Method Article

Tek Endolisozomal Vezikül Analizi için Yama-Klemp Teknikleri

DOI:

10.3791/67519

⸱

April 4th, 2025

 , 
1Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine, National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine, National Taiwan University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, manuel bir endolizozomal yama-kelepçe sistemi kullanarak hücre içi veziküller üzerindeki iyon kanalı aktivitesini doğrudan ölçmek için bir yöntemi detaylandırır. Endolizozomların büyütülmesini ve bu veziküllerin manuel olarak izole edilmesini içeren yöntemi gösteriyoruz. Bu yaklaşım, araştırmacıların prosedürü doğru bir şekilde tekrarlayabilmelerini ve uygulayabilmelerini sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endolizozomal iyon kanalları, endolizozomal iyon ve pH homeostazı, membran potansiyel regülasyonu ve vezikül kaçakçılığı için kritik öneme sahiptir. Bununla birlikte, elektrofizyolojik olarak bu kanallara küçük hücre içi veziküller içinde erişmek zor olmuştur. Endolizozomal yama-klemp tekniklerinin geliştirilmesi, endolizozomal membranlarda iyon kanalı aktivitesinin doğrudan ölçülmesine izin vererek bu engelin üstesinden gelmede etkili olmuştur.

Mevcut düzlemsel yama kelepçesi teknikleriyle karşılaştırıldığında, endolizozomal yama kelepçesi aynı anda birden fazla hücreyi kaydedebilir ve diğer ölçüm yöntemleriyle kolayca birleştirilebilir. Manuel çalıştırma, hedeflenen vezikülleri görselleştirme avantajı sunar. Ayrıca, endolizozomal membranın bir tarafında Ca2 + 'nın vazgeçilmez varlığının sınırlamasını da ele alarak deneysel tasarımın esnekliğini arttırır. Endolizozomal yama-klemp tekniklerinin kullanılması, endolizozomlar içindeki iyon kanalı aktivitesinin doğrudan ölçülmesini ve analiz edilmesini sağlar.

Anormal endolizozomal iyon kanalı fonksiyonu ile nörodejeneratif hastalıklar ve metabolik bozukluklar gibi hastalıklar arasındaki yakın ilişki göz önüne alındığında, bu kanalların araştırılması ve modüle edilmesi yeni ilaç hedeflerini ortaya çıkarabilir. Hücre içi iyon dengesini yeniden sağlayarak, ilgili hastalıkları hafifletebilir veya iyileştirebiliriz. Bu nedenle, bu teknik yeni ilaç hedeflerini keşfetmek ve ilgili ilaçları geliştirmek için çok önemlidir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İyon kanalları çok sayıda fizyolojik süreçte çok önemli bir rol oynar. Yüzey iyon kanalları önemli ölçüde dikkat çekerken, hücre içi kanalların, özellikle de endolizozomların içindeki kanalların önemi yavaş yavaş kabul edilmektedir. Endolizozomal sistem, geri dönüşüm endozomları (RE), erken endozomlar (EE), geç endozomlar (LE), lizozomlar (LY) ve hem endolizozomal hem de fagozomlar ve otofagozomlar gibi diğer bölme özelliklerine sahip hibrit organeller dahil olmak üzere temel hücresel işlevler için özelleşmiş çok işlevli, zara bağlı organellerden oluşur.

Sıralama endozomları (SE) olarak da bilinen EE, plazm....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Enstrüman kurulumu

  1. Donanım
    NOT: Standart bir elektrofizyoloji teçhizatı kurulumu için Şekil 1'e bakın.
    1. Bir masa ve bir Faraday kafesi kullanarak kurulumu dış müdahalelerden koruyun.
    2. Mikroelektrodu sabit bir şekilde konumlandırmak için mikromanipülatörlü ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın.
    3. Alınan sinyalleri toplamak ve yükseltmek için bir amplifikatör kurun.
    4. Analog sinyalleri dijital sinyallere dönüştürmek için bir sayısallaştırıcı kullanın.
    5. Deneysel protokoller oluşturmak ve toplanan verilerden anlamlı, analiz edil....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıda, endolizozomal yama-kelepçe deneyleri sırasında gözlemlenen mevcut şekiller açıklanmaktadır. Mevcut şekil beklendiği gibi değilse, bunun nedeni zayıf temas veya sızıntı olabilir. Referans elektrot banyo solüsyonu ile tam olarak temas etmiyorsa veya pipet elektrodu kırılmak üzereyse zayıf temas meydana gelebilir. Hazne ile lamel arasında sıvının objektif merceğe veya sahneye akmasına izin veren bir boşluk varsa sızıntı meydana gelebilir; Çok fazla veya çok az pipet çözeltisine sahip olmak da bu tür anormalliklere .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektrofizyolojik deney düzeneklerinin dört ana laboratuvar gereksinimi vardır: i) çevre: numuneyi sağlıklı tutmak için kullanılan yöntemler; ii) optik: numuneyi görselleştirme yöntemleri; iii) mekanik: mikroelektrodu stabil bir şekilde konumlandırma yöntemleri; ve iv) elektronik: sinyali yükseltme ve kaydetme yöntemleri.

Endolizozomal yama-kelepçe deneylerini başarılı bir şekilde gerçekleştirmek için birkaç önemli adım çok önemlidir. İlk olarak, hücrelerin du.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların rekabet eden finansal çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi, Tayvan (MOST 110-2320-B-002-022), Ulusal Tayvan Üniversitesi (NTU-112L7818) ve Tayvan Ulusal Sağlık Araştırma Enstitüleri (NHRI-EX112-11119SC).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BOROSİLİKAT CAMSUTTER CİHAZIBF150-75-10OD:1,5 mm, İç Çap 0,75 mm 10 cm uzunluk, filamentli
Digidata 1140AAxon Instruments
Ters mikroskop IX73OLYMPUS
MODEL P-97 mikropipet çektirmeSUTTER CİHAZI
MPC-200SUTTER CIHAZI
MultiClamp 700BAxon Instruments
PARLATICI
Hızlı Bırakma HaznesiWarner instruments641943QR-40LP, 25 mm Lameller için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (11), 679-696 (2018).
  2. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable mem....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Endolysosomal Patch ClampIon Channel RecordingSingle Vesicle AnalysisEndolysosomal Ion ChannelsVesicle TraffickingMembrane PotentialLysosomal Ion ChannelsWhole Vesicle RecordingGigaseal FormationVoltage Clamp

Related Articles