Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yüksek rejeneratif ktenoforlarda karmaşık bir duyu organının cerrahi olarak çıkarılması

824 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/67546

⸱

8 Ağustos 2025

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, New Jersey Institute of Technology

Bu makalede

Özet

Canlı görüntülemeye uygun olan ktenofor Mnemiopsis leidyi'deki statokist ve ilişkili dokuların çıkarılması için basit bir protokol tarif ediyoruz.

Özet

Ctenophore Mnemiopsis leidyi , tüm vücut rejenerasyonunun klasik bir hayvan modelidir. Birçok laboratuvar tekniği için artan izlenebilirlik ve bunların kalan Metazoa'nın olası kardeş grubu olarak filogenetik yerleşimi, ktenoforlarla çalışmaya yönelik bilimsel ilginin yakın zamanda yenilenmesine yol açmıştır. Birkaç gün boyunca vücudun ~% 15'i kadar küçük bir parçadan tam tüm vücut yenilenmesi de dahil olmak üzere herhangi bir eksik organ veya hücre tipini yeniden oluşturabilirler. Çoğu ktenofor gibi, M. leidyi de vücut pozisyonlarını ve yönelimlerini kontrol etmek için duyusal girdiyi motor çıkışına bağlayan, abortal olarak yerleştirilmiş, yerçekimi algılayıcı bir organa sahiptir. Bu protokol, M. leidyi'deki aboral organ (AO) kompleksinin ve ilişkili yapıların cerrahi olarak çıkarılmasını ve takip eden saatler ila günler içinde gerçekleşen yara iyileşmesi ve rejenerasyon süreçlerini görüntülemek için uygun kültürleme, taşıma ve montaj yöntemlerini gösterir. Bu basit teknikler, farklı deneysel paradigmalara ve laboratuvar bağlamlarına geniş ölçüde uyarlanabilir.

Giriş

Tarak jöleleri olarak da bilinen ktenoforlar, Dünya'nın deniz ortamları için kozmopolittir ve özellikle besin ağının bir parçası olarak ekosistemlerde önemli oyuncular olabilir. Ctenophore Mnemiopsis leidyi, tüm vücut yenilenmesinin tarihi ve giderek daha popüler hale gelen bir hayvan modelidir 1,2. Herhangi bir eksik organ veya hücre tipini yeniden oluşturma yetenekleri, embriyogenezin sonlarına doğru ortaya çıkar ve embriyonik sonrası ömürleriboyunca devam eder 3,4 (vücut büyüklüğünde ~ 0.1 ila >1.000 mm). Ayrıca yaşamları boyunca şeffaftırlar ve çeşitli canlı ve sabit görüntüleme tekniklerine uygundurlar. Tüm ktenoforların en son ortak atası birçok hücre tipine ve karmaşık organlara sahipti; mevcut ktenoforların çoğu, en az bir yaşam evresinde bunların çoğuna sahiptir: bir aboral, yerçekimi algılayıcı organ (tarihsel olarak apikal organ olarak adlandırılır ve burada aboral organ, AO olarak adlandırılır), koordineli bir şekilde atan yüksek derecede organize makrosilyalardan oluşan özel lokomotor yapılar (tarak sıraları), geri çekilebilir besleme dokunaçları ve zararlı uyaranlara yanıt olarak biyolüminesans yapan fotositler (Şekil 1).

Çok sayıda hücre tipine ve karmaşık, bağlama bağlı davranışlarına rağmen, sağlam bir genomik veri grubu, ktenoforların diğer tüm canlı hayvanlara olası kardeş grup olarak yerleştirilmesini destekler 5,6,7,8. Ctenophore sinir sisteminin hücresel ve işlevsel temelinde, bir sinir sistemine sahip diğer hayvanlardan (bilaterians ve cnidarians) büyük farklılıklar, ctenophore sinir sisteminin bağımsız bir kökeni temsil ettiği hipotezini ortaya koymuştur; Ancak, bu belirsizliğini koruyor 9,10,11,12.

Aboral duyusal organ kompleksi, birden fazla varsayılan nörosensör hücre 13,14,15,16,17,18 türü dahil olmak üzere birçok hücre tipini içeren ve manipüle edilmemiş ktenoforlarda sürekli bakım altında olan statosisti içerir. Mekanosensoriyel hücreler, yerçekimini tespit etmek için biyomineralize hücrelerden (litosit olarak adlandırılır) oluşan bir statolit tarafından saptırılan büyük siliyer demetler taşır. Bilinmeyen işlevi14 ve olası fotosensör hücreleri16 olan varsayılan duyusal yapıları içeren iki "polar alan", statosiste bitişiktir.

M. leidyi'nin rejeneratif kapasitesinin deneysel olarak araştırılması, embriyodan kuluçkaya geçişteki en küçük hayvanları (~ 100 μm) serbest yaşayan makroskopik yetişkinlere (>2 cm) kadar yaymıştır. Gövde çapı ~1 mm olan M. leidyi, mikromanipülatörler gibi özel aletler olmadan manuel cerrahi manipülasyona izin verecek kadar büyüktür, ancak yüksek güçlü objektiflerle görüntüleme için standart bir mikroskop lamına monte edilebilecek kadar küçüktür. Bu protokol, aboral duyu organının ve ilgili yapıların cerrahi olarak çıkarılmasını, takip eden saatler ila günler içinde gerçekleşen yara iyileşmesi ve rejenerasyon süreçlerini belgelemek için uygun kültür ve görüntüleme yöntemleri ile birlikte gösterir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Araç ve gereçleri hazırlayın

  1. Standart bir Bunsen brülörü kullanarak, cam kılcal mikropipetlerden cam diseksiyon iğnelerini elle çekin. 1 mm'den büyük hayvanlar için, sıvı işleme için tasarlanmış kalibre edilmiş soda kireç cam mikropipetleri kullanın.
    NOT: 100 μl boyutu, 0,5-3 mm'lik odak aralığında iyi sonuç verir.
    1. Bunsen brülöründe keskin mavi bir alev konisi oluşturun.
    2. Cam pipetin orta noktasını, hafif basınç altında hareket edecek kadar yumuşayana kadar alevin içinde tutun.
    3. Pipeti alevden çıkarın ve kısa, güçlü bir iğne oluşturmak için hemen iki tarafı düz bir şekilde birbirinden ayırın.
      NOT: İlk denemede tatmin edici bir sonuç alınamazsa cam iğne stoğu yeniden eritilebilir ve kırılan iğneler kurtarılarak yeniden çekilebilir. Bu yöntemle çekilen kullanılabilir ve kullanılamaz iğne örnekleri için Şekil 2'ye bakın.
      ALTERNATİF: 26 G 1/2 inç iğneler, özellikle odak boyutu aralığının daha geniş ucunda da iyi çalışır.
  2. Doğal veya yapay deniz suyunu 0,22 μm'lik bir filtreden geçirerek steril deniz suyu hazırlayın.
  3. Ölçüm pipetleri oluşturun.
    1. Keskin bir makas veya tıraş bıçağı kullanarak, tercih edilen boyutta iç çapa sahip bir açıklık oluşturmak için plastik bir transfer pipeti kesin. İstenen aralığın üst kısmı için en az bir pipet ve istenen aralığın altı için bir pipet hazırlayın. Örnek bir ölçüm pipeti seti için Şekil 3'e bakın.
      NOT: Bu pipetler ~8 mm'ye kadar iyi çalışır. Fotoğraflardan bir mikrometre veya ölçüm araçları ile boyutu tahmin etmek de mümkündür.

2. Deney için hayvanları hazırlayın

  1. İstenilen boyut ve aşamada morfolojik olarak normal bireyleri seçin.
    NOT: ~ 0,5-3 mm çapındaki hayvanların kızaklara montaj için en uygun olduğunu düşünüyoruz. Hayvanların, en düşük boyuttaki pipete sığmadığını, ancak sınıfının en iyisi boyutlandırma pipetine rahatça sığıp sığmadığını kontrol edin.
  2. Deney hayvanlarını 8-16 saat aç bırakın.
    NOT: M. leidyi optik olarak saydam ve yüksek derecede otofloresan olmasa da, sindirim sistemlerinde dolaşan yiyecekler genellikle opaktır ve genellikle otofloresandır.

3. Kesimler yapın

  1. Steril deniz suyu içeren 35 mm'lik polistiren bir kaba aktarmak için deney hayvanının vücut boyutundan daha geniş bir transfer pipeti kullanın.
  2. Diseksiyon mikroskobunu kullanarak numuneyi görselleştirin. Bir hayvanı özofagus tarafına yuvarlayın (Şekil 1). Bu görünüm, aboral organı çıkarmak için en kolay erişimi sağlar. Aboral organa odaklanın.
    NOT: En kullanışlı büyütme, hayvan boyutuna ve kullanıcı tercihine göre değişebilir. Genellikle 12-20x büyütme iyi sonuç verir.
  3. Baskın olmayan elinizi kullanarak hayvanı bir cam iğne ile nazikçe yerinde tutun.
  4. Baskın eli kullanarak, bir iğnenin ucunu aboral organın biraz altına sokun. Aboral organın görünür bir kenarından tabanının altına kadar bir kesim yapmak için eğik olarak girin. İğneyi geri çekin ve aboral organın tüm yapılarını içeren kama şeklindeki bir doku parçasını çıkarmak için ikinci bir kesim yapın (bkz. Şekil 4, üst panel). Operasyonun başarılı olduğundan emin olmak için hayvanı ve eksize edilen dokuyu dikkatlice inceleyin.
  5. Taze kesilmiş hayvanı steril deniz suyu içeren taze bir tabağa taşımak için aynı transfer pipetini kullanın.
    NOT: Yara hızlı bir şekilde kapanacaktır, bu nedenle deneysel hedeflere bağlı olarak (birden fazla eşzamanlı olarak yenilenen örnek için veya iyileşme ve rejenerasyonun erken aşamalarını görüntülemek gibi), birkaç örnek oluşturmak için hızlı hareket etmek gerekir. Yenilenen hayvan kohortlarını birbirine daha yakın tutmak için cerrahi süreyi sınırlamak için bir zamanlayıcı kullanın.

4. Kesimlerin doğru olup olmadığını kontrol edin

NOT: Diseksiyon mikroskobu altında dikkatlice kontrol edilse bile, bazen cerrahi hataları gözden kaçırmak mümkündür.

  1. Amaçlanan tüm yapıların doğru bir şekilde çıkarılıp çıkarılmadığını DIC ile bileşik bir mikroskop altında kontrol etmek için her bir ameliyat sonrası bireyi geçici olarak bir cam slayt üzerine monte etmek için aşağıdaki montaj adımlarını izleyin. Şu anda daha fazla görüntüleme yapmasanız bile bu kontrolü gerçekleştirin.
    NOT: Ktenoforların mükemmel iyileştirme yetenekleri, onları aşılama deneylerine iyi bir şekilde ödünç verir; Çıkarılan bir AO'nun ve çıkarıldığı hayvanın geri kalanının kesik taraflarının birbirine yapışma ve kaynaşma olasılığını önlemek için eksize edilen aboral organları her zaman kültür kabından çıkarırız.
    Doğrudan uzun süreli görüntülemeye geçmiyorsanız, slaydı kapatmayın. Bu, hızlı iyileşmeyi ve bu deney hayvanının kültürüne geri dönmesini kolaylaştıracaktır. Yüksek büyütme altında cerrahi doğruluğun kontrol edilmesi önerilir. Özellikle, statolit ameliyatı tamamlamadan kubbeden dışarı çıkarılabilir.

5. Canlı görüntüleme

  1. Montaj
    1. Standart bir cam mikroskop lamını, cam işleme için su itici gibi silanize edici bir madde ile işlemden geçirin ve tamamen kurumasını bekleyin.
    2. Cerrahi sonrası bir hayvanı bir transfer pipeti ile hazırlanmış bir slayta aktarın. Suyun içindeki hayvanla birlikte boncuklandığını onaylayın.
    3. Kapak camını hayvandan uzaklaştırmak için bir ara parça görevi görecek "ayaklar" oluşturmak için bir kapak camının her bir köşesine az miktarda modelleme kili (~ 1.5 mg) yerleştirin.
    4. Kapak camını, kil aşağı bakacak şekilde hayvanın üzerine nazikçe yerleştirin. Kapak camının her bir köşesini tutarak, hayvanı görüntüleme için uygun konuma getirin. Hayvanı hafifçe sıkıştırmak için aşağı bastırın ve yerinde tutun. Tatmin edici bir görünüme ulaşmak için numuneyi gerektiği kadar yeniden konumlandırın.
    5. ~30 dakikadan daha uzun görüntüleme için, numunenin kurumasını önlemek için kapak camının her iki kenarına ince bir tabaka vazelin uygulayın.
      NOT: Bu şekilde monte edilen M. leidyi , daha ileri kültür veya diğer tahliller için kolayca geri kazanılabilir. Bununla birlikte, hayvanlar genellikle 1-2 saat içinde serbest kalacak ve kendilerini yeniden konumlandıracaktır, bu nedenle 2 saatten daha uzun sürekli hızlandırılmış bir yakalama, farklı bir görüntüleme yaklaşımı gerektirecektir.

6. Kültür

  1. Cydippid kültür koşulları
    1. Kültür, cerrahi olarak manipüle edilmiş hayvanlar ve oda sıcaklığına yakın filtrelenmiş doğal veya yapay deniz suyunda kontroller. Tutarlı sonuçlar elde etmek için 20-22 °C'ye ayarlanmış bir inkübatör kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Cydippid evresi M. leidyi tipik olarak yaralanmadan sonra ~ 20 dakika içinde yara kapanmasını tamamlar (Şekil 4 ve Şekil 5), organın tam rejenerasyonu 1-3 gün sürebilir. Bu zamanlama bazı biyolojik değişkenliklere sahiptir, ancak neredeyse her zaman ameliyattan 72 saat sonra tamamlanır (Şekil 6).

Aboral organ kompleksinden ve yakındaki dokulardan hücrelerin ve mezogleananın cerrahi olarak çıkarıl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İstenilen herhangi bir boyutta M. leidyi üzerinde benzer deneyler yapılabilir; Organın morfogenezi, rejeneratif yeteneğinbaşlamasıyla eş zamanlı olarak tamamlanır 4. Hayvanlar vahşi doğadan19 toplanabilir veya laboratuvardayetiştirilebilir 20,21. Belirli bir vücut büyüklüğü isteniyorsa, hayvanların yumurtlamasına izin verilebilir ve yavrular istenen boyuta yükseltilebilir. ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar Jovita Joseph'e minnetle teşekkür ederler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.2 μ m SFCA şırınga filtresiTermo/Nalgen723-2520Steril deniz suyu oluşturun
35 mm polistiren petri kabıŞahin/Corning351008kesintiler yapmak; Kültür Küçük Hayvanlar
60 mL tek kullanımlık luer-lock şırıngaBH MalzemeleriBH60LLSteril deniz suyu oluşturun
Kalibre edilmiş cam pipetler, 100 μ LDrummond2-000-100Kesimler gerçekleştirin
Kapak camları, #1,5, 18 mm kareVWR16004-326Görüntüleme için montaj aparatı
ktenoforlarKörfez ÖrnekleriCanlı hayvanlar
Çift boşluklu cam çöküntü kızakları, 1,3 mmVWR470200-930Görüntüleme için montaj aparatı
Cam mikroskop slaytlarıVWR16004-398Görüntüleme için montaj aparatı
Anında Okyanus Deniz TuzuAnında OkyanusHayvan Kültürü Ortamı
mini cetvelTed Pella13623Plastik pipetleri ölçün
Modelleme kili (hamuru)Pepy PlastilinaGörüntüleme için montaj aparatı
Petroelum JöleVazelinGörüntüleme için montaj aparatı
Plastik Transfer Pipetleri (Çeşitli Boyutlarda)Cole-Parmer06226-13, 06226-12, 06226-01Küçük hayvanları hareket ettirin
Rain-X cam işlemeYağmur-XMikroskop slaytlarını silanize edin
cetvelBatı Cott10564Plastik pipetleri ölçün
makasOXOplastik pipetleri kes

Kaynaklar

  1. Edgar, A., Mitchell, D. G., Martindale, M. Q. Whole-body regeneration in the lobate ctenophore Mnemiopsis leidyi. Genes. 12 (6), 867(2021).
  2. Martindale, M. Q., Henry, J. Q. Ctenophora. Evolutionary Developmental Biology of Invertebrates 1. , Springer. 179-201 (2015).
  3. Martindale, M. Q. The onset of regenerative properties in ctenophores. Curr Opin Genet Dev. 40, 113-119 (2016).
  4. Martindale, M. Q. The ontogeny and maintenance of adult symmetry properties in the ctenophore, Mnemiopsis mccradyi. Dev Biol. 118 (2), 556-576 (1986).
  5. Dunn, C. W., et al. Broad phylogenomic sampling improves resolution of the animal tree of life. Nature. 452 (7188), 745-749 (2008).
  6. Ryan, J. F., et al. The genome of the ctenophore Mnemiopsis leidyi and its implications for cell type evolution. Science. 342 (6164), 1242592-1242592 (2013).
  7. Whelan, N. V., et al. Ctenophore relationships and their placement as the sister group to all other animals. Nat Ecol Evol. 1 (11), 1737-1746 (2017).
  8. Schultz, D. T., et al. Ancient gene linkages support ctenophores as sister to other animals. Nature. 618, 110-117 (2023).
  9. Burkhardt, P. Ctenophores and the evolutionary origin(s) of neurons. Trends Neurosci. 45 (12), 878-880 (2022).
  10. Sachkova, M. Y., et al. Neuropeptide repertoire and 3D anatomy of the ctenophore nervous system. Curr Biol. 31 (23), 5274-5285.e6 (2021).
  11. Moroz, L. L., et al. The ctenophore genome and the evolutionary origins of neural systems. Nature. 510 (7503), 109-114 (2014).
  12. Burkhardt, P., et al. Syncytial nerve net in a ctenophore adds insights on the evolution of nervous systems. Science. 380 (6642), 293-297 (2023).
  13. Tamm, S. L., Tamm, S. Novel bridge of axon-like processes of epithelial cells in the aboral sense organ of ctenophores. J Morphol. 254 (2), 99-120 (2002).
  14. Jager, M., et al. New insights on ctenophore neural anatomy: Immunofluorescence study in Pleurobrachia pileus (Müller, 1776). J Exp Zool B Mol Dev Evol. 316B (3), 171-187 (2011).
  15. Hernandez-Nicaise, M. -L. The nervous system of ctenophores III. Ultrastructure of synapses. J Neurocytol. 2 (3), 249-263 (1973).
  16. Schnitzler, C. E., et al. Genomic organization, evolution, and expression of photoprotein and opsin genes in Mnemiopsis leidyi: a new view of ctenophore photocytes. BMC Biol. 10 (1), 107(2012).
  17. Harrison, F. W., Westfall, J. A. Ctenophora. Microscopic Anatomy of Invertebrates. 2: Placozoa, Porifera, Cnidaria, and Ctenophora. , Wiley. New York. 359-418 (1991).
  18. Horridge, G. A. Presumed photoreceptive cilia in a ctenophore. J Cell Sci. S3-105 (71), 311-317 (1964).
  19. Ramon-Mateu, J., Edgar, A., Mitchell, D., Martindale, M. Q. Experimental methods to study ctenophore whole-body regeneration. Methods Mol Biol. 2450, 95-119 (2022).
  20. Soto-Àngel, J. J., et al. Stable laboratory culture system for the ctenophore Mnemiopsis leidyi. Methods Mol Biol. 2757, 123-145 (2022).
  21. Presnell, J. S., Bubel, M., Knowles, T., Patry, W., Browne, W. E. Multigenerational laboratory culture of pelagic ctenophores and CRISPR-Cas9 genome editing in the lobate Mnemiopsis leidyi. Nat Protoc. 17 (8), 1868-1900 (2022).
  22. Coonfield, B. R. Apical dominance and polarity in Mnemiopsis leidyi, Agassiz. Biol Bull. 70 (3), 460-471 (1936).
  23. Freeman, G. Studies on regeneration in the creeping ctenophore, Vallicula multiformis. J Morphol. 123, 71-84 (1967).
  24. Bading, K. T., Kaehlert, S., Chi, X., Jaspers, C., Martindale, M. Q., Javidpour, J. Food availability drives plastic self-repair response in a basal metazoan-case study on the ctenophore Mnemiopsis leidyi A. Agassiz. Sci Rep. 7 (1), 16419(2017).
  25. Mateu, J. R., Ellison, S. T., Angelini, T. E., Martindale, M. Q. Regeneration in the ctenophore Mnemiopsis leidyi occurs in the absence of a blastema, requires cell division, and is temporally separable from wound healing. BMC Biol. 17 (1), 80(2019).
  26. Mitchell, D. G., Edgar, A., Mateu, J. R., Ryan, J. F., Martindale, M. Q. The ctenophore Mnemiopsis leidyi deploys a rapid injury response dating back to the last common animal ancestor. Commun Biol. 7 (1), 203(2024).
  27. Jokura, K., Anttonen, T., Rodriguez-Santiago, M., Arenas, O. M. Rapid physiological integration of fused ctenophores. Curr Biol. 34 (19), R889-R890 (2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Ktenofor RejenerasyonuAboral Organ kar mMnemiopsis leidyiDuyusal Organ CerrahisiT m V cut RejenerasyonuYara yile mesiDiseksiyon MikroskobuCam ne Tekni iHayvan MontajDoku Rejenerasyonu
Yüksek rejeneratif ktenoforlarda karmaşık bir duyu organının cerrahi olarak çıkarılması
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.