Method Article

Hücreden Arındırılmış Fare Akciğerleri ve Primer İnsan Endotel Hücreleri Kullanılarak Biyomühendislik Ürünü Akciğerin Transplantasyonu

DOI:

10.3791/67565

⸱

March 28th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Thoracic Surgery, Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, hücreden arındırma ve yeniden hücreselleştirme yöntemleri kullanılarak biyomühendislik ürünü fare akciğerlerinin nasıl oluşturulacağını açıklamaktadır. Ayrıca sonraki ortotopik akciğer naklini de detaylandırır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akciğer nakli, idiyopatik pulmoner fibroz gibi son dönem akciğer hastalıkları olan hastalar için kritik bir tedavi yöntemidir, ancak donör kıtlığı ve nakil sonrası komplikasyonlar gibi zorluklar devam etmektedir. Hastaya özgü hücreleri hücrelerden arındırılmış hayvan iskelelerine entegre eden biyomühendislik ürünü akciğerler, umut verici bir alternatif sunuyor. Hayvan modellerinde biyomühendislik akciğerlerinin kullanımındaki ilerlemeye rağmen, işlevsellik ve yapı olgunlaşmamış durumda. Bu protokol, organ biyomühendisliğinde kritik bir engeli ele almaktadır: uygun maliyetli bir deneysel platforma duyulan ihtiyaç. Araştırmacılar, sıçanlar veya domuz gibi daha büyük hayvanlar yerine fare modelleri kullanarak, her deney için gereken kaynakları önemli ölçüde azaltabilir ve araştırma ilerlemesini hızlandırabilir.

Protokol, fare kalbi-akciğer bloğu için izolasyon stratejisi, hücre giderme, biyoreaktör kurulumu, perfüzyon bazlı organ kültürü ve biyomühendislik akciğerlerinin ortotopik transplantasyonuna odaklanarak, fare kalp-akciğer blokları ve insan birincil hücrelerini kullanarak akciğer biyomühendisliği için ayrıntılı bir prosedürün ana hatlarını çizmektedir. Bu fare ölçekli platform yalnızca deneysel maliyetleri azaltmakla kalmaz, aynı zamanda yeniden hücreselleştirme için hücre tiplerini ve sayılarını optimize etmek, histolojik ve moleküler yöntemler kullanarak farklı hücre tiplerini test etmek ve nakil sonrası kan akışını sağlamak için uygun bir çerçeve sağlar. Yöntem, üç boyutlu kültür koşullarında hücre etkileşimlerini, hücre matrisi etkileşimlerini ve ex vivo kanser modellemesini incelemek ve böylece organ biyomühendisliği alanını ilerletmek de dahil olmak üzere geniş uygulamalar için potansiyele sahiptir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akciğer nakli, ilaç tedavisinin solunum fonksiyonunun bozulmasını durdurmak için etkisiz kaldığı idiyopatik pulmoner fibroz gibi son dönem akciğer hastalığı1 olan hastalar için belirleyici tedavi olmuştur. Her yıl daha fazla uygun hasta bekleme listesine eklenir; Bununla birlikte, vefat eden vericilerden yapılan organ bağışı sayısı, artanbekleyen hasta sayısının 2,3'ünü geride bırakmaktadır. Akciğer nakli geçirdikten sonra bile, primer organ disfonksiyonu, reaktif allojenik sendrom ve akciğer nakli alıcılarının 5 yıllık sağkalımını önemli ölçüde azaltan enfeksiyonlar dahil olmak üzere oldukça az sayıda sorun, nakledilen akciğerlerin işlevini bozacaktır4.

Organ naklindeki mevcut sorunlara karşı koymak için, marjinal donörlerinkullanımı 5, donör akciğerlerinin ex vivo akciğer perfüzyon sisteminde geri kazanılması6 ve gen düzenlenmiş domuz7 kullanılarak ksenotransplantasyon dahil olmak üzere çeşitli seçenekler mevcuttur. Bu alternatifler donör organ havuzunu genişletebilir; Bununla birlikte, hiçbiri donör organların kıtlığını, immünojenisitesini ve fonksiyonel heterojenliğini tamamen ele alamaz.

Gerçeklikten uzaktır, ancak hastaya özgü hücrelerin hücrelerden arındırılmış hayvan organ iskelesine entegre edildiği biyomühendislik ürünü yapay organlar, katı organ nakli için büyüleyici bir potansiyel kaynaktır8. 2010'dan bu yana biyomühendislik akciğerlerinin potansiyel faydasını gösteren birkaç öncü çalışma bildirilmiştir 9,10. Bu çalışmalarda, sıçanlardan veya domuzlardan alınan akciğerler deterjanlarla hücrelerden arındırılmış, perfüzyon bazlı biyoreaktörde akciğer dokusunu yeniden oluşturmak için trakea veya pulmoner vaskülatürden hayvan veya insan hücreleri enjekte edilmiş ve bir kısmı ortototopik olarak hayvan göğüs boşluklarına nakledilmiştir 11,12,13,14,15. Bununla birlikte, biyomühendislik akciğerlerinin işlevi ve yapısı, muhtemelen biyoreaktörde kültürlenen yetersiz hücre sayısı veya daha az entegre hücreler arası bağlantılar nedeniyle erkendi.

Organ biyomühendisliğinde araştırmaları ilerletmenin önündeki engellerden biri, küçük ölçekli bir deney platformunun olmamasıdır. Sıçanlar veya domuzlar bu alanda yaygın olarak kullanılan hayvanlar olsa da, akciğer16 başına >108 akciğer hücresine ihtiyaç duyarlar ve bu da akademik laboratuvarlar için oldukça maliyetlidir. Organ biyomühendisliği araştırmaları için fareler mevcutsa, her deneyin maliyetini önemli ölçüde azaltabilir ve araştırma programını hızlandırabiliriz. Fare ve insan akciğerleri arasında anatomik farklılıklarolmasına rağmen 17, akciğerin temel mimarisi memeliler arasında benzerdir18. Bu nedenle, fare ölçeği deneylerinin sonuçları, sayıyı vücut büyüklüğüne göre çarparak daha büyük hayvanlara uygulanabilir.

Bu protokol, fare kalp-akciğer blokları ve insan birincil hücreleri19 kullanılarak akciğer biyomühendisliğinin ayrıntılı deneysel prosedürünü tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu çalışma için daha önce bildirilen ve yaygın olarak kullanılan fare akciğer hücreden arındırma protokolünü benimsedik 20,21,22. Akciğer biyomühendisliğinin zorlu kısmı, hücreden arındırılmış kılcal damar sisteminin yeniden hücreselleştirilmesidir20; Bu nedenle bu protokolde insan göbek kordonu ven endotel hücreleri kullanılacaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneyler, Tohoku Üniversitesi23 tarafından yayınlanan Tohoku Üniversitesi'ndeki Hayvan Deneyleri ve İlgili Faaliyetler Yönetmeliği'ni (15. baskı) takip etti. Bu çalışma Tohoku Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (#2020AcA-041-01).

1. Hücrelerden arındırma için malzemelerin hazırlanması

  1. Hücre giderme solüsyonlarının hazırlanması (1 L otoklavlanabilir cam şişede 1.000 mL formatı)
    1. Steril deiyonize (DI) su: 1 L otoklavlanabilir cam şişelere 1.000 mL damıtılmış veya DI su ekleyin. 121 °C'de 20 dakika otoklavlayın.
    2. Triton X-100: 1 L formatında otoklavlanabilir cam şişeye 1 mL Triton X-100 ila 1.000 mL steril DI su ekleyin. (İsteğe bağlı) 10 mL Penisilin ve Streptomisin çözeltisi (son konsantrasyon, 500 birim / mL penisilin ve 500 μg / mL streptomisin) ekleyin.
      NOT: Otoklav yapmayın.
    3. Sodyum deoksikolat: 1 L formatında otoklavlanabilir cam şişede 1.000 mL steril DI suya 20 g sodyum deoksikolat tozu ekleyin. Kapağı kapatın ve tozu çözündürmek için şişeyi çevirin. (İsteğe bağlı) 10 mL penisilin ve streptomisin çözeltisi ekleyin.
      NOT: Otoklav yapmayın.
    4. 1 M NaCl: 1 L formatında otoklavlanabilir cam şişede 1.000 mL damıtılmış veya DI suya 58,44 g NaCl ekleyin. 121 °C'de 20 dakika otoklavlayın.
    5. DNaz I stok çözeltisi: Ortam A'da 10 mg / mL konsantrasyonda seyreltin.
      1. Orta A: 5 mM CaCl2 (9 mL steril DI suda 5 mg CaCl2 ) hazırlayın ve steril DI su ile 1:10 seyreltin.
    6. DNase I çalışma solüsyonu: 10 mL Ortam B'ye 33 μL DNase I stok solüsyonu ekleyin.
      1. Orta B: 10x Orta B (100 mL steril DI su içinde 155 mg MgSO4 + 220 mg CaCl2 ) hazırlayın ve steril DI su ile 1:10 seyreltin.
  2. Pulmoner arter (PA) ve trakea için kateterlerin hazırlanması (steril prosedür)
    1. PA kateterini (sıçan juguler veni için kateter) yaklaşık 15 mm uzunluğunda kesin.
    2. Bileziği kateterin sonuna kadar hareket ettirin.
    3. PA kateterine bir kateter konektörü yerleştirin ve bir enjektöre takın. Hazırlanan PA kateterleri Şekil 1A'da sunulmuştur.
    4. PA kateterini kullanana kadar %70 etanol içinde saklayın.
    5. 20 G i.v. kateteri yaklaşık 15 mm uzunluğunda kesin. Bu bir trakeal kateter için kullanılır.
  3. Kalp-akciğer bloğunun toplanması için fare cerrahisi
    1. Bir erkek fareyi (C57BL / 6, ağırlık > 28 g) aşırı dozda karbondioksit veya izofluran ile ötenazi yapın.
    2. Fareyi ameliyat masasına sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve uzuvları sabitleyin. Göğüs ve karın yüzeyine% 70 etanol püskürterek sterilize edin.
    3. Medyan çizgideki karın boşluğunu paslanmaz makasla boyuna kadar açın ve sternumu makasla ayırın. Diyaframı torasik duvardan rezeke edin, torasik boşlukları tamamen ortaya çıkarmak için ventral göğüs duvarını kesin ve timusu çıkarın. Adım 1.3.5'te PBS'nin yetersizliğini önlemek için inferior vena kava ve sağ superior vena kava'yı 4-0 ipek ile ligrate edin, böylece pulmoner vaskülatürdeki kanın yıkanmasını artırın.
    4. Drenaj için abdominal aortu paslanmaz makasla kesin. Abdominal aort ayırt edilemezse, inferior vena kava ve abdominal aortu tamamen kesin.
    5. Sağ ventrikül duvarını delerek 5 mL steril şırınga ile 27 G iğne ile sağ ventrikülden 3 mL steril PBS enjekte edin.
    6. Ana PA'yı Dumont forseps kullanarak 4-0 ipek ile döngüleyin.
      NOT: Ana PA ve çıkan aort birlikte döngüye alınabilir.
    7. Sağ ventrikül duvarını yaylı makasla keserek PA valflerinin altında 2 mm'lik bir pencere açın.
    8. PA kateterini pencereden yerleştirin ve daha önce ilmekli 4-0 ipeği sabitleyin (Şekil 1B).
      NOT: Bu prosedür sırasında PA duvarına zarar verebilecek şekilde PA'ya dokunmaktan kaçının. Ana PA ve asendan aort birbirine bağlanabilir ve birlikte sabitlenebilir.
    9. 5 mL steril şırınga ile PA kateterinden yavaşça 2 mL PBS enjekte edin. PBS enjekte edilirken her iki akciğerin de hafifçe genişlediğinden emin olun.
    10. Trakeayı trakeal kateter ile kanüle edin ve 4-0 ipek sütür ile yerine bağlayın (Şekil 1C).
    11. Boş 5 mL steril şırınga ile trakeal kateterden yavaşça 2 mL hava enjekte edin ve 10 saniye tutun. Akciğerlerden hava sızıntısı olmadığından emin olun.
    12. Kalbi ve akciğeri blok halinde çıkarın. Trakeayı Dumont forseps ile ve trakeal kateter içerideyken alın, servikal özofagusu kesin ve omurlardan çıkarın. Bilateral subklavyen damarları ve arterleri kesin. Son olarak, yemek borusunu ve intravena kava'yı diyafram hizasında kesin.
      NOT: Akciğer yüzeyine herhangi bir aletle dokunmayın. Herhangi bir hafif dokunuş hava sızıntısına neden olabilir.
  4. Fare akciğerlerinin hücreden arındırılması (3 günlük prosedür)
    NOT: Bölüm 1.4'teki tüm işlemler temiz bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir.
    1. 1. Gün
      1. Rezeke edilen kalp-akciğer bloğunu 10 cm çapında plastik bir Petri kabına aktarın ve kalp-akciğer bloklarını steril DI suda 4 °C'de 1 saat inkübe edin.
      2. Trakea kateterinden 3x 2 mL steril DI su ve 5 mL steril şırınga ile PA kateterinden 2 mL steril su enjekte edin. Akciğer geri çekilirken sıvının dışarı çıkmasına izin vermek için her enjeksiyondan sonra duraklayın (Şekil 1C).
        NOT: Yaklaşık 0.5 mL/s'de su enjekte edin.
      3. Trakeal katetere 2 mL% 0.1 Triton X-100 solüsyonu ve PA kateterine 2 mL enjekte edin.
      4. Kalp-akciğer bloğunu Petri kabına yerleştirin ve Triton X-100 solüsyonunda gece boyunca 4 °C'de statik olarak inkübe edin.
    2. 2. Gün
      1. Triton X-100 solüsyonunu adım 1.4.1.2'de açıklandığı gibi steril DI su ile akciğerlerden çıkarın.
      2. Trakeal katetere 2 mL% 2 sodyum deoksikolat çözeltisi ve PA kateterine 2 mL enjekte edin. Deoksikolat çözeltisi içinde 4 ° C'de 24 saat inkübe edin.
    3. 3. Gün
      1. Sodyum deoksikolat çözeltisini adım 1.4.1.2'de açıklandığı gibi steril DI su ile akciğerlerden çıkarın.
      2. Trakeal katetere 2 mL 1 M NaCl solüsyonu ve PA kateterine 2 mL enjekte edin. RT'de 1 saat NaCl çözeltisi içinde inkübe edin.
      3. Adım 1.4.1.2'de açıklandığı gibi steril DI su ile NaCl çözeltisinden çıkarın.
      4. Trakeal katetere 2 mL DNAse I çalışma solüsyonu ve PA kateterine 2 mL enjekte edin. RT'de 1 saat DNaz çalışma solüsyonunda inkübe edin.
      5. DNaz çözeltisini adım 1.4.1.2'de açıklandığı gibi akciğerlerden çıkarın, ancak steril PBS ile. Hücre giderme prosedüründen sonra akciğerlerin kenarlarının beyaz ve şeffaf olduğunu onaylayın.
        NOT: Hücre çözme prosedürü ilerledikçe akciğer daha kırılgan hale gelir. Kalp-akciğer bloğunu her zaman dikkatli kullanın ve akciğer yüzeyine dokunmaktan kaçının. Decellularizasyondan sonra, kalp-akciğer blokları 3 haftaya kadar 4 ° C'de PBS / antibiyotiklerde saklanabilir.

2. İnsan birincil hücrelerinin kültürü

  1. Fetal sığır serumu (son konsantrasyon,% 2), hidrokortizon (son konsantrasyon, 0.2 μg / mL), insan bazik fibroblast büyüme faktörü (son konsantrasyon, 4 ng / mL), vasküler endotelyal büyüme faktörü (2 ng / mL), R3 insülin benzeri büyüme faktörü-1 (son konsantrasyon, 5 ng / mL), askorbik asit (son konsantrasyon, 75 μg / mL), insan epidermal büyüme faktörü (son konsantrasyon, 10 ng/mL), gentamisin/amfoterisin-1000 (son konsantrasyon, gentamisin: 30 μg/mL, amfoterisin: 15 ng/mL) ve heparin (son konsantrasyon, 1 ng/mL).
  2. 2 × 106 insan göbek kordonu ven endotel hücrelerini (HUVEC'ler) donmuş şişelerde 37 ° C'de bir su banyosunda çözdürün.
  3. Hücreleri 15 mL'lik bir konik tüpte EGM2 ile karıştırın ve 500 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
  4. Hücreleri sayın ve uygun bir hücre yoğunluğunda alt kültüre alın (2.0 x 104 hücre /cm2 önerilir). 6 oyuklu format plakalarından başlayın ve ardından T75 şişelerine aktarın.
  5. Gerekli sayıda hücre elde edilene kadar hücreleri geçirin.
    NOT: HUVEC'leri kullanarak tam pulmoner vasküler kapsama alanı için 3 × 107 HUVEC gerekecektir19.

3. Biyoreaktör kurulumu ve perfüzyon organ kültürü

  1. Bir organ odası ve bir hücre rezervuarının hazırlanması
    1. Şekil 2A'da gösterildiği gibi bir mantar delici kullanarak bir silikon tıpada delikler açın. Delik boyutları 5 mm (i, ii ve iii) ve 7 mm'dir (iv ve v). Şekil 2A'daki her delik numarası (i-v), Şekil 2B'deki delik numaralarına karşılık gelir.
    2. Pompa hortumunu Şekil 2B'de gösterildiği gibi silikon tıpadan geçirin.
    3. Bir mantar delici kullanarak üstü açık vidalı kapağın silikon septumunda 5 mm'lik bir delik açın. Deliğe L/S 14 platinle sertleştirilmiş bir boru yerleştirin (Şekil 2B,C).
    4. Borulu silikon tıpa, cam teneke kutu, tüplü GL-45 vidalı kapak, 250 mL otoklavlanabilir cam şişe ve yem bağlantı parçalarına sahip bir L/S 14 hortumu ( Şekil 3A'da Boru B ve Boru C) dahil olmak üzere yukarıdaki malzemeleri 20 °C'de 121 dakika boyunca otoklavlayın. B ve C borularının bir döngü oluşturmasını sağlamak için uygun yem bağlantı parçalarını seçin.
      NOT: Cam teneke kutu bir organ odası için kullanılır ve 250 mL cam şişe bir hücre rezervuarı için kullanılır.
  2. Perfüzyon tabanlı biyoreaktör devresinin montajı
    NOT: Aşağıdaki işlemler temiz bir tezgah üzerinde yapılmalıdır.
    1. Cam teneke kutuya 70 mL kültür ortamı ekleyin ve ardından silikon tıpayı cam teneke kutunun üzerine yerleştirin.
    2. Şekil 45A'da açıklandığı gibi üç musluklar kullanarak bir silikon tıpa, bir cam kutu, borulu bir GL-45 vidalı kapak, 250 mL otoklavlanabilir bir cam şişe ve yem bağlantı parçalarına sahip bir L/S 14 boruyu monte edin. GL-45 vidalı kapağın silikon septumuna 20 G'lik bir iğne yerleştirin.
    3. Boru A, B ve C'deki medyayı, musluk i) ve iii)'ye bağlı 10 mL'lik bir şırınga ile doldurun (1 m boruyu doldurmak için ~ 3-5 mL medya gerekecektir). Borunun içinde hava kabarcığı olmadığından emin olmak için üç bir musluktan 10 mL'lik bir şırınga kullanarak medya enjeksiyonunu ve çekilmesini tekrarlayın.
    4. Hücre dışı kalp-akciğer bloğunun PA kateterini, Boru C'ye bağlı bir yem bağlantısı aracılığıyla takın. Kateterde veya hortumda hava kabarcıklarından kaçının.
    5. EGM2'de 0.5-1 × 106 hücre / mL yoğunlukta HUVEC'leri hasat edin ve yeniden askıya alın. Adım 2.5'teki hücre süspansiyonunu hücre rezervuarına ekleyin.
      NOT: Hücre süspansiyonu tercihen 3.2.4 ve 3.2.5 adımları arasında hazırlanır. Hücre haznesine bir karıştırma çubuğu koyun.
  3. Endotel hücrelerinin yerçekimi güdümlü enjeksiyonu
    1. HUVEC'leri içeren hücre rezervuarını manyetik bir karıştırıcı üzerine yerleştirin. Hücre rezervuarının tabanının organ odasının 30 cm üzerinde olduğundan emin olun (Şekil 2D ve Şekil 3A).
    2. Manyetik karıştırıcıyı yaklaşık 120 rpm hızında açın.
    3. Hücre süspansiyonunun Boru A, Boru C ve PA kateteri aracılığıyla hücreden arındırılmış iskeleye enjekte edilebilmesi için musluk i) ve ii)'yi açın.
      NOT: 1 × 10 6 hücre / mL hücre yoğunluğunda 3 × 107 hücre enjekte edilirken, hücre süspansiyonunun hacmi 30 mL olmalıdır. Tipik bir enjeksiyon hızı 1-2 mL / dk'dır.
    4. Hücre süspansiyonunu tamamen enjekte ettikten sonra, Boru A'yı Stopcock ii'den ayırın).
      NOT: Hücre sayımı, hücresizleştirilmiş yapı iskelesindeki hücre tutma oranını ölçmek için bu adımda gerçekleştirilebilir. Tipik hücre tutma oranı, enjekte edilen hücre sayısından bağımsız olarak% 80-90'dır19.
      Hücreden arındırılmış akciğer iskelesinin kalitesi, hücre tutma oranını kesin olarak belirler. Hücresizleştirilmiş akciğerden herhangi bir sızıntı (ör., ana PA'dan, akciğer yüzeyinden) daha düşük bir hücre tutma oranı ile sonuçlanır. Perfüzyon bazlı biyoreaktördeki musluklardan birine bağlı steril bir şırınga ile 2-3 mL kültür ortamı enjekte ederek hücresizleştirilmiş akciğerden belirgin bir sızıntı olmadığından emin olun ve ortam enjekte edilirken hücresi ayrılmış akciğerlerin hafifçe genişlediğini doğrulayın.
  4. Perfüzyon organ kültürü
    1. Organ odasını bir CO2 inkübatöre yerleştirin.
    2. Boru B'yi pulsatil bir pompaya bağlı bir pompa kafasına sabitleyin.
    3. CO2 inkübatörünün cam kapısını kapatın. Borunun cam kapı ile lastik conta arasına düzgün şekilde yerleştirildiğinden emin olun (Şekil 3B).
    4. Enjekte edilen endotel hücrelerinin iskeleye yerleşmesine izin vermek için hücrelerden arındırılmış iskeleyi 37 ° C'de 3 saat inkübe edin.
      NOT: Pulsatil pompanın 3.4.1 ve 3.4.4 adımları arasında her zaman kapalı olduğundan emin olun.
    5. Pompayı 6 rpm hızında başlatın, bu da bir L/S 2 hortumu kullanarak 14 mL/dk ortam perfüzyonu ile sonuçlanır. Ortam perfüzyonu ile hücreden arındırılmış akciğerin hafifçe genişletilmesini izleyin.
    6. İnkübatör kapağını kapatın (Şekil 3C).
    7. Medya değişimini Stopcock iii aracılığıyla gerçekleştirin. Medyanın yarısını her 2 veya 3 günde bir değiştirin.
      1. Pompa tahrikini durdurun, vanaya 50 mL'lik steril bir şırınga takın iii) ve hazneden 50 mL ortam çekin.
      2. Başka bir 50 mL steril şırıngayı 50 mL önceden ısıtılmış ortamla doldurun ve ortamı musluk iii aracılığıyla hazneye aktarın. Vanayı uygun şekilde değiştirin ve ardından pulsatil pompayı çalıştırın.
    8. En az 2 günlük perfüzyon organ kültüründen sonra yeniden hücreli kalp-akciğer bloğunu hasat edin.
      NOT: Çalışmamızda, 3 × 107 HUVEC kullanılarak decellularize akciğer iskelesini homojen bir şekilde revaskülarize etmek için 2 günlük perfüzyon kültürü yeterli olmuştur. 3 × 107'den daha az HUVEC kullanıldığında, yeniden hücreselleştirmenin verimliliğini artırmak için daha uzun inkübasyon gerekebilir.

4. Biyomühendislik akciğerinin ortotopik nakli

  1. İlaç hazırlama
    1. Midazolam (son konsantrasyon, 4 mg / kg), medetomidin (son konsantrasyon, 0.75 mg / kg) ve butorphanol tartrat (son konsantrasyon, 5 mg / kg) klinik derece normal salin ile karıştırarak MMB kombinasyon anestezik ajanını hazırlayın.
    2. Heparin çözeltisini klinik derece normal salin (nihai konsantrasyon, 1000 U / mL) ile karıştırarak hazırlayın.
    3. Sefazolin sodyumunu klinik derece normal salin (bir doz, 30 mg / kg) ile karıştırarak hazırlayın.
  2. Cerrahi prosedür
    1. Manşetlerin hazırlanması
      1. Damarların kelepçeli kalmasını kolaylaştırmak için üç tip anjiyokateteri ince zımpara kağıdı ile hafifçe ovalayın.
      2. #11 neşter kullanarak 1 mm uzunluğunda 20 G Teflon anjiyokateterden bir bronş manşet hazırlayın. Anjiyokateteri kesmeden önce, 10-0 naylonu bağlamak için anjiyokateterde bir girinti yapmak için # 11 neşterin arkasını kullanın.
      3. Pulmoner ven (PV) manşetini 0,8 mm uzunluğunda 22 G Teflon anjiyokateterden ve PA manşetini 0,6 mm uzunluğunda 24 G Teflon anjiyokateterden hazırlayın.
        NOT: Bu hazırlık deney gününden önce yapılabilir.
    2. Manşetin biyomühendislik akciğerine takılması
      1. Kalp-akciğer bloğunu soğuk tuzlu su ile nemlendirilmiş bir parça steril gazlı bez üzerine yerleştirin, altına başka bir parça kuru, temiz gazlı bez yerleştirin ve temiz buzla dolu bir Strafor kutuya bir Petri kabı koyun.
        NOT: Kuru gazlı bezin yerleştirilmesi, kalp-akciğer bloğunun kazara donmasını önler.
      2. Trakea ve gazlı bezi sabitlemek için bir anevrizma klipsi yerleştirin (Şekil 4A). Kalbin üzerine, sağ akciğeri de kaplayacak şekilde küçük bir gazlı bez parçası yerleştirin. Sol akciğere başka bir gazlı bez yerleştirin. Sol hilumu mümkün olduğunca net bir şekilde ortaya çıkarmak için bu geri çekilmeyi nemli gazlı bezle ayarlayın.
      3. Tercihe bağlı olarak düz veya açılı mikro forseps kullanarak hiler yapıları birbirinden dikkatlice inceleyin (Şekil 4B). Vagus siniri boyunca pulmoner ligamentten diseksiyon yapmaya başlayın. PV altında viseral plevrayı kesin ve inen aort ve vagus sinirini birlikte sol pulmoner hilusun arkasından kraniyal tarafa doğru hareket ettirin.
      4. Sol ana PA'yı pulmoner gövdeden sol akciğerin en kenarına kadar diseke edin (Şekil 4C). Ardından, yeterli uzunluk elde etmek için PA'yı pulmoner gövde seviyesinde bölün.
      5. Sol PV'yi sol atriyumun sol tarafından sol akciğerin en kenarına kadar diseke edin (Şekil 4D). Yeterli uzunluk elde etmek için sol PV'yi sol atriyum seviyesinde bölün.
      6. Stabilizasyon cl'yi kullanarak PA manşetini PA'nın hemen üzerine asınamp ve PA'yı manşetin içine yerleştirin (Şekil 4E). PA'yı manşetin üzerine katlayın), endotel yüzeyini açığa çıkarın. 10-0 naylon kravat ile manşetin etrafını sabitleyin (Şekil 4F). Manşeti PV'ye aynı şekilde yerleştirin (Şekil 4G,H).
      7. Sol bronşu karina seviyesinde bölün. Manşeti bronşun üzerine aynı şekilde yerleştirin (Şekil 4I).
    3. Alıcı fare için prosedür
      1. Alıcı fareyi 27 G'lık bir iğne ile MMB ip karışımı ile uyuşturun ve mikroskop altında 20 G'lik bir poliüretan anjiyokateter yerleştirerek entübe edin. Alıcı fareyi sağ lateral dekübit pozisyonunda sıcaklık ayarlı bir elektrikli ısıtıcıya yerleştirin ve anjiyochatheteri solunum cihazına bağlayın. Ventilatör ayarını şu şekilde ayarlayın: oksijen 2 L/dk, solunum hızı 120 bpm, tidal hacim 0,5 mL. Göğüs duvarını% 70 etanol ile sterilize edin ve sefazolin karışımını sc enjekte edin.
      2. Cildi makasla kesin. Deri altı dokusunu ve kasları koter ile kesin. Göğsü 3. interkostal boşluktan açın ve göğüs ekartörlerini yerleştirin.
        NOT: Torakotominin implantasyon için yeterince büyük olması gerekmesine rağmen, iç meme arterine zarar vermeyin, bu da büyük kanamaya neden olabilir.
      3. Pulmoner ligamenti pamuklu çubuk ve büyük yaylı makasla inceleyin. Akciğeri kolayca geri çekmek için alıcının sol akciğerine kavisli bir arteriyel temizleyici yerleştirin. Açılı bir mikro forseps ile mediastinal plevrayı sol pulmoner hilum etrafında diseke edin.
        NOT: Plevranın diseksiyonunun temeli, bir insanın anatomik akciğer rezeksiyonuna benzer.
      4. Mediastenden sol akciğerin en kenarına kadar kavisli mikro forseps kullanarak PA'yı bronştan diseke edin (Şekil 5A). Bronşu, PV'den benzer şekilde inceleyin.
        NOT: Bir önceki manevrada plevra diseke edildiğinde diseksiyon kolaylıkla yapılabilir (adım 4.2.3.3).
      5. Tıkamak için PA'nın tabanına 10-0 ipekten bir düğüm yerleştirin (Şekil 5B). PV ve bronşun tabanına ince açılı bir anevrizmal klips yerleştirin (Şekil 5C).
      6. 10-0 naylonu bronş, PA ve PV'nin etrafına sarın ve aşağıdaki adımlarda manşetleri sabitlemek için gevşek bırakın.
      7. Mikro yaylı makas kullanarak alıcının PA, bronş ve PV'sini alıcının sol akciğerinin kenarında kesin (Şekil 5D). Düz mikro forseps kullanarak PA ve PV'yi nazikçe genişletin. PA ve PV'deki kanı 1 mL şırınga ve 24 G anjiyokatatör kullanarak salinle çıkarın.
        NOT: PA, bronş ve PV insizyonları, yolun yaklaşık üçte biri kadardır. Düz mikro forseps naziktir ve genişleme için uygundur.
      8. Nemli gazlı bezle kaplı biyomühendislik akciğerini, alıcının mediastenine mümkün olduğunca yakın olacak şekilde alıcının sol akciğerinin üzerine yerleştirin (Şekil 5E).
      9. Donör PA manşetinin alıcı PA'ya yerleştirilmesi (Şekil 5F).
        NOT: Donör PA'da biraz gerilme olacaktır. PA insizyon boyutu uygunsa, donörün manşetinin yerinden çıkma olasılığı daha düşüktür. Biyomühendislik ürünü akciğerin mediastene yakın hareket ettirilmesi, donörün manşetinin yerinden çıkmasını da önleyecektir.
      10. Manşetin etrafını 10-0 naylon kravat ile sabitleyin (Şekil 5G). Benzer şekilde, donör bronşları (Şekil 5H) ve PV manşetlerini (Şekil 5I,J) yerleştirin ve sabitleyin.
      11. İnce açılı anevrizmal klipsi çıkarın (Şekil 5L). Kanın PV manşetinin ötesine geri aktığını gözlemleyin ve biyomühendislik akciğerine antegrad kan akışını sürdürmek için PA üzerindeki ipek bağı çıkarın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre çözme protokolünü takiben, fare akciğerleri gözle görülür şekilde beyaz ve yarı saydamdır (Şekil 6A). Hücresel bileşenler tamamen çıkarılmalıdır, ancak histolojik gözlemde alveolar yapı bozulmadan kalır (Şekil 6B,C). 2 günlük perfüzyon bazlı biyoreaktör kültürü ile 3 × 107 HUVEC kullanan hücreselleştirilmiş fare akciğerleri, HUVEC'lerin homojen bir dağılımını göstermektedir (Şekil 7A). HUVEC'ler per...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organ biyomühendisliği zorlu bir kuruluştur. Maliyetli tarama süreci, bu alanın araştırma ve geliştirme döngüsünü engellemektedir. Fareleri deneysel bir platform olarak kullanarak, alan, hücreler ve ortam, daha önce kullanılan sıçan platformuna kıyasla önemli ölçüde azaltılır. Gaz değişimi, vasküler direnç veya akciğer uyumu gibi ayrıntılı fiziksel parametrelerin ölçülmesi henüz elde edilmemiş olsa da, fare akciğer modeli, deneysel protokollerin hızlı bir şekilde yinelenmesini ve hücre c...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların bu makale ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Bilimsel Araştırma için Yardım Hibesi / KAKENHI (C) #20K09174, #23K08308, TS için Ortak Uluslararası Araştırmaları Teşvik Fonu (B)) #22KK0132, TW için 21K08877 SAYILI JSPS KAKENHI HIBESI, FT için Leave a Nest Grant Ikeda-Rika ödülü ve FT için #21J21515 JSPS Fellows için Yardım Hibesi tarafından mali olarak desteklenmiştir. Tohoku Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyomedikal Araştırma Merkezi'nde teknik personel olan Bayan Maiko Ueda'ya histolojik gözlem konusundaki yoğun çalışmaları için çok teşekkür ederiz. Ayrıca, Tohoku Üniversitesi IDAC Araştırma Araçları Merkezi'nden Bayan Yumi Yoshida ve Bay Koji Kaji'nin görüntü işleme desteği için teknik tavsiyelerine de teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HÜCRE
27 G x 1/2 inç BD PrecisionGlide İğneBD305109Veya eşdeğeri 27 G enjeksiyon iğnesi
BD Insyte IV Kateter 20 GA X 1.8 8INBD381237Veya eşdeğeri 20 G IV kateter
Bıçak ipek sütür (4-0)NescoGA04SBVeya eşdeğeri
CaCl2Sigma-AldrichC5670
Sıçan juguler ven için kateter, PU 2Fr 10 cmInstechC20PU-MJV130130 g ve altındaki fareler için önerilir.
Sıçan juguler ven için kateter, PU 3Fr 10 cmInstechC30PU-RJV130730 g'ın üzerindeki fareler için önerilir.
DNase ISigma-AldrichDN25
MgSO4Sigma-AldrichM7506
NaClSigma-AldrichS3014
PinPort enjektörleriInstechPNP3M
PinPort'lar, 22 GInstechPNP3F22-50C30PU-RJV1307
PinPorts, 25 GInstechPNP3F25-50'yeC20PU-MJV1301'ye uyar
Sodyum deoksikolatSigma-AldrichD6750
Steril şırınga, 5 mLJenerik
Triton X-100Sigma-Aldrich9036-19-5
HÜCRE KÜLTÜRÜ
EGM-2 Endotel Hücre Büyüme Ortamı-2 BulletKitLonzaCC-3162
HUVEC – İnsan Göbek Damarı Endotel HücreleriLonzaC2519A PERFÜZYON BAZLI
BİYOREAKTÖR
20 G iğneJenerik
3 muslukJenerik
Mantar deliciJenerikDelik işleme boyutu, 6-10 mm
EasyLoad III pompa kafasıCole-Parmer243934
Cam teneke kutuHarioSCN-200Tİç çap: 80 mm
Isıtma manyetik karıştırıcıGenel
Yem bağlantısı, PVDF, Yumuşak Boru içinNordson Medical2-9965-01Dişi, ID 1,5 mm (L/S 14) ile boruya uyar
Yem bağlantısı, PVDF, Yumuşak Tüp içinNordson Medical2-9964-01Erkek, ID 1,5 mm (L/S 14) ile boruya uyar
Yem bağlantısı, PVDF, Yumuşak Boru içinNordson Medical2-9965-03Dişi, İç Çap 3 mm (U/S 16) ile boruya uyar,
PVDF, Yumuşak Boru içinNordson Medical2-9964-03Erkek, İç Çap ile boruya uyar 3 mm (L/S 16)
Manyetik karıştırma çubuğuJenerik
Masterflex L/S Uzak G/Ç ve Tezgah Üstü Denetleyicili Dijital Hassas Modüler SürücüCole-Parmer07557-00
Masterflex L/S Hassas Pompa Hortumu, PharMed BPT, L/S 16Cole-Parmer06508-16
Masterflex L/S Tüketim Pompası Hortumu, Platinle Kürlenmiş Silikon, L/S 14Cole-Parmer96410-14
Millex-GP Şırınga Filtre Ünitesi, 0.22 & m, polietersülfon, 33 mm, gama sterilizeedilmiş MilliporeSLGPR33RS
Pyrex 250 mL çim şişesi, GL-45 vidalı kapakCorning1395-250
GL45 için Silikon Septa Üstü Açık PBT Vidalı KapakCorning1395-455S
Silikon Işık DurdurucuIMG07763-18Üst çap: 87 mm, Alt çap: 75 mm
Steril şırınga, 10 mL, 50 mLJenerik
FARE CERRAHİSİ (Kalp-akciğer bloğunun izolasyonu | Akciğer nakli)
10-0 Naylon bağlarKono SeisakushoN/A
10-0 İpek kravatlarKono SeisakushoN/A
4-0 İpek bağlarKono SeisakushoN/A
Arteriyel kelepçe, 45 mm kavisli, yivliNatsume seisakusyoC-17-45
BD Insyte IV Kateter 24GABD381512Veya eşdeğer 24G iv kateter
Bulldog Vasküler Forseps 45mm kavisliNatsume seisakusyoM2
Butorphanol tartrat Meiji Seika Pharma N/A
Sefazolin SodyumOtsuka İlaç/A
Dumont forseps #5/45Güzel Bilim Araçları1251-35
İnce vannas tarzı yaylı makasGüzel Bilim Araçları15403-0845 derece uç, 0,01 x 0,06 mm
İkizler Koter KitiHarvard AparatıRS-300
Halsted-Sivrisinek kelepçesi kavisli uç, 125 mmBiyoaraştırma merkezi16181670
Hegar iğne tutucu, 150 mmB Braun/AesculapBM065R
Heparin çözeltisiMochida SeiyakuN/A
MedetomidinNippon Zenyaku KogyoN/A Mikro
forseps düzB Braun/AesculapBD33R
MidazolamSandozN/A
Fare VantilatörüHarvard AparatıModel 687™
Normal Salin, Klinik sınıfOtsuka İlaçN/A
Petri kabı, 60 x 15 mmBD351007
Safelet Cath PU 20 gauge poliüretan kateterNipro09-031
Sakaki paslanmaz makas kavisli 14 cm Biyoaraştırmamerkezi64152034
Neşter tutucuBiyoaraştırma merkezi16101040
Küçük hayvan geri çekme sistemiGüzel Bilim Araçları18200-20
Yedek bıçaklı neşter #11Muranaka Tıbbi Aletler567-001-03
Yaylı makas, 15 cmBiyoaraştırma merkeziPRI13-3736
StereomikroskopLeica MicrosystemsM525Esnek kol sistemine sahip klinik sınıf cerrahi mikroskop tercih edilir.
Sugita titanyum anevrizma klipsi kavisli ince, No.98Mizuho medikal17-001-98
Sugita titanyum klips aplikatörü, 110 mmMizuho medikal17-013-53
Sıcaklık ayarlı elektrikli ısıtıcıJenerik
Ultra ince pamuklu çubukJenerik
VASKÜLER VE BRONŞIYAL MANŞET
İnce zımpara kağıdıJenerik
Venula 20 gauge Teflon anjiyokateterTop1160
Venula 22 gauge Teflon anjiyokateterTop1161
Venula 24 gauge Teflon anjiyokateterTop1124
DIŞI, uyar N

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van der Mark, S. C., Hoek, R. A. S., Hellemons, M. E. Developments in lung transplantation over the past decade. Eur Respir Rev. 29 (157), 190132(2020).
  2. Valapour, M., et al. OPTN/SRTR 2022 Annual Data Report: Lung. Am J Transplant. 24 (2S1), S394-S456 (2024).
  3. Hoffman, T. W. Waiting list dynamics and lung transplantation outcomes after introduction of the lung allocation score in the Netherlands. Transplant Direct. 7 (10), e760(2021).
  4. Wilk, A. R., Edwards, L. B., Edwards, E. B. The effect of augmenting OPTN data with external death data on calculating patient survival rates after organ transplantation. Transplantation. 101 (4), 836-843 (2017).
  5. Neizer, H., Singh, G. B., Gupta, S., Singh, S. K. Addressing donor-organ shortages using extended criteria in lung transplantation. Ann Cardiothorac Surg. 9 (1), 49-50 (2020).
  6. Oliveira, P., Yamanashi, K., Wang, A., Cypel, M. Establishment of an ex vivo lung perfusion rat model for translational insights in lung transplantation. J Vis Exp. (199), e65981(2023).
  7. Anand, R. P. Design and testing of a humanized porcine donor for xenotransplantation. Nature. 622 (7982), 393-401 (2023).
  8. Shakir, S., Hackett, T. L., Mostaco-Guidolin, L. B. Bioengineering lungs: An overview of current methods, requirements, and challenges for constructing scaffolds. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1011800(2022).
  9. Ott, H. C. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat Med. 16 (8), 927-933 (2010).
  10. Petersen, T. H. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
  11. Leiby, K. L. Rational engineering of lung alveolar epithelium. NPJ Regen Med. 8 (1), 22(2023).
  12. Kitano, K., et al. Orthotopic transplantation of human bioartificial lung grafts in a porcine model: A feasibility study. Semin Thorac Cardiovasc Surg. 34 (2), 752-759 (2022).
  13. Ohata, K., Ott, H. C. Human-scale lung regeneration based on decellularized matrix scaffolds as a biologic platform. Surg Today. 50 (7), 633-643 (2020).
  14. Ren, X. Engineering pulmonary vasculature in decellularized rat and human lungs. Nat Biotech. 33 (10), 1097-1102 (2015).
  15. Doi, R. Transplantation of bioengineered rat lungs recellularized with endothelial and adipose-derived stromal cells. Sci Rep. 7 (1), 8447(2017).
  16. Stone, K. C., Mercer, R. R., Gehr, P., Stockstill, B., Crapo, J. D. Allometric relationships of cell numbers and size in the mammalian lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 6 (2), 235-243 (1992).
  17. Basil, M. C., Morrisey, E. E. Lung regeneration: a tale of mice and men. Semin Cell Dev Biol. 100, 88-100 (2020).
  18. Hsia, C. C., Hyde, D. M., Weibel, E. R. Lung structure and the intrinsic challenges of gas exchange. Compr Physiol. 6 (2), 827-895 (2016).
  19. Tomiyama, F., et al. Orthotopic transplantation of the bioengineered lung using a mouse-scale perfusion-based bioreactor and human primary endothelial cells. Sci Rep. 14 (1), 7040(2024).
  20. Stoian, A., Adil, A., Biniazan, F., Haykal, S. Two decades of advances and limitations in organ recellularization. Curr Issues Mol Biol. 46 (8), 9179-9214 (2024).
  21. Crabbe, A. Recellularization of decellularized lung scaffolds is enhanced by dynamic suspension culture. PLoS One. 10 (5), e0126846(2015).
  22. Daly, A. B. Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Tissue Eng Part A. 18 (1-2), 1-16 (2012).
  23. Regulations for Animal Experiments and Related Activities. , Tohoku University. at https://www.clag.med.tohoku.ac.jp/clar/en/ (2024).
  24. Sokocevic, D., et al. The effect of age and emphysematous and fibrotic injury on the re-cellularization of de-cellularized lungs. Biomaterials. 34 (13), 3256-3269 (2013).
  25. Ren, X., et al. Ex vivo non-invasive assessment of cell viability and proliferation in bio-engineered whole organ constructs. Biomaterials. 52, 103-112 (2015).
  26. Watanabe, T. Mesenchymal stem cells attenuate ischemia-reperfusion injury after prolonged cold ischemia in a mouse model of lung transplantation: a preliminary study. Surg Today. 47 (4), 425-431 (2017).
  27. Watanabe, T., et al. Donor IL-17 receptor A regulates LPS-potentiated acute and chronic murine lung allograft rejection. JCI Insight. 8 (21), e158002(2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lung BioengineeringDecellularized Mouse LungsHuman Endothelial CellsOrgan TransplantationPerfusion Organ CultureBioreactor SetupHeart Lung BlockRecellularization ProtocolHistological AnalysisCapillary Network Formation

Related Articles