Method Article

Hava Yollarındaki Mantar Sporlarının Mekansal Dinamiklerini Koruyan Murin Akciğerlerini Görüntülemek için Etkili Yöntem

DOI:

10.3791/67556

⸱

December 13th, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, New Jersey Medical School, Rutgers - The State University of New Jersey

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Floresan mikroskobu ile analiz için akciğer hava yollarındaki mantar sporlarının doğal yerleşimini koruyan bir mantar patogenez modeli için bir yöntem sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mantarlar, çevresel sporlar akciğerlere solunduğunda insanları enfekte eder. Akciğer heterojen bir organdır. Bronşlar ve bronşiyoller de dahil olmak üzere iletken hava yolları, gaz değişiminin meydana geldiği alveolar hava sahasında sonlanana kadar dallanır. Bronşiyollerden veya alveollerden kaynaklanan enfeksiyonlar, farklı konak yanıtları ve hastalık belirtileri ortaya çıkarır. Bu nedenle, sporların akciğerlerde, özellikle enfeksiyondan hemen sonra doğal olarak nerede lokalize olduğunu tam olarak anlamak, konakçı-patojen etkileşimlerinin araştırılması için fırsatları genişletir. Burada, Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia ile enfekte olmuş farelerden alınan akciğerlerin yerinde analizini detaylandırıyoruz. Histolojik koruma için geleneksel yöntemler, aspire edilmiş mantar partiküllerinin doğal konumunu değiştiren ve sporları proksimal bronşiyollerden terminal hava boşluklarına iten fiksatif bir çözelti ile hava yollarının sıvı şişirilmesini içerir.

Tersine, kan damar sistemi perfüzyon fiksasyonu ile bu hava şişirme yöntemi, mantar sporlarının bronşiyoller içindeki fizyolojik pozisyonunu korur. Ayrıca, akciğer örneklerinin kriyopreservasyonu, gömülmesi ve görüntülenmesi için basit bir yaklaşım açıklıyoruz. Ayrıca, mantar sporlarının akciğer içindeki uzamsal dağılımını analiz etmek için açık kaynaklı QuPath programı aracılığıyla yüksek verimli hesaplama tekniklerini paylaşıyoruz. Burada sunulan yöntem basit ve hızlıdır, gerçekleştirmek için minimum ekipman gerektirir ve birçok solunum yolu mantar enfeksiyonu modeliyle kullanım için kolayca uyarlanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsanlar, çeşitli çevresel mantarlardan günde milyarlarca sporu soluyabilir1. Bu solunan sporlara karşı bariyer savunmamızı anlamak için, bu sporların hava yolları ve akciğer parankimi içine indiği kesin mikroanatomik ortamları takdir etmeliyiz. Hava yollarının hücresel bileşimi (yani epitel hücreleri) trakea, bronşlar, bronşiyoller ve alveoller boyunca önemli ölçüde dönüşür. Bu farklı bölgelerin her biri, patolojik enfeksiyonu önlemek için bir savunma cephaneliğinden yararlanan ayrı işlevlere sahip farklı hücre tiplerinden oluşur.

Pulmoner mantar sporu birikiminin kesin yeri, kolumnar epitelyal astarlı bronşiyollerin, alveolar kanalların veya alveollerin2'nin hava yolu lümenleri arasında değişebilir. Klinik olarak ilgili mantar türlerinin çoğu, çapı 1 μm ile 10 μm arasında sporlar üretir3. Bu spor parçacıklarının akciğerde birikmesi, inhalasyondan sonra çökelme mekanizmasını etkileyebilen aerodinamik, yoğunluk, elektrik yükü ve foretik kuvvetler gibi çeşitli faktörlere bağlıdır4. Genel olarak, büyük partiküller (> 6 μm) üst solunum yolunda, orta büyüklükteki partiküller (2-6 μm) daha küçük hava yollarında birikebilir ve küçük partiküller (<2 μm) alveolar bölgeyeulaşır 5. Aspergillus sporlarının (2-3 μm) alveolar boşluklara ulaştığı bildirilmiştir, ancak klinik patoloji raporları da önemli bir bronşiyal ve bronşiolar hastalık yükü olduğunu göstermektedir6. Fleksibl bronkoskopinin artan popülaritesi nedeniyle Aspergillus fumigatus, Coccidioides immitis, Candida türleri, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum ve Zygomycetes'in endobronşiyal mantar enfeksiyonlarının tanınması da artmaktadır7. Farelerde Aspergillus enfeksiyonlarının mikroskobik görüntülemesindeki son gelişmeler, bronşlar ve bronşiyoller gibi daha proksimal hava boşluklarının patolojik mantar proliferasyonu için en yüksek yükü taşıyabileceğini de ortaya koymuştur8. Pulmoner mantar enfeksiyonlarına konak yanıtı üzerine yapılan araştırmalar, hem bronşioler epitel hücrelerinin hem de alveolar epitel hücrelerinin immün sentineller olarak önemli roller oynadığını göstermiştir, bu nedenle spor birikimi ve epitel etkileşiminin kesin bölgelerini aydınlatmak gelecekteki çalışmalar için hayati önem taşıyacaktır 2,9,10.

Bu proksimal hava yolu patogenez dinamiklerini incelemek zordur, çünkü standart akciğer fiksasyonu ve kesit hazırlama teknikleri, sporları epitel kaplı hava yollarındaki bu proksimal pozisyonlardan uzaklaştırabilir ve onları distal terminal alveolar bölgelere doğru itebilir. Genellikle, akciğerleri şişirmek ve tüm akciğeri hızla fiksatife maruz bırakmak için %10 formalin veya %4 paraformaldehit kullanılır. Akciğerleri kriyoseksiyon için hazırlarken, bazı gruplar kriyoseksiyon performansını iyileştirmek için akciğerlere optimal kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği uygular11. Bu uygulamalar doğru bağlamda yararlıdır, ancak laboratuvarımız ve diğer gruplar tarafından sporları ve partikülleri proksimal konumlardan uzaklaştırdığı, böylece spora maruz kalan hücre tipleri ve müteakip konakçı yanıtı hakkındaki yorumlara müdahale ettiği bulunmuştur12.

Solunan mantar sporlarının mikroanatomik lokalizasyonunu doğru bir şekilde belirlemek için, farelerin hava yollarındaki mantar sporlarının konumunun korunması için hızlı, düşük kaynaklı bir yöntem geliştirdik. Thomas ve ark. (2021), tatmin edici bir sonuç elde etmek için gereken ekipman, zaman ve teknik beceri miktarını azalttığımız bir murin hava şişirme vasküler perfüzyon fiksasyon yöntemi13. Burada tarif edilen yöntemden, Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ artrokonidia'nın (3-5 μm boyutunda) daha önce gösterilenden daha proksimal olarak, yani terminal alveollerden ziyade distal bronşiyollerde ve bronko-alveolar bileşkelerde biriktiğini gözlemledik. Bu bilgi, akciğerin bu bölgeleriyle ilişkili kritik hücre tipleri ve bunların solunan mantar sporlarına erken tepkiler üzerindeki etkileri ile ilgili biyolojik sorulara odaklanabilir.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde anlatılan tüm yöntemler Rutgers Biyomedikal Sağlık Bilimleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Sporları hücre içi floresan ile etiketleyin

  1. 30 ° C'de 30 dakika boyunca 5 μM'de karboksifloresein süksinimidil ester (CFSE), Cell Tracker Orange veya Cell Tracker Red (veya tercih edilen hücre içi boya) içinde 1 x 106 sporu boyayın, ardından PBS ile yıkayın ve sporları 12.000 x g'da döndürün. Bu yıkamayı bir kez tekrarlayın.
  2. Spor aşısını, 25 μL'nin bir fare için uygun spor dozunu içermesi için uygun konsantrasyonda hazırlayın.

2. İzofluran anestezisi kullanılarak aspirasyon inhalasyonu yoluyla farenin sporlarla aşılanması

DİKKAT: İzofluran uçucu bir anestezik ajandır ve kanallı bir biyogüvenlik kabini veya çeker ocak içinde kullanılmalıdır.

  1. İzofluran maruz kalma kavanozunu hazırlamak için, katlanmış bir peçeteyi 1 L'lik vidalı Nalgene kavanozuna yerleştirin ve fareler için bir platform olarak peçetenin üzerine plastik bir ağ çemberi yerleştirin. Peçeteye 2 mL izofluran ekleyin, kavanozu kapatın ve gazın kapta dengelenmesi için 1-2 dakika bekleyin.

figure-protocol-1
Şekil 1: Spor aşılamasının izofluran açık damla yöntemi için aparat. 1 L'lik vidalı bir kavanozun dibine katlanmış bir peçete yerleştirilir ve daha sonra fareler için bir platform görevi görmesi için dairesel bir plastik ağ yerleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Fareyi anesteziye maruz bırakmadan önce, 25 μL inokülum içeren bir pipet hazırlayın. Fareyi izofluran kabına yerleştirin ve farenin bilincini kaybettiği ve baş aşağı olduğu doğrultma refleksinin kaybını izlemek için kabı eğin. Bu genellikle yaklaşık 10 saniye sürer.
  2. Solunum hızını (RR), dinlenme RR'sinin yaklaşık% 50'si olan dakikada 50-80 nefese (bpm) yavaşlayana kadar izleyin. Bu genellikle 10 saniye daha sürer. Bu sırada, fareyi izofluran kavanozundan çıkarın.
    NOT: Bu, anestezinin hızlı bir şekilde indüksiyonunu üretecek yüksek bir izofluran konsantrasyonudur ve farenin çok yakından izlenmesi gerekir. Ölümcül izofluran doz aşımı bir risktir, çünkü izofluran konsantrasyonu değişken olabilir ve izoflurana doz-yanıt eğrisi çok diktir. Solunum hızı 50 bpm'nin altına düşerse ve/veya düzensizse, fareyi izoflurandan çıkarın, 3-5 dakika iyileşmesine izin verin ve tekrar deneyin (en fazla iki tekrarlanan deneme).
  3. Ayak parmağı sıkışmasına yanıt vermeyerek anestezik derinliği onaylayın. Ardından, fareyi bir elinizle sırtüstü pozisyonda konumlandırın ve farenin artan hızda (50-60 bpm'den başlayarak) ve kuvvetle 3-5 düzenli nefes almasına izin verin. Bu başladığında, pipet ucunu fare orofarenksinin arkasına yerleştirin ve bir inhalasyon sırasında aşıyı serbest bırakın.
    NOT: Ağızdan gelen bu nefesler, nefes almak için aksesuar kasların işe alınması nedeniyle başı aşağı doğru sarsar. Bu nefes alma sırasında pipet yerleştirildiğinde, her nefes alışta ağzın açılması gerekir. Ağız açılmazsa, fare yeterince uyuşturulmaz ve muhtemelen orofarenksten gelen içeriği solumaz. Pipet, aşının yutulmasını önlemek için dili bastırmalı, ağzın altına ve önüne doğru itmelidir. Pipet ağızda olduğunda ve fare yeterince uyuşturulduğunda, fare her nefeste ağzını açacaktır.
  4. El ve başparmak fareyi tutarken, aşının solunduğunu doğrulamak için fare göğsünün arka ve ön yönlerinde çatırtı hissedin.

3. Farelerin ötenazisi

  1. Kurban zaman noktasından 10 dakika önce fareye intraperitoneal olarak 200 mg / kg ketamin ve 24 mg / kg ksilazin kokteyli enjekte edin.
  2. Enjeksiyondan sonra 10 dakika bekleyin, fare cerrahi bir anestezi düzlemine girene kadar bekleyin, bu da ayak parmağının sıkışmasına yanıt vermeme ile onaylanır.

4. PBS ve formalin ile akciğerlerin perfüzyonu

  1. Anestezi uygulanmış fareye% 70 etanol püskürtün. Farenin derisini geri kesmek için makas kullanın ve her taraftaki peritonu ortaya çıkarmak için cildi ayırın. Cildi farenin üst yarısından başının üzerinden çekin ve kolları deriden dışarı çekin.
  2. Periton zarını sternumda ve göğüs kafesinin alt yönü boyunca kesin ve peritonu açığa çıkarın. Diyaframı ortaya çıkararak karaciğeri inferior olarak değiştirin. Akciğerlerde bir delik açılmasını önlemek için diyaframı akciğer parankiminden dikkatlice delmek için makas kullanın.
    NOT: Yanlışlıkla akciğerlerin delinmesi, sonraki hava şişmesini imkansız hale getirecektir.
  3. Diyafram delindikten sonra, hava göğüs kafesine girer ve akciğerleri çökertir. Kalbi ortaya çıkarmak için sol taraftaki göğüs kafesini kesin. 5 G'lik bir iğne ile 30 G'lik bir iğne ile 5 saniyede 1 mL oranında (damarlara zarar vermemek için) sağ ventriküle 5-10 mL PBS enjekte edin ve akciğerleri hızla beyazlatın.
    DİKKAT: Formalin, kanallı bir biyogüvenlik kabini veya çeker ocak içinde taşınması gereken tehlikeli bir uçucu maddedir.
  4. Bittiğinde, iğneyi çıkarın ve 5 mL% 10 nötr tamponlu formalin (NBF) enjekte etmek için yeni bir iğne kullanın.

5. Perfüze akciğerin hava ile şişirilmesi

  1. Göğüs kafesinin ön yarısını çıkarın. Trakeayı ortaya çıkarmak için, üst kaburgaları ve köprücük kemiklerini boynun sağına ve soluna doğru kesin. Soluk borusunun uzanacağı orta çizginin yakınında kesmekten kaçınmaya dikkat edin. Forseps ile kalan üst kaburgaları ve köprücük kemiklerini boyun orta hattında sıkın ve trakea açığa çıkana kadar üstünden çekin.
  2. 10 cm uzunluğunda bir dikiş ipliği hazırlayın, trakeanın altına çekin ve açıkta kalan trakeanın alt ucunda gevşek bir düğüm atın. 18 G kateter ile 1 mL'lik bir hava şırıngası hazırlayın. Maruz kalan bölgenin üst ucundaki trakeada bir delik açmak için 18 G'lik bir iğne kullanın.
  3. Kateteri bu deliğe yerleştirin ve havanın kaçmasını önlemek için nispeten sıkı bir uyum sağlayın. 1 mL havayı 10 saniye boyunca akciğerlere yavaşça enjekte edin ve tüm lobların akciğer şişmesini izleyin. Tam şişme, akciğerlerin kalbin etrafına hafifçe sarılması ve delinmemiş diyaframda kapladıkları hacmi doldurması ile sonuçlanır.
  4. Düğümü trakeanın etrafına sıkıca çekin ve kateteri çıkarın. Trakeayı tutun ve akciğerleri fareden çıkarmak için künt makas kullanın, akciğeri delmemeye dikkat edin.

6. Daldırma fiksasyonu ve dehidrasyon

  1. Akciğerleri 20 mL% 10 NBF ile doldurulmuş 50 mL'lik konik bir tüpün üst kenarına yerleştirin. Dikiş ipliklerini koninin dışında tutun, kapağı vidalayın ve konikleri ters çevirin, böylece akciğerler 20 mL NBF'de baş aşağı asılı kalır. 4 °C'de 24-48 saat bekletin.
  2. Akciğerleri PBS'de durulayın, ardından kriyoprezervasyona hazırlanırken akciğerleri kurutmak için 4 ° C'de 72-96 saat boyunca% 30'luk bir sükroz-PBS (w / h) çözeltisine koyun. Akciğerleri sakarozdan çıkarın, akciğerleri optimum kesme sıcaklığı (OCT) ortamına sahip bir kriyokalıba yerleştirin ve numuneyi -80 °C'de dondurun.

7. Kriyoseksiyon

  1. Kesitlemeden önce 1 saat boyunca OCT kriyobloklarındaki numuneleri kriyostatın -20 °C sıcaklığına dengeleyin. Blokları 20-100 μm kalınlıkta bölümlere ayırın.
    NOT: Hava şişirme, numunenin kırılganlığının artmasına neden olabilir ve artan kalınlıkta kesme, kesitleme sırasında doku kırılmasını önleyebilir.
  2. Bölümleri cam slaytlar üzerinde toplayın ve slayta doku yapışmasını sağlamak için 30 dakika ila 1 saat kurumaya bırakın.
    NOT: Slaytlar bu aşamada -80 °C'de tutulabilir.

8. Slayt hazırlama ve engelleme

  1. Slaytlardan OCT'yi çıkarmak için slaytları oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca PBS banyosuna (bir tabak veya Coplin kavanozunda) yerleştirin.
    NOT: Daha kalın bölümler (40-100 μm) cam slaytlara ve daha ince bölümlere yapışmayabilir, bu nedenle onları bir Coplin kavanozuna yan yatırmak yerine bir tabakta düz ve dik tutmak en iyisidir.
  2. OCT dokudan çözüldükten sonra slaytları kurutun. Doku örneğinin etrafındaki slaytın çevresinden fazla damlacıkları kurutmak için bir mendil kullanın.
  3. Numunenin etrafına bir çevre çizmek için hidrofobik bir Pap kalem kullanın ve 5 dakika kurumasını bekleyin.
  4. Slayt başına 300 mL'de% 0.3 Tween-20 ve 1: 100 Fc Blok ile hayvansız engelleme çözeltisinden oluşan bir engelleme tamponu hazırlayın.
    NOT: Hücre içi hedefler için %1 Tween-20 kullanılabilir. 300 μL'lik bir hacim genellikle yeterlidir, ancak dokuyu tamamen kaplamak için gerekli hacim hidrofobik işaretleyicinin çevre boyutuna bağlıdır. Doku bu noktadan itibaren kurumamalıdır.
  5. Engelleme solüsyonunu RT'de 1 saat slaytlar üzerinde bırakın.

9. İmmün boyama

  1. Sıvıyı pipetleyerek ve 300-500 μL PBS ekleyerek slaytı yıkayın. Yıkamayı bir kez tekrarlayın.
  2. Birincil AlexaFluor-647 konjuge sıçan anti-fare EpCAM (klon G8.8) antikoru (hava yolu epitel belirteci)% 0.33 Tween-20 (veya hücre içi hedefler için% 1) ile hayvansız bloker çözeltisinde hazırlayın. Bu çözeltinin slaytı başına 300 μL ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de boyayın.
    NOT: Antikorlar, boyama konsantrasyonu, süresi ve sıcaklığı için ampirik olarak test edilmelidir. İnce kesitler (8-20 μm) 37 °C'de 30 dakika ve daha kalın kesitler (20-100 μm) gece boyunca 4 °C'de çoğu antikor için 1:100 seyreltme kullanılarak boyanır. Konjuge olmayan antikorlar kullanılıyorsa, 2x'i (yukarıdaki gibi) yıkayın ve ampirik olarak belirlenmiş bir süre ve sıcaklık için ikincil bir floresan antikor uygulayın. Genel olarak, ikincil antikor boyaması RT'de 1:1000 seyreltmede 1 saat boyunca yapılır.
  3. Antikor çözeltisini numuneden çıkarın ve slaytı 300 mL PBS ile 5 dakika boyunca yıkayın. Bu yıkamayı bir kez tekrarlayın. Slaytları kurutun, numunedeki ve çevresindeki camdaki tüm fazla sıvıyı çıkarın.
  4. Her bir doku parçasına bir damla RT yumuşak set montaj ortamı (örn. SlowFade Glass) ekleyin. Şişenin baş aşağı dururken oturmasına izin vererek ve her damlayı yavaşça dokuların üzerine bırakarak kabarcıkları önlemeye dikkat edin. Numunenin ve hidrofobik işaretleyici çevresinin ötesine uzanmak için uygun boyutta bir kapak fişi yerleştirin.

10. Floresan mikroskobu ile görüntüleme

  1. Tek tek sporları ve konakçı hücreleri çözmek için yeterli çözünürlüğe sahip bir objektif kullanarak tüm akciğer bölümlerini tarafsız bir şekilde taramak için çok kanallı bir floresan mikroskobu kullanın (örneğin, NA = 0.8 veya benzeri olan 20x yağ objektifi kullanan Zeiss Axioscan 7).
    NOT: Lazer gücünün ve PMT hacminintage kazancın, floresan eksi bir (FMO) kontrolü ile belirlenen arka plan üzerinde hedefin sinyal-gürültü oranlarını en üst düzeye çıkaracak şekilde ayarlandığından emin olun.
  2. Tüm akciğer lobunu yakalamak için yeterli görüntü döşemesi toplayın (ör. 400 μm x 400 μm boyutunda ~200 döşeme). Mikroskop yazılım programını (örneğin, Zeiss ZEN 3.7 veya benzeri) kullanarak birleştirilmiş döşeme görüntüsünü sonraki işleme için dışa aktarın.

11. QuPath ile mekansal analiz

  1. Ücretsiz bir açık kaynaklı yazılım olan QuPath'te14, bir proje dosyası oluşturun ve floresan görüntüleri dosyaya ekleyin.
  2. Üst menü seçeneği Sınıflandır'a, ardından Piksel sınıflandırması > Eşitleyici Oluştur'a tıklayarak EpCAM+ piksellerini epitel olarak sınıflandırın. Hedef bölgeyi en iyi tanımlayan çözünürlüğü, kanalı, yumuşatma sigmasını ve eşik değerini seçin. Sınıflandırıcıyı benzersiz bir adla kaydedin ve Nesne Oluştur'u seçin.
  3. Yeni Nesne oluştur penceresinde, Ek Açıklama olarak Yeni nesne türü'nü seçin. Akciğer epiteli için minimum nesne boyutunu ve minimum delik boyutunu 100 mm2 olarak ayarlayın. Burada Nesneleri Böl'ü seçmeye gerek yoktur. Tamam'ı seçtikten sonra, ek açıklamalar oluşturulur ve sol üst taraftaki Fırça aracı kullanılarak gözle değiştirilebilir.
  4. Sporları sınıflandırmak için, sporların yakalandığı kanalı kullanarak 11.3-11.4 arasındaki adımları tekrarlayın ve yeni nesne türünü Ek Açıklama yerine Algılama yapın. Minimum nesne boyutunu ve minimum delik boyutunu 0 mm2 olarak ayarlayın ve Nesneleri Böl'ü seçin.
  5. Sporların uzamsal analizini yapmak için, Uzamsal Analiz > Analiz > Ek açıklamalara 2D işaretli mesafeyi hesapla üst menü seçeneğini seçin. Tespit edilen her spor için EpCAM+ epiteline olan mesafeler hesaplanacaktır. Bunları, Ölçümleri Dışa Aktar > üst menü seçeneği aracılığıyla dışa aktarın.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem sonuçta, hava yollarını rahatsız etmeden bırakmak için fizyolojik hava şişirme kullanarak fare akciğerlerinin immünofloresan görüntülerini üretir. Daha da önemlisi, yol boyunca birden fazla kontrol noktası, protokolün bileşenlerinin başarıyla gerçekleştirildiğini onaylayacaktır. Aşılama sırasında, farenin arka göğüs duvarında sıvının hava yollarına girdiğini gösteren "çatırtılar" hissedilerek aşının aspire edildiğini doğrulamak önemlidir. Çatırtı hissi yoksa, farenin aşıyı yutmuş olması mümkündür. Fare akciğerlerinin PBS ile perfüzyonu, akciğerlerin beyaz benekleşmesine ve ardından tüm akciğerin tamamen beyazlaşmasına neden olmalıdır (Şekil 2A). Eksik beyazlatma varsa, sonraki formalin perfüzyonu akciğer parankiminin tüm bölgelerine ulaşmayacaktır (Şekil 2B). Akciğeri hava ile şişirirken, akciğerler fizyolojik boyuta ulaşana kadar yavaşça şişmelidir. Akciğerlerin içindeki havayı sabitlemek için trakeal sütürü bağladıktan sonra, akciğerlerin boyutu kasılmamalıdır. Eğer yaparlarsa, işlem sırasında akciğer muhtemelen delinmiştir.

Burada, hem hava ile şişirilmiş hem de formalin sıvı ile şişirilmiş akciğerlerde Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ sporları (yeşil) ve EpCAM+ kolumnar bronşiolar epitel (macenta) etiketli kesitlerin temsili görüntülerini gösteriyoruz (sırasıyla Şekil 3A,B). Bu sporlar esas olarak distal bronşiyoller içinde ve bu distal bronşiyollerin hemen bitişiğindeki alveolar boşluklarda, muhtemelen alveolar kanallarda birikir. Hava ile şişirilmiş fiksatif perfüze akciğerler, sporların bronşiolar epitelden biraz daha dağınık göründüğü sıvı fiksatiften ziyade, bronşiyoller içinde daha sık görülen ve bronşiollere daha yakın kümelenen sporları içerir (Şekil 3A). QuPath uzamsal analizi sayesinde, sporların bronşiyolden uzağa ve daha distal alveolar boşluklara dağılma seviyesini belirtmek için tek tek sporların en yakın EpCAM+ bronşiolar epitele olan mesafesini ölçüyoruz. Sıvı şişirmenin, fizyolojik hava şişirmesine kıyasla sporları bronşiyollerden daha uzağa dağıttığını gösteriyoruz (Şekil 4A,B). Hava şişirme vasküler perfüzyonu, bu sporların distal bronşiyollerde doğal yerleşimini korur ve intratrakeal fiksatif damlatma ile bu sporların daha distal alveoler boşluklara yapay olarak dağılmasını önler.

figure-results-1
Şekil 2: Akciğer perfüzyonu başarı göstergesi. (A) Başarılı bir şekilde perfüze edilen akciğerler tamamen beyaz olacaktır. (B) Tam olarak perfüze edilmemiş akciğerler pembe veya benekli görünecektir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 3: Hava ile şişirilmiş formalin ile şişirilmiş akciğerlerde ve formalin ile şişirilmiş akciğerlerde spor dağılımının temsili görüntüleri. Hücre içi floresan sporlarının (yeşil), (A) hava ile şişirilmiş akciğerlerde (B) formalin ile şişirilmiş akciğerlere göre EpCAM+ bronşiolar epitele (macenta) daha yakın dağıldığı görülmektedir. Her tedavi grubundaki farelerin sol loblarının arka yüzeyinden 1.2 mm derinliğinde kesitlerden 20x büyütmede çok kanallı floresan mikroskopta görüntüler elde edildi ve karolar mikroskopi yazılımı kullanılarak dikildi. Ölçek çubuğu = 800 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 4: Hava ile şişirilmiş ve formalin ile şişirilmiş spor ile tedavi edilmiş akciğerler arasındaki bronşiolar epitele spor mesafesinin (mm) karşılaştırılması. Tedavi grubu başına 3 fareden alınan akciğerler, 1 x 106 Coccidioides posadasii cts2 / ard1 / cts3Δ artrokonidia ile aşılamayı takiben 1.5 saat boyunca toplandı, işlendi ve görüntülendi. Fare başına dört kesit, sol lobun arka yüzeyinden 0.8 mm, 1.2 mm, 1.6 mm ve 2.0 mm'de örneklendi, boyandı ve çok kanallı bir floresan mikroskopta görüntülendi. Her gruptaki tüm sporlar, (A) en yakın EpCAM+ kolumnar bronşiolar epitele olan mesafeyi belirlemek için QuPath'te tespit edildi ve uzamsal olarak analiz edildi ve (B) medyan ve% 95 güven aralıkları mikrometre birimlerinde görüntülendi. Hava şişirme sporları, n = 11,673. Sıvı enflasyon sporları, n = 9,837. Normallik olmaması nedeniyle Mann-Whitney t-testi yapıldı ve p < 0.0001 idi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spor inhalasyonu ve solunan sporların mekansal birikiminin analizi için bir boru hattı kurduk. Bu boru hattı, Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ artrokonidia'nın solunmasından etkilenen akciğerin ilgili stromal bölgelerini belirlemek için değerli bilgiler sağlar. Coccidioides sporlarının ve benzer büyüklükteki inert partiküllerin (veriler gösterilmemiştir) alveolar hava yolu lümenleri boyunca tamamen dağılmak yerine distal bronşiolar bölgelerde ve bronko-alveoler kavşaklarda biriktiğini gözlemledik. Bu model, doğal akciğer morfolojisini korurken hava yolu içeriğinin fizyolojik bütünlüğünü koruyan immünofloresan (veya immünohistokimya [IHC] gibi diğer aşağı akış boru hatları) için kriyoseksiyonlar üretmek için nispeten düşük düzeyde ekipman ve teknik beceri gerektirir. Hava şişmesi olmadan, alveollerin çökmesi, bronşiyolleri çevreleyen akciğer parankiminin doğal mimarisini bozar13,15. Histolojik işleme sırasında akciğerin hava hacminin kaybı, Amerikan Toraks Derneği ve Avrupa Solunum Derneği'nin akciğer yapısının kantitatif değerlendirmesi için standartların tanımlanmasında ortak bir resmi araştırma politikası beyanı ile "ciddi bir sorun" olarak belirtilmiştir16. Ayrıca, fiksatifin intratrakeal damlatılması, müsinler, yüzey aktif madde ve hava yolu kirpikleri gibi proksimal hava yolu moleküler ve hücresel bileşenlerinin doğasını ve yerini bozabilir 17,18,19. Burada tarif edilen yöntem, solunan mantar sporları ile etkileşime giren hava yolları boyunca moleküler ve hücresel bileşenlerle birlikte hem akciğerin hava hacmini yeterince korur.

İmmünofloresan mikroskobu, akciğer bileşenlerinin mekansal dinamiklerini sorgulamak için güçlü bir araç sağlar ve iyi bir şekilde gözden geçirilmiştir20,21. Bu bölümlerin immünofloresan yoluyla boyanabilecek hedefler için herhangi bir sınırlama yoktur, ancak formalin fiksasyonuna duyarlı epitoplara sahip antikorlar hedeflerini tatmin edici bir şekilde bağlayamayabilir. Yeni bir antikor kullanırken, antikorun arka planın üzerinde herhangi bir sinyal üretip üretmediğini belirlemek için bir floresan eksi bir (FMO) kontrolü hazırlamak en iyisidir. İkincil kullanılıyorsa, ikincil antikorun hedef dışı bağlanmasını kontrol etmek için birincil antikor içermeyen bir tedavi grubu kullanın. Primer konjuge monoklonal antikorlar çok spesifiktir, bu nedenle daha yüksek sıcaklıklarda (37 °C) daha kısa süre (30 dakika) boyama yaygındır ve genellikle hedeflerine spesifik olarak bağlanır. Öte yandan, konjuge olmayan poliklonal antikorlar antijenleri tespit etmek için daha hassastır, ancak daha az spesifiktir, bu nedenle daha düşük sıcaklıklarda (4 °C) daha uzun inkübasyonlar (~ 16 saat) sinyal-gürültü oranını optimize eder. Tüm antikorlar ampirik optimizasyon gerektirecektir.

Bu çalışmada spor lokalizasyonu için kullanılan mekansal analiz modeli, bireysel sporların en yakın bronşiolar epitele olan mesafesini ölçer. Bu, yüksek EpCAM sinyali ve tüp benzeri yapıları kaplayan kolumnar bir epitel olarak morfolojik olarak farklı görünümü kullanılarak bronşiolar epitelin uygun şekilde tanımlanmasını gerektirir. EpCAM ayrıca alveolar epitel ile daha düşük seviyelerde de eksprese edilebilir, bu nedenle tanımlanan ek açıklamaları morfolojik olarak doğrulanmış bronşiolar bölgelerle sınırlamak için QuPath'te EpCAM sinyalini eşiklemek önemlidir. Bronşiyoller anatomik olarak minimum bir boyuta sahip olduğundan, bu bölgelerin QuPath tanımını adım 11.3'te belirtildiği gibi minimum 100 mm2 alan ile sınırlayabiliriz. Bu, alveolar tip II epitel hücreleri gibi alveolar boşluklar boyunca izole edilmiş yüksek EpCAM eksprese eden hücreleri veya artefaktları QuPath ek açıklamalarından hariç tutacaktır. Bu adımlar, yalnızca bronşiolar epiteli QuPath açıklamaları olarak tanımlamamıza ve sporların bu tanımlanmış bronşiolar epitele yakınlığını belirlememize olanak tanır.

Burada tarif edilen enfeksiyon modeli, mantar sporlarının aspirasyonu için farelerde oral gasp tepkisini indüklemek için izofluran anestezisi kullanır. İzofluran açık damla yöntemi, farelerde kısa süreli anesteziyi indüklemek için hızlı, düşük kaynaklı bir teknik olarak geliştirilmiştir 9,22,23. Bu yöntemin tutarlı bir şekilde gerçekleştirilmesi biraz pratik gerektirir. Anestezi altındaki süre, fareyi faringeal içeriği aspire etmek için yeterince uyuşturacak kadar uzun olmalıdır. Fare yeterince anestezi altına alınmazsa, aşıyı aspire etmek yerine yutabilir. Yeterli anestezinin işaretine, fare yaklaşık 50-60 nefes / dakika hızında artan canlılıkta düzenli bir oral nefes aldığında ulaşılır. Sırtüstü farenin kafası her nefeste ileri doğru hareket etmelidir. Yetersiz anestezi, nefes alma eksikliği veya bıyık, dil veya uzuvların herhangi bir hareketi ile belirlenebilir. Yutmayı önlemek için aşıyı uygularken pipet ucuyla dili bastırmak en iyi uygulamadır. Aşırı dozda izofluran farenin ölümüne neden olabilir ve önlenmelidir. Bunu önlemek için iyi bir kural, farenin doğru refleksini kaybetmesi için geçen süre ile aynı süreden sonra fareyi izoflurandan çıkarmaktır. Örneğin, farenin doğru olma refleksini kaybetmesi 10 saniye sürerse, 10 saniye daha sonra fareyi çıkarın. İzofluran gazı, birden fazla fare tedavisi sırasında kaçtıkça, bu zaman çerçevesi artabilir. Elimizde daha fazla izofluran eklemeden 6-8 fareyi tedavi edebiliriz.

Bu protokolün bileşenlerinde bazı sınırlamalar vardır. Aşılama prosedürü, aerosol haline getirilmiş bir spor inokülasyonundan daha az fizyolojik olan 25 μL sıvı PBS ortamında süspanse edilmiş sporları kullanır. Aspire edilmiş sıvının kullanımının, havadaki sporların solunması gibi diğer aşılama yöntemlerine kıyasla sporların/partiküllerin lokalizasyonunu değiştirip değiştirmediği açık bir soru olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, aerosol haline getirilmiş inhalasyon, kapsamlı kaynak yatırımı gerektirir ve çalışmanın ve laboratuvar ortamının doğasına bağlı olarak optimal olmayabilecek başka sınırlamalara (sınırlı aşı boyutu, değişken maruziyet, mesleki risk) sahiptir. Bu protokolün bir başka sınırlaması, kriyoseksiyon sırasında doku kırılganlığının ortaya çıkabilmesidir, bu da doku boyunca hava varlığına veya intratrakeal fiksasyona kıyasla vasküler fiksasyonun etkinliğinin azalmasına bağlı olabilir. Bu kriyoseksiyon kırılganlığı, 60-100 μm'lik daha kalın kesitler kesilerek ve doku içindeki iki boyutlu (2D) düzlemleri görüntülemek için konfokal mikroskopi kullanılarak üstesinden gelinebilir.

Bu yöntemin basitliği ve uyarlanabilirliğinin, diğer grupların seçtikleri inhale patojenler ve ilgilendikleri konakçı yanıtları ile fayda bulmalarını sağlayacağına inanıyoruz.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansman ve destek, NIH hibesi K22 AI153678-01 ve Rutgers Lisansüstü Çalışmalar Okulu aracılığıyla alındı. Rutgers Biyomedikal Sağlık Bilimleri Hücresel Görüntüleme ve Histoloji Merkezi'nden Fawad Yousufzai ve Luke Fritzky'ye immünofloresan görüntüler elde etme konusundaki çalışmaları ve uzmanlıkları için teşekkür ederiz.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
18 G, 1 1/2 iğne (305185)Fisher305185
1 L  Vidalı Kavanoz  (Nalgene)Fisher Scientific11-823-33
Air-Tite Toplu Steril Olmayan Şırıngalar 10 mL Luer LockFisher14-817-175
AnaSed Enjeksiyonu (ksilazin steril solüsyonu)Akorn59399-110-20
Hayvansız Engelleyici ve Seyreltici, RTUVektörSP-5035-100
BD Insyte Autoguard Kanatlı Korumalı IV Kateter, BD Vialon Kateter Malzemeli 18 G x 1.88 BD381547
BD Pharmingen Saflaştırılmış Sıçan Anti-Fare CD16/CD32 (Fare BD Fc Blok ve ticaret;)BD553142
CellTracker Turuncu CMRA BoyaFisher ScientificNC0873640
CFSELabviva75003
Coccidioides posadasii cts2 / ard1 / cts3 & Delta;  BEI KaynaklarıNR-166
Corning 70 mikron süzgeçlerVWR10054-456
EpCAM AlexaFluor647 monoklonal antikorBiolegend118211
Exel International HYpodermic İğneler 30 G x 1/2"LabvivaEN3012
Fisherbrand Tek Kullanımlık Steril Şırıngalar (1 mL, Leur Slip) Fisher14-955-462
Glikoz MonohidratAzer Scientific ES17530-500G
Yüksek Vakumlu GresVWR59344-055
Hoechst 33342 Çözelti 20 mM (5 mL)ThermoFischer62249
İzofluran USPCovetrus29405
Ketamin HidroklorürDechra1000001250
KIMWIPES Hassas Görev Silecekleri (4.4" x 8.4")VWR21905-026
Lexer Bebek MakasıFST14078-10
Mikro Adson ForsepsFST11018-12
Nötr Tamponlu Formalin (%10) (Azer Scientific)Fisher22-026-350
Nunc EasYFlask doku kültürü şişeleri, T75, filtre kapaklarıVWR15708-134
PBSVWR45000-446
Soyulabilir-A-Way gömme kalıplarıSigmaE6032-1CS
QuPath 0.5.1 YazılımAçık kaynaklıhttps://qupath.github.io/
İpek Sütür iplik boyutu 3/0FST18020-30
SlaytlarMicro Slaytlar Superfrost Plus VWR48311-703
SlowFade Cam Yumuşak Set Antifade Mountant (2 mL)ThermoFischerS36917
SükrozSigmaS0389-500G
Tissue-Tek OCT Bileşiği, Sakura FinetekVWR25608-930
Tween 20ThermoFischerJ20605.
Vektör Laboratuvarları ImmEDGE Hidrofobik Bariyer Kalem 2'liSet Fisher ScientificNC9545623
VWR Mikro Kapaklı Camlar, Dikdörtgen (24 mm x 40 mm # 1.5)VWR48393-230
Beyaz Plastik HasırMAPORCH789862904922
Maya ÖzüFisherBP9727-500
Zeiss AxioScan 7 Carl Zeiss Microscopy GmbHhttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.htmlçok kanallı floresan mikroskop
ZEN 3.7 YazılımıCarl Zeiss Microscopy GmbHhttps://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.htmlmikroskobu yazılımı
AP

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. American Society for Microbiology. One Health: Fungal Pathogens of Humans, Animals, and Plants. Report on an American Academy of Microbiology Colloquium. , Washington, DC. (2019).
  2. Crossen, A. J., et al. Human airway epithelium responses to invasive fungal infections: A critical partner in innate immunity. J Fungi (Basel). 9 (1), 40(2022).
  3. Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6 (10), 1801-1811 (2012).
  4. Thakur, A. K., Kaundle, B., Singh, I. Mucoadhesive Drug Delivery Systems in Respiratory Diseases.Targeting Chronic Inflammatory Lung Diseases Using Advanced Drug Delivery Systems. , Elsevier, Academic Press. (2020).
  5. Darquenne, C. Aerosol deposition in health and disease. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 25 (3), 140-147 (2012).
  6. Kradin, R. L., Mark, E. J. The pathology of pulmonary disorders due to Aspergillus spp. Arch Pathol Lab Med. 132 (4), 606-614 (2008).
  7. Karnak, D., Avery, R. K., Gildea, T. R., Sahoo, D., Mehta, A. C. Endobronchial fungal disease: An under-recognized entity. Respiration. 74 (1), 88-104 (2006).
  8. Amich, J., et al. Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-Aspergillus fumigatus interactions. mBio. 11 (1), e02752-e02819 (2020).
  9. Wiesner, D. L., et al. Club cell TRPV4 serves as a damage sensor driving lung allergic inflammation. Cell Host Microbe. 27 (4), 614-628.e6 (2020).
  10. Evans, S. E., Hahn, P. Y., McCann, F., Kottom, T. J., Pavlovic', Z. V., Limper, A. H. Pneumocystis cell wall β-glucans stimulate alveolar epithelial cell chemokine generation through nuclear factor-κB-dependent mechanisms. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (6), 490-497 (2005).
  11. Bauer, C., Krueger, M., Lamm, W. J. E., Glenny, R. W., Beichel, R. R. lapdMouse: associating lung anatomy with local particle deposition in mice. J Appl Physiol. 128 (2), 309-323 (2020).
  12. Srirama, P. K., Wallis, C. D., Lee, D., Wexler, A. S. Imaging extra-thoracic airways and deposited particles in laboratory animals. J Aerosol Sci. 45, 40-49 (2012).
  13. Thomas, S. M., Bednarek, J., Janssen, W. J., Hume, P. S. Air-inflation of murine lungs with vascular perfusion-fixation. J Vis Exp. 168, e62215(2021).
  14. Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).
  15. Davenport, M. L., Sherrill, T. P., Blackwell, T. S., Edmonds, M. D. Perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology. J Vis Exp. 162, e60605(2020).
  16. Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for quantitative assessment of lung structure. Am J Respir Crit Care Med. 181 (4), 394-418 (2010).
  17. Gil, J., Weibel, E. R. Extracellular lining of bronchioles after perfusion-fixation of rat lungs for electron microscopy. Anat Rec. 169 (2), 185-199 (1971).
  18. Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 53 (2), 528-533 (1982).
  19. Evans, C. M., et al. The polymeric mucin Muc5ac is required for allergic airway hyperreactivity. Nat Commun. 6, 6281(2015).
  20. Galati, D. F., Asai, D. J. Immunofluorescence microscopy. Curr Protoc. 3 (8), e842(2023).
  21. Hickey, S. M., et al. Fluorescence microscopy-An outline of hardware, biological handling, and fluorophore considerations. Cells. 11 (1), 35(2021).
  22. Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. Open-drop anesthesia for small laboratory animals. Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).
  23. Bodnar, M. J., Ratuski, A. S., Weary, D. M. Mouse isoflurane anesthesia using the drop method. Lab Anim. 57 (6), 623-630 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Murine Lung ImagingFungal Spore LocalizationAirway Spatial DynamicsAir Inflation FixationVascular Perfusion FixationCryopreservation TechniqueFluorescent MicroscopyQuPath AnalysisEpCAM Antibody StainingRespiratory Fungal Infection

Related Articles