Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Tüberküloz Patogenezini Anlamak için Mycobacterium tuberculosis Kültür Filtratının Hazırlanması

1.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67540

⸱

28 Mart 2025

 , 
1CSIR-Centre for Cellular and Molecular Biology (CSIR-CCMB), 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), 3National Institute of Immunology

Bu makalede

Özet

Burada, bakteriler tarafından salgılanan proteinlerden oluşan bakteri üreme ortamı olan Mtb kültür filtratının (CF) hazırlanmasını gösteriyoruz. Mtb , patogenez için çok önemli olan konak sinyalizasyonunu ve bağışıklık tepkisini modüle etmek için proteinler salgılar. Hazırlanan CF'ler, tüm salgı faktörlerini tanımlamak için kütle spektrometresi ile analiz edilir.

Özet

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), sağkalımı artırmak için konak sinyalizasyonu, bağışıklık tepkisi, apoptoz vb. gibi çeşitli hücresel süreçleri modüle etmek için konakçıya birçok protein salgılar. Birkaç salgı faktörünün işlevi açıklığa kavuşturulmuş olsa da, birçoğu henüz karakterize edilmemiştir. Bu nedenle, Mtb salgı proteininin araştırılması önemli bir araştırma alanıdır. Mtb , proteinleri üç farklı salgı sisteminin yardımıyla ekstrasitoplazmik boşluğa salgılar: genel, ikiz arginin ve özel Tip VII salgı sistemi. Yeni salgı moleküllerini tanımlamak ve bilinen faktörleri işlevsel olarak karakterize etmek için sekretomun hazırlanması gerekir. Burada, kütle spektrometresi için sekretom hazırlama ve numune hazırlama yöntemini özetliyoruz. Sekretom hazırlama, iyi karakterize edilmiş membran, sekretuar ve sitozolik proteinlere karşı antikorlarla sondalama yoluyla izlenebilen sitozolik proteinlerin kontaminasyonunu önlemek için azami özen gerektirir. Bu şekilde hazırlanan kültür süzüntüsü, konak immünomodülasyon özelliklerinin araştırılmasını içeren farklı amaçlar için kullanılabilir.

Giriş

Dünya çapında en ölümcül patojenlerden biri olan Mycobacterium tuberculosis (Mtb), enfekte bir kişiden hapşırma veya öksürme sırasında bulaşan aerosoller yoluyla sağlıklı bireyleri enfekte eder1. Akciğerlere girdiğinde, alveolar makrofajlar tarafından yutulur ve hayatta kalmak için konakçı bağışıklık sistemini ele geçirir. Mtb'nin sağkalım için sahip olduğu çeşitli konak modülatör mekanizmalar arasında, salgı virülans faktörleri bunlardan biridir. Basilin büyümesi sırasında kültür ortamına salgılanan proteinlere Kültür Süzüntüsü (CF) proteinleri2 denir. Bu kültür süzüntü proteinleri, bakterilerin konakçı hücrelerin içindeki zorlu koşullarda hayatta kalmasına yardımcı olur. Mtb, üç farklı türde salgılama sistemi ile donatılmıştır: özel bir Tip VII salgılama sistemi (T7SS), genel bir Sec salgılama sistemi (Sec sistemi) ve bir ikiz arginin salgılama sistemi (Tat sistemi). T7SS, Gram-negatif bakterilerdeki tip I-VI'dan farklı olarak aktinobakterilerdeki en özel salgılama sistemidir3. Katlanmamış proteinin zar boyunca salgılanması büyük ölçüde Sec sisteminde yer alır ve proteinler bir N-terminal sinyal dizisi 4,5 tarafından tanınır. Katlanmış veya kısmen katlanmış proteinler, ikiz arginin motifi 6,7 ile bir N-terminal sinyal dizisi ile tanımlanan Tat sistemi boyunca taşınır. Sec ve Tat sisteminin protein salgılanmasını nasıl düzenlediği henüz belirlenmemiştir.

Mtb'de enfeksiyon üzerine konakçı oksidatif saldırıya dayanmaya ve hayatta kalmaya yardımcı olan bilinen bazı kültür süzüntü proteinleri, reaktif oksijen türlerini parçalamak için gerekli olan KatG ve SodA 8,9 gibi enzimlerdir. Ek olarak, heterodimerik bir protein kompleksi olan CFP10-ESAT6, sitokin tepkilerinin, bakteri kaçışının, ROS üretiminin vb. düzenlenmesinde hayati bir rol oynar.10. RD1 lokusu, CFP10-ESAT6'nın salgılanmasını içeren Tip VII sekresyon sisteminin modülasyonunda rol oynar ve cpf10-esat6'nın genetik silinmesi, bakterilerin ex vivo ve in vivo enfeksiyon modellerinde hayatta kalmasını tehlikeye atar. Mikobakteri bovis BCG aşı suşu, virülans faktörlerinin salgılanmasından sorumlu RD1 lokusundan yoksundur ve bu nedenle canlı zayıflatılmış aşı11 olarak kullanılabilir. Farklı keşfedilmemiş hücresel süreçler, salgılama sürecini sıkı bir şekilde düzenler. Kültür filtrat proteinleri, bakterilerin gizli durumdan yeniden büyümesine yardımcı olan resüsitasyonu teşvik edici faktörler (RpF'ler) içerir. Resüsitasyonu teşvik edici faktörler (Rpf'ler), uyku hali içinde rol oynadığı bilinen peptidoglikan hidrolize edici enzimlerdir. Mtb, bakterilerin tek başına veya diğer proteinlerle etkileşime girerek uyku halinden yeniden büyümesine yardımcı olan beş rpf benzeri geni (rpf AE) kodlar12. Rpf'ler bakteri kültürü süzüntüsünde bulunur ve Mtb virülansı ve konak bağışıklığında rol oynadığı bilinmektedir13,14. Yaygın olarak çalışılan rpf genleri rpfE ve rpfB, in vitro13 koruyucu bağışıklık gösterir ve in vivo olarak immün yanıtları arttırır. Bu nedenle, rpfE ve rpfB, Mtb aşı adayları olarak kullanılabilir.

Tersinir fosforilasyon15, çeşitli hücresel süreçleri, hücre homeostazını, hücre bölünmesini vb. değiştiren translasyon sonrası bir modifikasyondur. Örneğin, CFP10'un fosforilasyonu, CFP10'un hem fosfoablatif hem de mimetik mutantlarının CFP10-ESAT6 delesyon suşu16'da gözlenen fenotipi geri yükleyemediği durumlarda önemli bir düzenleyici rol oynar. SecA2 ise konak hücre17'nin DNA hasarında rol oynayan bir salgı proteinidir. SecA2 mutantının sekretomunu, konakçı bağışıklık tepkisini ve sinyal kaskadını 18,19 değiştirmek için yeterlidir. Bu nedenle, salgı proteinlerinin genlerinin silindiği (yayınlanmamış veriler) H37Rv ve Mtb mutantlarının sekretomunu araştırmak, konakçı immünomodülasyonunu ve sağkalımını nasıl etkilediklerine dair içgörüler elde etmek için gerekli ve heyecan vericidir.

Bu rapor üç hususa odaklanmaktadır: Mtb kültür filtratının hazırlanması, numunelerin kütle spektrometresi için işlenmesi ve immünomodülatör fonksiyonları incelemek için kültür filtratları ile ex vivo deneylerin gerçekleştirilmesi ile ilgili adımlar. Daha önceki çalışmalar, kültür filtrat proteinlerinin 2D jel elektroforezi ile tanımlandığını ve ardından Kütle spektrometrik analizi8 ile tanımlandığını göstermiştir. İlaca duyarlı ve dirençli suşlardan kültür süzüntü proteinleri, sekretom değişiklikleri hakkında bilgi edinmek ve ilaç direncinde rol oynayabilecek virülans faktörlerini belirlemek için kütle spektrometresi kullanılarak tanımlandı20. Daha önce kütle spektrometresi16 yardımıyla Mtb'nin sekretomunu ve fosfosekretomunu araştırmıştık. 2D jel elektroforezi gibi teknikler düşük verimlidir ve proteom veya sekretomdaki küresel değişiklikleri araştırmak için kullanılmaz. Kültür süzüntü proteinleri, bakteri suşlarından, büyüyen hücrelerin aşamalarından ve hatta çeşitli stres koşullarından farklı olacaktır. Farklı durumlara bağlı olarak, hücrelerin içindeki salgı protein havuzlarındaki değişiklik, tüm sekretomu bütünsel olarak keşfetmeyi ve terapötik müdahaleler için bakteri salgılama sistemi hakkında daha fazla bilgi sağlamayı teklif edecektir. Her bir salgı yolunun yolları ve hedefleri hakkında daha fazla bilgi edinmek için salgı sistemlerinin nakavtları veya tükenme suşlarındaki sekretoma bakmak daha da çekici olacaktır. Hücrelerin bakteri yerine kültür süzüntü proteinleri ile tedavi edilmesi, sitokin seviyelerini ve diğer immünomodülatör faktörleri değiştirir17. Sekretom çalışmasının yardımıyla, yeni virülans faktörleri ve bunların virülanstaki rolü tanımlanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Burada, Mtb'nin H37Rv patojenik laboratuvar türünü kullanıyoruz. Biyogüvenlik Laboratuvarı seviye 3'te (BSL-3) bakteri kültürünü büyütmek ve kültür süpernatantını izole etmek için gerekli adımlar gerçekleştirilmelidir. Kültürün yeniden canlandırılmasından süzüntü hazırlığına kadar BSL-3 tesisi kullanılır.

1. Mtb kültürünün aşılanması

  1. BSL-3'te çalışma alanının hazırlanması
    1. Kullanmadan önce biyogüvenlik kabininin UV ışığını 10 dakika boyunca açın. Biyogüvenlik kabinini kullanımdan önce ve sonra %75 etanol ile temizleyiniz. Kullanılan malzemeleri biyogüvenlik yönergelerine uyarak uygun çöp kutularına atın.
  2. Primer ve sekonder Mtb H37Rv kültürlerinin hazırlanması
    1. Gliserol stoğunu -80 °C'den alın ve stoğu oda sıcaklığında çözdürün. Biyolojik dörtlüler için dört bağımsız stok kullanın.
    2. Vidalı kapaklı 10 mL otoklavlanmış konik şişede% 10 ADC (9 mL 7H9 ortamı ve 1 mL ADC) içeren 10 mL 7H9 ortamı (Tablo 1) alın.
      NOT: 7H9 + ADC: 7H9, ticari olarak elde edilen ve ADC eklediğimiz besin açısından zengin bir ortamdır (ADC: Albümin, Dekstroz ve Katalaz; Tablo 2). Kültürü büyütmek için hem ADC hem de OADC kullanılabilir. Konik şişeler kültüre daha fazla havalandırma sağlar; Bununla birlikte, bakteri hücrelerini büyütmek için bir doku kültürü şişesi de kullanılabilir.
    3. Birincil kültür haline gelen kültürü canlandırmak için tüm gliserol stoğunu medyaya aşılayın. Gliserol stokları yapmak için600 ~ 0.8 büyüyen bir Mtb kültürü alın. % 15 gliserol ve büyüyen Mtb kültürünü bir kriyoviyalde karıştırın ve -80 ° C'de saklayın.
    4. Kültür şişelerini 37 °C'de bir inkübatör çalkalayıcıda 100 rpm'de 3-4 gün inkübe edin.
    5. 5.günde , 600 nm'de (A600) absorbansı ölçün. Kültürler A600 ~ 0.8-1'e ulaştığında, kültürü 500 mL'lik bir şişede 100 mL 7H9 +% 10 ADC ortamında A600 ~ 0.2'de aşılamak için kullanın. Çoğaltmalar için aynı adımları gerçekleştirin.
      1. Birincil kültürün A600'ünü ölçün. A600 ~ 0.8 ise, kültürü 10 dakika boyunca 2100 x g'da santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatanı atın, peleti 5 mL 7H9 +% 10 ADC ortamında yeniden süspanse edin ve A600'ü ölçün. 100 mL A600 ~ 0.2 ikincil kültürüne ne kadar aşı ekleneceğini hesaplayın. Örneğin, A600 ~ 4 kullanılıyorsa, bu kültürün 5 mL'sinin 100 mL taze 7H9 +% 10 A600 ~ 0.2 ADC ikincil kültürüne eklenmesi gerekir.
    6. OD A600 ~ 0.8'e kadar 2-3 gün boyunca 100 rpm'de bir inkübatörde 37 ° C'de büyütün.
    7. Filtre ucu takılmış bir pipet ucu kullanarak 10 μL çekin ve kültürü, bakteri davlumbazında antibiyotik içermeyen bir LB Agar plakası üzerinde tespit edin. Bakteriyel kontaminasyonu (varsa) görselleştirmek için plakayı 37 ° C'de 12-16 saat inkübe edin. Kültürleri atın ve herhangi bir bakteriyel kontaminasyon tespit edilirse deneyin yeni kültürlerini canlandırın.
  3. Soton'un ortamında bakteri üremesi
    1. A600 ~ 0.8'de, 500 mL'lik bir şişede 100 mL Soton'un ortamında A600 ~ 0.2'deki bakterileri aşılayın (Tablo 3) ve OD ~ 0.8'e ulaştıktan sonra 3-4 gün boyunca büyür.
    2. Kültür süzüntü hazırlığı için kullanılacak kültürlerin aşılanması için Soton'un ortamında (Sauton'un birincil kültürü) A600 ~ 0.8'e kadar büyütülen kültürleri kullanın.
      NOT: 7H9 + ADC, albümin içeren besin açısından zengin bir ortamdır. Albümin, kültür filtrat proteinlerini maskeleyebildiği için sekretom analizinde kullanılamaz. Bu nedenle, Sauton'un ortamı kültür süzüntüsü hazırlamak için kullanılır. Sauton'un ortamı, Tablo 3'te belirtilen bileşenlerin yeniden yapılandırılmasıyla hazırlanır.

2. Mtb kültürü filtrat proteinlerinin hazırlanması

  1. Kültür süpernatantı için santrifüjleme
    1. 300 mL Sauton'un ikincil kültürünü A600 ~ 0.2'de aşılamak için Sauton'un birincil kültürünü kullanın. OD A600 ~ 0.4-0.5 olana kadar kültürleri büyütün. Ölü hücrelerden kontaminasyonu önlemek için aktif olarak büyüyen erken log faz kültürlerini kullanın.
      1. İkincil kültürün OD'sini ölçün. OD A600 ~ 0.8'e ulaşırsa, kültürü 10 dakika boyunca 2.100 x g'da santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatanı atın, peleti 10 mL Soton'un ortamında yeniden süspanse edin ve OD'yi tekrar alın. Ölçülen OD'den 0.2 OD'lik 300 mL'lik bir kültüre ne kadar aşı ekleneceğini hesaplayın. Örneğin, OD 8 ise, bu kültürün 7.5 mL'si, 0.2 OD'lik 300 mL taze Soton'un ortamına eklenmelidir.
        NOT: Hücre lizizini ve GroEL kontaminasyonunu azaltmak için belirtilen OD'ye bağlı kalın. GroEL bir şaperondur ve yapısal olarak bakteri hücrelerinde eksprese edilir. Literatürün bir kısmı, büyüme sırasındaki stres nedeniyle kültür filtratlarında GroEL'in varlığını göstermiştir. Burada, hücrelere hafif stres sağlayan kültür filtrat hazırlığı için Soton'un ortamını kullanıyoruz; bu nedenle, GroEL kültür süzüntüsünde bulunabilir. Ek olarak, kültür OD'si 1'den fazlaysa, hücre lizisi meydana gelir ve bu da kültür süzüntüsünde GroEL kontaminasyonuna yol açar.
    2. 300 mL büyüyen kültürleri 6, 50 mL'lik tüplerde 2.100 x g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca peletleyin (Şekil 1A).
    3. Her durumda 25 mL serolojik pipet ile yeni bir tüpe peleti dokunmadan bırakarak 45 mL süpernatan çekin. Tam hücre lizatı (WCL) hazırlığı için peleti bir kenara koyun.
    4. Santrifüjlemeyi 2.100 x g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca tekrarlayın. 25 mL serolojik pipet ile 40 mL süpernatanı (5 mL kültüre dokunmadan) yeni bir tüpe çekin ve santrifüjleme adımını tekrarlayın.
    5. Süpernatanın 35 mL'sini yeni bir tüpe çekin ve 0.2 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak kültür süpernatanı filtreleyin. Patojenik bakteriyel kontaminasyonu ortadan kaldırmak için yeni bir tüpe süzün. 300 mL kültürden, replikat başına 210 mL kültür süzüntüsü geri kazanılır.
      NOT: Burada kültür süzüntüsünü filtrelemek için kullanılan filtre, 0.22 μm'lik (SY25PL-S tipi) steril bir şırınga filtresidir.
    6. Kültür filtratının süzülmesinden sonra, süzülen kültür filtratının 1 mL alikotunu bir agar plakasına aşılayın ve kültür filtratında diğer patojenik bakteriyel kontaminasyonun varlığını sağlamak için 37 ° C inkübatörde 4 hafta inkübe edin. Whole Cell Lysate'den (WCL) 1 mL alikot alın ve aynı güvenlik önlemlerini alın.
    7. Numune tüplerini %75 etanol ile silin ve bir geçiş kutusundan BSL-3'ten çıkarın.
  2. Tüm Hücre Lizatının (WCL) Hazırlanması
    1. Pelet, fenilmetilsülfonil florür (PMSF), 1x proteaz inhibitör kokteyli içeren 1 mL 1x PBSG içinde yeniden süspanse edin ve lizatı, 1/3hacim 0.1 mm Zirkonya boncuk içeren 2 mL vidalı kapaklı boncuk çırpma tüplerine aktarın.
      NOT: 1x PBSG, 1x PBS +% 5 gliserolden oluşur. 1: 3'lük pelet-tampon ağırlık oranını alın.
    2. Numuneleri mini bir boncuk çırpıcıda boncuk çırparak parçalayın: 1 dakika boncuk çırpma ve ardından 2 dakika buz üzerinde inkübasyon. Bunu 8x tekrarlayın.
    3. Tüpleri 18.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı 1.5 mL'lik taze bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın ve buz üzerinde tutun.
    4. Santrifüjleme adımını tekrarlayın. Patojenik bakteriyel kontaminasyonu ortadan kaldırmak için süpernatanı 0,2 μm'lik bir şırınga filtresinden geçirin.
      NOT: Burada kültür filtratını filtrelemek için kullanılan filtre, 0.22 mm'lik steril bir şırınga filtresidir (SY25PL-S tipi).
    5. Numuneleri %75 etanol ile silin ve bir geçiş kutusundan BSL-3'ten çıkarın. Aşağıda belirtildiği gibi BCA tahlil kitini kullanarak lizat konsantrasyonlarını kontrol edin. Lizatları -80 °C'de saklayın.
  3. Kültür süzüntü proteinlerini Santrifüj Filtre Üniteleri kullanarak konsantre edin.
    1. Santrifüj filtre üniteleri yardımıyla 210 mL Mtb kültürü süzüntü proteinlerini konsantre edin. Kültür süzüntüsünü ~1 mL'ye konsantre etmek için 3 kDa 15 mL santrifüj filtre ünitesi tüpleri (santrifüjler) kullanın (Şekil 1A). 3 kDa'lık santrifüj filtre ünitesi tüpleri, aynı boyuttaki veya 3 kDa'dan daha büyük proteinleri tutar.
    2. Bir santrifüj tüpüne her bir kültür filtratı replike kopyasından yaklaşık 15 mL ekleyin ve 4 ° C'de 1 saat boyunca 2.100 x g'da santrifüjleyin.
    3. Akışı normlara göre atın ve 210 mL kültür süzüntü konsantresi ~1 mL'ye gelene kadar 15x–16x için adım 2.3.2'yi tekrarlayın.
    4. Konsantre kültürün 100 μL'sini süzün, proteinleri on düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne süzün ve bir BCA kiti kullanarak protein konsantrasyonunu tahmin edin.
  4. Konsantre proteinlerin tahmini
    1. Standart olarak BSA'ya göre protein konsantrasyonunu tahmin edin. Çiftler halinde 25 μL hacimde 1 μg, 2 μg, 3 μg ve 4 μg BSA kullanın. Numune seyreltilmemişse, tahmin için iki kopya halinde 25 μL hacimde 5x seyreltilmiş (PBS cinsinden) bir numune kullanın. Tahminler 96 kuyulu plakada gerçekleştirilmiştir. 25 μL PBS içeren örneksiz bir kontrol (Boş) kullanın.
    2. Üreticinin talimatlarına göre 175 μL karışık reaktif ekleyin. Numuneleri çok kanallı bir pipet yardımıyla karıştırın ve 37 °C'de 1 saat inkübe edin. Bir ELISA okuyucu kullanarak okumaları 562 nm'de ölçün. BSA ve numuneler için değerler elde etmek için boş değerlerden değerleri çıkarın.
    3. Standart eğriyi doğrusal regresyon eğrisine uygun hale getirin ve numuneleri standarda göre tahmin edin. Protein tahmin kılavuzu için BCA kitini takip edin.

3. Kültür filtrat proteinlerinin farklı markörler kullanılarak doğrulanması

  1. Coomassie boyama ile proteinlerin tespiti
    1. Kültür süzüntüsündeki proteinlerin varlığını doğrulamak için 30 μg protein alın ve% 10 Sodyum Dodesil Sülfat –Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE; Tablo 4).
      NOT: SDS-PAGE, Coomassie boyama ve leke giderme solüsyonlarını tampon yapmak için tablo açıklamasını izleyin.
    2. Jele 20 mL Coomassie boyama solüsyonu (Tablo 5) ekleyin ve oda sıcaklığında külbütörler üzerinde 30 dakika inkübe edin. Boyama solüsyonunu atın.
    3. Jele 30 mL leke giderici solüsyon (Tablo 6) ekleyin ve oda sıcaklığında bir külbütör üzerinde 30 dakika inkübe edin. Leke giderme solüsyonunu atın ve taze bir leke giderme solüsyonu ekleyin. Jel düzgün bir şekilde lekelenene kadar tekrarlayın.
    4. Trans aydınlatıcı üzerindeki protein çizgisini kontrol edin (Şekil 1B). Kültür süzüntü proteini birkaç protein içerdiğinden, lekelenmeden sonra jelde bir dizi protein bandı görülebilir (Şekil 1B).
  2. Salgılanan protein markörü için Western blot onayı
    1. Kültür süzüntüsünde salgılanan proteinin varlığını kontrol etmek için salgılanan proteinin antikorunu kullanın. Ag85B (ab43019), kültür süzüntüsünde iyi bilinen bir Mtb salgılanan proteindir ve sitozolde bulunur; Ag85B (konsantrasyon 5 mg / mL) antikoru (% 5 BSA'da 1:5000 seyreltme) salgılanan protein için pozitif bir kontrol olarak kullanılır.
    2. Sitozolik / membran ve salgılanan protein fraksiyonları arasında ayrım yapmak için kültür süzüntü proteinleri ile bir WCL yükleyin. Ag85B sitozoliktir ve salgılanır, bu nedenle bu her iki fraksiyonda da mevcut olmalıdır; Öte yandan, PknB'nin membrana lokalize olduğu bilinmektedir ve kültür süzüntüsünde mevcut değildir.
    3. Bir BCA kiti yardımıyla WCL / kültür filtratındaki proteinlerin konsantrasyonunu belirleyin. 30 μg WCL / kültür filtratını 30 mL hacimde 2x-lamelli tamponu ile karıştırın (Tablo 7). Numuneleri, PknB için %10 SDS-PAGE ve Ag85B için %12 SDS-PAGE'de, SDS jel akış tamponu kullanarak boya cephesi dibe ulaşana kadar çözün (Tablo 8). Boyanın ön kısmının jelden akmasına izin vermeyin.
      NOT: Ag85B'nin boyutu ~35 kDa'dır, bu nedenle %12 SDS-PAGE kullanılır.
    4. Proteinin jelden zar üzerine aktarılması için 9 cm x 6 cm 0.2 μm nitroselüloz membran kesin (Tablo 9). Kasetleri ıslatın, köpük pedleri, kurutma kağıdını, jeli ve zarı 1x buz gibi transfer tamponuna batırın.
    5. Köpük pedi kasetin bir tarafına yerleştirin, ardından bir kurutma kağıdı yerleştirin, jeli yerleştirin, jelin üzerine nitroselüloz membran koyun, tekrar bir kurutma kağıdı yerleştirin ve son olarak başka bir köpük ped yerleştirin ve kaset tutucuyu kapatın. Kaset tutucuyu, membran tarafı anoda ve jel tarafı katoda bakacak şekilde transfer tankına yerleştirin.
    6. Kurulumu kapatmak için katot ve anot ucunu tanka bağlayın ve 120 dakika boyunca 120 mA akıma ayarlayın. Aktarımı soğuk bir odada çalıştırmaya başlayın.
    7. Aktarım bittikten sonra zarı küçük bir plastik kutuya yerleştirin. Külbütör üzerinde oda sıcaklığında 1 saat boyunca spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için 1x PBST20'de yapılan 10 mL %5 BSA solüsyonu kullanarak membranı bloke edin.
    8. Bloke edici çözeltiyi çıkarın, fare önleyici Ag85B antikoru olan 5-10 mL birincil antikor ekleyin (% 5 BSA çözeltisinde 1: 5.000 seyreltme) ve bir külbütörde gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Antikoru -20 °C'de saklayın ve 3 kata kadar tekrar kullanın.
    9. Birincil antikoru çıkarın, 5-10 mL 1x PBST20 ekleyin ve zarı oda sıcaklığında 8 dakika boyunca kuvvetlice çalkalayarak yıkayın. İlk yıkamayı çıkarın, tekrar 5-10 mL 1x PBST20 ekleyin ve yıkayın. Bunu 2 kez tekrarlayın.
    10. Anti-fare At redoks peroksidaz (HRP) konjuge antikoru (1: 10.000 seyreltme) olan ikincil antikor içeren 5-10 mL 1x PBST20 ekleyin ve bir külbütör üzerinde oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
    11. Adım 3.2.9'u izleyerek ikincil antikordan sonra zarı yıkayın. Bir kemilümometre altında zarı geliştirmek için eşit miktarda HRP substratı ve arttırıcı ekleyin (Şekil 1C).
      NOT: Sitozolik protein kontaminasyonunun olmadığını doğrulamak için, Western blot'u bir anti-PknB antikoru ile inceledik (Şekil 1C). Antikor, bir hayvan tesisi olan Ulusal İmmünoloji Enstitüsü'nde, PknB'nin saflaştırılmış ekstrasitoplazmik alanına karşı yükseltildi. PknB bandı kültür filtratlarında değil, WCL'de gözlemlenebilir ve PknB yalnızca sitozolik ve membrana bağlıdır ve kültür filtratında bulunmamalıdır.

4. Kütle spektrometresi için numunelerin hazırlanması

  1. Tripsin ile çözelti içi protein sindirimi gerçekleştirin.
    1. 100 μg kültür süzüntü proteini alın, 6x hacimde buz gibi soğuk aseton ekleyin ve gece boyunca -20 °C'de tutun.
      NOT: Kütle spektrometresi numunesi için tüm reaktifleri hazırlamak için cam eşyalar kullanın. Düşük proteinli bağlayıcı mikrosantrifüj tüpleri ve düşük proteinli bağlayıcı uçlar kullanın. Kütle spektrometresi analizinde polimer kontaminasyonunu önlemek için plastik malzeme kullanmayınız.
    2. Proteinleri 30 dakika boyunca 4 ° C'de 18.000 x g'da santrifüjleme ile çökeltin. Süpernatanı atın.
    3. Peleti 500 μL asetonla yıkayın, 18.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca peletleyin. Süpernatanı atın. Kalan asetonu bir vakum yoğunlaştırıcı yardımıyla çıkarın.
    4. 25 mM amonyum bikarbonat içinde çözünmüş 20 μL 8 M üre ekleyin (2 M stoğa MS dereceli suda hazırlanır). Numuneleri vorteksleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
    5. Ad 60 μL 25 mM amonyum bikarbonat 8 M üreyi 2 M'ye seyreltmek için oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. 4 μL TCEP (25 mM amonyum bikarbonatta yapılan 10 mM nihai konsantrasyon) ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, 1.800 x g'da çalkalayın.
    6. 4 μL IAA (25 mM amonyum bikarbonatta yapılan 25 mM nihai konsantrasyon) ekleyin ve karanlıkta 1.800 x g'da çalkalayarak oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. 110 μL 25 mM amonyum bikarbonat ekleyin.
    7. Tripsin ekleyin (1:20; Tripsin: μg cinsinden protein) çözeltiye ekleyin ve gece boyunca sindirim için 300 rpm'de çalkalayarak 37 ° C'de tutun (Şekil 2). % 10 TFA (trifloro asetik asit) ekleyerek sindirim reaksiyonunu durdurun. Numuneleri kuruması için tamamen hızlı vakumlayın.
  2. Numunenin tuzdan arındırılması
    1. Sindirilmiş peptitlere 100 μL %5 ACN + %0.1 TFA ekleyin. Oda sıcaklığında 1.500 rpm'de 30 dakika girdap.
    2. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 18.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı (peptit) peletlere dokunmadan taze mikrosantrifüj tüplerine alın ve tuzdan arındırma işlemine devam edin. Tuzdan arındırma adımından önce tüm yıkama ve elüsyon solüsyonlarını yapın.
    3. Çözeltiyi pipetleyerek ve işlemi 5 kez tekrarlayarak C-18 kolon ucunu 100 μL %100 ACN + %0,1 TFA ile dengeleyin.
    4. 100 μL %50 ACN + %0.1 TFA ekleyin ve işlemi 5 kez tekrarlayın. 100 μL %5 ACN + %0.1 TFA ekleyin ve işlemi 5x tekrarlayın.
    5. 30x pipetleyerek peptit bağlanmasının C-18 kolon ucunda gerçekleşmesine izin verin. Numune Kütle spektrometresi için işlenene kadar çözeltiyi -20 °C'de tutun. Şimdi, peptit C-18 kolonuna bağlıdır.
    6. C-18 kolonunu 100 μL MS sınıfı su +% 0.1 TFA ile pipetleme ile yıkayın ve işlemi 5 kez tekrarlayın.
    7. C-18 kolonunu pipetleme ile 100 μL %5 ACN + %0,1 TFA ile yıkayın ve işlemi 5 kez tekrarlayın. C-18 kolonundaki peptitleri 100 μL'de %50 ACN + %0.1 TFA'da 30x pipetleme ile elute edin (Şekil 2).
      NOT: Elüsyondan sonra, C-18 kolon ucu, Kütle spektrometresi yapılana kadar 4 ° C'de saklanabilir.
    8. Ayrıştırılan peptidi tamamen vakumlayın ve Kütle spektrometresi için numune verilene kadar -20 °C'de saklayın.
  3. Peptit örneklerinin bir Kütle spektrometresine enjeksiyonu.
    1. Kurutulmuş peptit numunelerine 20 μL çözelti A (Kütle spektrometresi tesisi tarafından sağlanır) ekleyin. Numuneleri 30 dakika vorteksleyin ve 4 ° C'de 90 dakika santrifüjleyin.
    2. 90 dakikalık bir gradyan çalışması için 20 μL numuneyi Kütle spektrometresi makinesine enjekte edin.

5. Kültür süzüntüsünde bulunan salgılanan proteinler için veri analizi

  1. Protein tanımlama
    1. Dört kutuplu kütle spektrometresini kullanarak proteomik numuneleri analiz edin. Elde edilen spektrumları Mtb H37Rv UniprotKB veritabanına karşı sorgulayın.
    2. Öncü ve parça kütle toleranslarını 10 ppm ve 0,5 Da olarak ayarlayın. Enzimi, kaçırılan maksimum bölünme değeri iki olan Tripsin'e ayarlayın.
    3. Sabit bir modifikasyon olarak sisteinin karbamidometilasyonu ile arama algoritması olarak Sequest ile proteom yazılımını kullanın.
    4. Tüm peptit spektrum eşleşmelerini (PSM) %1 yanlış keşif oranında tanımlayın. Diğer tüm parametreler için varsayılan ayarları uygulayın.
    5. Peptit dizisinin ham Kütle spektrometresi dosyalarını, ilgili Mtb proteinlerinin UniProt ID'si ile eşleştirin. Mycobrowser veritabanını kullanarak tüm Mtb proteinlerini, Uniprot kimliklerini ve fonksiyonel sınıflandırmayı listeleyin.
    6. Daha fazla analiz için, tanımlanan proteinlerin UniProt ID'lerini ilgili Rv numaralarıyla eşleştirin. Kütle spektrometresi sekretom verilerini PRIDE ortağı aracılığıyla ProteomeXchange Konsorsiyumu'na yatırın.

6. Konak sinyalindeki değişikliği kontrol etmek için H37Rv'yi kültür süzüntü proteini ile tedavi etmek

  1. Peritoneal makrofajların farelerden izolasyonu.
    NOT: Peritoneal makrofaj izolasyonu, hücrelerin tohumlanması ve enfeksiyon için referans21'i izleyin.
    1. Balb / c farelerine (4-6 haftalık) 1 mL% 4 tiyoglikolat enjekte edin ve enfeksiyonun 4. gününde fare peritonundan peritoneal makrofajları izole edin21 (Şekil 3).
    2. Fare peritona 1x PBS enjekte ederek makrofaj hücrelerini toplayın. Hücreleri 5 dakika boyunca 1.800 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve% 10 FBS (Fetal Sığır Serumu; tam ortam) ve 1x pen-strep (antibiyotikler) ile desteklenmiş 5 mL 1640 RPMI ortamı ekleyin.
    3. 24 oyuklu plakaya oyuk başına 3 x 105 hücre tohumlayın ve plakaları gece boyunca 37 ° C'lik bir inkübatörde inkübe edin. Ertesi gün, ortamı taze, eksiksiz ortama değiştirin ve hücreler enfeksiyon veya kültür süzüntü proteinleri ile tedavi için hazır olacaktır.
  2. Peritoneal makrofajların kültür filtrat proteinleri ile tedavisi
    1. Makrofaj hücrelerini BSL-3'e alın ve inkübatörde tutun. Hücreleri 1 mg / mL kültür süzüntü proteinleri ile tedavi edin (Şekil 3). Hücreleri, kültür sonrası süzüntü işleminden sonra 4 saat, 24 saat ve 48 saat olmak üzere farklı zaman noktalarında hasat edin.
      1. İzole edilmiş makrofaj hücrelerini, her zaman noktasında üç kopya halinde 24 oyuklu plakalara tohumlayın. Hücreleri 1 mg / mL kültür süzüntü proteinleri ile muamele edin ve CO2 varlığında 37 ° C inkübatörde inkübe edin. Hücreleri, işlemden 4 saat, 24 saat ve 48 saat sonra olmak üzere üç zaman noktasında hasat edin.
      2. Hücreleri, i) makrofaj hücresi lizatlarını yapmak ve Western blotlama yaparak farklı konak hücre belirteçlerini kontrol etmek için 2x-lamel tamponu ve ii) kitlerle birlikte üreticiler tarafından sağlanan immünolojik testler için farklı tamponlar ile tedavi edin.
    2. Konağın hücre lizatlarını hazırlayın ve kültür süzüntüsü ile muamele edilmiş makrofaj hücreleri üzerinde farklı belirteçleri, konakçı hücrelerin sitokin profilini ve çeşitli sinyal yolu protein ekspresyonlarını kontrol edin.
      NOT: Bir laboratuvarda salgı yolu proteininin bir gen replasman mutantı varsa, Mtb H37Rv ve Mtb mutantından hazırlanan kültür filtratları, konak immünomodülatör parametreleri üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokolde, Mikobakterilerden kültür süzüntü proteinlerinin izolasyonunu gösterdik (Şekil 1A). Kültür filtrat proteinleri daha sonra kültür filtrat izolasyonunu doğrulamak için farklı belirteçler için kontrol edildi. Protokolde belirtildiği gibi, protein yüklemesini kontrol etmek için bir Coomassie boyaması yapıldı. WCL fraksiyonunda (son şeritte Şekil 1B'de) çizgili bir protein bandı gözlemlenebilirken, CF (kültür süzüntüsü) şeritlerinde tüm protein...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kritik araştırma alanlarından biri, Mtb patogenezini anlamak ve etkili tanı ve aşılar geliştirmek ile ilgilidir22,23. Kültür filtrat proteinlerinin Mtb kültür ortamından izolasyonu, patojen tarafından salgılanan virülans faktörlerinin tanımlanmasını sağlayan bir işlemdir. Mtb patogenezini modüle etmede salgı proteinlerinin rolünün araştırılması mekanik içgörüler sağlar ve ayrıca terapötik müdahale için ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Hiç kimse.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.2 ve mikro; m Şırınga filtrelerimdiSYPL0601MNXX204
0.2 & mikro; m Nitroselüloz membranAmersham10600001
%37 HClMerckH1758
AsetonEMPLURA MERCKSL9F690866
AsetonikrilSigma-Aldrich34851-2L
AkrilamidBIORAD1610107
AlbüminBio Basic KanadaKedi No: AD0023
Amicon Ultra-15Merck, MilliporeUFC900396
Amonyum biyokarbonatSigma-Aldrich09830-500G
Amonyum persulpahteSigma-AldrichA3678-100G
anti-Ag85BAbcamAB43019
anti-fare HRP konjuge ikincil antikorThermo Fischer62-6520
AsparaginSigma-AldrichA0884-500G
bis-akrilamidSIGMA146072-500G
BSAMerckMB083-500G
C-18 sütunThermo FischerSEM SS18V
Katalaz Sigma-AldrichC1345
Sitrik AsitSigma-AldrichC0759-500G
DekstrozSigma-AldrichG7021-1KG
Difco Orta dere 7H9 et suyu   Fisher Scientific271310
Ferrik amonyum(III) sitratSigma-AldrichF5879-100G
Formik Asit %98-100MerckZ0823704246
Buzlu asetik asit %100MerckCD0C700160
GlisinSigma-AldrichG8898-1KG
GlisinSIGMAG8898-1KG
GycerolSigma-AldrichG5516
İmmobilion Batı Kemilüminesan HRP substratıMerckWBKLS0500
İyodoasetamidAmershamRPN6302V
Magnezyum sülfatSigma-AldrichM7506-500G
Mikobroswer
Oleik asitSigmaKedi No: O1008
Pierce BCA protein tahlil kitiThermo Fischer23225
Pierce Tripsin ProtazThermo Fischer90058
Proteome Discoverer 2.0Thermo Fischer Scientific
Q-Exactive HF (Thermo Scientific) (proteomik deneyler - peptit dizilimi, protein tanımlama ve miktar tayini)Thermo Fischer Scientific
Sodyum klorürSigma CatNo: S3014
Sodyum KlorürSigma-AldrichS7773-1KG
Sodyum dodesil sülfatSigma-AldrichL3771-1KG
TCEPSigma-AldrichC4706-25
TemedSigma-AldrichT9281-100ML
Tris BazBioRad161-0719
Tris-HClAMRESCO0234-500G
Tween 80Sigma-AldrichP1754
UniProt protein veri tabanı
UreaMP Bio194857

Kaynaklar

  1. Campbell, I. A., Bah-Sow, O. Pulmonary tuberculosis: diagnosis and treatment. Br Med J. 332 (7551), 1194-1197 (2006).
  2. Sonnenberg, M. G., Belisle, J. T. Definition of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate proteins by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, N-terminal amino acid sequencing, and electrospray mass spectrometry. Infect Immun. 65 (11), 4515-4524 (1997).
  3. Burts, M. L., Williams, W. A., DeBord, K., Missiakas, D. M. EsxA and EsxB are secreted by an ESAT-6-like system that is required for the pathogenesis of Staphylococcus aureus infections. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (4), 1169-1174 (2005).
  4. Braunstein, M., Brown, A. M., Kurtz, S., Jacobs, W. R. Jr Two nonredundant SecA homologues function in Mycobacteria. J Bacteriol. 183 (24), 6979-6990 (2001).
  5. Feltcher, M. E., et al. Label-free quantitative proteomics reveals a role for the Mycobacterium tuberculosis SecA2 pathway in exporting solute binding proteins and Mce transporters to the cell wall. Mol Cell Proteomics. 14 (6), 1501-1516 (2015).
  6. McDonough, J. A., Hacker, K. E., Flores, A. R., Pavelka, M. S. Jr, Braunstein, M. The twin-arginine translocation pathway of Mycobacterium smegmatis is functional and required for the export of mycobacterial beta-lactamases. J Bacteriol. 187 (22), 7667-7679 (2005).
  7. Saint-Joanis, B., et al. Inactivation of Rv2525c, a substrate of the twin arginine translocation (Tat) system of Mycobacterium tuberculosis, increases beta-lactam susceptibility and virulence. J Bacteriol. 188 (18), 6669-6679 (2006).
  8. Braunstein, M., Espinosa, B. J., Chan, J., Belisle, J. T., Jacobs, W. R. Jr SecA2 functions in the secretion of superoxide dismutase A and in the virulence of Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 48 (2), 453-464 (2003).
  9. Zulauf, K. E., Sullivan, J. T., Braunstein, M. The SecA2 pathway of Mycobacterium tuberculosis exports effectors that work in concert to arrest phagosome and autophagosome maturation. PLoS Pathog. 14 (4), e1007011(2018).
  10. Guinn, K. M., et al. Individual RD1-region genes are required for export of ESAT-6/CFP-10 and for virulence of Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 51 (2), 359-370 (2004).
  11. Lewis, K. N., et al. Deletion of RD1 from Mycobacterium tuberculosis mimics bacille Calmette-Guerin attenuation. J Infect Dis. 187 (1), 117-123 (2003).
  12. Kana, B. D., et al. The resuscitation-promoting factors of Mycobacterium tuberculosis are required for virulence and resuscitation from dormancy but are collectively dispensable for growth in vitro. Mol Microbiol. 67 (3), 672-684 (2008).
  13. Russell-Goldman, E., Xu, J., Wang, X., Chan, J., Tufariello, J. M. A Mycobacterium tuberculosis Rpf double-knockout strain exhibits profound defects in reactivation from chronic tuberculosis and innate immunity phenotypes. Infect Immun. 76 (9), 4269-4281 (2008).
  14. Biketov, S., et al. The role of resuscitation promoting factors in pathogenesis and reactivation of Mycobacterium tuberculosis during intra-peritoneal infection in mice. BMC Infect Dis. 7, 146(2007).
  15. Verma, R., et al. Quantitative proteomic and phosphoproteomic analysis of H37Ra and H37Rv strains of Mycobacterium tuberculosis. J Proteome Res. 16 (4), 1632-1645 (2017).
  16. Malakar, B., et al. Phosphorylation of CFP10 modulates Mycobacterium tuberculosis. mBio. 14 (5), e0123223(2023).
  17. Lochab, S., Singh, Y., Sengupta, S., Nandicoori, V. K. Mycobacterium tuberculosis exploits host ATM kinase for survival advantage through SecA2 secretome. Elife. 9, e51466(2020).
  18. Kurtz, S., McKinnon, K. P., Runge, M. S., Ting, J. P., Braunstein, M. The SecA2 secretion factor of Mycobacterium tuberculosis promotes growth in macrophages and inhibits the host immune response. Infect Immun. 74 (12), 6855-6864 (2006).
  19. Sullivan, J. T., Young, E. F., McCann, J. R., Braunstein, M. The Mycobacterium tuberculosis SecA2 system subverts phagosome maturation to promote growth in macrophages. Infect Immun. 80 (3), 996-1006 (2012).
  20. Putim, C., et al. Secretome profile analysis of multidrug-resistant, monodrug-resistant and drug-susceptible Mycobacterium tuberculosis. Arch Microbiol. 200 (2), 299-309 (2018).
  21. Naz, S., Dabral, S., Kumar, D., Nandicoori, V. K. Protocol for ex vivo competition and sequencing of Mycobacterium isolated from infected guinea pigs. STAR Protoc. 3 (4), 101804(2022).
  22. Xu, D. D., et al. Discovery and identification of serum potential biomarkers for pulmonary tuberculosis using iTRAQ-coupled two-dimensional LC-MS/MS. Proteomics. 14 (2-3), 322-331 (2014).
  23. Prasad, T. S., et al. Proteomic analysis of purified protein derivative of Mycobacterium tuberculosis. Clin Proteomics. 10 (1), 8(2013).
  24. Miller, B. K., et al. Mycobacterium tuberculosis SatS is a chaperone for the SecA2 protein export pathway. Elife. 8, e40063(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Sekresyon ProteinleriSekresyon SistemleriKütle SpektrometresiProtein KonsantrasyonuBakteriyel Virülans FaktörleriKonak İmmünomodülasyonuSantrifüjleme
Tüberküloz Patogenezini Anlamak için Mycobacterium tuberculosis Kültür Filtratının Hazırlanması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.