Yüksek rejeneratif ktenoforlarda karmaşık bir duyu organının cerrahi olarak çıkarılması

Tarak jöleleri olarak da bilinen ktenoforlar, Dünya'nın deniz ortamları için kozmopolittir ve özellikle besin ağının bir parçası olarak ekosistemlerde önemli oyuncular olabilir. Ctenophore Mnemiopsis leidyi, tüm vücut yenilenmesinin tarihi ve giderek daha popüler hale gelen bir hayvan modelidir ^1,2. Herhangi bir eksik organ veya hücre tipini yeniden oluşturma yetenekleri, embriyogenezin sonlarına doğru ortaya çıkar ve embriyonik sonrası ömürleri^{boyunca devam} eder ^3,4 (vücut büyüklüğünde ~ ^0.1 ila >1.000 mm). Ayrıca yaşamları boyunca şeffaftırlar ve çeşitli canlı ve sabit görüntüleme tekniklerine uygundurlar. Tüm ktenoforların en son ortak atası birçok hücre tipine ve karmaşık organlara sahipti; mevcut ktenoforların çoğu, en az bir yaşam evresinde bunların çoğuna sahiptir: bir aboral, yerçekimi algılayıcı organ (tarihsel olarak apikal organ olarak adlandırılır ve burada aboral organ, AO olarak adlandırılır), koordineli bir şekilde atan yüksek derecede organize makrosilyalardan oluşan özel lokomotor yapılar (tarak sıraları), geri çekilebilir besleme dokunaçları ve zararlı uyaranlara yanıt olarak biyolüminesans yapan fotositler (Şekil 1).

Çok sayıda hücre tipine ve karmaşık, bağlama bağlı davranışlarına rağmen, sağlam bir genomik veri grubu, ktenoforların diğer tüm canlı hayvanlara olası kardeş grup olarak yerleştirilmesini destekler 5,6,7,8. Ctenophore sinir sisteminin hücresel ve işlevsel temelinde, bir sinir sistemine sahip diğer hayvanlardan (bilaterians ve cnidarians) büyük farklılıklar, ctenophore sinir sisteminin bağımsız bir kökeni temsil ettiği hipotezini ortaya koymuştur; Ancak, bu belirsizliğini koruyor ^9,10,11,12.

Aboral duyusal organ kompleksi, birden fazla varsayılan nörosensör hücre 13,14,15,16,17,18 türü dahil olmak üzere birçok hücre tipini içeren ve manipüle edilmemiş ktenoforlarda sürekli bakım altında olan statosisti içerir. Mekanosensoriyel hücreler, yerçekimini tespit etmek için biyomineralize hücrelerden (litosit olarak adlandırılır) oluşan bir statolit tarafından saptırılan büyük siliyer demetler taşır. Bilinmeyen işlevi¹⁴ ve olası fotosensör hücreleri¹⁶ olan varsayılan duyusal yapıları içeren iki "polar alan", statosiste bitişiktir.

M. leidyi'nin rejeneratif kapasitesinin deneysel olarak araştırılması, embriyodan kuluçkaya geçişteki en küçük hayvanları (~ 100 μm) serbest yaşayan makroskopik yetişkinlere (>2 cm) kadar yaymıştır. Gövde çapı ~1 mm olan M. leidyi, mikromanipülatörler gibi özel aletler olmadan manuel cerrahi manipülasyona izin verecek kadar büyüktür, ancak yüksek güçlü objektiflerle görüntüleme için standart bir mikroskop lamına monte edilebilecek kadar küçüktür. Bu protokol, aboral duyu organının ve ilgili yapıların cerrahi olarak çıkarılmasını, takip eden saatler ila günler içinde gerçekleşen yara iyileşmesi ve rejenerasyon süreçlerini belgelemek için uygun kültür ve görüntüleme yöntemleri ile birlikte gösterir.

1. Araç ve gereçleri hazırlayın

1. Standart bir Bunsen brülörü kullanarak, cam kılcal mikropipetlerden cam diseksiyon iğnelerini elle çekin. 1 mm'den büyük hayvanlar için, sıvı işleme için tasarlanmış kalibre edilmiş soda kireç cam mikropipetleri kullanın.
   NOT: 100 μl boyutu, 0,5-3 mm'lik odak aralığında iyi sonuç verir.
   1. Bunsen brülöründe keskin mavi bir alev konisi oluşturun.
   2. Cam pipetin orta noktasını, hafif basınç altında hareket edecek kadar yumuşayana kadar alevin içinde tutun.
   3. Pipeti alevden çıkarın ve kısa, güçlü bir iğne oluşturmak için hemen iki tarafı düz bir şekilde birbirinden ayırın.
      NOT: İlk denemede tatmin edici bir sonuç alınamazsa cam iğne stoğu yeniden eritilebilir ve kırılan iğneler kurtarılarak yeniden çekilebilir. Bu yöntemle çekilen kullanılabilir ve kullanılamaz iğne örnekleri için Şekil 2'ye bakın.
      ALTERNATİF: 26 G 1/2 inç iğneler, özellikle odak boyutu aralığının daha geniş ucunda da iyi çalışır.
2. Doğal veya yapay deniz suyunu 0,22 μm'lik bir filtreden geçirerek steril deniz suyu hazırlayın.
3. Ölçüm pipetleri oluşturun.
   1. Keskin bir makas veya tıraş bıçağı kullanarak, tercih edilen boyutta iç çapa sahip bir açıklık oluşturmak için plastik bir transfer pipeti kesin. İstenen aralığın üst kısmı için en az bir pipet ve istenen aralığın altı için bir pipet hazırlayın. Örnek bir ölçüm pipeti seti için Şekil 3'e bakın.
      NOT: Bu pipetler ~8 mm'ye kadar iyi çalışır. Fotoğraflardan bir mikrometre veya ölçüm araçları ile boyutu tahmin etmek de mümkündür.

2. Deney için hayvanları hazırlayın

1. İstenilen boyut ve aşamada morfolojik olarak normal bireyleri seçin.
   NOT: ~ 0,5-3 mm çapındaki hayvanların kızaklara montaj için en uygun olduğunu düşünüyoruz. Hayvanların, en düşük boyuttaki pipete sığmadığını, ancak sınıfının en iyisi boyutlandırma pipetine rahatça sığıp sığmadığını kontrol edin.
2. Deney hayvanlarını 8-16 saat aç bırakın.
   NOT: M. leidyi optik olarak saydam ve yüksek derecede otofloresan olmasa da, sindirim sistemlerinde dolaşan yiyecekler genellikle opaktır ve genellikle otofloresandır.

3. Kesimler yapın

1. Steril deniz suyu içeren 35 mm'lik polistiren bir kaba aktarmak için deney hayvanının vücut boyutundan daha geniş bir transfer pipeti kullanın.
2. Diseksiyon mikroskobunu kullanarak numuneyi görselleştirin. Bir hayvanı özofagus tarafına yuvarlayın (Şekil 1). Bu görünüm, aboral organı çıkarmak için en kolay erişimi sağlar. Aboral organa odaklanın.
   NOT: En kullanışlı büyütme, hayvan boyutuna ve kullanıcı tercihine göre değişebilir. Genellikle 12-20x büyütme iyi sonuç verir.
3. Baskın olmayan elinizi kullanarak hayvanı bir cam iğne ile nazikçe yerinde tutun.
4. Baskın eli kullanarak, bir iğnenin ucunu aboral organın biraz altına sokun. Aboral organın görünür bir kenarından tabanının altına kadar bir kesim yapmak için eğik olarak girin. İğneyi geri çekin ve aboral organın tüm yapılarını içeren kama şeklindeki bir doku parçasını çıkarmak için ikinci bir kesim yapın (bkz. Şekil 4, üst panel). Operasyonun başarılı olduğundan emin olmak için hayvanı ve eksize edilen dokuyu dikkatlice inceleyin.
5. Taze kesilmiş hayvanı steril deniz suyu içeren taze bir tabağa taşımak için aynı transfer pipetini kullanın.
   NOT: Yara hızlı bir şekilde kapanacaktır, bu nedenle deneysel hedeflere bağlı olarak (birden fazla eşzamanlı olarak yenilenen örnek için veya iyileşme ve rejenerasyonun erken aşamalarını görüntülemek gibi), birkaç örnek oluşturmak için hızlı hareket etmek gerekir. Yenilenen hayvan kohortlarını birbirine daha yakın tutmak için cerrahi süreyi sınırlamak için bir zamanlayıcı kullanın.

4. Kesimlerin doğru olup olmadığını kontrol edin

NOT: Diseksiyon mikroskobu altında dikkatlice kontrol edilse bile, bazen cerrahi hataları gözden kaçırmak mümkündür.

1. Amaçlanan tüm yapıların doğru bir şekilde çıkarılıp çıkarılmadığını DIC ile bileşik bir mikroskop altında kontrol etmek için her bir ameliyat sonrası bireyi geçici olarak bir cam slayt üzerine monte etmek için aşağıdaki montaj adımlarını izleyin. Şu anda daha fazla görüntüleme yapmasanız bile bu kontrolü gerçekleştirin.
   NOT: Ktenoforların mükemmel iyileştirme yetenekleri, onları aşılama deneylerine iyi bir şekilde ödünç verir; Çıkarılan bir AO'nun ve çıkarıldığı hayvanın geri kalanının kesik taraflarının birbirine yapışma ve kaynaşma olasılığını önlemek için eksize edilen aboral organları her zaman kültür kabından çıkarırız.
   Doğrudan uzun süreli görüntülemeye geçmiyorsanız, slaydı kapatmayın. Bu, hızlı iyileşmeyi ve bu deney hayvanının kültürüne geri dönmesini kolaylaştıracaktır. Yüksek büyütme altında cerrahi doğruluğun kontrol edilmesi önerilir. Özellikle, statolit ameliyatı tamamlamadan kubbeden dışarı çıkarılabilir.

5. Canlı görüntüleme

1. Montaj
   1. Standart bir cam mikroskop lamını, cam işleme için su itici gibi silanize edici bir madde ile işlemden geçirin ve tamamen kurumasını bekleyin.
   2. Cerrahi sonrası bir hayvanı bir transfer pipeti ile hazırlanmış bir slayta aktarın. Suyun içindeki hayvanla birlikte boncuklandığını onaylayın.
   3. Kapak camını hayvandan uzaklaştırmak için bir ara parça görevi görecek "ayaklar" oluşturmak için bir kapak camının her bir köşesine az miktarda modelleme kili (~ 1.5 mg) yerleştirin.
   4. Kapak camını, kil aşağı bakacak şekilde hayvanın üzerine nazikçe yerleştirin. Kapak camının her bir köşesini tutarak, hayvanı görüntüleme için uygun konuma getirin. Hayvanı hafifçe sıkıştırmak için aşağı bastırın ve yerinde tutun. Tatmin edici bir görünüme ulaşmak için numuneyi gerektiği kadar yeniden konumlandırın.
   5. ~30 dakikadan daha uzun görüntüleme için, numunenin kurumasını önlemek için kapak camının her iki kenarına ince bir tabaka vazelin uygulayın.
      NOT: Bu şekilde monte edilen M. leidyi , daha ileri kültür veya diğer tahliller için kolayca geri kazanılabilir. Bununla birlikte, hayvanlar genellikle 1-2 saat içinde serbest kalacak ve kendilerini yeniden konumlandıracaktır, bu nedenle 2 saatten daha uzun sürekli hızlandırılmış bir yakalama, farklı bir görüntüleme yaklaşımı gerektirecektir.

6. Kültür

1. Cydippid kültür koşulları
   1. Kültür, cerrahi olarak manipüle edilmiş hayvanlar ve oda sıcaklığına yakın filtrelenmiş doğal veya yapay deniz suyunda kontroller. Tutarlı sonuçlar elde etmek için 20-22 °C'ye ayarlanmış bir inkübatör kullanın.

Cydippid evresi M. leidyi tipik olarak yaralanmadan sonra ~ 20 dakika içinde yara kapanmasını tamamlar (Şekil 4 ve Şekil 5), organın tam rejenerasyonu 1-3 gün sürebilir. Bu zamanlama bazı biyolojik değişkenliklere sahiptir, ancak neredeyse her zaman ameliyattan 72 saat sonra tamamlanır (Şekil 6).

Aboral organ kompleksinden ve yakındaki dokulardan hücrelerin ve mezogleananın cerrahi olarak çıkarılması ve ardından yaranın hızlı bir şekilde kapatılması, ameliyat öncesi ve sonrası görüntülerde gösterildiği gibi genel olarak daha küçük bir vücut çapı ile sonuçlanır (Şekil 3).

Laboratuvarımızdaki lisans öğrencileri, 0.5-3 mm boyut aralığında cydippid stage M. leidyi kullanarak, hayvanların S'ü çıkarıldıktan 48 saat sonra ve 0 çıkarıldıktan 72 saat sonra (N = 30) aboral organlarını tamamen yenileyerek rejenerasyon testleri yapabilmişlerdir.

Ameliyattan sonra, kullanıcının hipotezine göre uyarlanmış takip testleri, hızlandırılmış görüntüleme, fiksasyon ve etiketleme (RNA in situ hibridizasyon veya immünohistokimya gibi) veya yayınlanmış yöntemler kullanılarak daha fazla karakterizasyon için biyomoleküllerin ekstraksiyonunu içerebilir.

Resim 1: Mnemiopsis leidyi cydippit, ana gövde eksenleri ve organları tanımlanmıştır. Üst panel: Adesofajus görünümü, aboral-oral eksen oral tarafı aşağı bakacak şekilde dikey olarak yönlendirilmiş. Alt panel: Aboral görünüm, özofagus ekseni dikey olarak yönlendirilmiş. Ölçek çubuğu = 0,1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Elle çekilmiş iğneler. (A) Elle çekilmiş iyi iğne örnekleri. (B) (a) Elle çekme sırasında meydana gelebilecek çeşitli hataların yanı sıra iyi çekilmiş bir iğne, (b) yavaş çekme ve/veya düşük sıcaklık nedeniyle ayrılmayan bir pipet, (c) alevin içinde kalmaktan veya fazlalığı çıkarmadan aynı cam pipeti kullanarak birden fazla denemeden kaynaklanan çok fazla fazla malzeme içeren bir iğne, (d) yeterince keskin olmayan bir iğne, (e) Birden fazla iğne yapmak için aynı pipetin kullanılmasından kaynaklanan kısa saplı bir iğne, (f) pipetin belirli bir açıyla çekilmesi nedeniyle çengelli ucu olan bir iğne, (g) tekrarlanan denemeler nedeniyle vücutta fazla materyal bulunan iğne, (h) çok kısa ve küt uçlu bir iğne ve (i) çok uzun ve ince uçlu bir iğne. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Ölçüm pipetleri. (A) Bir kesilmemiş tek kullanımlık pipet ve uçları daha büyük açıklıklar oluşturmak için pipetin farklı noktalarından kesilmiş iki tek kullanımlık pipet, yandaki kesilen parçalar farklı iç çapları gösterecek şekilde. (B) Bir dizi boyut seçeneği oluşturmak için bazıları kesilmiş ve bazıları kesilmemiş, farklı iç çaplara sahip tek kullanımlık pipetler. (C) Altta gösterilen aynı boyutta tek kullanımlık pipetten yapılmış üç farklı ölçüm pipeti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: M. leidyi cydippid'de aboral organın çıkarılması ve ardından yara kapanması, lateral görünüm. Üst panel: Aboral organın çıkarılmasına cerrahi yaklaşım. Kesikli kırmızı çizgi, bozulmamış bir cydipsid'in diyagramatik gösteriminden kaldırılacak alanı gösterir. Alt paneller: Yara kapanması sırasında ameliyattan 10, 30 ve 60 dakika sonraki zaman serileri. Yara, yaralanmadan birkaç dakika sonra kapanır. Ölçek çubuğu = 0,1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Cydippid evre M.leidyi'de başarılı aboral organ çıkarılması ve ardından yara kapanmasının aboral görünümü. Üst panelde kesilmemiş bir hayvan gösterilir; Kesikli kırmızı daire, kaldırılacak alanı gösterir. Orta panel: Ameliyattan hemen sonra aynı hayvan, kesikli kırmızı daire yaklaşık yara kenarlarını gösterir. Açık yarada açıkta kalan mezogleea, ortada hayvanın bağırsağının kesitte görülebildiği, biraz odak dışı bir alan olarak görünür. Alt panel: Ameliyattan 20 dakika sonra aynı hayvan. Yara kenarları önemli ölçüde küçülmüştür ve doku, hayvanın bağırsağının üzerindeki bölge boyunca odak düzleminde görülebilir ve bu da 0 dakikada açığa çıkmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6. Cydippid evresinde başarılı aboral organ çıkarılması ve ardından yara kapanmasının lateral görünümü M.leidyi. Sol üst panel: Cerrahi olarak çıkarılmadan önce bir cydippidin aboral organı. Diğer tüm paneller: Aboral organın çıkarılmasından hemen sonra (0 dakika) ve yara kapanmasının zaman serisinden (60 dakikada açıkça gösterilmiştir) ve aboral organın tam rejenerasyonundan (72 saatte gösterilmiştir) hemen sonra aynı cydipsid. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Lobat evresinde başarılı aboral organ çıkarılması ve ardından yara kapanmasının yanal görünümü M. leidyi. Sol üst panel: Bir lobatın cerrahi olarak çıkarılmadan önceki aboral organı (tam vücut görüntüsü ekinde). Diğer tüm paneller: Aboral organın çıkarılmasından hemen sonra (0 dk) ve yara kapanmasının zaman serisinden (240 dk'da gösterilmiştir) ve aboral organın tam rejenerasyonundan (120 saatte gösterilmiştir) hemen sonra aynı lobat. Zaman serisi panellerindeki iç kısımlar, yara kapanışının aboral görünümünü gösterir. Ölçek çubuğu = tüm paneller için 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.