Yüksek Büyütmeli Canlı Hücre Konfokal Floresan Mikroskobu için Equibiaxial Germe Cihazı

Özet

Burada, pnömatik olarak çalıştırılan ve yüksek çözünürlüklü mikroskopi ile uyumlu çok yönlü bir eşbiaksiyel germe cihazı sunuyoruz.

Özet

Hücreler, çeşitli çekme ve basınç gerilmeleri dahil olmak üzere fizyolojik ve patolojik durumlarda sürekli olarak mekanik kuvvetlere maruz kalırlar. Hücrelerin ve dokuların bu tür streslere nasıl tepki verdiğini ve adapte olduğunu ve bu tepkilerin mekanokimyasal sinyalleme ile nasıl bütünleştiğini araştıran çok aktif araştırmalar var. Bu, standart hücre kültürü protokolleri ve mikroskopi yöntemleriyle uyumlu, in vitro çalışmalarda fizyolojik stresleri yeniden üreten sofistike araçlara ihtiyaç doğurmuştur. Bu çalışma, yüksek çözünürlüklü optik ve floresan mikroskobu ile uyumlu bir germe cihazının tasarımını, işlevini ve karakterizasyonunu sunmaktadır. Pnömatik veya motor tabanlı çok sayıda germe cihazı geliştirilmiş ve bu alanda kullanılmıştır. Tasarım yönergeleri, çeşitli uygulamalar ve benzer bir kurulum oluşturmak için tüm araçlar dahil olmak üzere bu sistemlerden birini ayrıntılı olarak sunuyoruz. Sistem, vakum uygulaması üzerine eş eksenli olarak gerilmiş, homojen, tekrarlanabilir ve kontrollü bir numune suşu oluşturan, deforme olabilen bir polidimetilsiloksan (PDMS) membranına dayanmaktadır. Dakik ve anında gerilmeden, kontrollü genlik ve frekansta tekrarlanan gerilme-serbest bırakma döngülerine kadar çeşitli çekme gerilmeleri sağlar. Adezyon proteinleri ile substrat kaplaması, germe cihazında floresan raportörler taşıyan hücrelerin tohumlanmasına ve bu hücrelerin gerilme üzerine yüksek büyütmeli floresan mikroskoplar kullanılarak canlı görüntülenmesine olanak tanır. Basınç gerilmeleri, numunenin gerilmeye adapte olmasına izin vererek ve ardından serbest bırakarak veya numuneyi gerdirme serbest bırakmadan önce önceden gerilmiş bir alt tabaka üzerine tohumlayarak da uygulanabilir. PDMS substratının ek topografik modellemesi, aynı numunenin farklı mikroskopi modlarında (floresan ve elektron mikroskobu gibi) görüntülenmesini sağlar. Poliakrilamid jeller ayrıca PDMS membranına da bağlanabilir, bu da farklı sertlikteki substratlar üzerine ekilen hücrelerin gerilmesine neden olur. Genel olarak, canlı numuneler üzerine kontrollü çekme gerilmeleri uygulayarak, bu germe cihazı, yüksek kaliteli floresan mikroskobu ile birleştiğinde, mekanobiyolojideki çok çeşitli soruları ele alabilir.

Giriş

İnce deforme olabilen polidimetilsiloksan (PDMS) membranları, PDMS, mikroskopi görüntüleme ile uyumlu, iyi kurulmuş biyouyumlu bir inert malzeme olduğundan, çeşitli ısmarlama germe cihazlarında ^1,2,3 yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, diğerleri^gibi 4,5,6,7,8,9, sağlam ve kontrol edilebilir bir eşbiaksiyel germe cihazını monte etmek için zarı deforme etmek için basit bir vakum uygulama konsepti kullanılır. Membranı dairesel bir halka içine sıkıştırarak ve halkayı bir "germe direği" nin üzerine kapatarak (Şekil 1A-C), düzgün ve izotropik bir deformasyon elde edilir. Biyolojik numune, halkanın merkezinde, floresan mikroskobu kullanılarak görüntülemeyi mümkün kılan bağımsız PDMS membranı üzerinde bulunur. Burada, iki mikroskop aşamalı modelle (Şekil 1D-F) uyumlu ve biyolojik uygulamalar açısından çok yönlü iki özel yapım kurulum sunulmaktadır. Genel tasarım basit ve diğer aşamalara aktarılabilir olsa da, kurulumun boyutları görüntüleme gereksinimlerine uyacak şekilde dikkatli bir şekilde seçilmelidir. Bir kez elde edildikten sonra, cihazın gerinim profili karakterize edilmeli ve doğrulanmalıdır.

Kurulumun kendisinden ayrı olarak, gerinim büyüklüğünü, homojenliğini ve izotropiyi karakterize etmek için bir Matlab kodunun eşlik ettiği basit bir yöntem sunulmaktadır. Germe cihazı daha sonra sentetik sistemlere¹⁰, tek hücrelere^11,12 veya tek katmanlara¹³ eşbiaksiyel çekme gerilmeleri uygulamak için kullanılabilirken, floresan mikroskobu kullanılarak numunenin biyolojik tepkisini yüksek uzay-zamansal çözünürlükle kaydeder. Membran, farklı hücre dışı matris yapışma proteinleri ile kaplanabilir^14,15. Biyolojik çalışmanın ihtiyaçlarına göre ekstra özellikler eklenebilir. Örneğin, poliakrilamid jeller,^13,16 gerilirken substrat sertliğini ayarlamak için PDMS membranına bağlanabilir ve PDMS membranları, bir numune¹² içinde aynı ilgilenilen bölgenin posterior görüntülemesi için referans numaralı bir ızgara ile üretilebilir. Sabit gerilmiş numuneler ayrıca immün boyama ile işlenebilir ve daha sonra floresan görüntüleme için yeniden gerilebilir¹⁷. Uygulanan esneme modeli, tek bir anlık gerilme darbesinden değişen büyüklüklerde, frekanslarda veya şekillerde döngüsel gerinimlere^{kadar kontrol edilebilir 14,16}.

Protokol

1. Sahne ve germe direğinin tasarlanması (Şekil 1)

1. Sahne boyutu/tutucuları ve objektif konfigürasyonu ile boyut olarak uyumlu bir germe direği tasarlayın. İki özel germe direği Şekil 1A,D'de gösterilmektedir.
   NOT: Bu protokolde sağlanan FreeCAD dosyaları (Ek Klasör 1) aşağıdaki Nikon mikroskopları ve aşamalarıyla uyumludur: NI-SH-E aşaması ile donatılmış Eclipse Ni-E dik ve TI-S-ER aşaması ile donatılmış ters çevrilmiş Eclipse Ti-E/B, Şekil 1D. Direk üç boyutlu (3D) olarak basılabilir ancak tekrarlanan kullanımdan sonra deforme olabilir; Alüminyum bazlı direkler bu dezavantajdan muzdarip olmayacaktır. Oksidasyonu önlemek için alüminyum bazlı direkleri eloksalladığınızdan emin olun. Dik konfigürasyon, daha büyük bir hareket genliğine izin verir. Ek olarak, dik bir konfigürasyon, deforme olabilen PDMS membran substratı durumunda optik olarak uygun olan, arayüz olmadan numunenin doğrudan görüntülenmesini sağlar. Bunun yerine, ters çevrilmiş bir konfigürasyonda, aydınlatma huzmesi PDMS membranından geçer (Şekil 1F); gerdirme uygulaması üzerine PDMS membranı hareket edeceğinden, hedef için daldırma ortamı dikkatli bir şekilde seçilmelidir (önerilen suya daldırma türleri, hava veya gliserol; PDMS alt tabakaları ile uyumsuzluk nedeniyle yağa daldırma önerilmez). Ticari tutucular, ekstra vida delikleri kullanılarak değiştirilebilir; Vidalama sırasında tozlanmamak için plastik veya Teflon bazlı vida kullanmaya dikkat edin. Şekil 1E'de gösterildiği gibi, germe direğinin sahnenin üstüne takılmasını sağlayan bir tutucu tasarlamak uygun olabilir. Bu protokolde sağlanan FreeCAD dosyası, bir Eclipse Ni-E dik mikroskop aşaması ile uyumludur.
2. Germe direği ile boyut olarak uyumlu streç halkalar (Şekil 1C) tasarlayın (Şekil 1A,B). Bu protokolde sağlanan FreeCAD dosyaları, ilgili direklerle uyumludur (numuneleri işlerken halkaları kaplamak için çapları bir Petri kabının boyutuyla uyumlu olacak şekilde seçilebilir).
   NOT: Yüzük ayrıca alüminyum bazlı (eloksallı) veya 3D baskılı olabilir. Germe direğini ve halkaları vakumla kapatmak için yeterli çaplarda contalar ekleyin.
3. İsteğe bağlı: Bir vakum kontrolörü üretin. Bu protokolde kullanılan vakum kontrol kutusunun elektriksel bir haritası, ek bilgilerde verilmiştir (bkz. Ek Klasör 2). Germe cihazına uygulanan vakum seviyesinin manuel olarak kontrol edilmesine izin verir.
   NOT: Ticari vakum kontrol cihazları da benzer işlevler sağlayabilir ve genellikle çeşitli sinyal türlerinin (sinüzoidal, üçgen, vb.) uygulanmasını sağlayan kontrol yazılımı eşlik edebilir. (Akıcı, Kobalt).

2. Gerilebilir zarın imalatı

1. Dairesel plakalar tasarlayın (önerilen malzeme: polimetakrilat, PMMA). Bu plakaların halkalardan daha geniş olduğundan ve boyut olarak sıkma kaplayıcı ile uyumlu olduğundan emin olun (Şekil 2A). Önerilen boyutlar için Tablo 1'e ve Ek Klasör 3'e bakın.
   NOT: 1. direk için 12 cm çap kullanılmıştır; 2. direk için 18-21 cm çapında. Her kullanımdan önce ve her kullanım arasında, plakalar dokunmamış mendiller ve% 96 etanol kullanılarak dikkatlice temizlenmelidir. Plakalarda, kenarlıklarda ve altlarda PDMS birikimini önlemek önemlidir.
2. PDMS 1:10'u hazırlayın ve çok homojen bir emülsiyon elde etmek için iyice karıştırın (önerilen karıştırma kaşıklarını kullanın).
   NOT: 12 cm için, plaka başına 4,5 g hazırlayın; 18 cm'lik plakalar için, plaka başına 8 g. Birden fazla plaka hazırlamak için, örneğin 10 plaka için gerekenden 10 mL daha fazla ekstra PDMS hazırlayın. 12 cm'lik 10 plaka için 50 g A bileşeni ve 5 g B bileşeni hazırlayın. Kolayca pipetlemek için büyük kaplar kullanmak kullanışlıdır. Priz, PDMS'nin düzgün şekilde döndürülmesini ve kürlenmesini engelleyebilecek toz veya başka herhangi bir kir içermemelidir. PDMS kürlenmesini sağlamak için uyumlu malzemeden eldivenler kullanın (lateksten kaçının; vinil eldivenler uygundur).
3. Bir vakum odası kullanarak en az 1 saat gazdan arındırın.
   NOT: Alternatif olarak, PDMS, 50 mL'lik bir tüp kullanılarak 5 dakika boyunca 0,2 × g'da santrifüjlenebilir, ancak PDMS karışımını dağıtım şırıngası ile bir tüpten aspire etmenin karmaşık olduğuna dikkat edin (adım 2.4 için gereklidir). PDMS'nin ön kürlenmesini önlemek için doğrudan ışıkla çok uzun süre (en fazla 2 saat) gazdan arındırmayın.
4. PMMA plakalarının üstünde PDMS döndürme kaplaması
   1. PMMA plakalarının üzerine 4.2 mL veya 7.5 mL gazı alınmış PDMS dağıtın.
   2. Aşağıdaki önerilen ayarları kullanarak plakaları sıkarak kaplayın:
      1. 100 rpm/s hızlanma ile 500 rpm'de 5 sn sıkma kaplaması.
      2. 300 rpm/s hızlanma ile 500 rpm'de 1 dakika sıkın.
         NOT: Eğirme ve homojen eğirme sırasında plakaların merkezlenmesini sağlamak için PMMA plakasının merkezini alt tarafında işaretlemek uygun olabilir. Adım 2.4.2.1, özellikle hızlanma parametresi ayarlanamıyorsa zorunlu değildir; eğirmeden önce PDMS'nin yayılmasına yardımcı olur. Bu protokol, yaklaşık 140 μm kalınlığında PDMS membranları verir (interferometri ile ölçülmüştür; bakınız Ek Şekil 1 ve Tablo 2). Spin kaplayıcı modelinin veya parametrelerinin farklı membran özelliklerine yol açması durumunda deneylerden önce kalibrasyonlar yapılmalıdır.
5. Toz birikmesini önlemek için her plakayı bir Petri kabında saklayın ve gece boyunca fırının içinde 65 °C'de polimerize edin.
   NOT: Sıcaklığa dayanıklı tabaklar kullanmaktan kaçının. Kürleme koşulu, uygulanan belirli bir vakum seviyesi için PDMS'nin deforme olabilirliğini etkileyecektir.

3. Halkalar halinde membran sandviçleme

1. Montaj malzemesinin tasarımı.
   1. Spin kaplı PDMS dairesel membranı döşemek için iç/dış çaplı PMMA halkaları tasarlayın (Şekil 2A). Tablo 1 ve Ek Klasör 3'te önerilen boyutlara bakın.
   2. Halkanın üzerine oturacağı bir montaj desteği (Şekil 2B) tasarlayın ve yükseklik, membranı halkaya monte ederken ön gerilmeyi de belirleyecektir.
      NOT: Montaj desteği, mevcut laboratuvar ekipmanlarına (örn. bir Petri kabı) dayalı basit bir çözüm olabilir. Daha zarif bir çözüm, desteği 3D olarak yazdırmaktır (bu protokolde sağlanan bu parçanın FreeCAD dosyasına bakın, Ek Klasör 3'e bakın), çünkü yükseklik kullanıcı tarafından tanımlanabilir ve kolayca değiştirilebilir (bu protokolde küçük halkalar için 10 mm'lik bir yükseklik kullanılmıştır). Desteğin orta kısım yüksekliği, yarım halka yüksekliğinden daha küçük seçilmelidir, böylece PDMS alt tabakası montaj sırasında desteğe temas etmez (adım 3.4.2'deki daha fazla kullanıma bakın). Polilaktik asit (PLA) filamentleri kullanan bir 3D yazıcı ( Malzeme Tablosuna bakınız) bunun için uygundur. Neşter için bir kılavuz görevi görmesi için 3D baskılı bir kesme halkası da tasarlanabilir (Şekil 2A).
   3. Membranı monte ederken halkaya ağırlık uygulamak için boyut olarak uyumlu pirinç ağırlıklar tasarlayın ve üretin (Şekil 2C) ve tekrarlanabilir ön gerilime yol açın.
      NOT: Burada sağlanan FreeCAD dosyaları (Ek Klasör 3'e bakın) bu protokolde sunulan halka boyutlarıyla eşleşir.
2. PDMS membranını PMMA plakasından çıkarın.
   1. PMMA halkalarını bir beyaz tezgah kağıdının üzerine hazırlayın.
      NOT: Montaj sırasında kağıdın PDMS membranına temas etmesini önlemek için tezgahın ve kağıdın düz kalması önemlidir.
   2. PDMS'nin tüm çevresi boyunca temiz bir kesime sahip olduğundan emin olmak için plakanın kenarını bir bıçakla (bir veya iki kez) dikkatlice dolaşın ve ardından aynı kenarı keskin cımbızla çizin (Şekil 2A).
   3. Membranı bir kenarından dikkatlice kaldırmak için cımbız kullanın. Ardından, zarı kenardan eşit şekilde kaldırmak için PDMS tabakasının kenarını başparmaklarınızla nazikçe soyun. Membranın kenarını, plaka çevresinin yarısı boyunca plakadan ayırın (Şekil 2A).
      NOT: PDMS membranının altına birkaç damla %96 etanol dökmek, membranın kırılmadan kaldırılmasına yardımcı olacaktır.
3. PDMS membranını kurutun.
   1. Daha önce hazırlanmış PMMA halkasının (adım 3.2.1) tüm üst yüzeyine% 96 etanol silin ve eşit şekilde yaymak için parmaklarınızı kullanın.
   2. PDMS membranını, daha önce kaldırılmış kenardan kaldırarak (adım 3.2.3'te açıklanmıştır) dikkatlice çıkarın ve simetrik olarak etanol kaplı PMMA halkasına yerleştirin. PDMS'deki kırışıklıkları giderin, ancak zarı germediğinizden emin olun; sadece düzeltin.
      NOT: Bu aşamada ön gerdirme uygulamak, uygulanan belirli bir vakum seviyesi için PDMS'nin deforme olabilirliğini etkileyecektir.
   3. Etanol tamamen kuruduktan sonra, PDMS membranının PMMA halkasına sıkıca yapıştığından emin olun.
4. Streç halkayı monte edin.
   1. Başka bir boş PMMA halkası alın. Montaj halkasının üzerine yerleştirin ve PDMS membranını iki halka arasına sıkıştırarak bunları birbirine yapıştırmak için metal klipsler kullanın (PDMS membran sandviçi, Şekil 2B).
   2. Germe halkasının alt yarısını, adım 3.1.2'de tasarlanan montaj desteğinin üzerine yerleştirin (Şekil 2B).
   3. PDMS halka sandviçini streç halkanın üzerine yerleştirin ve tamamen aşağı ulaşana kadar sıkıca aşağı doğru itin. PDMS alt tabakası montaj desteğine temas etmiyor. Contayı doğru konumda sabitleyin (Şekil 2B).
   4. Dairesel pirinç ağırlıkları numunenin üzerine yerleştirin (Şekil 2C). Bu, monte edilen tüm halkalarınkine benzer sabit bir ön gerilim uygular ve sistemi kalibre ederken daha fazla tekrarlanabilirlik sağlar.
   5. Metal streç halkanın üst yarısını, vida delikleri hizalı olarak üstüne yerleştirin, tüm vidaları yerleştirin ve sıkın (Şekil 2C).
      NOT: Bu aşamada, PDMS membranında delikler vardır, bu nedenle protokolde sökmeye veya geriye gitmeye çalışmayın.
   6. PDMS'yi halkanın etrafından bir bıçakla nazikçe kesin (Şekil 2C).
   7. Membranı tozdan korumak için örtün (örneğin bir Petri kabı ile) (Şekil 2C).
      NOT: PDMS'nin bir poliakrilamid jel ile işlevselleştirilmesi gerekiyorsa, bölüm 5'e geçin. İlk kalibrasyon ölçümleri için bölüm 6'ya geçin. PDMS halkası hücre tohumlama için kullanılacaksa, bölüm 7'ye geçin.

4. PDMS membran imalatının varyasyonu: bir referans ızgarası deseni

1. Fotolitografi kullanılarak oluşturulan SU8 bazlı bir ızgara ile "desenli" bir PMMA plakası (PDMS spin-kaplamadan önce) hazırlayın (Şekil 2D). Bunun için, bir fotoğraf maskesi filmi (asetat maskesi) oluşturmak için ilgi çekici bir desen tasarlayın.
   NOT: Bu protokolde sağlanan pdf dosyası (Ek Klasör 4'e bakın) alternatif numaralarla bir ızgara oluşturur; Şekil 2D'ye bakın. Izgara, desenin boyutu göz önüne alındığında Inkscape gibi basit yazılımlar (veya Clewin veya FreeCAD gibi alternatifler) kullanılarak oluşturulabilir. Tasarım, dış şirketler tarafından fotoğraf filmlerine basılabilir (bkz. Malzeme Tablosu).
2. PMMA plakası üzerindeki fotolitografi protokolü (PMMA optik özellikleri için Ek Klasör 3'e bakınız).
   1. 0,8 bar'lık sabit oksijen akışı ile 7 W'ta 20 dakika boyunca PMMA plakalarının oksijen plazma işlemini gerçekleştirin.
      NOT: Plakaların olası plastik korumasının çıkarıldığından ve PMMA plakalarının tamamen şeffaf olduğundan emin olun.
   2. 95 °C'de 5 dakika pişirin.
   3. PMMA plakasını bir nitrojen tabancası kullanarak soğutun ve ardından 4 cm PMMA plakasına 8 mL SU-2100 12 reçine yerleştirin (farklı plaka boyutları kullanıyorsanız ses seviyesini ayarlayın).
   4. Aşağıdaki parametrelerle sıkın (veya yaklaşık 10 μm yüksekliğinde bir katman oluşturmak için sıkma parametrelerini ayarlayın): 100 rpm/sn hızlanma ile 500 rpm'de 5 sn ve ardından 300 rpm/sn hızlanma ile 4000 rpm'de 30 s.
   5. 95 °C'de 2,5 dakika pişirin.
   6. PMMA plakasını asetat maskesinin varlığında bir maske hizalayıcıya yerleştirin ve aşağıdaki parametreleri kullanın: i-line olmadan. Geniş bant pozlama (260 ile 460 nm arasında), 25 mW/^cm2, 7,5 s pozlama.
   7. 95 °C'de 3,5 dakika pişirin.
   8. Propilen glikol monometil eter asetat ile deseni 1 dakika boyunca geliştirin.
   9. İzopropanol ile yoğun bir şekilde yıkayın.
   10. Parlak alan mikroskobunda düşük büyütme objektifi (2-10x) kullanarak desen kalitesinin görsel doğrulamasını gerçekleştirin.
       NOT: PMMA desenli plakanın silanizasyonu, tekrarlanan kullanım için desenin ömrünü uzatır. Bunun için, desenli PMMA plakasını oksijen plazma tedavisi ile 30 saniye boyunca etkinleştirin ve ardından kimyasal bir başlıkta vakum altında Trikloro (1H, 1H, 2H, 2H-perflorooktil) silan ile 1 saatlik bir işlem gerçekleştirin.
3. PDMS gerilebilir membranı döndürmek için 2.2 ila 2.5 adımlarında olduğu gibi desenli PMMA plakasını kullanın.
   NOT: Desenli PDMS, daha önce belirtildiği gibi bir parlak alan mikroskobunda ve ayrıca bir taramalı elektron mikroskobunda görüntülenebilir (Şekil 2D). Deseni istenen yönde elde etmek için PDMS membranını streç halkaya monte ederken desenin hangi tarafının yukarı baktığına dikkat edin.

5. PDMS membranının üzerine bir poliakrilamid (PAA) jeli takılması

NOT: Bu adım, PMMA plakasına bağlı PDMS membranı (bkz. bölüm 2) veya önceden monte edilmiş gerdirme halkaları (bkz. bölüm 3) üzerinde gerçekleştirilebilir. Kimyasal bir başlık altında çalışın; Isıtma ile ilgili adımlar için, kimyasal davlumbazın altında küçük bir fırın bağlantısı kullanmak uygundur, Malzeme Tablosuna bakın; Aksi takdirde, numuneleri fırında hermetik bir kutuda saklayın).

1. PDMS membran ön kaplaması (Şekil 2E)
   1. %96 etanolü bir mikrosantrifüj tüpünde %10 (3-Aminopropil)trietoksisilan (APTES) ile karıştırarak kaplama çözeltisini hazırlayın (örn., 180 μL etanol içinde 20 μL APTES).
   2. PDMS membranlarını bir korona plazma boşaltıcı ile 1 dakika boyunca etkinleştirin (veya bir oksijen plazma temizleyici kullanarak 30 saniye boyunca etkinleştirin).
   3. 200 μL APTES/etanol çözeltisini zarın ortasına yerleştirin.
   4. Membranı 65 °C'deki fırının içinde 1 saat bekletin.
   5. PBS ile iki kez yıkayın. İkinci yıkama için, çalkalarken PBS'yi 10 dakika bekletin.
   6. PBS'de% 3 glutaraldehit (GA) çözeltisini hazırlayın. APTES ile muamele edilen zarın aynı bölgesine zar başına 200 μL GA yerleştirin.
   7. 25 dakika bekleyin (en fazla 30 dakika).
   8. PBS ile iki kez, ikinci kez çalkalarken yıkayın.
   9. Sıvıyı aspire edin ve PBS tamamen kuruyana kadar halkayı kapalı bir konuma getirin.
2. Lamel silanizasyon
   1. 6 mL Repel Silan hazırlayın ve bir Petri kabına dökün.
   2. Kare 18 mm'lik cam lamelleri özenle tek tek sıvının içine yerleştirin.
   3. Lamelleri 5 dakika inkübe edin.
   4. İki beher hazırlayın; biri %96 etanol, diğeri ultra saf su içerir.
   5. Lameli Repel Silane'den cımbızla çıkarın ve önce %96 etanolde yıkayın, ardından ultra saf suda yıkayın (lamel suyla yıkamadan "kuru" çıkmalıdır).
   6. Bir Petri kabının kenarında 30 dakika daha kurumaya bırakın.
3. PDMS membranına poliakrilamid (PAA) jel bağlantısı
   1. Repel Silane ile muamele edilmiş lamellerin yarısını bir Petri kabının dibine yerleştirin.
   2. İstenilen sertlikte^16,18 bir PAA jel karışımı hazırlayın.
   3. Her lamel üzerine 10 μL jel karışımı damlatın.
   4. Jeli yaymak için üstüne başka bir Repel Silan muameleli lamel yerleştirin. İki lamel hizalamayın. Kolay ayrılmayı kolaylaştırmak için yıldız şeklinde düzenlendiklerinden emin olun. Jel düzleşecek ancak lamel alanını aşmayacak şekilde hafifçe bastırın.
   5. 45 dakika ila 1 saat bekleyin.
   6. Lamelleri cımbız kullanarak nazikçe ayırın. Jelenin lamellerden birine bağlı kaldığından emin olun.
   7. Jelin bağlı olduğu lamel alın ve jeli daha önce GA ile muamele edilmiş PDMS alanı ile temas edecek şekilde yerleştirin (Şekil 2E).
   8. Alttan ve üstten iki parmağınızla 5 saniye boyunca bastırın.
   9. Gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
   10. Ertesi gün, halkayı 30 dakika boyunca PBS ile doldurun.
   11. Üst lamel cımbızla nazikçe çıkarın.
   12. PAA jelinin çevresini PDMS membranının diğer tarafından kalıcı bir işaretleyici ile çizin. Bu, aşağıdaki adımlarda örneğin bulunmasına yardımcı olur.
   13. PBS'yi aspire edin.
   14. İstenen hücre dışı matris proteininin jel^15'e bağlanmasını kolaylaştırmak için bir işlevselleştirme adımı gerçekleştirin.

6. Germe cihazının çalışması, gerinim kalibrasyonu ve çözünürlük değerlendirmesi

1. Gerinim kalibrasyonu için floresan boncuklu bir PDMS gerdirme halkası hazırlayın.
   1. Fosfat tampon salin (PBS) çözeltisinde seri seyreltme ile (PBS'de 1:5000 1:1 μm veya 0.2 μm floresan boncuk (Malzeme Tablosuna bakınız) 1:5000 seyreltme hazırlayın (2 μL boncuk stok çözeltisi ile PBS'de 1:500 ara çözelti ve ardından 1 mL PBS içinde ara çözeltiden 10 μL'lik son seyreltme).
      NOT: Membran üzerindeki yüksek boncuk yoğunluğu, kalibrasyon adımı için en uygunudur; Boncuk kümeleri kalibrasyon sırasında işleme yardımcı olduğu için çözeltiyi sonikleştirmeyin.
   2. PDMS'nin ortasına 10-30 μL'lik bir damla yerleştirin.
      NOT: Montaj desteği, merkeze çapraz numune biriktirme ile uygun şekilde tasarlanabilir
   3. Kürleme sonrası kafa karıştırıcı sorunları önlemek için 40 °C'den yüksek olmayan bir sıcaklıkta kurumaya bırakın.
2. Çözünürlük değerlendirmesi için floresan boncuklu bir PDMS streç halkası hazırlayın.
   1. Boncuk çözeltisini, kırınım sınırından daha küçük çaplara sahip boncuklar, tipik olarak 0.1 μm çapında boncuklar kullanarak hazırlamak için Cole ve ^ark.19 protokolünü izleyin.
      (Bkz . Malzeme Tablosu). Her ara adımda boncuk çözeltilerini dikkatlice sonikleştirin.
   2. PDMS substratını etkinleştirmek için halkanın merkezinde korona tedavisi kullanın.
   3. Hemen 20 μL boncuk solüsyonunu tedavi edilen PDMS merkezi alanının üzerine yayın ve kurumaya bırakın.
      NOT: Bu durumda, boncuk çözeltisi yüksek oranda seyreltilir ve geniş yayılmayı sağlamak ve substrat üzerinde adsorbe edilmiş tek ayrılmış 0,1 μm boncuklar elde etmek için hidrofilik PDMS üzerinde inkübe edilir.
3. Germe cihazının mikroskop tablası tutucusuna monte edilmesi (Şekil 1F).
   1. Germe direğini mikroskoba monte edin.
   2. Direğin dairesel alanının üzerine cömertçe kayganlaştırıcı (Vazelin) uygulayın (orta kısım, Şekil 1D, F).
      NOT: PDMS alt tabakasının sürtünmelerin üstesinden gelmesi ve direk üzerinde kayması için yağlayıcının kullanılması zorunludur ve her numune arasında yağlayıcının yenilenmesi gerekir. Vazelin, bu protokolde sunulan kurulumda çok uygun bir kayganlaştırıcı olarak kullanılır.
   3. Adım 6.1'de hazırlanan gerdirme halkasını germe direğine monte edin ve tertibatı kapatmak için üst kapağı vidalayın.
   4. Vakum kontrol cihazını vakum kaynağına ve germe direğine bağlayın (Şekil 3A).
      1. Vakum kontrol kutusunun arkasını vakum kaynağına bağlayın (Şekil 3A).
      2. Kutunun ön tarafını germe direğine bağlayın (Şekil 1B, D, F).
         NOT: Vakum kaynağı, binanın alt yapısında mevcut olan vakum hattı olabilir. Yeterli bir esneme için orta derecede bir vakum gereklidir, ancak gerdirme halkası çapına bağlıdır (daha küçük bir çap için aynı vakum seviyesinde daha küçük bir gerilme elde edilecektir). Alternatif olarak, vakum pompaları ticari olarak temin edilebilir (Fluigent veya Elveflow, otonom vakum pompaları sağlar); Bu durumda, vakum kaynağına bağlantı için üreticinin talimatlarına uyun. Vakum kontrollü bir kaynak olmadan (bu protokolde sunulan özel yapım vakum kontrol kutusu veya ticari olarak mevcut sistemler gibi) bir vakum kaynağı kullanmayın
4. Gerinim kalibrasyonu
   1. Görüş alanının her yerinde yüksek boncuk yoğunluğu ve kullanıcı için tanınabilir boncuk kümeleri içeren bir ilgi alanı seçin (bkz. Şekil 3B).
   2. Seçilen görüş alanının "hareketsiz" bir görüntüsünü elde edin (konumu kaydedin).
   3. Düşük vakum seviyesinde esneme uygulayın (bu kurulumda -20 mbar). Numune her yöne hareket edecektir (X-Y-Z).
   4. Z düzleminde önce yeniden odaklanın.
   5. Hareketsiz durumda görüntülenen aynı ilgi alanını bulmak için sahneyi xy yönlerinde hareket ettirin, gerilmiş durumdaki boncukların görüntüsüne ince odak yapın ve bir görüntü elde edin.
      NOT: Numune çok merkezden uzaksa, gerinim büyüklüğüne bağlı olarak ilgilenilen bölge önemli ölçüde hareket edecektir. Yer değiştirme, merkezden uzakta daha büyük olacaktır, ancak gerinim büyüklüğü, numunenin substrat üzerindeki konumundan bağımsızdır. 2048x2048 çözünürlükle görüntüleri gruplama olmadan kaydedin.
   6. Gerginliği serbest bırakın. 6.4.3-6.4.5 adımlarını daha yüksek bir vakum seviyesiyle (-30 mbar, -40 mbar, vb.) tekrarlayın.
      NOT: Kalibrasyon amacıyla, PDMS deformasyon üzerine histerezis davranışına sahip olduğundan, yeniden gerdirmeden önce daima dinlenme durumuna dönün (bkz. Ek Şekil 3A).
   7. İkinci bir gerdirme halkası takın ve 6.4.1-6.4.6 adımlarını tekrarlayın. Bu kalibrasyonu en az 3 farklı streç halka için gerçekleştirin.
   8. Alınan görüntüleri örneğe göre düzenlenmiş bir klasörde saklayın.
   9. Her klasörde, dinlenme reference_str1 alınan referans boncuk görüntüsünü ve artan vakumda gerilmiş görüntüleri adlandırın stretched_str1, stretched_str2, stretched_str3 vb.
      NOT: Bu adım, sistemin temel kalibrasyonunu oluşturur. Kullanıcının ihtiyaçlarına bağlı olarak, benzer boncuk numuneleri kullanılarak ancak diğer vakum uygulama protokolleri kullanılarak ek kalibrasyon yapılmalıdır. Biyolojik numuneye uygulanan suşa benzer bir suş protokolü uygulayın (temsili sonuçlar bölümüne bakın).
5. ^{Gerinimi ölçmek için Matlab kodunu kullanın 20}.
   1. Matlab klasörünün tamamını aşağıdaki bağlantıdan indirin https://github.com/xt-prc-lab/Le_Roux_et_al_2024_JOVE
      NOT: Çalıştırılacak ana kod gel_strain olarak adlandırılır ve ana kodla aynı klasörde saklanan, sağlandığı gibi saklanması gereken diğer Matlab kod dosyalarını çağırır.
   2. Matlab'ı açın ve kodu gel_strain açın.
   3. Parametreleri ayarlayın (önerilen ayarlar için Tablo 3, Code_Parameter'e bakın).
   4. Üst ve deneme klasörü yollarını kodda belirtildiği gibi tanımlayın.
      NOT: Klasör mevcut değilse, kod bir uyarı açılır penceresi gösterecektir; Yola Ekle'yi seçin ve görüntülerin depolandığı deneysel klasöre göz atın.
   5. gel_strain kodunu çalıştırın.
   6. Kodun istediği şekilde stretched_str1 açın.
   7. Kod tarafından istendiği şekilde reference_str1 açın.
      NOT: Bu protokolde belirtildiği gibi tüm gerilmiş görüntüleri aynı anda farklı vakum seviyelerinde işlemek uygundur; Tüm dosyaların aynı deneysel klasörde depolanması gerekir, ancak kod yalnızca ilk uzatılmış görüntünün açılmasını ister. Görüntü adları, bu bölümün 6.4.9 Maddesinde belirtildiği gibi, X artımlı sayılar 1, 2, 3 vb. olmak üzere strX adlarıyla bitmelidir.
   8. Sonuçlar klasörünün 4 alt klasörle birlikte göründüğünü doğrulayın: Kırpılmış ve hizalanmış verileri içeren kırpılmış veriler; Boncuk yer değiştirme dosyasını içeren yer değiştirmeler; Radyal yer değiştirmelerin ve gerinimin grafiğini içeren görüntüler; Her bir vakum seviyesi için elde edilen gerinim matrisinin elektronik tablosunu içeren gerinimler.
      1. Her vakum seviyesi için gerinim matrisinin medyanını hesaplayın.
      2. Her numune için tekrarlayın (en az 3).
      3. Kalibrasyon eğrisini elde etmek için 3 numune için medyan gerinim matrisini vakum seviyesine karşı çizin (Şekil 3C).
         NOT: Boncuk görüntüsünün koddan düzgün bir şekilde işlenmemesi durumunda birkaç parametre değiştirilebilir. Bunu yapmak için, Matlab'da set_settings_stretch dosyayı açın ve Settings.Resolution ve Settings.Overlap kod açıklamalarındaki önerilere göre değiştirin (ayrıca bkz. Tablo 3). Deneysel ihtiyaçlara bağlı olarak, biyolojik numuneye uygulanan gerinim değiştirilebilir (döngüsel gerinim, daha büyük gerinim, vb.): bu koşulların kalibrasyonu önerilir (Ek Şekil 2 ve Ek Şekil 3'teki örneklere bakın).
6. Çözünürlük değerlendirmesi (Cole ve ^ark.19 tarafından hazırlanan protokolü takip edin)
   1. Adım 6.2'de hazırlanan streç halkayı monte edin.
   2. Tek boncuk noktaları içeren bir görüş alanı hayal edin (kullanılan hedefle ilgili Z adım mesafesine sahip bir yığın hayal edin).
   3. Esneme kurulumunun XYZ çözünürlüğünü karakterize etmek için Cole ve ark.'da belirtildiği gibi MetroloJ (Fiji eklentisi) kullanın (Şekil 3D ve Ek Şekil 4).

7. Hücre tohumlama ve germe

1. PDMS'nin hücre adezyon proteini ile kaplanması
   1. PDMS halkasını 15 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakarak sterilize edin (Şekil 4A). Steriliteyi sağlamak için protokolün sonraki tüm adımlarını biyokaput altında gerçekleştirin.
   2. Kaputun altındaki plakayı steril PBS ile durulayın.
   3. Halkanın merkezinde 100-200 μL'lik bir çözelti damlası bırakarak bir hücre yapışma proteini^11,14,15 inkübe edin (Şekil 4A).
      NOT: Genellikle, 10 μg / mL fibronektin çözeltisi uygundur¹¹. PDMS'yi kaplamak için ilgilenilen diğer yapışma proteinleri kullanılabilir (örneğin, laminin, keratin¹⁵; spesifik tedaviler / protokoller gerekebilir). Fibronektin kaplama için inkübasyon gece boyunca 4 ° C'de önerilir; alternatif yöntem 37 °C'de 1 saattir.
   4. Damlanın çevresini PDMS membranının alt tarafından kalıcı bir işaretleyici ile çizin. Bu, aşağıdaki adımlarda örneğin bulunmasına yardımcı olur.
2. PDMS halkasında hücre tohumlaması (Şekil 4A).
   1. Gerekirse, germe deneyinden önce ilgilenilen hücreleri bir floresan proteini ile transfekte edin (geçici transfeksiyonlar için, transfeksiyon yöntemine ve özelliklerine bağlı olarak deneyden 1-3 gün önce) veya ilgilenilen floresan belirteçleri görselleştirmek için özel protokoller kullanın.
      NOT: İlk deneyler için, hücre zarı tepkisini ve potansiyel yırtılmaları görselleştirmek için GFP-mem ^11,12 gibi bir plazma zarı işaretleyicisi kullanmak uygundur. Markörün transfekte edilmesi kolaydır ve plazma membran yırtılmasına yol açacak gerilme eşiğini değerlendirmek için transfekte edilmiş hücrelerin artan gerinim seviyelerinde gerilmesi tavsiye edilir. Ek Klasör 5'teki plazmid haritasına bakın. Bu, hücre tipine bağlıdır ve tek hücreli deneylerde hücre tek katmanlarına kıyasla daha düşük olacaktır. Bu membran markörü, düşük gerilme seviyelerinde plazma membran yırtılmasına yol açtığı gözlemlenen bazı membran yerleştirici boyaların aksine, hücre gerilmesi ile uyumludur.
   2. Deney günü, hücre ortamını ısıtın ve CO_2'den bağımsız ortam hazırlayın.
      NOT: Mikroskop, germe sistemi ile uyumlu CO₂ kontrolüne sahipse, deneyler normal hücre kültürü ortamında gerçekleştirilebilir (bu, CO_2'den bağımsız ortamda hayatta kalamayan hassas numuneler için gerekli bir kurulum olacaktır). Bir ağartma önleyici madde ile takviye edilmiş CO₂ bağımsız önerilir (ör., GFP proteinleri için, 10 mg / mL'de rutin takviye²¹ ).
   3. Hücreleri tripsinize edin ve sayın.
   4. Hücre bağlanmasını teşvik etmek ve CO₂ nem kontrollü bir inkübatörde tutmak için standart hücre ortamı ile küçük bir hacimde (20-50 μL) uygun sayıda hücre tohumlayın.
      NOT: Düz ve büyük fibroblastlar ve tek hücreli deneyler için 5000 hücre; Sayılar hücre tipine ve deneyin kendisine bağlıdır.
   5. 20-30 dakikalık inkübasyondan sonra (ilk hücre ekini kontrol edin), hücrelerin üzerine yavaşça 500 μL ortam ekleyin. Daha fazla hücre yayılmasına izin vermek için inkübatöre geri yerleştirin.
      NOT: Tohumlama süresi hücre tipine ve deneysel gereksinimlere bağlıdır; Gece boyunca inkübasyon ile tek tabakalı bir tabaka oluşumu da mümkündür. Kültür ortamının hacmi buna göre ayarlanmalıdır. İkincil hücre boyama: bir kez bağlandıktan sonra, hücreler, çekirdeği görselleştirmek için SpyDNA gibi bir boya (Malzeme Tablosuna bakınız) (Ek Şekil 5) veya ilgilenilen herhangi bir yapıyı görselleştirmek için başka bir boyama ile boyanabilir. Canlı hücre lekelenmesinin veya transfeksiyon yoluyla protein aşırı ekspresyonunun, özellikle hücre korteksinde, plazma zarında veya mekanosensitif proteinlerde/yapılarda hücre tepkisini etkileyebileceğine daima dikkat edin.
   6. CO_2'den bağımsız ortama değiştirin ve hemen germe cihazında kullanın.
      NOT: Şimdi, numune bir esneme deneyi için hazırdır.
3. Hücre germe deneyi: fibroblastların dinamik PM yeniden şekillenmesini yakalamak için tek bir germe-bırakma döngüsü ve plazma zarının (PM) görüntülenmesi örneği.
   1. Germe halkasını mikroskop tablasına bölüm 6, adım 6.2'deki gibi monte edin.
   2. İlgilendiğiniz bir hücreyi bulun, konumunu kaydedin ve önceden gerilmiş hücrenin bir görüntüsünü alın (Şekil 4B).
   3. Kalibrasyon eğrisine göre istenen alt tabaka gerilimine uyan istenen vakumu uygulayın.
   4. Uzatılmış hücreyi bulmak için, önce Z'de yeniden odaklayın ve ardından hücreyi bulmak ve görüş alanına geri ortalamak için X-Y yönünde hareket edin.
   5. Görüntüleri istenen süre boyunca kaydedin (Şekil 4B).
      NOT: Türüne bağlı olarak (ortalama olarak) çekme gerilmesine hücre tepkisini belirlemek için genellikle ilk deneylere ihtiyaç duyulur. Taşıyabilecekleri maksimum çekme yükünü belirlemek için hücreleri farklı substrat suşlarında gerin. Plazma zarı floresan zar işaretleyicisi aracılığıyla görselleştirildiği gibi, gerilme hücre için fazlaysa, plazma zarı yırtılması meydana gelir.
   6. Hücrenin serbest bırakılması için, dinlenme durumunda hücre konumuna geri dönün ve numune yeniden odaklanır odaklanmaz edinimin başlayabilmesini sağlamak için mikroskobun çekim modunu AÇIK konuma getirin.
   7. Uzatmayı serbest bırakın ve Z formatında manuel olarak hızla yeniden netleme yapın.
   8. Serbest bırakılan hücrenin görüntülerini istenen süre boyunca kaydedin (Şekil 4B). PDMS membranının esnek yapısı nedeniyle, numune zamanla kolayca bulanıklaşır. Bu nedenle, görüntü alımı boyunca odağı manuel olarak ayarlayın.
      NOT: Serbest bırakıldıktan sonra görüntüleme sırasında başarılı bir şekilde yeniden odaklama yapmak için görüntülerin yeterince sık görselleştirilmesi gerekir; Her 3 saniyede bir 3-5 dakikalık bir video görüntüleme makuldür. PDMS substratı, mikroskobun mükemmel odak sistemi ile uyumlu değildir, bu nedenle hızlı alım için genellikle kullanıcı tarafından manuel ayarlama yapılması gerekir. Yazılım odaklaması çözülebilir, ancak olası hatalara ve gerdirme direği parçasına çarparak hedefe zarar verebilecek büyük sahne hareketine karşı dikkatli olun. Kullanıcı, deneye bağlı olarak numunenin birden fazla uzatmasını gerçekleştirmeye karar verebilir.
4. İşlem sonrası: Fiji kullanarak görüntüleri hizalayın
   1. Görüntüleri dinlenirken açın ve süzün.
   2. Eşleşen Fiji eklentisi şablonunu kullanın ve hizalamak için hücrenin bir bölgesini seçin (Şekil 4C).
      NOT: Hizalanmış gerinim görüntüsünün göreli yer değiştirmeleri Fiji tarafından oluşturulur ve görüntüler kırpılır ve hizalanır. template_matching eklentisini bu bağlantıdan indirin: https://sites.google.com/site/qingzongtseng/template-matching-ij-plugin

8. Önceden gerilmiş bir substrat üzerinde hücre tohumlama

1. Yapışma proteini ile kaplanmış gerilmiş halkayı germe cihazına monte edin.
2. PDMS alt tabakasını istenen gerinim seviyesine kadar gerin.
3. Hücreleri bölüm 7'deki gibi tohumlayın.
   NOT: Bu deneyde, tohumlama steril koşullarda yapılmaz, bu nedenle protokol tüm hücre tipleri için uygun olmayabilir.
4. Hücreler yapıştıktan sonra, ortamı CO_2'den bağımsız bir ortama değiştirin.
   NOT: Yapışma süresini en aza indirmek için hızlı yapışan hücreleri seçin.
5. İstenen bir inkübasyon süresinden sonra, gerilmeyi serbest bırakın ve ilgilenilen bir hücreyi görüntüleyin.
   NOT: Bu adımda, dinlenme halindeki hücre konumu bilinmediğinden ve PDMS substrat hareketi kolayca tahmin edilemediğinden, gerdirme serbest bırakıldıktan sonra aynı hücreyi bulmak zordur.

9. Gerilmiş veya gevşemiş hücrelerin sabitlenmesi

1. Hücreleri gergin halde sabitleyin (kimyasal başlık altında çalışın)
   NOT: Paraformaldehit (PFA) standart bir fiksasyon maddesidir; hızlı sabitleme sağlamak için 37 °C'de sıcak kullanın. Alternatif olarak, glioksal çözelti²² , iyi bir numune koruması ile hızlı bir numune fiksasyonuna izin verir.
   1. Fiksasyon ajanı hazırlayın.
   2. Adım 7.2'yi takip eden halkalardaki tohum hücreleri.
   3. Germe direğini ve kontrol cihazını bir kimyasal davlumbazın içine monte edin ve vakum kaynağına bağlayın.
   4. Tohumlanmış hücrelerin bulunduğu halkayı germe direğine yerleştirin.
   5. Gergin durumu düzeltmek için, istenen gerginliğe kadar gerin. Hücre kültürü ortamını çıkarın ve hücrelere 37 ° C'de 10 dakika boyunca% 4 PFA çözeltisi ekleyerek sabitleyin. Daha sonra PBS ile yıkayın, her zaman streçte tutun. Vakumu yavaşça serbest bırakın ve daha fazla PBS ile yıkayın.
      NOT: Esneme olmayan bir kontrol durumu hazırlamayı unutmayın (bunun için küçük bir PDMS parçası kesilebilir ve altında az miktarda %96 etanol çözeltisi ile bir cam lamel üzerinde kurutulabilir). Sabit numuneyi görüntülemek için, numuneyi aynı büyüklüğe geri uzatmanız önerilir. PFA toksik olduğundan, bu adımda yeterli önlemler alınmalıdır. Kaputun altında tutulabilen küçük bir fırın kullanmak uygundur, Malzeme Tablosuna bakınız).
   6. Numuneyi, tercihen vakumu tekrar uygulayarak, sabitleme sırasında kullanılanla aynı seviyeye getirin, bu da numunenin "yeniden düzleştirilmesini" sağlar (Şekil 4D).
2. Streç serbest bıraktıktan sonra hücreyi sabitleyin (kimyasal başlık altında çalışın).
   1. Hücreleri istenen gerginliğe ve zamana kadar gerin. Streç serbest bırakmadan hemen önce, numuneyi tamamen kurutmadan ortamın çoğunu çıkarın ve suşu serbest bırakın. Alternatif olarak, belirli bir sürenin döngüsel bir esnemesini uygulayın.
   2. Ortamı hızlı bir şekilde çıkarın ve hemen 10 dakika boyunca sabitleyici solüsyonla sabitleyin. PBS ve görüntü ile yıkayın.
      NOT: Numune ayrıca önceden gerilmiş bir substrat üzerine tohumlanabilir ve kullanıcı tanımlı bir tohumlama süresinden sonra, adım 9.2.2'deki gibi sabit gerdirme sonrası serbest bırakma yapılabilir.
3. Sabit numunenin immünofloresansı: gerilmiş veya serbest bırakılmış immünofloresan için standart protokolleri izleyin; Balık Jelatini ile bloklama BSA^17'ye tercih edilir.
4. Örneği görüntüleyin (Şekil 4E).
5. Numune koruma
   1. Numunenin korunması için montaj ortamını hazırlayın (Mowiol veya Prolong).
   2. PBS'yi çıkarın ve bir damla (yaklaşık 75 μL) montaj ortamı ekleyin.
   3. Cımbızla bir lamel alın ve nazikçe üstüne yerleştirin (görselleştirmeyi engelleyecek baloncuklardan kaçının).
   4. Oda sıcaklığında (RT) en az 48 saat kurutun.
   5. PDMS sabit numunesinin etrafını kesin ve daha sonra görüntüleme için başka bir cam lamel üzerine monte edin.
      NOT: PDMS membranının koruma ortamı ile bir lamel üzerine monte edilmesi, membranın yalnızca rahat durumda korunmasını içerdiğinden, bu adım, numunenin gerilmiş membran üzerinde sonradan görüntülenmesi ile uyumlu değildir.

10. Aynı numune alanını farklı modlarda görüntülemek için ızgara ile sabitleme - örnek olarak SEM görüntüleme

NOT: Bu protokol, burada sunulduğu gibi floresan mikroskobu ve taramalı elektron mikroskobu olmak üzere iki farklı mikroskopta aynı tek hücreyi görüntülemek için kullanılabilir. İlişkili görüntüleme, bu protokolün kapsamında olmayan gelişmiş görüntü işleme gerektirir. Diğer yararlı uygulamalar, örneğin, numunenin canlı modda görselleştirilmesi, kaputun altında daha fazla fiksasyon ve immün boyamadan sonra aynı hücrenin görselleştirilmesi olabilir ( Ek Şekil 5 için kullanılan protokol).

1. Bölüm 4'teki desenli PMMA plakalarını kullanarak bir streç halka hazırlayın.
2. Hücreleri adım 7.2'deki gibi tohumlayın.
   NOT: Küçük ızgara deliklerinde bile PDMS'nin tam olarak kaplanmasını sağlamak için kaplama çözeltisinin dikkatli bir şekilde uygulanması gerektiğine dikkat edin.
3. Bölüm 8'de açıklandığı gibi, ancak numune ve elektron mikroskobu görüntüleme ile uyumlu uygun fiksatif ve protokol kullanarak düzeltin.
   NOT: PFA + glutaraldehit karışımı kullanılıyorsa (örn.%2-%2.5), glutaraldehit reaktifinin varlığından gelen otofloresansa dikkat edin ve sonunda bir su verme adımı²³ gerçekleştirin.
4. Numuneyi floresan modunda görüntüleyin ve hücre konumunu kaydedin (örneğin, ızgarayı yazdırın ve konumu bir çarpı ile not edin).
5. Tüm görüntüler çekildikten sonra, önce numunenin etrafındaki PDMS'yi keserek (daha önce yağlayıcıyı çıkararak) numuneyi EM için hazırlayın.
6. Taramalı elektron mikroskobu için PDMS membranı + numuneyi işleyin (numune dehidrasyonu ve metal püskürtmenin standart protokolünü içerir)¹².
7. SEM mikroskobunda görüntüleme yaparken, ızgara konumlarını bulun ve daha önce floresan modunda görüntülenen hücreleri arayın (Şekil 4F,G).

Sonuçlar

Kalibrasyon ve radyalite
Elde edilen suşun uygun karakterizasyonu, deneylerin tekrarlanabilirliği ve kontrolü için bir garantidir. Gerinimi hassas bir şekilde kaydetmek için her numuneye floresan boncuklar eklenebilirken, önceki bir kalibrasyon adımı, deneycinin gerçek gerdirmeden önce numuneye uygulamak istediği gerinimin büyüklüğünü bilerek deney için uygun planlamayı sağlar. Gerinme sadece uygulanan vakuma bağlı olmayacak, aynı zamanda streç halka boyutlarına, PDMS bileşimine (1:10'dan farklı karış...

Tartışma

Biyolojik numunelere mekanik gerdirme uygulamak için vücuttaki fizyolojik koşulları taklit eden çok sayıda germe cihazı kullanılmıştır^24,25. Literatürde çok sayıda kurulum mevcuttur ve numune tepkisinin gözlemlenmesi genellikle germe cihazlarının atomik kuvvete²⁶ veya floresan mikroskobu 27,11'e bağlanmasıyla gerçekleştirilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Asetat maskesi	JD Fotoğraf Verileri
Akrilamid	Biorad Hakkında	161-0140	%40 Akrilamid çözeltisi
APS	Sigma Aldrich	A3678 Serisi	Elektroforez için amonyum persülfat, ≥ 98%
Aptes	Sigma Aldrich	281778	(3-Aminopropil)trietoksisilan
Otonom mikroakışkan pompa	Elf Akışı Kobalt	Kobalt İkili	Kobalt İkili
Bisakrilamid	Biorad Hakkında	161-0142	%2 Bis Çözümü
Bıçak	Fisher Bilimsel	11733919	Didaktik Grup Hoja yaptıá ctica X100 LAME BISTOURI STERIL N° 23  LAMD23
Klip -leri	Sprintis	AKXX000001	Bull Dog Klipsleri, 32 mm, metalden yapılmış, kapasite 10 mm, nikel kaplama
Korona tedavisi gören	Elektroteknik ürünler	BD-20AC, Ürün Kodu:12051A	BD-20AC LABORATUVAR KORONA TEDAVI CIHAZI
Bardak	VWR	611-1368	VWR, Beher Bardakları, Tek Kullanımlık, 250 mL
DAPI	Roche	10236276001	DAPI boyama
Etanol %96	Panreac Quí mika, SLU	131085-1212	Etanol %96 v/v an&aakut için; lisis, ACS- 2,5 L
Fibronektin	Sigma	F0895 Serisi	Fibronektin, İnsan plazmasından, sıvı  0.1%
FluoSpheres Karboksilat Modifiye Mikroküreler, 0.1 µ m	Yaşam Teknolojisi	F8801, F8803	Çözünürlük değerlendirmesi için sarı, yeşil ve Kırmızı floresan boncuklar
FluoSpheres Karboksilat Modifiye Mikroküreler, 0.2 &mikro; m	Fisher Bilimsel	F8809, F8810	Gerinim kalibrasyonu için sarı, yeşil ve Kırmızı floresan boncuklar
Glutaraldehit	Sigma Aldrich	G6403 Serisi	H2O içinde %50 glutaraldehit çözeltisi
İnterferometre	Veeco	Wyko NT1100	PDMS membran kalınlıklarını ölçmek için interferometre
İzopropanol	Panreac Quí mika, SLU	131090-1212	2-Propanol (Reag. Ph. Eur.) para aná lisis, ACS, ISO
Laiton tartıyor			Özel yapım
Tüy bırakmayan mendiller	Berkshire	DURX670, DR670090920	Dokunmamış mendiller
Yağlayıcı (vazelin)	Sigma	16415	Vazelin
Maske Hizalayıcı	Sü ss MicroTec	MJB4	PMMA plakalarında fotolitografi için maske hizalayıcı
Mowiol	Calbiochem - Merck	475904	MOWIOL 4-88 Reaktif
NIKON mikroskop dönen disk konfokal	Nikon	Tutulma Ti-E/B	Nikon Ti-S-ER ile donatılmıştır  safha
NIKON Mikroskop Dik	Nikon	Ni-E Tutulması	Nikon NI-SH-E tablası ile donatılmıştır
Hedef 60x	Nikon	CFI Apo NIR 60X W	NIR Apo 60X/1.0w DIC N2 WD 2.8
PBS çözümü	Gibco	14200067	DPBS, 10x
PDMS	Dow Corning	2401673921	Sylgard - 184 Silikon Elastomer KİTİ DN 109
Petri kabı halka kapağı (büyük)	Prokinort	93060	Plato de cultivo celular TPP SKU: 07177925 diametro 100
Petri kabı halka kapağı (küçük)	Prokinort	93060	Plato de cultivo celular TPP SKU: 07177924
Plazma temizleyici	Harrick	Ürün Kodu-002	Oksijen Plazma Jeneratörü
PMMA plakaları ve halkaları			Ek belgelerdeki Excel belirtim tablosuna bakın
Prolong	Davetli	P36930 /P36934	ProLong Gold antifade reaktifi
İtici-Silan	GE Sağlık	17-1332-01	PlusOne İtici-Silan ES
Halkalar / kauçuk halka	Tecnifil		Özel yapım
Spin kaplayıcı	Laurel	WS-650 Boyut	Spin kaplayıcı
SPY650-DNA	Spirokrom	SC 501	SPY650-DNA
Direksiyon kaşığı	VWR	231-0416	Eko kısa tek kullanımlık spatula, çift uçlu kaşık ve kepçe, PP ve EcoPure katkısı
SU8 reçine 2100	Mikrokimya	Y111075	SU8-2100 Serisi
SU8-Geliştirici	Sigma-Aldrich	484431	Propilen Glikol Monometil Eter asetat
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281-50ML	N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamin, Biyoreaktif uygun. Elektroforez reaktifi
Trikloro(1H,1H,2H,2H-perflorooktil)silan	Sigma Aldrich	448931	Trikloro(1H,1H,2H,2H-perflorooktil)silan
Cımbız	IESMAT	T5039	Dumont HP Cımbız 7 Paslanmaz Çelik. 0,17 x 0,10 mm uç. (Agar Bilimsel Ltd.)
Vakum kontrolörü	GARCAP/Parker	990-005203-005	Vacio  kontrol cihazı;
Vakum kontrolörü fluigent	Akıcı	LU-FEZ-N800	Diziliş Akışı EZ (n800mbar)
Beyaz tezgah kağıdı	Raima	931.1001	Kağıt Raima 42 x 52