Bu makale, Brillouin mikrospektroskopisi kullanılarak 3D bir matriks içinde yaşayan sferoidlerin mekanik karakterizasyonu için bir protokolü tanımlar. Bu tamamen optik yöntem, mikro ölçekli çözünürlük ve nicel mekanik özelliklerle küresel görselleştirmeyi mümkün kılar. Bu yaklaşımın mekanik fenotipleme için etkileri vardır; örneğin, tümör sferoidlerinin patolojik durumlarını 3D mikro ortamda belirlemek.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Brillouin Spektroskopisi Kullanılarak Sferoidlerin Mekanik Haritalanması
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Biyomedikal bilimde büyük ilgi gören yeni bir teknik olan Brillouin spektroskopisi, araştırmacıların örneklerin viskoelastik ve mimari özelliklerini tahrip etmeyen, temassız bir şekilde sorgulayarak mekanik ve yapı ile ilgili bilgi toplamalarını sağlar. Bu yaklaşım, görünür ışığın termal olarak indüklenen akustik dalgalar/fononlarla etkileşimini ölçerek 3B örneklerin mekanik özelliklerini değerlendirir. Brillouin spektroskopisi'nin sağladığı bilgiler, biyofiziğin in vivo değerlendirmesi ve hastalık patolojilerinin olası teşhisi için potansiyele sahiptir. Brillouin spektroskopisinin önemli bir avantajı, biyolojik bir örnek içindeki mikro ölçekli mekaniği değerlendirebilme yeteneğidir; Bu çözünürlüğü elde edebilen diğer geleneksel teknikler, örneğin atomik kuvvet mikroskobi, doğrudan temas gerektirdikleri için örnekleri yalnızca 2B olarak inceleyebilir. Bu çalışma, 3D hidrojel matris içinde gömülü yaşayan sferoidlerin biyomekaniğini incelemek için Brillouin mikrospektroskopisinin uygulanmasını açıklar. Hücresel sferoidlerin 3D mikro ortamda kapsüllenmesi, hücreler ile ekstrasellüler matriks arasındaki arayüzü in vivo yakından tekrarlayan bir sferoid sistem oluşturur. Protokolümüzde, Brillouin spektrumlarının sferoid örnek hazırlama ve ölçümlerini ardışık floresan görüntüleme ile tanımlıyoruz. Ayrıca, spektral veri analizi prosedürlerini ve optik sistemle ilgili teknik detayları tartışıyoruz.
Giriş
Hücreleri 3D modellerde kültürleme, tipik 2B hücre kültür yöntemlerine kıyasla avantajlıdır; çünkü canlı olarak bulunan doku yapılarını ve hücre-hücre etkileşimlerini daha iyi özetler. Sferoidler, karmaşık hücre-hücre etkileşimlerini kolaylaştıran 3D hücre agregajlarıdır; Bu etkileşimler, doku kültürü plastiği üzerinde tek katmanlı olarak yetiştirilen hücrelerde bozulur. Sferoidler, hücrenin geldiği mikro ortamı taklit eden bir iskele içinde yetiştirilebilir. Örneğin, hidrojeller, sertlik, bozunabilirlik, gözenek boyutu ve büyümefaktörleri 1'in dahil edilmesi gibi parametrelerin hassas kontrolünü sağla....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. 2D hücre kültürü
NOT: Mümkün olduğunda, tüm hücre kültürü çalışmalarının steril bir ortamda, kontaminasyonu önlemek için doku kültürü standartı bir laminar akış başlığı kullanılarak yapıldığından emin olun. Mevcut protokolde MSC'ler kullanılmış, ancak çalışmanın özel amaçlarına bağlı olarak diğer hücre tipleri sferoidler oluşturmak için kullanılabilir.
- Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) hücre kültür ortamında kültür MSC'leri, hücreleri kaplayacak kadar hacme sahip, 4,5 g/L D-Glukoz, + %10 fetal sığır serumu (FBS), 100 μM sodyum piruvat, %1 önemsiz amino asit (NEAA), %....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Tarama sonrası elde edilen dosyalar arasında spektrumlar, tarama uyum parametreleri (.csv), tarama parametreleri ve analizi, BFS ve çizgi genişliği haritaları, ilgi alanının belirlendiği parlak alan görüntüsü ve UI penceresinin ekran görüntüsü bulunur. Çok boyutlu Brillouin taramasının her noktası için bir BFS değeri elde edilir. Şekil 9'da, parlak alan görüntüsüyle birlikte yüksek çözünürlüklü bir örnek tarama ve aktin filamentleri ile çekirdekleri gösteren.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Hidrojellere gömülü sferoidlerin mikroskala çözünürlüğüyle biyomekanik olarak görüntülemesi için Brillouin mikroskoposunu kullanmak için bir protokol oluşturduk. Hidrojel, elde edilen BFS değerlerindeki farklılıklarla canlı sferoidden ayırt edilebilir. Temsil eden sonuçlarda MSC sferoidleri ve PEG-maleimid hidrojelleri kullandık; ancak bu protokol diğer hücre tiplerine (örneğin, kanser hücre hatları) geniş çapta uygulanabilir. Bu çalışmadaki hücreler canlı ve ilgili bir 3D mikro ortamda .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, T. Allen ve G. Wardle'ın, bu çalışmada kullanılan Brillouin spektrometresini üreten ve satan LightMachinery'nin çalışanları olduğunu belirtmektedir. Şirket, bu çalışmanın yayımlanmasından fayda sağlayabilir. Diğer tüm yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir.
Teşekkürler
Yazarlar, bu yöntemin geliştirilmesini desteklemek için MechanoMeds Faz 2 hibesi, UKRI/EPSRC, EP/X033554/1 hibe numarasından elde edilen fonları kabul etmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 4-kol PEG-Maleimid (20 kDa) | Yaratıcı PEGWorks | PSB-455 | https://creativepegworks.com/product/4-arm-peg-mal-mw-20k |
| AggreWell 400 plakaları | STEMCELL Teknolojileri | 34411 | http://stemcell.com/products/aggrewell400.html |
| Hava aralığında etalon | LightMachinery | HF-16074-660 | https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-spectroscopy-excitation-laser-optimization/ |
| Anti-yapışma yıkama çözeltisi | STEMCELL Teknolojileri | 7010 | https://www.stemcell.com/products/aggrewell-rinsing-solution.html |
| Bold Line Top Stage Kuluçka Makinesi | Okolab | H301-NIKON-NZ100/200/500-N | https://www.oko-lab.com/live-cell-imaging/stage-top-digital-gas/chamber/nikon/h301-nikon-nz100-200-500-n |
| Cobolt Flamenco-100 660 nm lazer | Huebner | 0660-05-01-0100-700 | https://hubner-photonics.com/products/lasers/single-frequency-lasers/05-01-series/ |
| Konfokal sirkülatör | LightMachinery | HF-13311 | Yok |
| D-LEDi Floresans aydınlatma sistemi | Nikon | MBF83000 | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/light-sources/d-ledi |
| EPI-FL modülü | Nikon | Ti2-LA-FL-3 | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/intermediate-modules |
| Fibronectin (insan) | YoProteins | 663 | https://www.yoproteins.com/fibronectin-human-5-mg-663.html |
| Gibco Dulbecco' s Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) | ThermoFisher | 11965092 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965092 |
| HyperFine Brillouin spektrometresi | LightMachinery | HF-8999-PK-660 | https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-hyperfine-spectrometer/ |
| LED-DA/FI/TR/Cy5-B Dörtlü bantlı filtre küpü | Nikon | MXR00753 | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/fluorescent-filter-cubes |
| Mezenkimal kök hücreler (MSC) | PromoCell | C-12974 | https://promocell.com/us_en/human-mesenchymal-stem-cells-hmsc.html |
| Motorlu çeviri aşaması | Önceki Bilimsel Çalışmalar | H117E2NN | https://www.prior.com/imaging-components/motorized-stages?filter=MicroscopeBrand-33 |
| NucBlue™ Live ReadyProbes™ reaktif (Hoechst 33342) | ThermoFisher | R37605 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605 |
| Objective, S Plan Fluor 20X NA 0.45, hava | Nikon | MRH08230 | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/selector/comparison/-1708 |
| ORCA-Fusion CMOS kamera | Hamamatsu | C14440-20UP | https://www.hamamatsu.com/eu/en/product/cameras/cmos-cameras/C14440-20UP.html |
| PEG-ditiol, 2 kDa | Yaratıcı PEGWorks | PLS-613 | https://creativepegworks.com/product/hs-peg-sh-mw-2k-10g |
| sCMOS kamera | Teledyne Vision Çözümleri | 01-IRIS-15-USB-M-16-C | https://www.teledynevisionsolutions.com/en-gb/products/iris/?model=01-IRIS-15-USB-M-16-C&vertical=tvs-photometrics&segment=tvs |
| SPY555-aktin | Spirokrom | CY-SC202 | https://spirochrome.com/product/spy555-actin/ |
| TemperatureApp | Sıcaklık kontrol yazılımı | ||
| VPM peptid, GCRDVPMSMRGGDRCG | GenScript | Yok | Yok |
| Eclipse Ti-2A mikroskobu | Nikon | Eclipse Ti-2A | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series |
Kaynaklar
- Caleb, J., Yong, T. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
- Walker, M., Gourdon, D., Cantini, M. Beyond static models: mechanically dynamic matrices reveal new insights into cancer a....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
