific | https://www.fishersci.com/us/en/browse/90184247/surgical-tools | Diğer nitelikli tedarikçilerden satın alınabilir |
| Şırınga (1 & nbsp; mL) | Fisher Bilimsel | https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955464 | Diğer nitelikli tedarikçilerden satın alınabilir |
| vazyme | TD501-01 | için TruePrepTM DNA Kitaplığı | Hazırlık Kiti V2 Illumina için TruePrep DNA Kitaplığı Hazırlık Kiti V2, Illumina'nın yüksek verimli dizileme platformu için özel olarak geliştirilmiş, amaca yönelik bir kittir. Kiti kullanarak DNA, Illumina'nın yüksek verimli dizileme platformuna adanmış dizileme kitaplıklarına hazırlanabilir. |
| vazyme | TD202 | için TruePrepTM İndeks Kiti V2 | Illumina için TruePrep İndeks Kiti V2, Illumina için TruePrep DNA Kitaplığı Hazırlık Kiti V2 için bir Kittir. 96 farklı çift uçlu Index kütüphanesi hazırlamak için kullanılabilir. |
Kaynaklar
- Mortaz, E., Alipoor, S. D., Adcock, I. M., Mumby, S., Koenderman, L. Update on neutrophil function in severe inflammation. Front Immunol. 9, 2171(2018).
- Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann Intern Med. 109 (2), 127-142 (1988).
- De Oliveira, S., Rosowski, E. ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
